AT356823B - Diagnoseverfahren zum nachweis von colien- terotoxin - Google Patents

Description

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 Erreger einer akuten Enteritis bei neugeborenen Schweinen, Schafen und Kälbern, die jedoch nicht mit denen der Humanmedizin identisch sind. 



   Untersuchungen zur Pathogenese der Coli-Enteritis führten zu zwei unterschiedlichen Prinzipien :
1. Die Erreger dringen in die Schleimhaut des   Dünn- und   Dickdarms ein und verursachen ein ruhrähnliches Krankheitsbild. 



   2. Die Keime bleiben im Darmlumen und führen über ein Enterotoxin zu einer choleraähnlichen Erkrankung. 



   Stämme des invasiven Typus führen meist zu Fieber, Darmkrämpfen und wässerigen Durchfällen, in schweren Fällen gefolgt von ruhrähnlichen Symptomen mit Tenesmus sowie Schleim- und Blutauflagerung des Stuhls. Coli-Stämme der 0-Gruppen 028,0112, 0115, 0124, 0136,0143, 0144, 0147 und 0152 sind als Erreger derartiger Fälle identifiziert worden. 



   Das andere pathogenetische Prinzip, die Enterotoxinbildung, wurde zunächst von der Veterinärmedizin erkannt. Untersuchungen in tropischen Ländern führten sodann zum Nachweis toxinogener   E.   Coli-Stämme als Ursachen einer akuten bis choleriformen Erkrankung beim Menschen, die in der Literatur als "Cholera ohne Vibrionen", "akuter unspezifischer tropischer Durchfall" bzw. 



    "Touristendurchfall"beschrieben   worden ist. Es wird hiebei sowohl ein thermostabiles als auch ein thermolabiles Toxin gebildet. Dabei wird in erster Linie dem thermolabilen Toxin pathogenetische Bedeutung zugesprochen. Die Toxinbildung ist an einen genetischen "Transfer-Faktor", ein Plasmid, gebunden und kann wie die Antibiotikaresistenz auf nicht toxinogene Stämme übertragen werden. Verschiedene toxinbildende Serotypen von   E.   coli bilden ein immunologisch einheitliches Toxin. 



   Die Ähnlichkeit des klinischen Bildes der akuten toxinbedingten Coli-Enteritis mit der Cholera sowie eine ähnliche Reaktion im Tierversuch liessen ein gleiches pathogenetisches Prinzip bei beiden Enterotoxinen vermuten. Untersuchungen an Menschen ebenso wie an der abgebundenen Darmschlinge von Kaninchen und Schwein zeigten in der Tat das gleiche anatomische Bild und die gleiche chemische Zusammensetzung der ausgeschiedenen Flüssigkeit. Im Gegensatz zur Cholera scheint aber die Glucoseresorption bei der toxinbedingten Coli-Enteritis beeinträchtigt zu sein. Colienterotoxin bewirkt weiterhin, ebenso wie das Choleratoxin, eine Stimulierung der AdenylatcyclaseAktivität in der Mucosa. Schliesslich gibt es auch Anhaltspunkte für eine serologische Verwandtschaft beider Toxine. 



   Im Gegensatz zur Cholera bereitet der Nachweis von Colienterotoxin im Tierversuch Schwierigkeiten und führte in der Vergangenheit zu widersprüchlichen Ergebnissen. Untersuchungen zu dieser Frage zeigten, dass neugeborene Tiere empfindlicher reagieren als ältere bzw. erwachsene. Hiebei ergaben sich interessante Parallelen zur menschlichen Enteritis : E. coli-Stämme von choleriformen Erkrankungen beim Erwachsenen führten zu positiven Reaktionen bei neugeborenen und erwachsenen Kaninchen, toxinogene Stämme von leichteren Fällen von Säuglingsenteritis verursachten dagegen nur beim neugeborenen Kaninchen eine vermehrte Flüssigkeitsausscheidung und erwiesen sich als nicht pathogen für erwachsene Tiere. 



