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Superoxyddismutasen, beispielsweise die von Markovitz (J. Biol. Chem. 234, S. 40, 1959) aus Rindererythroeyten und die von Keele und Fridovich (J. Biol. Chem. 245, S. 6176,1970), aus Escherichia coli gewonnenen Superoxyddismutasen, hemmen die nach der Gleichung 20-+ 2H+-H +02 ablaufende Dismutation von Superoxydionen, welche bei unter dem Einfluss von molekularem Sauerstoff ablau- fenden Oxydationsreaktionen entstehen und vor allem in Nahrungsmitteln zu einem raschen Abbau der Nucleisäuren und der Proteine führen, wobei in den Proteinen vorwiegend das Tryptophan oxydiert wird. Die Pa-
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jeglichenlipidische, proteinische oder lipoproteinische Nahrungsmittel sowie andere oxydierbare Stoffe oder Stoffge- mische wirken.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Behindern der Autoxydation von einem Abbau durch Oxydation unter dem Einfluss von Superoxydionen ausgesetzten Substanzen und dieses Ver- fahren ist gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass man mit den Substanzen, beispielsweise Nah- rungsmitteln, insbesondere lipidischen, proteinischen oder lipoproteinischen Nahrungsmitteln, Bakterien oder Viren, oder für das Wachstum von Zellen benutzten Kulturmedien, 1 bis 200 Einheiten mindestens einer
Superoxyddismutase je Gramm oder Milliliter Substanz vereinigt. Im Rahmen des erfindungsgemässen Ver- fahrens können als einemAbbau durch Oxydation ausgesetzte Substanzen Lipide und/oder Verbindungen, die
Insbesondere in der Lebensmittelindustrie als Antioxydantien dienen oder Antioxydantien aus Pyrogallol oder
Ascorbinsäure eingesetzt werden.
Solche üblicherweise in der Nahrungsmittelindustrie verwendetenAnti- oxydantien können statt erwartungsgemäss eine Oxydation der Nahrungsmittel zu verhindern, diese Oxydation von Nahrungsmitteln gegen jede Erwartung, sei es im Zusammenwirken mit Enzymen oder sei es unter dem
Einfluss von Metallionen, sogar begünstigen, werden jedoch in Anwesenheit einer Superoxyddismutase daran gehindert.
Eine besonders gute Behinderung der Autooxydationvon einem Abbau durch Oxydation unter dem Einfluss von Superoxydionen ausgesetzten Substanzen ergibt sich dann, wenn gemäss der Erfindung die Superoxyddis- mutase in die einem Abbau durch Oxydation ausgesetzte Substanz im Verhältnis von 1 bis 100 Einheiten
Superoxyddismutaseenzym je Milliliter oder Gramm Substanz eingebracht wird.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine aus Seebakte- rienstämmen, Escherichia coli, Pilzen oder Blutextrakten, insbesondere Erythrocupreinen, extrahierte Su- peroxyddismutase eingesetzt, da sich derartige Superoxyddismutasen als besonders wirksam erwiesen ha- ben. Von diesen Superoxyddismutasen sind vor allem die aus Seebakterienstämmen extrahierten Superoxyd- dismutasen besonders brauchbar, von welchen wieder die aus den Seebakterienstämmen Photobacterium leiognathi, Photobacteriumphosphoreum oder Photobacterium sepia, insbesondere Photobacterium leiognathi Nr. ATCC25521, PhotobacteriumphosphoreumNr. ATCC11040oderPhotobacteriumsepia Nr. ATCC 15 709 extrahierten Superoxyddismutasen besonders wirksam sind.
Superoxyddismutasen aus Seebakterien können entsprechend der AT-PS Nr. 339242 der Patentinhaberin hergestellt werden.
Die Superoxyddismutase-Wirkung der erfindungsgemäss eingesetzten Superoxyddismutasen wurde dadurch ermittelt, dass die Chemolumineszenz in einem Sauerstoff, Hypoxanthin, Xanthinoxydase und Luminol (auch als 5-Amino-2, 3-dihydro-phthalazin-1, 4-dionoder 5-Amino-phthalsäurehydrazid bezeichnet) enthaltenen wässerigem Reaktionsgemisch durch Zusetzen der zu prüfenden Superoxyddismutase zum Reaktionsgemisch abgeschwächt wurde und als eine Superoxyddismutase-Einheit willkürlich jene Menge an Superoxyddismutase definiert wurde, welche die Chemolumineszenz um 50% abschwächte.
Im einzelnen wurde hiebei so vorge- gangen, dass einem aus
0, 3 ml wässeriger, 10-3 -molarer Luminollösung,
0, 3 ml wässerigem, 10-3 -molarem Phosphatpuffer von pH = 7, 8, 0, 3 ml wässeriger, 10's-molarer Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure,
1, 0 ml Wasser und
0,050 ml einer wässerigen Lösung von Xanthinoxydase (1 mg/ml),
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in einer versilberten Küvette hergestellten Gemisch bei Durchführung des Blindversuches lediglich 1 ml einer 3.
10-4-molaren wässerigen Lösung von Hypoxanthin und bei Bestimmung der Superoxyddismutasewir- kung einer Superoxyddismutase dem Gemisch zunächst 5 gl einer wässerigen Lösung der zu prüfenden Super- oxyddlsmutase und dann 1 ml der erwähnten wässerigen Lösung von Hypoxanthin zugesetzt wurde, worauf die
Küvette vor das Objektiv eines Photovervielfachers gesetzt, der sich beim Blindversuch und der sich beim
Istversuch einstellende Strom, welcher In der Grössenordnung von 10-7 bis 10-8 A liegt, registriert und aus den erhaltenen Messwerten die in der Lösung der zu prüfenden Superoxyddismutase enthaltenen Einheiten an
Superoxyddismutase unter Berücksichtigung des Umstandes errechnet wurden,
dass bis zu einer Verringerung der Chemolumineszenz um 50% die erzielte Verringerung der Chemolumineszenz proportional der Konzen- tration an Superoxyddismutase in der zu prüfenden Lösung ist und, wie erwähnt, als Superoxyddismutaseein- heit willkürlich jene Menge an Superoxyddismutase definiert ist, welche unter den angegebenen Versuchsbe- dingungen die Chemolumineszenz um 50% verringert.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel l : 5 g frische Champignons ("Champignons de Paris") wurden in feine Scheiben zerschnit- ten und von den bei der späteren colorimetrischen Prüfung störenden farbigen Lamellen befreit, worauf die
Pilzscheiben auf mehrere Bechergläser von 100 ml Fassungsraum verteilt und in jedes der Bechergläser
50ml eines 0, 02 Gew.-% Ascorbinsäure enthaltenden 0, 01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7, 8 einge- bracht wurden. In eines der Bechergläser wurden zusätzlich 50 Einheiten Superoxyddismutase aus Photobac- terium leiognathi Nr. ATCC 25 521 eingebracht. Die Bechergläser wurden sodann mit einem gefalteten Pa- pierblatt bedeckt und 40 h bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf die optische Dichte der überstehen- den Flüssigkeitin einem jeden Becherglas mit Licht der Wellenlänge 600 nm bestimmt wurde.
Hiebei zeigte sich, dass die optische Dichte der Flüssigkeit in den Vergleichszwecken dienenden Bechergläsern, also in den keine Superoxyddismutase enthaltenden Lösungen, im Mittel um 0, 13 angestiegen war, wogegen die optische
Dichte der Superoxyddismutase enthaltenden Flüssigkeit um 0, 092 angestiegen war. Das Ausmass der Oxydation konnte somit durch die zugesetzte Superoxyddismutase um 47% verringert werden.
