<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fruktose und fruktosereichen Sirupen, wobei die Fruktose aus Sacchariden mit Hilfe eines Fruktosepolymeren enthaltenden Substrats gewonnen wird. Es handelt sich dabei um einen neuartigen enzymatischen Weg für die Herstellung von Sirupen mit hohem Fruktosegehalt, der wesentlich höher als derzeit durch Glukoseisomerisierung von Stärkehydrolysaten erhältlich ist, wobei die Notwendigkeit entfällt, das erhaltene Fruktose-Endprodukt physikalisch abzutrennen. Dieses Verfahren ist besonders für die Herstellung von Fruktosesirupen mit über 55% Fruktose anwendbar.
Das erfindungsgemässe Verfahren ergibt eine Reihe von Produkten. Diese umfassen Fruktose oder einen Sirup mit hohem Fruktosegehalt, sowie verschiedene Zwischenprodukte wie das Fruktosepolymere, das das eingesetzte Fruktosepolymere (oder Polysaccharid) enthaltende Substrat, das Substrat, aus welchem das Polymere entfernt wurde, und das Substrat (mit oder ohne das Polymere) nach der Isomerisierung. Jedes dieser Produkte ist in seiner Weise direkt nützlich. Jedes dieser Produkte hat die Eigenschaften üblicher Zucker und Sirupe und kann in dieser Weise verwendet werden. Beispiele für diese Verwendung sind Süssungsmittel für Nahrungsmittel und Rohmaterialien für die Herstellung von Pharmazeutika.
Ausserdem können diese Produkte in üblicher Weise industriell wie Zucker und Sirupe verarbei-
EMI1.1
Weichmacher, Verdickungsmittel usw. verwendet werden.
Zusammengefasst lässt sich also sagen, dass sie im gesamten breiten Spektrum von Verwen- dungen nützlich sind, wo analoge Produkte bereits eingesetzt wurden.
Im folgenden werden einige der hier gebrauchten Bezeichnungen definiert :
Glukose und Dextrose
Diese beiden Namen werden nebeneinander zur Bezeichnung dieses Monosaccharids in jeder
Form in Lösung oder als Trockensubstanz verwendet.
Saccharose
Dieses Disaccharid wird gereinigt oder roh in Lösung oder als Trockensubstanz eingesetzt und kann aus jeder Saccharosequelle, z. B. Zuckerrohr oder Zuckerrüben, gewonnen werden. Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Saccharoseausgangsmaterial typischer- weise in wässerigen Medien eingesetzt.
Fruktose und Laevulose
Auch diese beiden Namen werden gleichzeitig für das Dextroisomere, welches süsser als Dextrose ist, verwendet. Fruktose ist im Honig und in Invertzucker zusammen mit Dextrose zu finden und ist wegen seiner Süsskraft wertvoll. Die Ausdrücke Laevulose und Fruktose werden hier nebeneinander zur Beschreibung des Monosaccharids in jeder Form in Lösung oder als Trockensubstanz verwendet.
Enzympräparat
Dieser Ausdruck wird hier verwendet, um eine beliebige Substanz zu bezeichnen, welche die gewünschte enzymatische Aktivität besitzt. Es kann sich z. B. um lebende ganze Zellen, trockene Zellen, Zellextrakte, gereinigte und konzentrierte Präparate aus Zellen und aus Kulturflüssigkeiten handeln. Die Enzympräparate können erfindungsgemäss als Lösung oder in immobilisierter Form eingesetzt werden.
Isomeraseenzym
Jedes Enzympräparat, das Dextrose zu Laevulose isomerisiert, wird hier als Isomeraseenzym bezeichnet. Diese Enzyme sind dem Fachmann gut bekannt und werden als Dextroseisomerase, Xyloseisomerase und Glukoseisomerase bezeichnet. Diese Enzyme können aus einer Vielzahl geeigneter Mikroorganismen erhalten werden. Beispiele für solche Mikroorganismen umfassen jene der Arten Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium usw.
Das bevorzugte Isomeraseenzym für die Erfindung wird aus Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21713, ATCC Nr. 21714 oder ATCC Nr. 21715 (letzteres ist eine einzelne Kolonie von ATCC Nr. 21713) erhalten, wie in den US-PS Nr. 3, 813, 318 und Nr. 3, 957, 587 beschrieben, insbesondere nach dem Verfahren der US-PS Nr. 3, 770, 589 und Nr. 3, 813, 318.
In jüngerer Zeit wurden Verfahren entwickelt, bei welchen das Isomeraseenzym auf einem
<Desc/Clms Page number 2>
wasserunlöslichen inerten Träger immobilisiert wird. Das immobilisierte Enzym kann dann bei der kontinuierlichen Überführung von Glukose in einen Sirup mit hohem Fruktosegehalt verwendet werden. Beispiele für solche Verfahren sind in den US-PS Nr. 3, 708, 397, Nr. 3, 788, 945, Nr. 3, 850, 751, Nr. 3, 868, 304, Nr. 3,960, 663 und der BE-PS Nr. 819859 beschrieben.