   Auch in der Diagnostik der Säuglingsenteritis erwies sich die Unzulänglichkeit serologischer Methoden zur Identifizierung toxinbildender Stämme. Der Tierversuch als derzeit meist verwendete Methode zum Nachweis der Toxinbildung bei E. coli ist für Routineuntersuchungen zu aufwendig. 



   Zur eindeutigen Diagnose der durch E. coli bedingten Gastroenteritis bzw. zum Nachweis des Colienterotoxins wurde ein Diagnoseverfahren wie nachstehend beschrieben entwickelt. Da die partielle serologische Identität zwischen dem hitzelabilen Colienterotoxin und dem Choleratoxin als erwiesen gilt, kann mit der beschriebenen Technik auch das Choleratoxin qualitativ und quantitativ bestimmt werden. 



   Voraussetzung dafür ist das Vorliegen von hochreinem Colienterotoxin sowie des entsprechen- 

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 den monospezifischen Antiserums. 



   Reines Colienterotoxin wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. 



   Colienterotoxin wird durch Kultivierung (Submerskultur) von E. coli als Bestandteil des Zellfiltrates erhalten. Beispielsweise kultiviert man einen E. coli Stamm bei vorzugsweise 37 C und erntet die Zellen   z. B.   durch Zentrifugation unter Kühlung   z. B.   bei   4 C.   Das so erhaltene Zellfiltrat wird anschliessend sterilfiltriert. 



   Zur Reinigung des durch Kultivierung von   E.   coli erhaltenen Zellfiltrates kann   z. B.   Gelfiltration und/oder Isotachophorese angewendet werden. Besonders gute Ergebnisse wurden mit einer Kombination der beiden Methoden erzielt. Eine weitere Reinigungsmethode besteht in der Affinitätschromatographie. Diese Reinigungsmethoden sind bekannt. 



   Die Reinigung mittels Affinitätschromatographie kann vorzugsweise ausgeführt werden, indem man bei der Herstellung des Affinitätsharzes Ganglioside oder amphipathische Substanzen verwendet. Beispielsweise knüpft man ein Copolymeres wie Poly-L-Lysyl-DL-Alanin an cyanbromidaktivierte Agarose (P. Cuatrecasas   : J. Biol. Chem. 245/3059 [1970]   und V. Sica et al. : Nature [London], New Biology 244/36   [1973]).   Zur Kupplung können amphipathische Substanzen   z. B.   Phospholipide oder Glykolipide mit freier Carboxylgruppe verwendet werden, im Falle der Ganglioside werden die Carboxylgruppen der terminalen Sialinsäure an die Aminogruppen der oben beschriebenen Agarosederivate unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimidreagenzes   z.

   B. l-Äthyl-3- (3-dimethyl-   aminopropyl)-carbodiimid oder mittels Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt. Zur Kupplung können die Ganglioside vorteilhafterweise in Form ihrer N-Hydroxysuccinimidester oder ihrer aktivierten gemischten Anhydride eingesetzt werden. Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch   z.   B. in einem cyclischen Äther wie Dioxan oder in einem Wasser/Dioxan-Gemisch durchgeführt werden. 



   An Stelle der oben beschriebenen Agarosederivate können auch Fettsäure-Aminoalkyl-AgaroseKomplexe verwendet werden. Als Alkyldiamine können z. B. Hexandiamin, Decandiamin oder Äthylendiamin, als Fettsäure z. B. Palmitinsäure eingesetzt werden. Die Herstellung kann nach der Methode von Cuatrecasas und Anfinsen (Methods in Enymol. 22/345 [1971]) durchgeführt werden. 



   Ein auf diese Weise hergestelltes Affinitätsharz wird bei der Affinitätschromatographie   z. B.   in einer Affinitätssäule eingesetzt. Der gefriergetrocknete Kulturmedienüberstand bzw. das Zellfil- 
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 Colienterotoxins kann nach bekannten Methoden erfolgen   (z.   B. K. Weber et al.   : J. Biol. Chem. 246/4504   [1971]). Die Reinheit des so gereinigten Colienterotoxins beträgt mindestens 99 Gew.-%. 