Beispiel 2 : ApfelscheibenwurdenineineneinenPH-Wertvon7, 8besitzendenundpromillillterdrei
Einheiten Superoxyddismutase aus Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 enthaltenden Phosphatpuffer einige Minuten eingelegt, dann dem Puffer entnommen und In Petrischalen gelegt, wo sie einige Tage belassen wurden. ImAnschluss daran wurde das Aussehen der In erfindungsgemässer Weise behandelten Apfelscheiben mit dem Aussehen von in gleicher Weise, jedoch ohne Verwendung einer Superoxyddismutase zubereiteten Apfelscheiben verglichen, wobei die nicht in erfindungsgemässer Weise behandelten Apfelscheibenstärker braun verfärbt werden als die in erfindungsgemässer Weise behandelten Apfelscheiben.
Beispiel 3 : Runde Kartoffelscheiben wurden in Bechergläser eingelegt, in welche zuvor ein einen pH-Wert von 7, 8 besitzender und pro Milliliter 3 Einheiten Superoxyddismutase aus Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 eingebracht worden war, worauf die Kartoffelscheiben nach einigen Minuten den Bechergläsern entnommen und in Petrischalen eingelegt wurden, wo sie 4 Tage belassen wurden. Die so in erfindungsgemässer Weise behandelten Kartoffelscheiben wurden mit an sichin gleicher Weise, jedoch in Abwesenheit einer Superoxyddismutase behandelten Kartoffelscheiben verglichen und erwiesen sich als weniger oxydiert als die letztgenannten.
Beispiel 4 : In diesem Beispiel wurde die Behinderung der Autoxydation von lipoproteinischen Nahrungsmitteln am Modellfall von t-RNS-Hefeligasen untersucht, welche Lipoproteine darstellen, deren Enzymwirkung durch Oxydation, wobei vor allem der Lipidantell angegriffen wird, beeinträchtigt wird, womit es möglich wird, durch Vergleich der Enzymwirkung nicht oxydierter t-RNS-Hefeligasen mit der Enzymwirkung oxydierter t-RNS-Hefeligasen, die durch eine Superoxyddismutase erzielte Behinderung der Autoxydation quantitativ zu bewerten.
Die hiebei verwendeten t-RNS-Hefeligasen wurden aus Saccharomycetes cerevisiae in folgender Weise gewonnen. Saccharomycetes cerevisiae Nr. ATCC 9841 wurde in einem 30 g Glucose und 5 g Hefeextrakt enthal- tenden Nährmedium während der Halbwertszeit des logarithmisch ansteigenden Wachstums gezüchtet, worauf die Hefezellen aus dem Nährmedium abzentrifugiert und 67 g der erhaltenen Hefezellen in 67 ml eines an Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethan] 0,01 molaren, an MgCl2 0, 01 molaren, an EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) 0,001 molaren, an Phenylmethylsulfoniumfluorid 0,002 molaren und 10 Gew.-% Glycerin
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gebracht worden war, aufgegeben,
worauf zunächst die Kolonnenfüllung mit 370 ml des genannten Puffers gewaschen und anschliessend aus der Kolonne die Ligasen mittels eines an Kaliumphosphat 0,25 molaren, an MercaptoäthanolO,02molarenundanMgCl 0, 001molarenund 10Gew.-% Glycerlnenthaltenen Puffers eluiert wurden.
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Die Enzymwirkung der Hefeligase enthaltenden Fraktion, also deren Fähigkeit, in Anwesenheit eines Nukleosidtriphosphats aus AminosäurenPeptidketten aufzubauen, wurde in 0, lml einer 0,05 Mol 3-Morpholino-propyl-schwefelsäure, 0,01 Mol Mg12, 0, 02 Mol ATP (Adenosintriphosphorsäure) und 0,0004 Mol mit 14 C markierten Lysins enthaltenden und einen pH-Wert von 6,5 besitzenden Lösung bestimmt, welche, nachdem sie mit einer bestimmten Menge einer Lösung von 0,37 mg der erhaltenen Hefeligase in 1 ml 0,5 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,5 versetzt worden war, eine bestimmte Zeit bei 40C stehengelassen wurde. Anschliessend wurden 0,05 ml des Reaktionsgemisches auf ein Filterpapier aufgetropft, worauf das aufgetropfte Gemisch 1, 5 h mit 8, 7%iger Essigsäure und mit 2, 5% luger Ameisensäure gewaschen wurde.
Die Menge des in dem auf dem Filterpapier verbliebenen Fleck enthaltenen Polypeptids wurde mittels eines auf die von 4C ausgesandte Strahlung ansprechenden Szintillationszählers bestimmt. Inder gleichen Weise wurde die Enzymwirkung der Hefeligase enthaltenden Fraktion nach 2-, 4-, 7-und 9tägigem Stehenlassen bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
Um die Behinderung der Oxydation der t-RNS-Hefeligase durch eine Superoxyddismutase zu beurteilen, wurden der pro Milliliter Phosphatpuffer 0, 37 mg Hefeligase enthaltenden Lösung 90 Einheiten einer aus Photobacteriumleiognathi Nr. ATCC 25 521 gewonnenenSuperoxyddismutase zugesetzt, worauf die Enzymwirkung der erhaltenen Lösung sofort und ebenfalls nach 2-, 4-, 7-und 9tägigem Stehenlassen bei 40C in der oben angegebenen Weise bestimmt wurde. Zu Vergleichszwecken wurde die erwähnte Lösung der Hefeligase mit 0, 1 Gew. -% Ascorbin- säure versetzt, worauf die Prüfung der Enzymwirkung in der eben angegebenen Weise vorgenommen wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I zusammengefasst.
Tabelle I
EMI3.1
<tb>
<tb> Tage <SEP> Enzymwirkung <SEP> in <SEP> %
<tb> ohne <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> Gew.-% <SEP> mit <SEP> 90 <SEP> Einheiten <SEP> SuperoxydSchutzmittel <SEP> Ascorbinsäure <SEP> dismutase <SEP> von <SEP> Photobacterium <SEP> leiognathi <SEP> ATCC <SEP> 25521
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 81 <SEP> 31 <SEP> 97
<tb> 4 <SEP> 62 <SEP> 19 <SEP> 96
<tb> 7 <SEP> 35 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 72
<tb> 9 <SEP> 27 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 67
<tb>
Man erhält ähnliche Ergebnisse unter Verwendung der gleichen Anzahl von Einheiten einer Superoxyddismutase aus Pleurotus olearius Gillet, Escherichia coli Nr. ATCC 15 224 oder Eryhtrocuprein.
Beispiel 5 : Zwecks Bestimmung des Schutzes von Bakterien gegen Oxydation durch eine Superoxyddismutase benutzte man Leuchtbakterien von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521, deren Oxydation man künstlich durch Photoreduktion des Flavinmononucleotids (FMN) beschleunigte, um die Schutzwirkung innerhalb eines kürzeren Zeitraumes erkennbar zu machen. Die Bakterien wurden bei 28 C auf einem auf 1000 ml 8 g Nährbouillon, 10 g NaCI, 14 g Na2HP04 und 2 g KH2P04 enthaltenden und auf einen pH-Wert von 7 eingestellten Nährboden gerichtet.
EMI3.2
10 ml verdünnt und die verdünnte Suspension bei 250C mit Licht der Wellenlänge 365 nm unter ständigem Rühren bestrahltwurde.
Nachfestgelegten Bestrahlungszeiten unter der Bestrahlungslampe wurden der Bakteriensuspension gleiche Anteile entnommen und darin die Zahl der lebenden Zellen bestimmt.