Isomeraseeinheit
Isomeraseeinheit ist definiert als jene Enzymaktivität, die erforderlich ist, um 1 pMol Laevulose/min unter den später beschriebenen Isomerisierungsbedingungen (Bestimmung der Isomeraseaktivität) zu erhalten.
Bestimmung der Isomeraseaktivität
Hiefür wird eine Bestimmungsmethode verwendet, bei welcher spektrophotometrisch unter Standardbedingungen die Menge an aus einer Glukoselösung hergestellter Ketose bestimmt wird.
Eine Ausgangslösung wird in folgender Weise bereitet :
0, 1 M MgSO. 7H20 1 ml
0, 001 M COCI,. 6H2O 1 ml
1 M Natriumphosphatpuffer, PH 7, 5 0, 5 ml wasserfreie D-Glukose 1,44 g destilliertes Wasser auf ein Gesamtvol. von 7,5 ml
Das zur Untersuchung vorgesehene Enzympräparat wird zuerst auf 1 bis 6 Isomeraseeinheiten/ml verdünnt.
Eine enzymatische Isomerisierung wird eingeleitet, indem 1 ml des Enzympräparats zu 3 ml der Ausgangslösung gefügt wird und die Mischung 30 min lang bei 60 C inkubiert wird. Am Ende der Inkubationszeit wird ein Aliquot von 1 ml entnommen und in 9 ml 0, 5 N Perchlorsäure eingegossen. Dann wird auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Für Vergleichszwecke wird in einer Kontrollprobe Glukose eingesetzt, jedoch an Stelle des Enzympräparats am Beginn der Inkubationszeit 1 ml Wasser zugesetzt.
Die Ketose wird dann nach der Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Für die Zwecke dieser Prüfung wird eine Isomeraseeinheit definiert als die Menge Enzymaktivität, die zur Herstellung von 1 j1Mol Laevulose/min unter den beschriebenen Bedingungen erforderlich ist.
Transfruktosylierung
Dieser Ausdruck bezeichnet den Übergang einer Fruktoseeinheit von einem Donor, z. B. Saccharose, an einen Akzeptor, z. B. Polysaccharid.
Fruktosyltransferaseenzym
Darunter ist hier jedes Enzym zu verstehen, welches die Transfruktosylierung katalysiert, einschliesslich des aus Pullularia pullulans ATCC 9348 (synonym mit Aureobasidium pullulans) erhaltenen Enzyms.
Fruktosyltransferaseeinheit
Eine Fruktosyltransferaseeinheit ist definiert als die Menge Enzymaktivität, die zur Herstellung von 1 j1Mol eines reduzierenden Zuckers, berechnet als Glukose, pro min unter folgenden Bedingungen erforderlich ist :
EMI2.1
Substratkonzentration 60 g Saccharose (Nahrungsmittelqualität) pro 100 ml wässerige Reaktionsmischung
Die Bestimmung eines reduzierenden Zuckers (berechnet als Glukose) wurde unter Verwendung eines"Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York) durchgeführt. Die Analyse wird nach der üblichen Alkaliferricyanid-Methode vorgenommen, wie sie in Analytical Biochemistry 45, Nr. 2, S. 517-524 (1972) beschrieben wurde, adaptiert für die Benutzung des Autoanalyzers II.
Wenn nicht anders angegeben, werden Enzymaktivitätsbestimmungen durch kontinuier-
<Desc/Clms Page number 3>
liche Messung einer Reaktionsmischung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt : 7, 5 ml 80% ige (Gew./Vol.) wässerige Saccharoselösung (Nahrungsmittelqualität)
2, 3 ml 0, 1 M Citratpuffer PH 5, 5
0, 2 ml Enzymprobe, enthaltend eine Menge Fruktosyltransferaseenzym, die 5 bis
25 pg reduzierenden Zucker (berechnet als Glukose) pro min und ml
Reaktionsmischung ergibt.
Alle Teile beziehen sich auf das Gewicht und alle Prozentangaben auf Gew./Vol., wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Sirupe werden unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigkeits- chromatographie nach der folgenden Vorgangsweise analysiert :
Die Komponenten werden durch Elution mit Wasser aus einem Kationenaustauscherharz in der Kalziumform getrennt. Die eluierten Komponenten werden mit einem Differentialrefraktometer festgestellt. Von Dextrose verschiedene Kohlenhydrate werden von einem elektronischen Integrator quantitativ bestimmt, und der Gehalt der Dextrose wird durch Differenzbestimmung erhalten. Die allgemeine Vorgangsweise ist jene, die in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chroma- tography", Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, S. 43-46 beschrieben ist. Das verwendete Harz ist "Aminex Q" 15-5 in der Kalziumform (hergestellt von Bio Rad Laboratories, Richmond, California).
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Fruktose besteht darin, dass a) Sacchari- de in einer für eine Transfruktosylierung geeigneten Form mit einer für diese Reaktion zur Ver- fügung stehenden Fruktosylgruppe, vorzugsweise Saccharose in einer Konzentration von mindestens etwa 10% (Gew./Vol.), der Wirkung eines Fruktosyltransferaseenzympräparats bei einer Temperatur von 25 bis 65. C und einem PH-Wert von 4, 5 bis 6, 5 ausgesetzt werden, wobei ein Reaktionsprodukt, welches Fruktosepolysaccharide in Dextrose enthält, erhalten wird, und b) das Fruktosepolysaccha- rid und/oder die Dextrose des Reaktionsproduktes durch Hydrolyse des Fruktosepolysaccharids und/ oder durch Isomerisierung der Dextrose in Fruktose umgewandelt wird.
