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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuem 3-Fluor-D-alanin, 2-Deutero- - 3-fluor-D-alanin oder 2,3, 3-Trideutero-3-fluor-D-alanin und von deren Salzen.
Die Fluorierung von Aminosäuren mit Fluoroxyperfluoralkanen ist bekannt ; vgl. hiezu Kollonitsch, Am.
Soc. 92 [19 70], S. 7494 bis 7495.
Die racemische Verbindung 3-Fluor-D, L-alanin ist eine bekannte Verbindung, die vonLettre und Mitarb. in Ann. Chem., Bd. 708 [1967], S. 75 bis 85, beschrieben worden ist. Die oben genannten optischen D-Isomeren sind jedoch bisher weder beschrieben worden, noch wurde die antibakterielle Aktivität des Racemats untersucht.
Es wurde nun gefunden, dass nur unter spezifischen, in vitro vorgenommenen Testverfahren zur Ermittlung antibakterieller Aktivität die Hemmaktivität des 3-Fluor-D-alanins in Erscheinung tritt. Es war daher möglich, zu zeigen, dass in vitro die antibakterielle Aktivität der optischen Isomeren vergleichbar ist. Dennoch unterscheiden sich die Isomeren in vivo bedeutend. Das D-Isomer behält seine antibakteriellen Eigen- schaften bei und dient dem Schutz infizierter Tiere, während dem L-Isomer die Fähigkeit, bakteriell infizierte Tiere zu schützen, zu fehlen scheint und tatsächlich bei solchen Tieren bei nur mässigen Dosierungswerten tötlich wirkt.
Die neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen und ihre Salze sind antibakterielle Mittel, die bei der Hemmung des Wachstums pathogener Bakterien sowohl grampositiver als auch gramnegativer Art, wie Streptococcus, Escherichia, Staphylococcus, Salmonella, Pseudomonas, Diplococcus, Klebsiella, Proteus, Mycobacterium, Vibrio, Pasteurella und Serratia, sowie der antibiotikaresistentenStämme derselben wirksam sind. Veranschaulichende Beispiele für solche Pathogene sind Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes.
Somit können die neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen und ihre Salze als antiseptische Mittel zur Entfernung empfindlicher Organismen von Einrichtungen benutzt werden, die für pharmazeutische, Dental-und medizinische Zwecke dienen, und sie können auch auf andern Gebieten verwendet werden, die Infektionen durch solche Organismen unterliegen.
Die neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen und ihre Salze sind besonders wertvoll, da sie nicht nur die oben erwähnte Verwendbarkeit aufweisen, sondern auch bei der Behandlung von Krankheiten nützlich sind, die durch die obigen Organismen bei Menschen und Tieren hervorgerufen werden, und sie können in einer umfassenden Vielzahl von therapeutischen Dosierungsformen in üblichen Trägern verabreicht werden, beispielsweise durch orale Verabreichung in Form von Kapseln oder Tabletten oder in einer flüs si- gen Lösung oder Suspension.
Geeignete Ansätze können Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Schutzstoffe, Bindemittel, Geschmacksstoffe und Überzugsmittel enthalten, wobei es sich um Zusätze handelt, die dem Sachverständigen an sich bekannt sind, und die Dosierung der Produkte kann innerhalb eines umfassenden Bereiches variieren, wobei eine Obergrenze durch den autoantagonistischen Schwellenwert des infizierenden Organismus in bezug auf das 3-Fluor-D-alanin im unmittelbaren Bereich der erwarteten antibakteriellen Wirkung gegeben ist. Beispielsweise können Dosierungen von etwa 250 bis etwa 500 mg des Aktivbestandteils je Patient mit 70 kg Körpergewicht zwei-bis viermal täglich gegeben werden. Ein heranwachsendes Tier bei Gruppenfütterung unter wachstumsfördernder Therapie soll etwa 100 g/t vollständigen Futters erhalten.
Alternativ kön- nen die Verbindungen parenteral durch Injektion in einem sterilen Exzipienten verabfolgt werden.
Die Besonderheit des antibakteriellen in vitro-Tests, der oben erwähnt worden ist, war durch die ungewöhnlichen Eigenschaften des 3-Fluor-D-alanins bestimmt, das in hohen Konzentrationen autoantagonistisch wirkt. Demgemäss wird bei antibakteriellen Standarduntersuchungen, die mit dem Ziele angestellt werden, Aktivitäten sehr geringen Grades auszusondern und bei welchen daher relativ hohe Konzentrationen der Testverbindungen angewendet werden, die Aktivität des 3-Fluor-D-alanins nicht zu ermitteln sein.