Der oben beschriebene Versuch wurde mit der Abänderung wiederholt, dass der auf 10 ml verdünnten Bakteriensuspension pro Milliliter noch 13, 5 Einheiten einer aus Pleurotes olearius Gillet gewonnenen Superoxyddismutase zugesetzt wurden.
Während man vor der Bestrahlung 1. 101 lebende Zellen/ml zählt, zählte man nach festgelegten Bestrahlungszeiten die in der nachstehenden Tabelle n angegebene Anzahl von lebenden Zellen/ml.
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Tabelle II
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<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> lebenden <SEP> Zellen/ml
<tb> Expositionsdauer <SEP> Vergleich <SEP> in <SEP> Anwesenheit <SEP> von <SEP> 13,5 <SEP> Einheiten
<tb> in <SEP> min <SEP> Superoxyddismutase <SEP> aus <SEP> Pleuratus
<tb> olearius <SEP> pro <SEP> ml
<tb> 30 <SEP> 4. <SEP> 106 <SEP> 7. <SEP> 106 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 5. <SEP> 105 <SEP> 3, <SEP> 9. <SEP> 106 <SEP>
<tb> 120 <SEP> 8.103 <SEP> 6. <SEP> 104
<tb>
Beispiel 6 : Man arbeitete wie In Beispiel 5, indem man Bakterien von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 in 10 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, die erhaltene Suspension mittels einer Lampe B 100 A 16 h mit Licht der Wellenlänge 365 nm bestrahlte (einfallende Energie 0,55 mW/ cm2) und anschliessend in Petri-Schalen die Anzahl der lebenden Bakterien ermittelte.
Bei einem in an sich der gleichen Weise, jedoch in Anwesenheit von 53 Einheiten pro ml einer aus Pleurotus olearius Gillet gewonnenen Superoxyddismutase durchgeführten Versuch zeigte sich, dass trotz der sehr langenBestrahlungsdauer von 16 hin Anwesenheit der Superoxyddismutase 3, 3mal mehr Bakterien überlebten als beim ohne Superoxyddismutase durchgeführten Versuch.
Die erhaltenen Ergebnisse waren folgende :
EMI4.2
<tb>
<tb> nichtbestrahlte <SEP> Bakterien <SEP> 9, <SEP> 7. <SEP> 104 <SEP> Zellen/ml
<tb> bestrahlte <SEP> Bakterien
<tb> (Vergleich) <SEP> 1, <SEP> 5. <SEP> 102 <SEP> Zellen/ml <SEP>
<tb> bestrahlte <SEP> Bakterien
<tb> (versetzt <SEP> mit <SEP> 53 <SEP> Einheiten/ml
<tb> Superoxyddismutase <SEP> aus
<tb> Pleurotus <SEP> olearius <SEP> Gillet) <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 102 <SEP> Zellen/ml <SEP>
<tb>
EMI4.3
s pie 1 7 : Es wurde ein Versuch zum Konservieren eines Bacteriophags durchgeführt, der ein Nu-0, 2 ml einer Lösung von Escherichia coli des Stammes Nr.
ATCC 15 224,10 g Typticase, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 1000 ml Wasser brüten, u. zw. bei einer optischen Dichte von 0,5 bei 650 nm und mit 3 ml weicher Gelosesuspension (bestehend aus 8 g Agar, 10 g Trypticase, 1 g Hefeextrakt, 8 g NaCl, 1000 ml Wasser, 2 ml 1 molare CaCl-Lösung und 5 ml 20%iger Glukose), die man auf 450C hält. Das ganze giesst
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von Flavinen, wobei man die Bacteriophaglösung mit einer Lösung von 10-4 Mol FMN, 10-3 Mol EDTA und 10-2 Mol Phosphatpuffer von PH 7 verdünnt und die Photoreduktion am Fluorlmeter bei einem Endvolumen der Lösung von 0,8 ml und in Anwesenheit von 13,5 Einheiten pro Milliliter Superoxyddismutase aus Pleurotus olearius durchführt.
Mit einer Lösung enthaltend anfänglich 4, 1. 108 Teilchen/ml im Augenblick t = 0, erhält man die in der nachstehenden Tabelle in angegebenen Resultate :
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Tabelle III
Teilchen/ml
EMI5.1
<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> aufeinander- <SEP> Vergleichsversuch <SEP> mit <SEP> 13,5 <SEP> Einheiten/ml <SEP> Schutz
<tb> folgenden <SEP> Photoreduk- <SEP> (enthaltend <SEP> 0, <SEP> 05mg <SEP> Dismutase <SEP> aus <SEP> Pleuro- <SEP> (Verhältnis <SEP> (B))
<tb> tionsvorgänge <SEP> bei <SEP> pq <SEP> 3 <SEP> inaktivier- <SEP> tus <SEP> olearius <SEP> (A) <SEP>
<tb> te <SEP> Dismutase)
<tb> (A) <SEP> (B)
<tb> 0 <SEP> 4, <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP> 4, <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 4. <SEP> 9. <SEP> 107 <SEP> 7. <SEP> 5. <SEP> 107 <SEP> 1,53
<tb> 6 <SEP> 5. <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 5.
<SEP> 107 <SEP> 3,00
<tb> 9 <SEP> 5. <SEP> 105 <SEP> 2. <SEP> 106 <SEP> 4,00
<tb> I
<tb>
EMI5.2
Beispiel 8 : Man arbeitet wieim Beispiel 7mitdem Unterschied,. dassmanzurBeschleunigungderOxy- dation des Bacteriophags R 17 0,3 ml einer Suspension desselben mit Sauerstoff in Anwesenheit von Hypoxanthin und Xanthinoxydase bei einem Gesamtvolumen von 3 ml behandelt. Nach 15 min behandelt man das System nochmals durch Zugabe von 0, 05ml Xanthinoxydase und 0, 3 mll0-S molarer Hypoxanthinlösung. Mit 0, 5. 108 Teilchen/ml im Zeitpunkt terhält man die Ergebnisse der nachstehenden Tabelle IV in Abwesenheit und in Gegenwart von 200 Einheiten/ml Superoxyddismutase aus Photobacterium sepia des Stammes Nr. ATCC 15 709. Die erhaltenen Ergebnisse sind vergleichbar mit den mit Superoxyddismutasen von Pleurotus olearius Gillet oder Eryhtrocuprein erzielten Ergebnissen.
Tabelle IV Teilchen/ml
EMI5.3
<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> aufeinander- <SEP> ohne <SEP> Superoxyd- <SEP> mit <SEP> Superoxyd- <SEP> Sterblichkeit <SEP> Sterblichkeit
<tb> folgenden <SEP> enzymati- <SEP> dismutase <SEP> dismutase <SEP> in <SEP> % <SEP> in <SEP> %
<tb> schen <SEP> Vorgänge <SEP> (Vergleich) <SEP> (200 <SEP> Einheiten) <SEP> (Vergleich) <SEP> (mit <SEP> Superoxyddismutase)
<tb> 0 <SEP> 5, <SEP> 0.108 <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 108 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 3,5. <SEP> 108 <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 108 <SEP> 30 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 2,0.108 <SEP> 3,0.108 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Beispiel9 :
ManprüftdieSchutzwirkungdurchdieSuperoxyddismutasengegenOxydasederpancreatischen Ribonucléase mittels einer Oxydation, indem man eine Photoreduktion von FMN einsetzt, um die Er-
EMI5.4
molarem Phosphatpuffer von PH 7, wobei das Endvolumen 0,8 ml beträgt. Man unterzieht so das pancreati- sche Ribonucleaseprotein mehreren Photoreduktionszyklenin Abwesenheit und in Gegenwart von 67,5 Einheiten/ml Superoxyddismutase aus Pleurotus olearius Gillet oder in Gegenwart derselben, bei pH 3 denaturierten und inaktiven Dismutase.
