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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen und gegebenenfalls Bestimmen von Lipoproteinfraktionen in Körperflüssigkeiten durch fraktionierte Fällung.
Die Lipoproteine des menschlichen Serums lassen sich in vier Hauptklassen einteilen : Very Low Density Lipoproteine (VLDL), Low Density Lipoproteine (LDL) und High Density Lipoproteine (HDL). Die HDL-Fraktion zerfällt noch in zwei Unterklassen : HDL2 und HDL3. Die Nomenklatur ist auf das Verhalten der Lipoproteine (Lp) in der Ultrazentrifuge zurückzuführen.
Die Bestimmung der HDL-Lipoproteinfraktionen und der HDLz-und HDLs-Lipoproteinsubfrak- tionen in menschlichen Körperflüssigkeiten, wie Serum oder Plasma, ist deshalb von grosser diagnostischer Bedeutung, weil auf Grund dieser Bestimmungen das atherogene Risiko von Patienten abgeschätzt werden kann. Ferner können Rückschlüsse auf metabolische Veränderungen und angeborene Stoffwechselstörungen gewonnen werden.
Die Bestimmungen der genannten Fraktionen wurden bisher hauptsächlich mit Hilfe der präparativen und analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt. Diese Geräte sind jedoch sehr teuer, verlangen geschultes Personal und kommen nur für kleine Probenserien in Frage.
Weiters ist auch eine Präzipitationsmethode zum Abtrennen der HDLz-und HDLs-Lipoprotein- fraktion bekannt, wobei als Fällungsmittel Heparin und Dextransulfat unter Zusatz von Mangan (II)ionen verwendet werden. Diese stören jedoch bei verschiedenen weiteren chemischen Untersuchungen. Ausserdem sind mehrere Pipettierungsschritte und länger dauernde Inkubationen notwendig, was eine geringe Präzision zur Folge hat. Schliesslich lassen sich Proben mit hohem Triglyceridgehalt nach dieser bekannten Methode nicht analysieren.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, welches eine möglichst einfache, rasche und reproduzierbare fraktionierte Trennung entweder der beide Subfraktionen enthaltenden HDL- Fraktion oder der HDLs-Subfraktion allein von den übrigen Lipoproteine in den Körperflüssigkeiten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass als Fällungsmittel Polyäthylenglykol verwendet wird, wobei durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 5 bis 8% w/v in dem Fällmedium ein die VLDL- und LDL-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL2 - und HDL3 -Fraktionen im Überstand bleiben, bzw. durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 9 bis 11% w/v in dem Fällmedium ein die VLDL-, LDL- und HDL2-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL3- - Fraktion im Überstand bleibt.
Die Verwendung von Polyäthylenglykol als Mittel zur Fällung von Proteinen aus Körperflüssigkeiten ist an sich bekannt.
Gemäss der einen Ausführungsform der Erfindung wird ein Teil Plasma oder Serum mit zwei Teilen einer 8- bis 10%igen Polyäthylenglykol-Lösung mit einem pH-Wert von 6 bis 7 versetzt, gemischt und in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei ein die VLDL- und LDL-Fraktion enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL2-und HDL3-Fraktionen im Überstand bleiben.
Gemäss der andern Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird ein Teil Serum oder Plasma mit zwei Teilen einer 14- bis 15%igen Polyäthylenglykol-Lösung mit einem pH-Wert von 7 bis 8 versetzt, gemischt und in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei ein die VLDL-, LDLund HDL2-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL3 -Fraktion im Überstand bleibt.
Bei beiden Ausführungsformen wird sodann der Cholesteringehalt des Überstandes enzymatisch oder chemisch bestimmt und auf Grund der bekannten Zusammensetzung der HDL-Fraktionen die Masse des HDL2 und die Masse des HDL3 ermittelt. Die chemische Zusammensetzung der HDL- - Fraktionen ist in der folgenden Tabelle dargestellt :
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Tabelle
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<tb>
<tb> % <SEP> der <SEP> Lipoprotein-Masse
<tb> Fraktion <SEP> Protein <SEP> Phospholipid <SEP> Cholesterin <SEP> Triglycerid <SEP>
<tb> HDL2 <SEP> 41 <SEP> 35 <SEP> 19 <SEP> 5
<tb> HDLa <SEP> 57 <SEP> 23 <SEP> 16 <SEP> 4
<tb>
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2/3 aus Cholesterinester. Multipliziert man den bei der Analyse gefundenen Cholesterinwert mit 1, 48, so erhält man die Masse der Mischung Freies Cholesterin und Cholesterinester.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden näher erläutert.