Das Fruktosyltransferase- - Enzympräparat ist imstande, Saccharose zu einem Produkt umzuwandeln, welches eine Mono- saccharidfraktion mit einem überwiegenden Anteil Glukose und einem geringeren Anteil Fruktose und
Fruktosepolysaccharide mit mindestens 66 Gew.-% Fruktosyleinheiten enthält.
Die Fruktosepolysaccharide enthalten alle Fruktose enthaltenden Polymeren (mit Ausnahme von
Saccharose) mit 2 oder mehr Monosaccharideinheiten. Diese Polymeren können auch derart charakte- risiert werden, dass sie Polysaccharide enthalten, in welchen Fruktosyleinheiten durch (2 -l) -ss- - Bindungen verknüpft sind.
Wie später beschrieben wird, können die unter gegebenen Bedingungen der Transfruktosylierung erhaltenen Polysaccharide überwiegend in einem vorherbestimmbaren Bereich liegen. So können z. B. Reaktionsprodukte erhalten werden, in welchen ein Grossteil (z. B. mindestens 60 Mol-%) des Polysaccharids Oligomeren mit 2 bis 10 (d. h. DP 2 bis 10), noch häufiger 3 bis 6 (d. h. DP 3 bis 6), Monosaccharideinheiten sind. Danach kann diese Glukose in Gegenwart von Polysacchariden zur Fruktose isomerisiert werden, wonach die Fruktosepolysaccharide in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden. Die Hydrolyse kann enzymatisch unter Verwendung von Invertase oder durch saure Hydrolyse unter milden Bedingungen vorgenommen werden.
Nach einer andern Ausführungsform der Erfindung können die Fruktosepolysaccharide von der Glukose und der Fruktose im Zwischenprodukt abgetrennt und danach wie oben beschrieben hydrolysiert werden, um einen Sirup mit extrem hohem Fruktosegehalt, z. B. von über 66 Gew.-% und vorzugsweise über 90 Gew.-% zu erzeugen, wobei die Notwendigkeit der Isomerisierung der Dextrose in diesem Zwischenprodukt entfällt. Diese Abtrennung kann am besten durch die üblichen physikalischen Trennmethoden auf Basis von Unterschieden in der Molekulargrösse durchgeführt werden, z. B. durch übliche Membrantrennverfahren (z. B. Ultrafiltration oder Dialyse), Lösungsmittelausscheidung, Kohleabsorption, u. dgl.
Beispiele für Membrantrennverfahren finden sich in den US-PS Nr. 3, 173, 867, Re 26, 074 Nr. 3, 541, OO6 und Nr. 3, 691, 068.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Sirup
<Desc/Clms Page number 4>
mit hohem Fruktosegehalt, bei welchem Saccharose der Wirkung eines Fruktosyltransferaseenzyms, wie es z. B. aus Pullularia pullulans (ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL
YB3892, NRRL 3937, ATCC 15223 und NRRL YB3861) gewonnen wird, ausgesetzt wird. Das entstehende
Produkt kann der Wirkung eines Isomeraseenzyms ausgesetzt werden. Danach kann das isomerisier- te Produkt in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden.
Das Zwischenprodukt aus der Transfruktosylasereaktion ist in einzigartiger Weise geeignet für eine Isomerisierung und nachfolgende Hydrolyse zur Bildung eines Sirups, der mehr als 55%
Fruktose enthält.
Um einen Sirup mit mehr als 55% Fruktose zu erhalten, enthält das Zwischenprodukt vor- zugsweise (1) 20 bis 60 Gew.-% Monosaccharide, die einen überwiegenden Anteil Glukose und einen kleineren Anteil Fruktose enthalten, und (2) 70 bis 40% Polysaccharide mit mehr als
66 Gew.-% Fruktosyleinheiten. Besonders bevorzugt sind Zwischenprodukte, die aus Saccharose durch Transfruktosylierung in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Fruktosyltransferaseenzyms, erhalten aus einem Stamm von Pullularia pullulans ATCC 9348 bei einer Temperatur von 25 bis
65OC, vorzugsweise von 50 bis 60 C, und bei einem pH-Wert im Bereich von 4, 5 bis 6, 5, vorzugs- weise 5, 4 bis 5, 6, gewonnen wurden. Die verwendeten Konzentrationen in der Ausgangslösung der
Saccharose können nur 10 g/100 ml Wasser betragen.
Bevorzugt wird jedoch eine möglichst hohe
Konzentration an Trockensubstanz, vorzugsweise von 30 bis 60 g/100 ml (für eine maximale Re- aktionsgeschwindigkeit), gegebenenfalls bis zum Sättigungspunkt der Saccharose und sogar darüber, wie später noch dargelegt werden wird.