Man bestimmt die Aktivität des Ribonucleaseenzyms mittels eines Spektrophotometers, indem man die Zunahme der optischen Dichte bei 280 nm einer Ribonucleinsäurelösung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, verfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse finden sich in der nachstehenden Tabelle :
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Tabelle V % Restaktivität
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<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> Vergleich <SEP> Vergleich <SEP> mit <SEP> bei <SEP> Superoxyddismutase
<tb> Zyklen <SEP> (ohne <SEP> Dismutase) <SEP> pH <SEP> 3 <SEP> inaktivierte <SEP> 67,5 <SEP> Einheiten/ml
<tb> Superoxyddismutase <SEP> (0, <SEP> 05 <SEP> mg) <SEP>
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 3 <SEP> 67 <SEP> 56 <SEP> 89
<tb> 6 <SEP> 45 <SEP> 45 <SEP> 89
<tb> 9 <SEP> 22 <SEP> 22 <SEP> 67
<tb>
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EMI6.3
<tb>
<tb> Wochen <SEP> a) <SEP> Natriumtetra-Vergleiche <SEP> (Natriumtetrathionat)
<tb> thionat
<tb> + <SEP> Enzym <SEP> erster <SEP> zweiter <SEP> dritter
<tb> 1 <SEP> + <SEP> +
<tb> 2 <SEP> + <SEP> +
<tb> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
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Tabelle VI (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Wochen <SEP> a) <SEP> Natriumtetra- <SEP> Vergleiche <SEP> (Natriumtetrathionat)
<tb> thionat
<tb> + <SEP> Enzym <SEP> erster <SEP> zweiter <SEP> dritter
<tb> 4 <SEP> + <SEP> +-
<tb> 5 <SEP> + <SEP> +-
<tb> 6 <SEP> + <SEP> + <SEP> +-
<tb> 7 <SEP> +---
<tb> . <SEP> 9 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 11 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb> 13 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0
<tb> mittelmässig
<tb>
Ergebnis befriedigend : reine Salmonellenkultur - = schlechtes Ergebnis : Kultur E.
Coli
0 = schlechtes Ergebnis : überhaupt keine Kultur a) = es wurde jedesmal Enzym und Substrat zugesetzt
Aus dieser Tabelle ist unmittelbar ersichtlich, dass die Inhalte der Rohre, in denen Superoxyddismutaseenzyme eingeführt sind, alle ihre Eigenschaften bewahrt haben. Was das Vergleichs röhrchen selbst betrifft, so war es nur während der drei ersten Versuche befriedigend, was der bisher als normal angesehenen Gültigkeitsdauer für die handelsüblichen Quanten von Milieus mit Natriumtetrathionat entspricht. Auf Grund der folgenden Versuche wurde festgestellt, dass die Ergebnisse für die Vergleichsröhrchen sehr unregelmässig sind, was es ausschliesst, das Produkt als handelsfähig anzusehen. Man stellt also fest, dass dieser Zusatz von 2 ml einer Lösung von Superoxyddismutaseenzym des Stammes Photobacterium leiognathi Nr.
ATCC 25 521 je Röhrchen von 20 ml Natriumtetrathionat die Widerstandsfähigkeit des letzteren gegen Oxydation um mindestens 10 Wochen und sogar noch mehr verlängert.
Beispiel 11 : Konservierung von Kartoffeln
A. 250 g geschälte Kartoffeln werden 30min in Wasser bei 1000C gekocht. Man gibt 60 ml Wasser hin- zu und passiert durch einen Mischer bis zur Erzielung einer homogenen Masse. Drei Teilmengen von
50 g werden in Becher gegeben, und in jeden Becher werden 20 ml Wasser zugefügtund mitdem Brei gut vermischt.
Becher P 1 Vergleich
P 2 500 Einheiten Superoxyddismutase (10 Einheiten/g (P. leiognathi) werden zugesetzt und vermischt.
P 3 Vergleich plus 0, 5 ml 2,0% Ascorbinsäure (Endkonzentration 0, 02% Ascorbinsäure).
P 4 wie P 3 aber es sind auch 500 Einheiten Superoxyddismutase zugefügt.
Alle Muster werden dann durch Gefrieren getrocknet (lyophilisiert) und bei Umgebungstemperatur belassen.
B. Man verwendet Kartoffelflocken, die 25 mg/kg BHT (Ditertiärbutyl-paracresol) und BHA (butyl-hy- droxyanisol) und Glycerinmonostearat (1%) enthalten.
In 250 ml siedendes Wasser gibt man 45 g dieser Flocken, belässt sie 2 min und rührt mit einem
Glasstab. Zwei Teilmengen von 50 g dieses Kartoffelbreies werden aufgenommen und mit 50 ml Was- ser vermischt.
M1 Vergleich
M2 500 Einheiten Superoxyddismutase (10 Einheiten/g Brei) werden zugesetzt und gut durchge- mischt.
Die beiden Muster werden anschliessend durch Gefrieren getrocknet und das Pulver bei Umgebungs- temperatur belassen.
Nach zwei Monaten wird der Geruch der Muster A) und B) von sechs Personen verglichen. Bei Gegen-
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wart von Superoxyddismutase ist der Geruchunterschiedlich von dem der Vergleichsmuster, u. zw. weniger sauer und angenehmer.
Beispiel 12 : Konservierung von Karotten
Es wird genau dieselbe Arbeitsweise wie vorstehend für Kartoffeln beschrieben angewandt, aber für mit Wasser gekochte Karotten und mit derselben Menge Superoxyddismutase/g. Nach zwei Monaten wird der Ge- ruch der Muster von sechs Personen verglichen. Bei Vorhandensein von Superoxyddismutase ist der Geruch anders als der der Vergleichsmuster, er ist weniger sauer und angenehmer.
Die gemäss einigen der obigen Beispiele verwendete Superoxyddismutase von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr. ATCC 25 521 wurde entsprechend dem erwähnten gleichaltrigen Vorschlag der Patentinhaberin in folgender Weise hergestellt.
Bakterien von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr. ATCC 25 521 wurden auf einem künstlichen Nährboden gezüchtet, der in g/l enthielt :
EMI8.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 30
<tb> Na2HP0, <SEP> 12 <SEP> HO <SEP> 18,7
<tb> KR <SEP> 2 <SEP> P04 <SEP> 2
<tb> MgS04'7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> (NH4)2HPO4 <SEP> 0,5
<tb> Glukose <SEP> 1,5
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> Trypticase <SEP> 5
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5
<tb>
EMI8.2
EMI8.3
<tb>
<tb> über <SEP> NachtLuminol <SEP> 10-3Mol <SEP> 0, <SEP> 3mi
<tb> Phosphatpuffer <SEP> 10-6 <SEP> Mol <SEP> PH <SEP> 7,8 <SEP> 0,3 <SEP> ml
<tb> EDTA <SEP> 10-3 <SEP> Mol <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> ml <SEP>
<tb> Wasser <SEP> l, <SEP> 0 <SEP> mil <SEP>
<tb> Xanthinoxydase <SEP> (1 <SEP> mg/ml) <SEP> 0, <SEP> 050 <SEP> ml <SEP>
<tb>
Man initiiert die Reaktion, indem man in die Küvette 1 ml Hypoxanthin von 3 x 10-4 gibt.