Man bereitete zunächst die Fällungsmittel vor, u. zw. als Fällungsmittel A eine Lösung mit 9, 5% Polyäthylenglykol und einem PH-Wert von 6, 5 und als Fällungsmittel B eine Lösung mit 14, 5% Polyäthylenglykol und einem PH-Wert von 7, 5.
Beispiel 1 :
100 (d menschliches Serum wurden mit 200 pl des Fällungsmittels A versetzt, um eine Endkonzentration von 6, 3% w/v Polyäthylenglykol zu erreichen ; sodann wurde die Mischung zentrifugiert und der Überstand abgetrennt. Im Überstand wurde das Cholesterin enzymatisch bestimmt und ein Wert von 55 mg/100 ml gefunden.
Weitere 100 gel des Serums wurden mit 200 ! des Fällungsmittels B versetzt, um eine Endkonzentration von 9, 7% w/v Polyäthylenglykol zu erreichen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Cholesteringehalt im Überstand bestimmt. Es wurde ein Wert von 41 mg/100 ml gefunden.
Aus den gefundenen Werten wurde die Masse des HDL2 und HDL3 unter Zugrundelegung der in der Tabelle angegebenen Mengenverhältnisse wie folgt errechnet :
55 x 1, 48 = 81, 4 mg/100 ml Cholesterinmasse in HDL2 und HDL3 (Gesamt-HDL)
41 x 1, 48 = 60, 7 mg/100 ml Cholesterinmasse in HDL3 81, 4-60, 7 = 20, 7 mg/100 ml Cholesterinmasse in HDL2
100 : 19 (% Cholesterin) = 5, 25 : Konversionsfaktor für HDL2 -Masse
100 : 16 (% Cholesterin) = 6, 25 : Konversionsfaktor für HDL3-Masse
20, 7 x 5, 25 = 108, 7 = Masse des HDL2
60, 7 x 6, 25 = 379, 4 = Masse des HDL3
Beispiel 2 :
Zwei Proben von je 100 p. l einer andern Serumprobe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den Fällungsmitteln A und B gefällt.
Nach jeweiligem Abtrennen der Niederschläge wurden im Überstand statt des Cholesterins die Phospholipide bestimmt. Dabei ergaben sich die folgenden Werte : Überstand nach Fällung mit Fällungsmittel A : 96, 5 mg/100 ml
Phospholipide = Phospholipidgehalt in HDL2 + HDL3 (Gesamt-HDL) Überstand nach Fällung mit Fällungsmittel B : 73, 4 mg/100 ml
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Unter Zugrundelegung der in der Tabelle angegebenen Werte ergaben sich die Konversionsfaktoren :
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100 : 35 = 2, 86 (Konversionsfaktor für HDL2)
100 : 23 = 4, 35 (Konversionsfaktor für HDL3) und daraus : 23, 1 x 2,86 = 66, 1 mg/100 ml HDL2 -Masse
73, 4 x 4, 35 = 319, 3 mg/100 ml HDLs-Masse
Beispiel 3 :
Zwei Proben von je 100 111 einer weiteren Serumprobe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den Fällungsmitteln A und B gefällt.
Nach jeweiligem Abtrennen der Niederschläge wurden jedoch im Überstand an Stelle der Bestimmung des Cholesterins bzw. der Phospholipide der Gehalt an Apoprotein AI bestimmt und daraus die HDLz-und HDLs-Masse errechnet :
Im Überstand nach der Fällung mit Fällungsmittel A wurden 151 mg/100 ml Apoprotein AI gefunden, im Überstand nach der Fällung mit Fällungsmittel B 122 mg/100 ml Apoprotein AI.
Daraus ergaben sich unter Heranziehung der in der Tabelle angegebenen Werte die folgenden HDL2- und HDL3-Massen :
41 (% Protein in HDL2) x 0, 75 = 30, 75 - entspricht % der Apoprotein AI-Masse in HDL2
100 : 30, 75 = 3, 25 = Konversionsfaktor für HDL2 -Masse aus Apoprotein AI
57 x 0, 70 = 39, 9 - entspricht % der Apoprotein AI-Masse in HDL3
Als Konversionsfaktor für HDL3 -Masse aus Apoprotein AI ergab sich aus 100 : 39, 9 = 2, 51.
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122 x 2, 51 = 306, 2 mg/100 ml HDL3-Masse.
PATENTANSPRCHE :
1. Verfahren zum Trennen und gegebenenfalls Bestimmen von Lipoproteinfaktoren in Körperflüssigkeiten durch fraktionierte Fällung, dadurch gekennzeichnet, dass als Fällungsmittel Polyäthylenglykol verwendet wird, wobei durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 5 bis 8% w/v in dem Fällmedium ein die VLDL- und LDL-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL2 - und HDL3 -Fraktionen im Überstand bleiben, bzw. durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 9 bis 11% w/v in dem Fällmedium
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HDL2-FraktionenHDLs-Fraktion im Überstand bleibt.