Mindestens 0, 5 Einheiten Fruktosyltransferase/g Saccharose können erfindungsgemäss ver- wendet werden. Im allgemeinen wird die Menge an verwendetem Enzym 50 Einheiten/g Saccharose aus ökonomischen Erwägungen nicht überschreiten. Besonders bevorzugt zur Herstellung des ge- wünschten Zwischenproduktes in kommerziell annehmbarer Zeit und innerhalb der oben genannten
Verfahrensparameter ist ein Bereich von 2 bis 30 Einheiten/g Saccharose.
Für die Herstellung der erfindungsgemäss verwendeten Fruktosyltransferase können übliche
Fermentationsverfahren angewendet werden, wie z. B. in den US-PS Nr. 3, 565, 756, Nr. 3, 806, 419,
Nr. 3, 535, 123 und in Applied Microbiology, 11, 211-215 (1963) von S. Ueda et al. beschrieben.
Vorzugsweise werden Massnahmen zur Abtrennung und Reinigung angewendet, die später be- schrieben werden.
Das folgende Beispiel ergibt eine typische Vorgangsweise für die Fermentation zur Herstel- lung des Enzyms aus Pullularia pullulans ATCC 9348 an.
Beispiel 1 : Herstellung von Fruktosyltransferaseenzympräparat auf Celite als Träger
A) Fermentationsverfahren zur Herstellung des Enzyms
Das für die Entwicklung des Inokulums und die Fermentation verwendete Medium zur Herstellung des Enzyms ist folgendes : 0, 5% Dibasisches Kaliumphosphat
0, 1% Natriumchlorid 0, 02% Magnesiumsulfatheptahydrat 0, 06% Diammoniumsulfat
0, 3% Hefeextrakt
7, 5% Saccharose (Nahrungsmittelqualität)
PH-Wert auf 6, 8 eingestellt
500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml sterilem Medium werden aus einer Kultur von Pullularia pullulans inokuliert. Der spezielle verwendete Hefestamm ist ATCC 9348.
Nach Entwicklung auf einer Schüttelvorrichtung im Verlaufe von 48 h bei 32 C wird der Inhalt der Kolben dazu verwendet, in 1 1 Erlenmeyer-Fermentationskolben mit 200 ml des oben beschriebenen Mediums zu inokulieren. Die Konzentration des Inokulums ist dabei 0, 5% (Gew./Vol.). Die Fermentation wird auf (liner Schüttelvorrichtung bei 32 C 7 Tage lang vorgenommen.
<Desc/Clms Page number 5>
B) Isolierung des Enzyms aus der Fermentationsbrühe
Die Fermentationsbrühen aus 40 l-Schüttelkolben werden vereinigt und die Kolben mit Wasser gespült, welches danach ebenfalls mit den Brühen vereinigt wird. Das Endvolumen nach Verdünnung beträgt 12 1. Das ursprüngliche Volumen der Brühe ist etwa 8 1. Die 12 1 Fermentationsbrühe werden kontinuierlich durch eine Zentrifuge geleitet, um die Hefezellen und Zellreste zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit, welche eine schwarze viskose Lösung ist, wird dann mit Kalziumchlorid auf eine Konzentration von 0, 5% (Gew./Vol.) versetzt und der PH -Wert der entstehenden Lösung mit Natriumhydroxyd auf 7,0 gebracht. Dann wird nochmals durch die Zentrifuge laufen gelassen, wobei eine viskose überstehende Flüssigkeit mit geringer Färbung erhalten wird.
Der PH-Wert der entfärbten Flüssigkeit wird mit Salzsäure auf 5, 5 eingestellt, worauf 1000 Einheiten (wie in der US-PS Nr. 3, 806, 419 definiert) Pullulanase zugesetzt werden. Die entstehende Brühe wird mit Toluol konserviert (bis zur Sättigung zugesetzt) und die Pullulanase über Nacht bei Umgebungstemperatur wirken gelassen. Danach wird eine l% ige Zubereitung von Celite in die Brühe eingeschlemmt, worauf 2 Volumina (24 l) Aceton zugesetzt werden. Es bildet sich ein Niederschlag, der durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und bei Umgebungstemperatur getrocknet wird. Der gesammelte Filterkuchen enthält die unlöslich gemachten Fruktosyltransferaseenzyme.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Zugabe von Kalziumchlorid zur Fermentationsbrühe und
EMI5.1
615-622 [1962]). Das endgültige Enzymprodukt wird dadurch in Form einer relativ reinen farblosen Substanz erhalten.
Der beschriebene Reinigungsvorgang stellt eine bevorzugte Massnahme im Rahmen der Erfindung dar und erlaubt einfache Techniken, d. h. Zentrifugieren, Filtrieren oder Ausfällen, zur Erzielung des Endproduktes. Würden die Nebenprodukte nicht entfernt, so würden sie nach Zugabe von Lösungsmittel zur Fermentationsbrühe zusammen mit dem Enzym ausfallen.