Dann wird ein Photonenfluss emittiert, der unter der Wirkung des Photomultiplikators einen Strom entstehen lässt, dessen Intensität sowie Intensitätsschwankungen am Picoampéremeter gemessen und aufgezeichnet werden.
Wenn man in die Reaktionsmischung vor der Auslösung der Reaktion 5 jul einer Superoxyddismutaselösung einführt, die in vorstehender Weise hergestellt wurde, erhält man eine Beeinträchtigung der Lichtemission, und es wird willkürlich angenommen, dass eine Einheit Superoxyddismutaseenzym die Enzymmenge sein würde, die eine Verhinderung von 50% der Lichtemission hervorruft. Bei der UV-Spektroskopie liefert die extrahierte Superoxyddismutase das bekannte Spektrum von nichthämatinischen Proteinenmit einer Trypto-
<Desc/Clms Page number 9>
phanschulter bei 290 mu.
Zur Bestimmung ihres Molekulargewichtes benutzt man zwei bekannte Methoden : die eine besteht in der Bestimmung eines Zentrifugiergradientenan Saccharose, und im andern Fall setzt man ein Sephadexgel G 200 ein. Um dies zu bewirken, benutzt man folgende Markierungsmittel von bekannten Molekulargewichten :
EMI9.1
<tb>
<tb> Hefe-ADH <SEP> Molgewicht
<tb> Rinderalbumin <SEP> 150000
<tb> Peroxydase <SEP> 66000
<tb>
Es wird auf ein Molekulargewicht von 40000 z 2500 geschlossen.
Um die Bausteine der Proteinstruktur des Enzyms zu bestimmen, wird eine Elektrophorese in Polyacrylamidgel, versetzt mit SDS (Natriumdedecylsulfat) von 10%, durchgeführt. Man beobachtet eine einzige Bausteinart vom Molekulargewicht etwa 21000. Das Molekulargewicht der erhaltenen Superoxyddismutase kann also zu 21000 x 2, d. h. 42000, geschätzt werden. Ebenfalls auf dem Polyacrylamidgel erhält man ein rotes Band in Gegenwart von Bathophenantrolin und Hydrazin genau auf dem Niveau des durch Coomassieblau entwickelten Superoxyddismutasebandes.
Bei einer colorimetrischen Analyse einer Proteinlösung erhält man für das Eisen einen Wert, der bei Schätzung des Molekulargewichtes des Enzyms zu 42000 etwa 2 Atome Eisen je Molekül ergibt. Eine Atomabsorptionssepektrometrie einer Proteinlösung von 0, 2 mg/ml bestätigt diesen Wert. Man kann also verhältnismässig auf 2 die Atomanzahl Eisenje Mol Superoxyddismutase schätzen. Anderseits hat das gemäss diesem Beispiel extrahierte Enzym gezeigt, dass es keinem merklichen Aktivitätsverlust nach 5 min bei einer Temperatur von 700C unterliegt. Eine Elektrofocalisation der Superoxyddismutase gestattet, den pHi-Wert oder isoelektrischen Punkt dieses Enzyms zu 4, 4 zu bewerten.
Das Enzym besitzt eine Höchstaktivität bei pH et-
EMI9.2
Man erhält ein identisches Enzym mit ähnlichen Eigenschaften aus einem Bakteriumstamm von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 587.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum Behindern der Autoxydation von einem Abbau durch Oxydation unter dem Einfluss von Superoxydionen ausgesetzten Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man mit den Substanzen, beispielsweise Nahrungsmitteln, insbesondere lipidischen, proteinischen oder lipoproteinischen Nahrungmitteln, Bakterien oder Viren, oderfür das Wachstum von Zellenbenutzten Kulturmedien, 1 bis 200 Einheiten mindestens einer Superoxyddismutase je g oder ml Substanz vereinigt.
<Desc / Clms Page number 1>
Superoxide dismutases, for example the superoxide dismutases obtained by Markovitz (J. Biol. Chem. 234, p. 40, 1959) from bovine erythrocytes and that of Keele and Fridovich (J. Biol. Chem. 245, p. 6176, 1970) from Escherichia coli , inhibit the dismutation of superoxide ions, which takes place according to the equation 20- + 2H + -H +02, which result from oxidation reactions taking place under the influence of molecular oxygen and lead, especially in food, to a rapid breakdown of nucleic acids and proteins, where in the proteins mainly the tryptophan is oxidized. The pa-
EMI1.1
Any lipid, protein or lipoprotein food as well as other oxidizable substances or mixtures of substances work.
Accordingly, the invention relates to a method for preventing the autoxidation from degradation by oxidation under the influence of superoxide ions and this method is characterized according to the invention in that the substances, for example food, especially lipid, proteinaceous or lipoproteinic foods, bacteria or viruses, or culture media used for the growth of cells, 1 to 200 units of at least one
Superoxide dismutase combined per gram or milliliter of substance. In the context of the process according to the invention, lipids and / or compounds that are exposed to degradation by oxidation can be used
Especially in the food industry as antioxidants or antioxidants from pyrogallol or serve
Ascorbic acid can be used.
Such antioxidants commonly used in the food industry can, instead of preventing the food from being oxidized as expected, this oxidation of food against all expectations, be it in conjunction with enzymes or be it under the
Influence of metal ions, even favoring them, are however prevented in the presence of a superoxide dismutase.
A particularly good prevention of auto-oxidation from degradation by oxidation under the influence of superoxide ions results when, according to the invention, the superoxide dismutase in the substance exposed to degradation by oxidation in a ratio of 1 to 100 units
Superoxide dismutase enzyme is introduced per milliliter or gram of substance.
According to a preferred embodiment of the method according to the invention, a superoxide dismutase extracted from sea bacterial strains, Escherichia coli, fungi or blood extracts, in particular erythrocupreines, is used, since such superoxide dismutases have proven to be particularly effective. Of these superoxide dismutases, the superoxide dismutases extracted from sea bacteria strains are particularly useful, of which again those from the sea bacteria strains Photobacterium leiognathi, Photobacteriumphosphoreum or Photobacterium sepia, in particular Photobacterium leiognathi No. ATCC25521, Photobacteriumphosphoreum no. ATCC11040 or Photobacterium Sepia No. ATCC 15 709 extracted superoxide dismutases are particularly effective.
Superoxide dismutases from sea bacteria can be produced in accordance with AT-PS No. 339242 of the patent holder.
The superoxide dismutase effect of the superoxide dismutases used according to the invention was determined by the fact that the chemiluminescence in an oxygen, hypoxanthine, xanthine oxidase and luminol (also referred to as 5-amino-2, 3-dihydro-phthalazine-1, 4-dione or 5-aminophthalic acid hydrazide ) contained aqueous reaction mixture was weakened by adding the superoxide dismutase to be tested to the reaction mixture and that amount of superoxide dismutase was arbitrarily defined as a superoxide dismutase unit which attenuated the chemiluminescence by 50%.