   Zum Nachweis von Colienterotoxin setzt man die Methode der "Rocket Immunelektrophorese" (Laurell-Elektrophorese) entsprechend der von Laurell beschriebenen Methode ein. 



   Die Methode der "Rocket Immunelektrophorese" kann zur qualitativen Identifizierung sowie zur quantitativen Erfassung des Colienterotoxins pathogener E. coli-Stämme unterschiedlichen Serotyps und verschiedener Wirtsadaptierung angewendet werden. Für die Durchführung der quantita- 
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 derungsgeschwindigkeit nativer Antikörper bei PH = 8, 6 praktisch null, da der Tendenz der anodischen Wanderung bei diesem PH-Wert der elektroendosmotische Fluss, der der Kathode zugerichtet   ist.,   weitgehend entgegenwirkt. Bei Agarosegel-Elektrophorese muss der PH erniedrigt werden, damit das Colienterotoxin im elektrischen Feld wandert (Abb.   IA   und B).

   P-263 Antikörper bzw. eine Immunoglobulinpräparation aus einer Anti-P-263 Toxinpräparation, die in einem Agarosegel elektrophoretisch bei jedem beliebigen PH-Wert zwischen PH = 8, 6 und 4, 5 nicht wandern, können durch eine Modifizierung mittels Carbamylierung hergestellt werden. Die Identifizierung kann leicht vorgenommen werden, da durch das Vorlegen eines monospezifischen Antiserums nur ein einziges Präzipitat auftritt. Die Quantifizierung des Colienterotoxins in unbekannten Probelösungen beruht auf dem Vergleich der Höhe dieser Präzipitate mit denen einer Standardlösung.

   Beispielsweise kann, wie bereits von Laurell vorgeschlagen, so vorgegangen werden, dass man die Testplatte mit den Präzipitaten unter ein Millimeterpapier schiebt, das die Eichkurve in natürlicher Grösse wiedergibt 

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 (Abszisse : die Colienterotoxinkonzentration, Ordinate : Höhe der Präzipitationsspitze). Die Platte wird mit den Stanzlöchern entlang der Abszisse geführt, bis die entsprechende Präzipitationsspitze die Eichkurve tangential berührt und der dazugehörige Abszissenwert abgelesen werden kann (Abb.   IB.   c und d). 



   Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken. 



   Beispiele :
1. Herstellung des Colienterotoxins :
Als Medium kann ein"trypticase soy broth"-Medium verwendet werden. Das Pepton-WasserMedium enthält pro Liter 17 g Trypticasepepton, 3 g Phytonpepton, 5 g NaCl,   2, 5   g Dextrose und 
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 che wie oben beschrieben ist, wobei jedoch das Pepton vor seiner Verwendung einer Ultrafiltration durch Diaflo   PM-10   Membranen (Amicon) unterworfen wird. Eine 30% ige (Gew./Vol.) Lösung eines "trypticase soy broth"-Mediums wird ultrafiltriert, der Rückstand verworfen und das Filtrat weiterverwendet. Es ist vorteilhaft, diese relativ kleinen Peptonmoleküle an Stelle des rohen Produkts zu verwenden, da dadurch die spätere Abtrennung des Anteiles unveränderten Mediums von den bakteriellen Produkten in den Rohkulturen von   E.   coli erleichtert wird. 



   Der gefriergetrocknete E. coli Stamm 263, Serotype   08 : K87, K88ab : H19   wird in Wasser aufgenommen, auf Blutagarplatten ausgestrichen und 12 h bei   370C   kultiviert. Dann werden mit einer Platinschleife Zellen aus der Oberfläche in einen 1   l   Erlenmeyerkolben übertragen, der 200 ml des oben beschriebenen   modifizierten"trypticase   soy broth"-Mediums enthält und der sich auf einem rotierenden Schüttelapparat befindet. Die Bakterien werden 4 h bei   37 C   kultiviert. Dann wird damit eine 2 1 Kultur beimpft, die ihrerseits nach Erreichen der Mitte der logarithmischen Phase als Impfflüssigkeit für einen 20   l   Fermenter, in dem das Medium mit 500 Umdr/min gerührt und mit 10 l/min Luft belüftet wird, verwendet wird.