Als weitere Reinigung des Enzympräparats empfiehlt es sich, das Pullulan-Polysaccharid, welches in der Fermentationsbrühe auf jeden Fall vorliegt, zu entfernen, weil auch dieses nach Zugabe eines Lösungsmittels zur Fermentationsbrühe zusammen mit dem Fruktosyltransferaseenzym ausfallen würde. Die nach der Behandlung mit Kalziumchlorid unter Einstellung des PH-Wertes erhaltene überstehende Flüssigkeit kann daher mit einem gut bekannten Hydrolyseenzym, der Pullulanase, weiter behandelt werden. Das Enzym Pullulanase hydrolysiert das Pullulan an willkürlichen Stellen zu einem Polymeren mit niedrigerem Molekulargewicht, so dass ein Mitausfallen und eine dadurch bedingte Verunreinigung des Fruktosyltransferaseenzyms während der Behandlung mit dem Lösungsmittel (z. B. Aceton, Alkohol u. dgl.) vermieden wird.
Das Fruktosyltransferaseenzym kann auch ohne vorherige Entfernung des Pullulans eingesetzt werden. Die Erfindung kann also auch ohne die Hydrolyse des Pullulans durch Pullulanase ausgeführt werden, in welchem Fall das Pullulan als Träger für das Fruktosyltransferaseenzym dient.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Pullulan als Träger.
EMI5.2
als Träger dient, wird kein Celit verwendet. Die Aktivität der Fruktosyltransferase beträgt 677 Einheiten/g Pullulan. Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur durchgeführt, bis die Mischung trüb zu werden beginnt. Eine Probe dieses Materials wird durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden :
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> Fruktose <SEP> Dextrose <SEP> DP <SEP> DP <SEP> DP4+
<tb> 6, <SEP> 9 <SEP> 40, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Das folgende Beispiel erläutert die Eigenschaften des im Beispiel 1 erhaltenen Enzyms.
Beispiel 3 : Produkte der Enzymwirkung und thermische Stabilität des Enzyms
In Reaktionsflaschen mit Schraubverschluss werden 60 g Sukrose von Nahrungsmittelqualität und ein Fruktosyltransferaseenzympräparat eingebracht. Das Enzympräparat wird aus dem Produkt von Beispiel 1 durch Dispersion geeigneter aliquoter Mengen in abgemessene Mengen Wasser erhalten. Der Celit wird dann durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird dafür verwendet, in der Reaktionsmischung 10,20 bzw. 30 Einheiten/g Sukrosesubstrat einzustellen. Diese Mischungen werden dann jede auf ein Endvolumen von 100 ml mit Wasser verdünnt. Die Umsetzungen werden 66 h lang bei einem PH-Wert von 5, 5 bei 55 oder 60 C durchgeführt. Nach 24,43 und 66 h werden Proben genommen, um das Vorliegen enzymatischer Aktivität durch Bestimmung des reduzierenden Zuckers sicherzustellen.
Nach Durchführung der Bestimmungen des reduzierenden Zuckers an den Proben werden die verbleibenden Reaktionsmischungen eingefroren, um die enzymatische Wirkung zu verhindern, und es wird eine Bestimmung der Kohlenhydratzusammensetzung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie vorgenommen. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten :
Bestimmung reduzierender Zuckerl
EMI6.2
<tb>
<tb> Temperatur <SEP> Enzym- <SEP> reduzierende <SEP> PH <SEP> reduzierende <SEP> PH <SEP> reduzierende
<tb> einheiten2 <SEP> Zucker <SEP> Zucker <SEP> Zucker
<tb> (OC) <SEP> (mg/ml) <SEP> (mg/ml) <SEP> (mg/ml)
<tb> 24 <SEP> h <SEP> 43 <SEP> h <SEP> 66 <SEP> h
<tb> 55 <SEP> 0-5, <SEP> 80-5, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 191 <SEP> 5, <SEP> 40 <SEP> 231 <SEP> 5, <SEP> 25 <SEP> 268
<tb> 20 <SEP> 192 <SEP> 5, <SEP> 40 <SEP> 270 <SEP> 5, <SEP> 25 <SEP> 301
<tb> 30 <SEP> 246 <SEP> 5, <SEP> 35 <SEP> 334 <SEP> 5, <SEP> 15 <SEP> 390
<tb> 60 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 75 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 80 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 200 <SEP> 5, <SEP> 10 <SEP> 243 <SEP> 4, <SEP> 70 <SEP> 270
<tb> 20 <SEP> 219 <SEP> 5, <SEP> 15 <SEP> 288 <SEP> 4, <SEP> 90 <SEP> 346
<tb> 30 <SEP> 282 <SEP> 5,
<SEP> 20 <SEP> 360 <SEP> 4, <SEP> 95 <SEP> 420
<tb>
'Verfahren wie für die Bestimmung der Fruktosyltransferaseeinheit Enzymeinheiten/g Saccharose
<Desc/Clms Page number 7>
Kohlenhydratzusammensetzung
EMI7.1
<tb>
<tb> Enzymein- <SEP> Reaktions- <SEP> Dextrose <SEP> Laevulose <SEP> DP2 <SEP> DP3 <SEP> DP
<tb> heiten <SEP> zeit
<tb> (h)
<tb> Reaktionstemperatur <SEP> 550C
<tb> 10 <SEP> 24 <SEP> 31, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 31, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 17, <SEP> 9 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> 35, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 33, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 34, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 7,
<SEP> 9 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 40, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 10, <SEP> 8 <SEP> 36, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 24 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 39, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 41, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 4 <SEP> 34, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 46, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 27, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Reaktionstemperatur <SEP> 600C <SEP>
<tb> 10 <SEP> 24 <SEP> 32, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 3 <SEP> 30, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 9, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 36, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 35, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 8,
<SEP> 4 <SEP> 17, <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 41, <SEP> 3 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 24 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 12, <SEP> 1 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 43, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 30, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 66 <SEP> 47, <SEP> 8 <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 11, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Beispiel 3 : zeigt die thermische Stabilität des Enzyms in Gegenwart von Substrat bei 55 und 60 C im Verlauf von bis zu 66 h bei einem pH-Wert von 5, 5, was die kommerziellen Möglichkeiten des Enzyms zeigt.