In detail, this was done in such a way that one off
0.3 ml aqueous, 10-3 molar luminol solution,
0.3 ml aqueous, 10-3 molar phosphate buffer of pH = 7.8, 0.3 ml aqueous, 10's-molar solution of ethylenediaminetetraacetic acid,
1, 0 ml of water and
0.050 ml of an aqueous solution of xanthine oxidase (1 mg / ml),
<Desc / Clms Page number 2>
Mixture prepared in a silver-plated cuvette when carrying out the blind test only 1 ml of a 3rd
10-4 molar aqueous solution of hypoxanthine and, when determining the superoxide dismutase effect of a superoxide dismutase, first 5 μl of an aqueous solution of the superoxide dismutase to be tested and then 1 ml of the above-mentioned aqueous solution of hypoxanthine were added, whereupon the
Cuvette placed in front of the lens of a photomultiplier, which is in the blind test and in the
The actual test setting current, which is in the order of magnitude of 10-7 to 10-8 A, is recorded and the units contained in the solution of the superoxide dismutase to be tested are displayed from the measured values obtained
Superoxide dismutase were calculated taking into account the fact,
that up to a reduction in chemiluminescence by 50%, the reduction in chemiluminescence achieved is proportional to the concentration of superoxide dismutase in the solution to be tested and, as mentioned, the superoxide dismutase unit is arbitrarily defined as the amount of superoxide dismutase which is defined under the specified test conditions - conditions reduce chemiluminescence by 50%.
The method according to the invention is explained in more detail below by means of exemplary embodiments.
Example 1: 5 g of fresh mushrooms ("Champignons de Paris") were cut into fine slices and freed from the colored lamellae, which would interfere with the subsequent colorimetric test, whereupon the
Spread the mushroom discs on several beakers with a capacity of 100 ml and put them in each of the beakers
50 ml of a 0.01 molar phosphate buffer with a pH of 7.8 and containing 0.02% by weight ascorbic acid were introduced. An additional 50 units of superoxide dismutase from Photobacterium leiognathi No. ATCC 25 521 were placed in one of the beakers. The beakers were then covered with a folded sheet of paper and left to stand for 40 hours at room temperature, after which the optical density of the supernatant liquid in each beaker was determined with light at a wavelength of 600 nm.
It was found here that the optical density of the liquid in the beakers used for comparison purposes, i.e. in the solutions not containing superoxide dismutase, had increased by an average of 0.13, whereas the optical density
The density of the superoxide dismutase-containing liquid had increased by 0.092. The degree of oxidation could thus be reduced by 47% through the added superoxide dismutase.
Example 2: Apple slices were found to have a PH value of 7, 8 and a promillion of three
Units of superoxide dismutase from phosphate buffer containing Photobacterium leiognathi No. ATCC 25 521 were placed for a few minutes, then removed from the buffer and placed in Petri dishes, where they were left for a few days. Subsequently, the appearance of the apple slices treated according to the invention was compared with the appearance of apple slices prepared in the same way, but without the use of a superoxide dismutase, the apple slices not treated according to the invention being more brown than the apple slices treated according to the invention.
Example 3: Round potato slices were placed in beakers into which a pH of 7.8 and 3 units per milliliter of superoxide dismutase from Photobacterium leiognathi No. ATCC 25 521 had previously been introduced, whereupon the potato slices were removed from the beakers after a few minutes and placed in petri dishes, where they were left for 4 days. The potato slices treated in this way according to the invention were compared with potato slices treated in the same way, but in the absence of superoxide dismutase, and were found to be less oxidized than the latter.
Example 4: In this example, the obstruction of the autoxidation of lipoproteinic foods was investigated using the model case of t-RNA yeast ligases, which are lipoproteins whose enzyme action is impaired by oxidation, whereby the lipid cell is attacked in particular, which makes it possible Comparison of the enzyme action of unoxidized t-RNA yeast ligases with the enzyme action of oxidized t-RNA yeast ligases, to quantitatively evaluate the obstruction of autoxidation achieved by a superoxide dismutase.
The t-RNA yeast ligases used here were obtained from Saccharomycetes cerevisiae in the following manner. Saccharomycetes cerevisiae No. ATCC 9841 was grown in a nutrient medium containing 30 g of glucose and 5 g of yeast extract during the half-life of the logarithmically increasing growth, whereupon the yeast cells were centrifuged from the nutrient medium and 67 g of the yeast cells obtained in 67 ml of a Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] 0.01 molar, 0.01 molar in MgCl2, 0.001 molar in EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.002 molar in phenylmethylsulfonium fluoride and 10% by weight glycerol
EMI2.1
had been brought, abandoned,
whereupon the column filling was first washed with 370 ml of said buffer and then the ligases were eluted from the column by means of a buffer containing 0.25 molar potassium phosphate, 0.25 molar mercaptoethanol and 0.001 molar anMgCl and 10% by weight glycerine.
<Desc / Clms Page number 3>
The enzyme action of the yeast ligase-containing fraction, i.e. its ability to build up peptide chains from amino acids in the presence of a nucleoside triphosphate, was measured in 0.1 ml of 0.05 mol of 3-morpholino-propylsulfuric acid, 0.01 mol of Mg12, 0.02 mol of ATP (adenosine triphosphoric acid ) and 0.0004 mol of lysine labeled with 14 C and having a pH of 6.5 is determined which, after being treated with a certain amount of a solution of 0.37 mg of the yeast ligase obtained in 1 ml of 0.5 molar Phosphate buffer with a pH of 7.5 was added and left to stand for a certain time at 40C. Subsequently, 0.05 ml of the reaction mixture was dropped onto a filter paper, whereupon the dropped mixture was washed for 1.5 hours with 8.7% acetic acid and with 2.5% formic acid.
The amount of polypeptide contained in the stain remaining on the filter paper was determined by means of a scintillation counter responding to the radiation emitted by 4C. In the same manner, the enzyme activity of the fraction containing yeast ligase was determined after standing for 2, 4, 7 and 9 days. The results obtained are shown in Table I below.
In order to assess the hindrance of the oxidation of the t-RNA yeast ligase by a superoxide dismutase, 90 units of a superoxide dismutase obtained from Photobacteriumleiognathi No. ATCC 25 521 were added to the solution containing 0.37 mg of yeast ligase per milliliter of phosphate buffer, whereupon the enzyme action of the resulting solution was added immediately also after 2, 4, 7 and 9 days' standing at 40 ° C. was determined in the manner indicated above. For comparison purposes, 0.1% by weight of ascorbic acid was added to the above-mentioned solution of yeast ligase, whereupon the enzyme action was tested in the manner just indicated.
The results obtained are also summarized in Table I.
Table I.
EMI3.1
<tb>
<tb> days <SEP> enzyme action <SEP> in <SEP>%
<tb> without <SEP> with <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>% by weight <SEP> with <SEP> 90 <SEP> units <SEP> superoxide protective agent <SEP> ascorbic acid <SEP> dismutase <SEP > from <SEP> Photobacterium <SEP> leiognathi <SEP> ATCC <SEP> 25521
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 81 <SEP> 31 <SEP> 97
<tb> 4 <SEP> 62 <SEP> 19 <SEP> 96
<tb> 7 <SEP> 35 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 72
<tb> 9 <SEP> 27 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 67
<tb>
Similar results are obtained using the same number of units of a superoxide dismutase from Pleurotus olearius Gillet, Escherichia coli No. ATCC 15 224 or eryhtrocuprein.
Example 5: To determine the protection of bacteria against oxidation by a superoxide dismutase, luminous bacteria from Photobacterium leiognathi No. ATCC 25 521 were used, the oxidation of which was artificially accelerated by photoreduction of the flavin mononucleotide (FMN) in order to make the protective effect recognizable within a shorter period of time. The bacteria were placed at 28 ° C. on a culture medium containing 8 g nutrient broth, 10 g NaCl, 14 g Na2HPO4 and 2 g KH2PO4 and adjusted to a pH of 7 at 1000 ml.
EMI3.2
10 ml and the diluted suspension was irradiated at 250C with light of wavelength 365 nm with constant stirring.
After specified irradiation times under the irradiation lamp, equal proportions were removed from the bacterial suspension and the number of living cells therein was determined.