Diese autoantagonistische Eigenschaft ist jedoch der Brauchbarkeit nicht abträglich, da sie, beispielsweise in vivo, nur bei Dosierungen auftritt, die grösser sind als das etwa 10fache der mittleren wirksamen, für die Heilung erforderlichen Dosis.
Während 3-Fluor-L-alanin rasch und vollständig mit toxischen Folgen metabolisiert wird, unterliegt 3-Fluor-D-alanin in vivo einem viel langsameren Abbau. Ein möglicher Wirkstoff ist das D -Aminosäure- oxydaseenzym, das beim Menschen und bei der Ratte reichlich vorhanden ist, das aber bei der Maus und bei gewissen pflanzenfressenden Tieren in einem viel geringeren Ausmass vorliegt. Aber weder die Metabolisierungsgeschwindigkeit, soweit sie Blutspiegel des Therapeutikum beeinflussen kann, noch die Nebenprodukte dieses Metabolismus sprechen gegen die Verwendung der Verbindung bei den Dosierungen, wie sie für Menschen oder Tiere vorgeschlagen werden.
Es wurde ferner gefunden, dass die Deuterierung neuen Deuteroanalogades3-Fluor-D-alanins, 2-Deutero-3-fluor-D-alanin und 2,3, 3-Trideutero-3-fluor-D-alanin gegen Angriff durch D-Aminosäureoxydase signifikant weniger empfindlich ist und dennoch die antibakterielle Mächtigkeit der Stammverbindung beibehalten wird. Die in vivo-Aktivität wird dabei erhöht und aufrecht erhalten.
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Wirksamkeit des 3-Fluor-D-alanins im Vergleich zu andern Antibiotikas bei der Behandlung infizierter Mäuse.
Weibliche C. D. l-Mäuse mit einem mittleren Gewicht von 21, 0 g wurden intraperitoneal mit 0, 5 ml einer entsprechenden Verdünnung einer 16 h alten Kulturbrühe injiziert, welche die angegebenen Pathogene enthielt. (Die Schwere der Infektionsgefahr wird in jedem Fall als das Multipel der Verdünnung der Kulturbrühe angegeben, die bei nur 50% der unbehandelten Tiere tödlich wirkt, d. h. die LD50-Dosis.) Das Therapeutikum wurde dann rasch in einem Volumen von 0,5 ml auf einem der nachstehend angegebenen Wege verabreicht : Entweder subkutan am Rücken (S. C.), intraperitoneal (I. P.) oder durch perorale Gabe (P. 0.). Im Falle der mit Streptococcus- oder Diplococcusorganismen infizierten Mäuse wurde auch eine zweite Dosis des Therapeutikums 6 h nach der Infektion gegeben.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Form der statistisch interpolierten Dosis angegeben, die zum Schutz von 50% der infizierten Tiere während eines Zeitraumes von sieben Tagen nach der Infektion und Behandlung notwendig ist. (Tod durch Behandlungsfehler und bei unbehandelten Kontrolltieren trat in allen Fällen innerhalb der ersten drei Tage ein.) Die Abkürzungen, die für die verglichenen Verbindungen verwendet wurden, sind folgende :
3FDA = 3-Fluor-D-alanin ;
CYC = D-Cycloserin ;
TET = Tetracyclin ;
CLM = Chloramphenicol.
EMI2.1
<tb>
<tb>
Therapeutische <SEP> Wirksamkeit
<tb> (ED50) <SEP> in <SEP> mg <SEP> : <SEP>
<tb> Organismus <SEP> : <SEP> Weg <SEP> : <SEP> 3FDA <SEP> : <SEP> CYC <SEP> : <SEP> TET <SEP> : <SEP> CLM <SEP> : <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 2017 <SEP> I. <SEP> P. <SEP> 0, <SEP> 331 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 008 <SEP> 0, <SEP> 040 <SEP>
<tb> 7-10LD <SEP> S. <SEP> O. <SEP> 0, <SEP> 361 <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 044 <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP>
<tb> P. <SEP> C. <SEP> 0, <SEP> 377 <SEP> 2, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 600 <SEP> 0, <SEP> 446 <SEP>
<tb> Klebsiellapneumoniae"B"S. <SEP> C. <SEP> 0, <SEP> 162 <SEP> 0, <SEP> 332 <SEP> 0, <SEP> 190 <SEP> 0, <SEP> 340 <SEP>
<tb> 10-30 <SEP> LD <SEP> P. <SEP> O. <SEP> 0, <SEP> 109 <SEP> 1, <SEP> 51 <SEP> 1, <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 440 <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> eruginosa2616 <SEP> S. <SEP> C.