Ausserdem wird gezeigt, dass das Zwischenprodukt nach der enzymatischen Umwandlung von Sukrose mit dem Fruktosyltransferasepräparat ein wertvolles Produkt darstellt, das für die Herstellung von Sirup mit hohem Fruktosegehalt geeignet ist, weil die überwiegenden Bestandteile Dextrose und Polymeren sind, die nach Hydrolyse Fruktose als vorwiegendes Monosaccharid ergeben. Dieses Beispiel zeigt ferner, dass das neue Enzym bei einer Konzentration an Saccharose von 60% (Gew./Vol.) wirksam ist und auch in Gegenwart hoher Glukosekonzentrationen wirkt.
Beispiel 4 : Wirkung der Temperatur auf die Enzymaktivität
Die Wirkung der Temperatur auf die Reaktionsgeschwindigkeit von Fruktosyltransferaseenzym wird unter Verwendung eines Technicon Autoanalyzer II wie folgt bestimmt :
Die Reaktionsmischung besteht aus 7, 5 ml 80%iger (Gew. /Vol.) Saccharoselösung, 2, 3 ml
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
Proben werden bei den nachfolgend genannten Temperaturen gehalten und 10 min lang auf dem Autoanalyzer untersucht.
Bei 400C ergibt sich eine Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms, die um 1, 89mal grösser als jene bei 300C ist ; bei SOIC ist sie 1, 29mal grösser als bei 40 C ; und bei 60 C ist sie 1, 48mal so gross wie bei 50 C. Dies zeigt eine mit steigender Temperatur steigende Reaktionsgeschwindigkeit.
Beispiel 5 : Die Michaelis-Menten-Konstante (Km) des Fruktosyltransferaseenzyms
Der Km-Wert eines Enzyms gibt die Substratkonzentration an, bei welcher die Geschwindigkeit der Produktbildung die Hälfte der Maximalgeschwindigkeit beträgt.
Zur Bestimmung des Km-Wertes vom Fruktosyltransferaseenzym wurde folgende Vorgangsweise angewendet :
Unter Verwendung einer 90% igen (Gew./Vol.) Saccharoselösung, eingestellt auf einen PH-Wert von 5, 5 mit 0, 1 M Citratpuffer, wurden die geeigneten Konzentrationen an Saccharose in 9, 8 ml- - Aliquoten eingestellt, um in einem Endvolumen von 10 ml Konzentrationen an Saccharose von 5, 10,20, 30,40, 50,60 und 75% zu ergeben. Eine Enzymlösung in einer Menge von 0, 2 ml, enthaltend 1, 1 Einheiten Fruktosyltransferaseenzym, wird den Proben zugefügt. Dann werden die Proben sofort bei 55 C in einem Technicon Autoanalyzer II wie oben beschrieben untersucht. Ein Glukosestandard wird als Kontrolle verwendet.
Nachfolgend wird die Geschwindigkeit der Glukosebildung in pg/ml. min bei verschiedenen Substratkonzentrationen und einer konstanten Menge an Fruktosyltransferaseenzym (1, 1 Einheiten), hergestellt gemäss Beispiel 1, angegeben :
EMI8.2
<tb>
<tb> % <SEP> Substrat <SEP> pg/ml. <SEP> min <SEP> pg/m1.
<SEP> mina) <SEP>
<tb> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 30 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 17, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 40 <SEP> 18, <SEP> 6 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 50 <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP> 17, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 17, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 70 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
a) Neuerliche Prüfung am nächsten Tag mit einer
Saccharoselösung mit 60%
Der Km-Wert liegt bei einer 0, 27 molaren Saccharoselösung. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit tritt bei einer Substratkonzentration entsprechend einer 1, 374 molaren Saccharoselösung bei einem PH-Wert von 5, 5 und einer Temperatur von 55 C auf.
Beispiel 6 : Herstellung und Isomerisierung von Zwischenprodukt aus Saccharose
A) Herstellung des Zwischenproduktes
600 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität werden in Wasser auf ein Volumen von 800 ml gelöst. Der PH-Wert dieser Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf 5, 5 eingestellt. Ein trockenes Celite-Enzym-Präparat mit einer Aktivität von 550 Einheiten/g, hergestellt gemäss Beispiel 1, wird in einer Menge von 11 g in 100 ml Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird im Vakuum durch ein Whatman-Filter Nr. 1 in einem Büchner-Trichter filtriert. Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml Wasser gewaschen. Die 200 ml Filtrat werden dann der Saccharoselösung zugesetzt, welche sich in einer 2 1-Flasche mit Schraubverschluss befindet.