The experiment described above was repeated with the modification that 13.5 units of a superoxide dismutase obtained from Pleurotes olearius Gillet were added per milliliter to the bacterial suspension diluted to 10 ml.
While 1. 101 living cells / ml were counted before the irradiation, the number of living cells / ml given in Table n below was counted after fixed irradiation times.
<Desc / Clms Page number 4>
Table II
EMI4.1
<tb>
<tb> Number <SEP> of <SEP> living <SEP> cells / ml
<tb> Exposure duration <SEP> Comparison <SEP> in <SEP> presence <SEP> of <SEP> 13.5 <SEP> units
<tb> in <SEP> min <SEP> Superoxide dismutase <SEP> from <SEP> Pleuratus
<tb> olearius <SEP> per <SEP> ml
<tb> 30 <SEP> 4th <SEP> 106 <SEP> 7th <SEP> 106 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 5. <SEP> 105 <SEP> 3, <SEP> 9. <SEP> 106 <SEP>
<tb> 120 <SEP> 8.103 <SEP> 6. <SEP> 104
<tb>
Example 6: The procedure was as in Example 5, by suspending bacteria from Photobacterium leiognathi No. ATCC 25 521 in 10 ml of a physiological saline solution, and irradiating the suspension obtained with a lamp B 100 A for 16 h with light at a wavelength of 365 nm (incident energy 0.55 mW / cm2) and then determined the number of living bacteria in Petri dishes.
In an experiment carried out in the same way, but in the presence of 53 units per ml of a superoxide dismutase obtained from Pleurotus olearius Gillet, it was shown that despite the very long exposure time of 16 times the presence of superoxide dismutase, 3.3 times more bacteria survived than with those without superoxide dismutase performed experiment.
The results obtained were as follows:
EMI4.2
<tb>
<tb> non-irradiated <SEP> bacteria <SEP> 9, <SEP> 7. <SEP> 104 <SEP> cells / ml
<tb> irradiated <SEP> bacteria
<tb> (comparison) <SEP> 1, <SEP> 5. <SEP> 102 <SEP> cells / ml <SEP>
<tb> irradiated <SEP> bacteria
<tb> (offset <SEP> with <SEP> 53 <SEP> units / ml
<tb> Superoxide dismutase <SEP> off
<tb> Pleurotus <SEP> olearius <SEP> Gillet) <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 102 <SEP> cells / ml <SEP>
<tb>
EMI4.3
s pie 1 7: An attempt was made to preserve a bacteriophage containing a Nu-0.2 ml of a solution of Escherichia coli strain No.
ATCC 15 Incubate 224.10 g of Typticase, 5 g of yeast extract, 10 g of NaCl and 1000 ml of water, u. between at an optical density of 0.5 at 650 nm and with 3 ml of a soft gel suspension (consisting of 8 g agar, 10 g trypticase, 1 g yeast extract, 8 g NaCl, 1000 ml water, 2 ml 1 molar CaCl solution and 5 ml of 20% glucose), which is kept at 450C. The whole pours
EMI4.4
of flavins, whereby the bacteriophage solution is diluted with a solution of 10-4 mol FMN, 10-3 mol EDTA and 10-2 mol phosphate buffer of PH 7 and the photoreduction on the fluorometer with a final volume of the solution of 0.8 ml and in the presence of 13.5 units per milliliter of superoxide dismutase from Pleurotus olearius.
With a solution initially containing 4.18 particles / ml at the moment t = 0, the results given in the table below are obtained:
<Desc / Clms Page number 5>
Table III
Particles / ml
EMI5.1
<tb>
<tb> Number of <SEP> of <SEP> consecutive <SEP> comparison tests <SEP> with <SEP> 13.5 <SEP> units / ml <SEP> protection
<tb> following <SEP> photoreduk- <SEP> (containing <SEP> 0, <SEP> 05mg <SEP> dismutase <SEP> from <SEP> pleuro- <SEP> (ratio <SEP> (B))
<tb> inactivate <SEP> at <SEP> pq <SEP> 3 <SEP> - <SEP> tus <SEP> olearius <SEP> (A) <SEP>
<tb> te <SEP> dismutase)
<tb> (A) <SEP> (B)
<tb> 0 <SEP> 4, <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP> 4, <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 4. <SEP> 9. <SEP> 107 <SEP> 7. <SEP> 5. <SEP> 107 <SEP> 1.53
<tb> 6 <SEP> 5th <SEP> 106 <SEP> 1st <SEP> 5.
<SEP> 107 <SEP> 3.00
<tb> 9 <SEP> 5th <SEP> 105 <SEP> 2nd <SEP> 106 <SEP> 4.00
<tb> I.
<tb>
EMI5.2
Example 8: One works as in example 7 with the difference,. that in order to accelerate the oxidation of the bacteriophage R 17, 0.3 ml of a suspension of the same is treated with oxygen in the presence of hypoxanthine and xanthine oxidase in a total volume of 3 ml. After 15 min, the system is treated again by adding 0.05 ml xanthine oxidase and 0.3 ml0-S molar hypoxanthine solution. The results in Table IV below are obtained at 0.5.108 particles / ml at the time in the absence and in the presence of 200 units / ml superoxide dismutase from Photobacterium sepia of strain No. ATCC 15 709. The results obtained are comparable to those with superoxide dismutases results obtained by Pleurotus olearius Gillet or Eryhtrocuprein.
Table IV particles / ml
EMI5.3
<tb>
<tb> Number <SEP> of <SEP> one after the other- <SEP> without <SEP> superoxide- <SEP> with <SEP> superoxide- <SEP> mortality <SEP> mortality
<tb> following <SEP> enzymati- <SEP> dismutase <SEP> dismutase <SEP> in <SEP>% <SEP> in <SEP>%
<tb> between <SEP> processes <SEP> (comparison) <SEP> (200 <SEP> units) <SEP> (comparison) <SEP> (with <SEP> superoxide dismutase)
<tb> 0 <SEP> 5, <SEP> 0.108 <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 108 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 3.5. <SEP> 108 <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 108 <SEP> 30 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 2.0.108 <SEP> 3.0.108 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Example9:
The protective effect of the superoxide dismutases against oxidase of the pancreatic ribonucléase is tested by means of an oxidation using a photoreduction of FMN in order to
EMI5.4
molar phosphate buffer of PH 7, the final volume being 0.8 ml. The pancreatic ribonuclease protein is thus subjected to several photoreduction cycles in the absence and in the presence of 67.5 units / ml superoxide dismutase from Pleurotus olearius Gillet or in the presence of the same, denatured and inactive dismutase at pH 3.
The activity of the ribonuclease enzyme is determined by means of a spectrophotometer by following the increase in optical density at 280 nm of a ribonucleic acid solution as described above. The results obtained can be found in the table below:
<Desc / Clms Page number 6>
Table V% residual activity
EMI6.1
<tb>
<tb> Number of <SEP> of <SEP> comparison <SEP> comparison <SEP> with <SEP> with <SEP> superoxide dismutase
<tb> Cycles <SEP> (without <SEP> dismutase) <SEP> pH <SEP> 3 <SEP> inactivated <SEP> 67.5 <SEP> units / ml
<tb> Superoxide dismutase <SEP> (0, <SEP> 05 <SEP> mg) <SEP>
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 3 <SEP> 67 <SEP> 56 <SEP> 89
<tb> 6 <SEP> 45 <SEP> 45 <SEP> 89
<tb> 9 <SEP> 22 <SEP> 22 <SEP> 67
<tb>
EMI6.2
EMI6.3
<tb>
<tb> weeks <SEP> a) <SEP> sodium tetra comparisons <SEP> (sodium tetrathionate)
<tb> thionate
<tb> + <SEP> enzyme <SEP> first <SEP> second <SEP> third
<tb> 1 <SEP> + <SEP> +
<tb> 2 <SEP> + <SEP> +
<tb> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
Table VI (continued)
EMI7.1
<tb>
<tb> weeks <SEP> a) <SEP> sodium tetra- <SEP> compare <SEP> (sodium tetrathionate)
<tb> thionate
<tb> + <SEP> enzyme <SEP> first <SEP> second <SEP> third
<tb> 4 <SEP> + <SEP> + -
<tb> 5 <SEP> + <SEP> + -
<tb> 6 <SEP> + <SEP> + <SEP> + -
<tb> 7 <SEP> + ---
<tb>. <SEP> 9 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 11 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb> 13 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0
<tb> mediocre
<tb>
Satisfactory result: pure salmonella culture - = bad result: culture E.