<SEP> 0, <SEP> 897-2, <SEP> 4 <SEP> 7, <SEP> 66 <SEP>
<tb> 9 <SEP> LD50 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 3009 <SEP> S. <SEP> C. <SEP> 0, <SEP> 023 <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 71 <SEP>
<tb> 9 <SEP> LD50 <SEP> (x2)
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 2949 <SEP> S. <SEP> C. <SEP> 0, <SEP> 538 <SEP> 0, <SEP> 726 <SEP> 0, <SEP> 046 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 3 <SEP> LD50 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 1-37 <SEP> S. <SEP> C. <SEP> 0, <SEP> 104 <SEP> > 10 <SEP> 0, <SEP> 084 <SEP> 1, <SEP> 780 <SEP>
<tb> 17 <SEP> LD50 <SEP> (x2)
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> 3010 <SEP> P. <SEP> O.
<SEP> 0, <SEP> 294 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 217 <SEP> 0, <SEP> 440 <SEP>
<tb> 14 <SEP> LD50
<tb>
3-Fluor-D-alanin zeigt eine bemerkenswerte Überlegenheit in seiner Wirksamkeit bei der Behandlung eines breiten Spektrums bakterieller Infektionen. Insbesondere bei der Verabfolgung auf dem praktischen oralen Wege ergibt 3-Fluor-D-alanin einen Wirksamkeitsgrad, der dem der anerkannten Antibiotika Chloramphenicol und Tetracyclin gleichkommt oder diesen übersteigt.
Vergleich vonsicherheit undHeilwirksamkeit des 3-Fluor-L-alanins (3-FLA) unddes3-Fluor-D-alanins (3-FDA) bei Mäusen :
Gruppen von fünf weiblichen C. D. 1-Mäusen mit einem mittleren Körpergewicht von 21 g dienten entweder als nichtinfizierte Kontrolltiere oder zur antibakteriellen Therapie, die im Anschluss an die intraperitoneale Injektion mit 0,5 ml einer verdünnten Kulturbrühe von Escherichia coli 2017, welche 7 DL50 der bakteriellen Pathogenen repräsentiert, vorgenommen wurde. Das Therapeutikum wurde in den angegebenen Dosierungen in einem Volumen von 0,5 ml in jedem Falle auf dem oralen Wege verabreicht.
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EMI3.1
<tb>
<tb>
Dosierung <SEP> % <SEP> überlebender <SEP> Tiere <SEP> je <SEP> Gruppe <SEP> : <SEP>
<tb> Nichtinfizierte <SEP> Vergleichstiere <SEP> : <SEP> Infizierte <SEP> Mäuse <SEP> : <SEP>
<tb> 3-FLA <SEP> : <SEP> 3-FDA <SEP> : <SEP> 3-FLA <SEP> : <SEP> 3-FDA <SEP> : <SEP>
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 078--0 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 312 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 20
<tb> 1, <SEP> 250 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 80
<tb> 20 <SEP> - <SEP> 100 <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 40 <SEP> - <SEP> 100 <SEP> - <SEP> -
<tb>
EMI3.2
EMI3.3
<tb>
<tb>
Menge <SEP> auf <SEP> Durchmesser <SEP> der <SEP> Zonen <SEP> um <SEP> die <SEP> Scheiben <SEP> in <SEP> mm <SEP> : <SEP>
<tb> der <SEP> Scheibe <SEP> in <SEP> y <SEP> : <SEP> 3-FLA <SEP> 3-FDA
<tb> Hemmung <SEP> : <SEP> Auto-Hemmung <SEP> : <SEP> Auto- <SEP>
<tb> antagonismus <SEP> : <SEP> antagonismus <SEP> : <SEP>
<tb> 25 <SEP> 24 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 28 <SEP> 0 <SEP> 33 <SEP> 11
<tb> 100 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 35 <SEP> 13
<tb> 200 <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 38 <SEP> 15
<tb> 400 <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> 41 <SEP> 17
<tb>
EMI3.4
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Verbindungen,Polytrifluormonochloräthylen-Stab gefertigt und mit einem ultraviolettdurchlässigen Fenster ausgestattet ist.
Alternativ kann die Reaktion in einem Druckgefäss, wie in einer Nickellegierungs-oder einer Stahl-Bombe mit einer Platinauskleidung, ausgeführt werden, in welchem Falle höhere Temperaturen, beispielsweise bis zu etwa 100 C, angewendet werden können. In einem solchen Fall ist die Verwendung von -Strahlen oder Röntgenstrahlen als Initiatoren freier Radikale zweckmässig, da diese hochenergetischen Strahlen die Wand des Reaktors durchdringen.
Das oben beschriebene Verfahren kann unter Anwendung üblicher absatzweiser Methoden durchgeführt werden, oder es kann in einer kontinuierlichen Weise in einem röhrenförmigen Reaktor ausgeführt werden, welcher mit oder ohne Packung, wie Raschig-Ringen, Schikanen od. dgl., ausgeführt sein kann, durch welchen das Substrat oder seine Lösung und das Fluorierungsmittel gepumpt werden, vorzugsweise im Gegenstrom, während die Einwirkung der radikalbildenden Strahlung erfolgt.