   Um ein Schäumen der Lösung zu verhindern, wird 1 ml eines   2,5%gen   Antischaummittels (Gew. /Vol.) zugesetzt. Es wird 9 h bei   37 C   inkubiert. Dann werden die Zellen durch Zentrifugation in einer gekühlten Ultrazentrifuge bei   4 C   geerntet. Die überstehende Flüssigkeit wird durch ein Membranfilter von 0, 45 p Porenweite filtriert und das Filtrat auf Sterilität geprüft (durch Bestreichen einer Blutagarplatte). Das sterile Filtrat wird durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt, lyophilisiert und   bei -20 bis -70oC   für die weitere Verwendung gelagert. 



   Analog wie oben beschrieben können auch andere   E.   coli Stämme verwendet werden, wie   z. B.   die schweinepathogenen E. coli Stämme P155, Serotype 0149 : K91 : 88a, c und P307, Serotype 
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Das wie unter Punkt 1 beschrieben erhaltene Lyophilisat wird in 0, 1 M   NH, HCO,-Puffer   p   = 7, 9   aufgenommen und der chromatographischen Auftrennung mit einer Bio Gel A-5m-Säule (Trennbereich 5000000 bis 80000) zugeführt. 



   Bei Verwendung dieser Säule (2, 5 x 100 cm) mit einem Gesamtschichtvolumen von 500 ml, dem überschlägigen Leervolumen von 190 ml, eluiert ein Substanzpeak bei etwa 220 ml, was einem 
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   Eo Ein weiterer Substanzpeak mit einer deutlich abgesetzten Vorschulter eluiert bei 420 bis 480 ml, was bei Anwendung derselben Kalkulation einem theoretischen Molekulargewichtsbereich von rund 9   x     104 bis 1,2   x 105 Dalton entspricht. Die hitzelabile Aktivität kann eindeutig der Vorschulter dieses Peaks zugeordnet werden. 



   Das so erhaltene lyophilisierte aktive Produkt wird in 0, 1 M   NHHCOs-Puffer p,.   = 7, 9 aufgenommen und der Gelfiltration in einer Sephadex G-75-Säule (Trennbereich 70000 bis 3000) zugeführt. Das im Leervolumen eluierte Material ist deutlich von Begleitproteinen abgesetzt und zeigt biologische Aktivität. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. 

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   3. Reinigung des Colienterotoxins durch Isotachophorese :
Das Zellfiltrat oder die nach der Gelfiltration erhaltene vorgereinigte Colienterotoxinpräparation wird der präparativen Isotachophorese unterworfen. Für die isotachophoretische Trennung wird eine senkrechte Säulenelektrophoreseapparatur mit 3, 3% Polyacrylamidgel als Trägermaterial   z. B.   nach P. J. Svendsen und   Carsten   Rose (Science Tools, Vol. 17, No. l, 1970, Seite 13) verwendet. 



  Es wird nur eine gepufferte Gelsäule verwendet und die"Ampholine carrier Ampholyte" werden mit der Proteinprobe sowie dem Terminatorelektrolyten (Tris E-aminocaproat-Puffer, PH = 8, 9) gemischt. Über das Gel wird der Terminatorelektrolyt geschichtet, der das System mit der oberen Elektrode (der Kathode) verbindet. In der Eluierungskammer im unteren Elektrodenteil (Anode) wird Tris-sulfat-Puffer (PH = 7, 1) als Eluierungselektrolyt verwendet. Die Pufferlösung ist an ein äusseres Reservoir angeschlossen und wird durch eine elektrische, isolierte Pumpe in Zirkulation 
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 durchstösst. Um das Einbringen der Probe zu erleichtern, werden zur Erhöhung der Viskosität 3% Sucrose zugesetzt. 



   Das Gel wird von einer Vorratslösung nach der Methode von B. J. Davies (Ann. N. Y. Acad. Sci. 