Die Flasche wird dann in ein
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> Zwischenprodukt <SEP> (A) <SEP> Endprodukt <SEP> (B)
<tb> Fruktose <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 32, <SEP> 8 <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP, <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP>
<tb> DP3 <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP4+ <SEP> 31, <SEP> 3 <SEP> 31, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Diese Ergebnisse zeigen, dass 42, 38% der freien Dextrose im Zwischenprodukt in der Kolonne zu Fruktose isomerisiert wurden. Die im Zwischenprodukt enthaltenen Fruktosepolymeren scheinen nicht beeinflusst zu werden oder die Isomerisierung von Dextrose zu Fruktose zu beeinflussen. Es ist beachtenswert, dass die Gesamtverteilung an Monosacchariden im Endprodukt 45% Fruktose und 55% Dextrose aufweist.
Im folgenden Beispiel werden zwei Wege angewendet, um die im Zwischenprodukt vorliegenden Polysaccharide zu spalten und die Isomerisierungsprodukte davon zu trennen. Der eine Weg ist enzymatisch, der andere wendet eine Hydrolyse durch Säure bei milden Bedingungen an.
Beispiel 7 : Herstellung eines Sirups mit hohem Fruktosegehalt durch Hydrolyse
A) Enzymatische Hydrolyse
100 ml des Produktes B von Beispiel 6 werden mit 10 mg gereinigter Invertase aus Candida utilis versetzt. Diese Mischung (stabilisiert mit Toluol) wird über Nacht bei Umgebungstemperatur reagieren gelassen, wonach eine Probe entnommen und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert wird.
Das verbleibende Produkt B wird weitere 6 Tage reagieren gelassen, wonach eine zweite Probe nach der gleichen Prüfmethode untersucht wird : Die Ergebnisse sind folgende :
EMI10.2
<tb>
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> Nach <SEP> Invertase-Nach <SEP> weiteren
<tb> (Produkt <SEP> B) <SEP> wirkung <SEP> 6 <SEP> Tagen
<tb> Fruktose <SEP> 15, <SEP> 7% <SEP> 41, <SEP> 9% <SEP> 62, <SEP> 4% <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 18, <SEP> 9% <SEP> 29, <SEP> 4% <SEP> 36, <SEP> 2% <SEP>
<tb> DP, <SEP> 11, <SEP> 0% <SEP> 1, <SEP> 9% <SEP> 0
<tb> DP3 <SEP> 22, <SEP> 9% <SEP> 12, <SEP> 9% <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> DP <SEP> 31, <SEP> 5% <SEP> 13, <SEP> 9% <SEP> 0, <SEP> 9% <SEP>
<tb>
Die eingesetzte Invertase hatte eine Aktivität von 123 Einheiten/mg,
wobei eine Einheit Invertase die Spaltung von Saccharose unter Bildung von 1 pMol Glukose und 1 pMol Fruktose/min unter speziellen Bedingungen katalysiert.
B) Saure Hydrolyse von Produkt B
Die saure Hydrolyse einer Probe von Produkt B von Beispiel 6 wurde durch Zugabe von Schwefelsäure auf eine Konzentration von 0, 05 N und Erhitzen auf 75 bis 800C durchgeführt. Nach 1 und 2 h werden Proben entnommen und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert.
Die Ergebnisse sind :
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h <SEP>
<tb> (Produkt <SEP> B)
<tb> Fruktose <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 60, <SEP> 3 <SEP> 59, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP> 38, <SEP> 7 <SEP> 37, <SEP> 9 <SEP>
<tb> DP, <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> DPa <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> DP4+ <SEP> 31. <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Die Ergebnisse von Verfahrensvariante A zeigen eine überwiegende Steigerung des Fruktosegehaltes und eine geringere Steigerung der Glukoseausbeute zusammen mit einem entsprechenden Abfall der Mengen an DP2, DP3 und DP., wodurch die Anwesenheit eines Fruktosepolymeren demonstriert wird.
Die Ergebnisse der sauren Hydrolyse der Verfahrensvariante B sind in Übereinstimmung mit jenen der Verfahrensvariante A, zeigen also auch die Spaltung des Fruktosepolymeren.
Die bisherigen Ausführungen bezogen sich auf eine Transfruktosylierung unter Verwendung eines Ausgangssubstrats, dessen Trockensubstanzgehalt an Saccharose unter den gegebenen Reaktionsbedingungen den Sättigungspunkt nicht überschritt. Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Ausgangssubstrats mit einer Saccharoseausgangskonzentration über dem Sättigungspunkt, welches, wenn es der Wirkung des Fruktosyltransferaseenzyms ausgesetzt wird, ein
EMI11.2
im Zwischenprodukt im Vergleich zur Konzentration in Abwesenheit von Fruktosyltransferaseenzym. Ausserdem wird gezeigt, dass bei Steigerung der Konzentration an Trockensubstanz im Ausgangssubstrat der Polymerisationsgrad des Fruktosepolymeren im Zwischenprodukt sinkt und DP 4+ -Ma- terialien in geringeren Mengen vorliegen.