Coli
0 = bad result: no culture at all a) = enzyme and substrate were added each time
It is immediately apparent from this table that the contents of the tubes in which superoxide dismutase enzymes are introduced have retained all of their properties. As far as the comparison tube itself is concerned, it was only satisfactory during the first three attempts, which corresponds to the validity period previously regarded as normal for the commercial quanta of milieus with sodium tetrathionate. On the basis of the following tests it was found that the results for the comparison tubes are very irregular, which rules out the product as being marketable. It is thus found that this addition of 2 ml of a solution of superoxide dismutase enzyme from the Photobacterium leiognathi strain No.
ATCC 25 521 per tube of 20 ml of sodium tetrathionate prolongs the resistance of the latter to oxidation by at least 10 weeks and even more.
Example 11: Preservation of potatoes
A. 250 g of peeled potatoes are boiled in water at 1000C for 30 minutes. 60 ml of water are added and passed through a mixer until a homogeneous mass is obtained. Three subsets of
50 g are placed in beakers and 20 ml of water is added to each beaker and mixed well with the pulp.
Cup P 1 comparison
P 2,500 units of superoxide dismutase (10 units / g (P. leiognathi) are added and mixed.
P 3 comparison plus 0.5 ml of 2.0% ascorbic acid (final concentration 0.02% ascorbic acid).
P 4 like P 3, but 500 units of superoxide dismutase are also added.
All swatches are then freeze dried (lyophilized) and left at ambient temperature.
B. Potato flakes are used which contain 25 mg / kg BHT (di-tert-butyl-paracresol) and BHA (butyl-hydroxyanisole) and glycerol monostearate (1%).
45 g of these flakes are added to 250 ml of boiling water, left for 2 minutes and stirred with a
Glass rod. Two portions of 50 g of this mashed potatoes are taken up and mixed with 50 ml of water.
M1 comparison
M2 500 units of superoxide dismutase (10 units / g slurry) are added and mixed thoroughly.
The two samples are then dried by freezing and the powder is left at ambient temperature.
After two months, the odor of samples A) and B) of six people is compared. When opposing
<Desc / Clms Page number 8>
In the case of superoxide dismutase, the odor is different from that of the reference samples, and between less sour and more pleasant.
Example 12: Preservation of Carrots
Exactly the same procedure is used as described above for potatoes, but for carrots boiled with water and with the same amount of superoxide dismutase / g. After two months, the smell of the samples is compared by six people. In the presence of superoxide dismutase, the odor is different from that of the comparison samples, it is less acidic and more pleasant.
The superoxide dismutase from Photobacterium leiognathi of the strain No. ATCC 25,521 used in accordance with some of the above examples was prepared in the following manner in accordance with the above-mentioned suggestion of the same age by the patentee.
Bacteria of Photobacterium leiognathi of the strain No. ATCC 25 521 were grown on an artificial culture medium containing in g / l:
EMI8.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 30
<tb> Na2HP0, <SEP> 12 <SEP> HO <SEP> 18.7
<tb> KR <SEP> 2 <SEP> P04 <SEP> 2
<tb> MgS04'7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> (NH4) 2HPO4 <SEP> 0.5
<tb> glucose <SEP> 1.5
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> Trypticase <SEP> 5
<tb> yeast extract <SEP> 5
<tb>
EMI8.2
EMI8.3
<tb>
<tb> via <SEP> night luminol <SEP> 10-3Mol <SEP> 0, <SEP> 3mi
<tb> Phosphate buffer <SEP> 10-6 <SEP> Mol <SEP> PH <SEP> 7.8 <SEP> 0.3 <SEP> ml
<tb> EDTA <SEP> 10-3 <SEP> Mol <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> ml <SEP>
<tb> water <SEP> l, <SEP> 0 <SEP> mil <SEP>
<tb> Xanthine oxidase <SEP> (1 <SEP> mg / ml) <SEP> 0, <SEP> 050 <SEP> ml <SEP>
<tb>
The reaction is initiated by adding 1 ml of 3 x 10-4 hypoxanthine to the cuvette.
A flow of photons is then emitted which, under the action of the photomultiplier, creates a current, the intensity and fluctuations of which are measured and recorded on the pico-ammeter.
If 5 jul of a superoxide dismutase solution prepared in the above manner is introduced into the reaction mixture before the initiation of the reaction, there is an impairment of light emission and it is arbitrarily assumed that one unit of superoxide dismutase enzyme would be the amount of enzyme which would prevent 50% % of the light emission. In UV spectroscopy, the extracted superoxide dismutase provides the well-known spectrum of non-hematinic proteins with a trypto-
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phan shoulder at 290 mu.
Two known methods are used to determine their molecular weight: one consists in determining a centrifugation gradient in sucrose, and in the other a Sephadex gel G 200 is used. To do this, the following markers of known molecular weights are used:
EMI9.1
<tb>
<tb> yeast-ADH <SEP> molecular weight
<tb> bovine albumin <SEP> 150000
<tb> Peroxidase <SEP> 66000
<tb>
A molecular weight of 40,000 to 2,500 is concluded.
In order to determine the building blocks of the protein structure of the enzyme, electrophoresis is carried out in polyacrylamide gel, mixed with SDS (sodium dedecyl sulfate) of 10%. A single type of building block with a molecular weight of about 21,000 is observed. The molecular weight of the superoxide dismutase obtained can thus be 21,000 × 2, i.e. H. 42,000, are estimated. A red band is also obtained on the polyacrylamide gel in the presence of bathophenantroline and hydrazine exactly at the level of the superoxide dismutase band developed by Coomassie blue.
A colorimetric analysis of a protein solution gives a value for iron which, if the molecular weight of the enzyme is estimated to be 42,000, gives about 2 atoms of iron per molecule. Atomic absorption spectrometry of a protein solution of 0.2 mg / ml confirms this value. The number of iron atoms per mole of superoxide dismutase can therefore be estimated to be a proportion of 2. On the other hand, the enzyme extracted according to this example has shown that there is no noticeable loss of activity after 5 minutes at a temperature of 70.degree. Electrofocalization of superoxide dismutase allows the pHi value or isoelectric point of this enzyme to be assessed as 4.4.
The enzyme has a maximum activity at pH et-
EMI9.2
An identical enzyme with similar properties is obtained from a bacterium strain of Photobacterium leiognathi No. ATCC 25 587.
PATENT CLAIMS:
1. A method for preventing the autoxidation from degradation by oxidation under the influence of superoxide ions exposed substances, characterized in that with the substances, for example foods, in particular lipidic, proteinaceous or lipoproteinic foods, bacteria or viruses, or culture media used for the growth of cells , 1 to 200 units of at least one superoxide dismutase per g or ml of substance combined.