  121/404 [1964]) unter Verwendung von Tris-phosphat, PH =   8, 1 als   Gelpuffer hergestellt, das nur durch Photopolymerisation polymerisiert wird. Das aktive Material eluiert im"Ampholine carrier Ampholyte" System PH = 6 bis 8 knapp vor, bzw. mit dem Terminatorelektrolyten. 



   Das Eluat wird über einen UV-Absorptiometer zu einem Fraktionssammler geleitet, wodurch ein erster Wert für den Trenneffekt erhalten wird. Die endgültige Bestimmung der Fraktionierung wird mit Hilfe des in vitro Tests für Colienterotoxin (Adenylatcyclase-Test) durchgeführt. 



   4. Reinigung des Colienterotoxins durch   Affinitätschromatographie :  
Die Säule (10 ml Gel in einer Glassäule [l x 20 cm]) wird bei Zimmertemperatur 2 Tage mit 50% (V/V) Methanol, gefolgt von 6 M Guanidin. HCl (200 ml, 6 h) und einem Krebs-Ringer-BicarbonatPuffer PH =7, 4 (100 ml, 3 h), gewaschen. 50 g lyophilisierter Kulturmedienüberstand wird in 150 ml Krebs-Ringer-Biocarbonat-Puffer PH = 7, 4 aufgenommen und erschöpfend bei   40C   dagegen dialysiert. Die Probe wird hierauf aufgetragen und die Säule wird mit einer Fliessgeschwindigkeit 
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 sondert nachstehender Behandlung zur Entfernung von SDS und Renaturierung aus einer Harnstofflösung unterworfen   (K. Weber, D. J. Kuter : J. Biol.

   Chem. 246/4504 [1971]) :  
Die Proteinlösung wird durch Zugabe von festem Harnstoff auf 6 molaren Harnstoffgehalt gebracht und 30 min inkubiert, hierauf wird gegen Pufferlösung A (0, 05 m Tris-acetat PH   = 7, 8   6 M in Harnstoff) dialysiert. Das SDS wird auf einer Säule aus Dowex 1 x 2, äquilibriert mit Puffer A, entfernt. Die Entwicklung der Säule erfolgt mit derselben Pufferlösung. Die Rekonstitution des Proteins aus der Harnstofflösung erfolgt bei Zimmertemperatur durch tropfenweise Verdünnung 
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 Die Lösung wird hierauf bei   40C   über Diaflo UM 10 Filter in einer Amicon-Zelle konzentriert und gegen den 0,05 M Tris-acetat-Puffer PH = 7,8 bei   4 C   dialysiert, um Reste von Harnstoff zu entfernen. 



  Das in der Säule benötigte Gel kann folgendermassen erhalten werden : A) Kupplung mit Carbodiimid : Das Agarosederivat (25 ml) wird mit Wasser gewaschen und hierauf in 50 ml einer 50% (V/V) 
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 wird nochmals 100 mg des Carbodiimids hinzugefügt. Nach 12 h weiterem Schütteln wird das Gel mit 500 ml Wasser, 500 ml 75% (V/V) wässerigem Methanol, 250 ml 6 M Guanidinhydrochlorid und 500 ml Wasser gewaschen. Der Gehalt an Gangliosid, bestimmt aus der Differenz des wiedergewonnenen, nicht umgesetzten Gangliosids, ist ungefähr   0, 5 mg/ml   Gel. 

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 einfacher durchzuführen, wenn reine Immunoglobuline verwendet werden. Speziell Lipoproteine geben eine starke Untergrundfärbung.

   Auch für die im Anschluss noch zu besprechende Carbamylierung erweist sich die Verwendung von reinen Immunoglobulinen als notwendig. 