Dies steht in deutlichem Kontrast zu den in den vorherigen Beispielen unter Verwendung von Saccharosesubstrat unterhalb der Sättigung erhaltenen Ergebnissen. In jenen Beispielen ist das DP.-Material das Hauptprodukt.
Beispiel 8 : Herstellung von Zwischenprodukt aus Saccharoseaufschlämmungen oberhalb der
Sättigung
Saccharose von Nahrungsmittelqualität wird in 200 g-Mengen in 600 ml-Flaschen mit Schraubverschluss gefüllt. Zur Kontrolle werden in eine Flasche 50 ml Wasser gegeben, in die andern Flaschen werden jeweils 50 ml Wasser mit steigenden Mengen an Fruktosyltransferaseenzym auf Celit (hergestellt gemäss Beispiel 1) gegeben. Jede Flasche wird verschlossen und in ein bewegtes Wasserbad von 54 bis 55. C eingebracht. Die Flaschen werden 24 h lang mit gelegentlichem manuellem Vermischen geschüttelt. Eine Probe überstehender Flüssigkeit wird aus jeder Flasche genommen und in einem verschlossenen Reaktionsröhrchen in ein siedendes Wasserbad gegeben, um das Enzym zu inaktivieren.
Diese Proben werden dann durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert, und es werden Bestimmungen des Trockensubstanzgehaltes der überstehenden Flüssigkeit nach dem K. Fischer-Verfahren mit folgenden Ergebnissen gemacht.
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb>
Flasche <SEP> Saccharose <SEP> Enzymein-Trockensubstanz <SEP> Kohlenhydratzusammensetzung <SEP> (%) <SEP>
<tb> Nr. <SEP> (g) <SEP> heiten' <SEP> (Gew.-%) <SEP> Fruktose <SEP> Dextrose <SEP> DP2 <SEP> DP, <SEP> DP4+ <SEP>
<tb> 1 <SEP> 200 <SEP> 100 <SEP> 74, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 9, <SEP> 6 <SEP> 80, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> ND2 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 200 <SEP> 200 <SEP> 75, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 12, <SEP> 7 <SEP> 72, <SEP> 2 <SEP> 13, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 200 <SEP> 300 <SEP> 76, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 14, <SEP> 5 <SEP> 66, <SEP> 8 <SEP> 16, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 200 <SEP> 400 <SEP> 77, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 62, <SEP> 6 <SEP> 19, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 200 <SEP> 500 <SEP> 77, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 17, <SEP> 3 <SEP> 58, <SEP> 5 <SEP> 21,
<SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 200 <SEP> 600 <SEP> 78, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 56, <SEP> 0 <SEP> 21, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 200 <SEP> 700 <SEP> 78, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 18, <SEP> 8 <SEP> 53, <SEP> 9 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 200 <SEP> 800 <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 19, <SEP> 3 <SEP> 52, <SEP> 2 <SEP> 24, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 200 <SEP> 900 <SEP> 79, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 19, <SEP> 9 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 200 <SEP> 1000 <SEP> 79, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 20, <SEP> 6 <SEP> 48, <SEP> 6 <SEP> 25, <SEP> 4 <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kontr.
<SEP> 200 <SEP> 0 <SEP> 72, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> ND2 <SEP> 99, <SEP> 7 <SEP> ND2 <SEP> ND2 <SEP>
<tb>
1 Gesamteinheiten an Fruktosyltransferaseenzym in 50 ml Wasser 2 ND = nicht bestimmt
<Desc/Clms Page number 13>
Es ist bemerkenswert, dass im obigen Beispiel die Kontrollprobe beim Kühlen auf Umgebungstemperatur (etwa 25 C) auskristallisierte, während das enzymatisch hergestellte Zwischenprodukt in Lösung bleibt und ohne Kristallisation eine ausgezeichnete Lagerfähigkeit aufweist.
Obwohl in Beispiel 8 200 g Saccharose/50 ml Wasser eingesetzt werden, d. h. eine 80 gew.-% ige Lösung, kann die Konzentration an Trockensubstanz des Saccharoseausgangsmaterials noch weiter gesteigert werden.
Obzwar. der Transfruktosylierungsschritt der Erfindung hier für ansatzweises Arbeiten beschrieben wurde, ist es für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich, dass ebenso kontinuierliche Vorgangsweisen angewendet werden können. Dabei wird das Transfruktosylaseenzym günstigerweise unter Verwendung der oben erwähnten Techniken immobilisiert und die beschriebene Vorgangsweise gewählt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Fruktose und fruktosereichen Sirupen, dadurch gekennzeichnet, dass a) Saccharide in einer für eine Transfruktosylierung geeigneten Form mit einer für diese
Reaktion zur Verfügung stehenden Fruktosylgruppe, vorzugsweise Saccharose in einer
EMI13.1
von 4, 5 bis 6, 5 ausgesetzt werden, wobei ein Reaktionsprodukt, welches Fruktosepoly- saccharide und Dextrose enthält, erhalten wird, und b) das Fruktosepolysaccharid und/oder Dextrose des Reaktionsproduktes durch Hydrolyse des Fruktosepolysaccharids und/oder durch Isomerisierung der Dextrose in Fruktose umgewandelt wird.