Eine geeignete Strahlungsquellefür die Radikalbildung stellt eine Quecksilber-Xenon-Bogenlampe dar, die mit einer Leistung von 1000 W betrieben wird. Die Lampe wird in einen Projektor montiert, der mit einer Quarz-Kondensorlinse und mit einem Wärmefilter (Wasser) ausgestattet ist.
Beispiel 1 : 3-Fluor-D-alanin.
In eine Lösung von 1, 822 g D- (-)-Alanin in 45 ml flüssigem Fluorwasserstoff leitet man 0, 6 g Fluoroxytrifluormethangas während eines Zeitraumes von etwa 1 h ein, wobei magnetisch gerührt, in einem Trokkeneisacetonbad gekühlt und mit Ultraviolettlicht bestrahlt wird. Nach 80 min weiterer Bestrahlung werden weitere 2 g Fluoroxytrifluormethangas unter Ultraviolettbestrahlung während 1, 5 h durchgeleitet, worauf eine weitere Stunde Ultraviolettbestrahlung erfolgt.
Das Lösungsmittel wird entfernt, indem ein Strom von Stickstoffgas durchgeblasen wird. Der Rückstand wird in Eiswasser aufgelöst, und eine Probe davon wird im Spinco-Beckman-Aminosäureanalysator analysiert, wobei ermittelt wird, dass 3-Fluor-D-alanin in 41% niger Ausbeute vorliegt und dass 32% nichtumgesetztes Ausgangsmaterial vorhanden sind. Zur Isolierung wird die Mischung über ein Kationenaustauscherharz (H+-Form) (ein Polystyrol-Kernsulfonsäureharz) chromatographiert. Zur Eluierung wird 2n-Salzsäure angewendet. Aus den entsprechenden Fraktionen erhält man durch Eindampfen im Vakuum reines 3-Fluor- - D-alaninhydrochlorid. 3-Fluor-D-alanin wird aus dem Hydrochlorid in einem Gemisch aus Wasser, Pyri-
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; Fp.Beispiel 2 : 2-Deutero-3-fluor-D-alanin.
Herstellung des Ausgangsmaterials :
Deuterium wird in die a-Stellung des D-Alanins eingeführt, indem man L-Alanin der Wirkung von Alaninracemase in O aussetzt, wobei für diesen Zweck ein Rohenzympräparat aus Staphylococcus aureus (E.
Ito und J. L. Strominger, J. Biol. Chem., Bd. 237 [1962], S. 2689) angewendet wird, das exhaustiv gegen gepuffertes DO dialysiert worden ist. Nach Rückgewinnung des salzfreien Alanins aus der Reaktionsmischung nach einer Ionenaustauschermethode wird das gebildete D-Alanin von dem zugeführten L-Alanin getrennt, indem die Folge chemischer N-Acetylierung und spezifischer enzymatischer Entacylierung des L -Isomeren mit Schweinenierenacylase I angewendet wird, wie von J. P. Greenstein und M. Winitz in Chemistry of the Amino Acids, Bd. 3 [1961], S. 1831 (Wileyand Sons, New York), beschrieben worden ist.
Das nach derSäurehydrolyse des acetylierten Rückstandes erhaltene 2-Deutero-D-alanin war zu 95% in bezug auf Deuterium in der 2-Stellung (bestimmt durch kernmagnetische Resonanzanalyse) angereichert und enthielt weniger als 1% L-Alanin, wie enzymatisch mit L-Alanin : Oxoglutarattransaminase bestimmt worden ist.
2-Deutero-3-fluor-D-alanin.
Unter Anwendung der Verfahrensweise des Beispiels 1, j edoch unter Ersatz des dabei verwendeten D- - Alanins durch eine äquivalente Menge 2-Deutero-D-alanin, das wie oben angegeben, hergestellt worden war,
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; [a] PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von neuem3-Fluor-D-alanin, 2-Deutero-3-fluor-D-alanin oder 2, 3, 3-Tri- deutero-3-fluor-D-alanin und von deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Alanin oder eines der Deuteroanalogen 2-Deutero-D-alanin bzw. 2,3, 3,3-Tetradeutero-D-alanin mit einem Fluoroxy- perfluoralkanmit lbis 5Kohlenstoffatomen oder mit Fluoroxypentafluorschwefel in Gegenwart eines Initiators für freie Radikale umsetzt und gewünschtenfalls ein erhaltenes Alanin in dessen Salz überführt bzw. aus einem erhaltenen Salz das Alanin freisetzt.