   Die Isolierung von   IgG   + IgA aus dem Kaninchenserum wird folgendermassen durchgeführt :
Zu 100 ml Antiserum werden 25 g   (NH) SO   hinzugefügt und die Mischung wird 20 h bei Zimmertemperatur belassen. 98% der Antikörperaktivität werden durch Zentrifugieren bei 4000 x g, 
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 hierauf gegen destilliertes Wasser dialysiert. Ausgefallenes Lipoprotein wird durch Zentrifugation entfernt und der Überstand auf eine DEAE-Sephadex A 50 Säule, äquilibriert mit Acetatpuffer    PH     = 5, 0, aufgebracht.   Die Säule wird mit Acetatpuffer eluiert. Durch diese Methode werden die Kaninchen   IgG   und IgA quantitativ zurückgewonnen, während IgM verloren wird. 



   7. Die Carbamylierung
Die Mischung für die Carbamylierung ist wie folgt : 
71 mg Protein
0, 1 mM Natriumchlorid
2, 0 mM Kaliumcyanat
0, 1 mM Natriumborat
0, 4 mM HCl in einem Gesamtvolumen von 10 ml. Die Reaktion erfolgt bei 45OC, 220 min, auf einem PH-Stat in einem thermostatierten Reaktionsgefäss. 
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  Die Reaktion wird durch Gelfiltration abgestoppt und entsalzt. 



   8. Rocket Immunelektrophorese (nach Laurell). 



   Auf 10 x 10 cm Glasplatten wird 1% (w/v) Agarose in der entsprechenden Pufferlösung aufgebracht. Die Platten enthalten 0, 5% Antiserum oder   Immunoglobulinpräparation   (bzw. die carbamylierte Präparation). Es wird 1 h bei   4 C   vorinkubiert und hierauf entweder 18 h bei 2 1/2 V/cm oder 3 h bei 10 V/cm die Elektrophorese durchgeführt. Die Agaroseplatten werden wie bei Laurell beschrieben gepresst, 1/2 h in   0, 9% NaCI-Lösung   und die gleiche Zeit in destilliertes Wasser eingelegt, nochmals gepresst, getrocknet und abschliessend mit Coomassie Brillant Blau gefärbt. 



   Für die Versuche können die beiden E. coli-Stämme P263 und P307, die für die Verursachung der Coli-Bacillosis bei Saug- und Absatzferkel bedeutungsvoll sind, sowie der humanpathogene Keim H10407 verwendet werden. Als Kontrolle dient der nichtpathogene Keim   H10405.   Es werden auch Lyophilisate eines sterilen Filtrates einer 18 h-Kultur in Trypticase-Soy-Broth verwendet. 



   Die Eichkurve wird aus den Höhen der Präzipitationsspitze von 3 bekannten Verdünnungen der Standardlösung ermittelt (Fig. 1 B, a, b, e). 



   A Rocket Immunoelektrophorese
Antigen : 5 pl Colienterotoxin P263
Stanzloch   a, b, c : 0, 2 pg/5 pI, 0, 3   pg/5 pl,   0, 5 pg/5 pi     Antikörper : 0, 5%   monospezifisches Kaninchen Anti P263 Toxin
Elektrophorese : Barbital Puffer PH =   8, 6, Ionenstärke   =   0, 02 ;   mit 10   V/cm ; 15OC,   3 h
Anfärbung : Coomassie Brillant Blue R
Kathode unten 

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 B Antigen : 5   pl/Stanzloch  
Stanzloch a : Standardlösung (reines Colienterotoxin P263)   0, 2 pg/5 pl    b : Standardlösung 0, 6 pg/5 pl e : Standardlösung 0, 8 pg/5 pl c : Toxinlösung P307 d :

   Toxinlösung H10407
Antikörper : 0,5% carbamylierte Immunoglobulinfraktion vom
Kaninchen Anti P263 Toxin. 
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Claims (1)

1. Elektrophorese : PHTetramethyl-l, 2-diaminoäthan und 0,029 M Essig- säure auf 1 l) Kathode oben PATENTASPRUCH : Diagnoseverfahren zum Nachweis von Colienterotoxin in einer Probe mit Hilfe der Methode der Rocket Immunelektrophorese, dadurch gekennzeichnet, dass man durch Immunisierung mit reinem Colienterotoxin hergestelltes monospezifisches Antiserum verwendet. **WARNUNG** Ende CLMS Feld Kannt Anfang DESC uberlappen**.