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The invention relates to a method for separating and optionally determining lipoprotein fractions in body fluids by fractional precipitation.
The lipoproteins of human serum can be divided into four main classes: Very Low Density Lipoproteins (VLDL), Low Density Lipoproteins (LDL) and High Density Lipoproteins (HDL). The HDL fraction still falls into two subclasses: HDL2 and HDL3. The nomenclature is due to the behavior of the lipoproteins (Lp) in the ultracentrifuge.
The determination of the HDL-lipoprotein fractions and the HDLz and HDLs-lipoprotein sub-fractions in human body fluids, such as serum or plasma, is of great diagnostic importance because the atherogenic risk of patients can be estimated on the basis of these determinations. Furthermore, conclusions can be drawn about metabolic changes and congenital metabolic disorders.
Up to now, the determinations of the fractions mentioned have mainly been carried out using the preparative and analytical ultracentrifuge. However, these devices are very expensive, require trained personnel and are only suitable for small sample series.
Furthermore, a precipitation method for separating the HDLz and HDLs lipoprotein fraction is also known, heparin and dextran sulfate with the addition of manganese (II) ions being used as the precipitant. However, these interfere with various other chemical tests. In addition, several pipetting steps and longer incubations are necessary, which results in low precision. Finally, samples with a high triglyceride content cannot be analyzed using this known method.
The invention aims at avoiding the disadvantages and difficulties described and has as its object to create a method which allows the simplest, quick and reproducible fractional separation of either the HDL fraction containing both subfractions or the HDLs subfraction from the other lipoproteins alone the body fluids.
According to the invention, this object is achieved in that polyethylene glycol is used as the precipitant, a precipitate containing the VLDL and LDL fractions being obtained by adding polyethylene glycol up to a final concentration of 5 to 8% w / v in the precipitation medium, while the HDL2 and HDL3 fractions remain in the supernatant, or a precipitate containing the VLDL, LDL and HDL2 fractions is obtained in the precipitation medium by adding polyethylene glycol to a final concentration of 9 to 11% w / v, while the HDL3 fraction remains in the supernatant.
The use of polyethylene glycol as a means of precipitating proteins from body fluids is known per se.
According to one embodiment of the invention, one part of plasma or serum is mixed with two parts of an 8 to 10% polyethylene glycol solution with a pH of 6 to 7, mixed and centrifuged in a centrifuge, with one of the VLDL and LDL Fraction containing precipitate is obtained, while the HDL2 and HDL3 fractions remain in the supernatant.
According to the other embodiment of the method according to the invention, one part of serum or plasma is mixed with two parts of a 14 to 15% polyethylene glycol solution with a pH of 7 to 8, mixed and centrifuged in a centrifuge, with one of the VLDL, Precipitation containing LDL and HDL2 fractions is obtained while the HDL3 fraction remains in the supernatant.
In both embodiments, the cholesterol content of the supernatant is then determined enzymatically or chemically and, based on the known composition of the HDL fractions, the mass of the HDL2 and the mass of the HDL3 are determined. The chemical composition of the HDL fractions is shown in the following table:
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table
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<tb>
<tb>% <SEP> of the <SEP> lipoprotein mass
<tb> fraction <SEP> protein <SEP> phospholipid <SEP> cholesterol <SEP> triglyceride <SEP>
<tb> HDL2 <SEP> 41 <SEP> 35 <SEP> 19 <SEP> 5
<tb> HDLa <SEP> 57 <SEP> 23 <SEP> 16 <SEP> 4
<tb>
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2/3 from cholesterol ester. If the cholesterol value found in the analysis is multiplied by 1.48, the mass of the mixture of free cholesterol and cholesterol ester is obtained.
The method according to the invention is explained in more detail below.
First, the precipitants were prepared, u. between as a precipitant A, a solution with 9.5% polyethylene glycol and a pH of 6.5, and as a precipitant B, a solution with 14.5% polyethylene glycol and a pH of 7.5.
Example 1 :
100 μl of the precipitant A were added to 100 (human serum) in order to achieve a final concentration of 6.3% w / v polyethylene glycol. The mixture was then centrifuged and the supernatant separated. In the supernatant, the cholesterol was determined enzymatically and a value of 55 mg / 100 ml found.
Another 100 gels of the serum were used at 200! of the precipitant B is added to achieve a final concentration of 9.7% w / v polyethylene glycol. The mixture was centrifuged and the cholesterol content in the supernatant determined. A value of 41 mg / 100 ml was found.
The mass of the HDL2 and HDL3 was calculated from the values found using the quantitative ratios given in the table as follows:
55 x 1, 48 = 81, 4 mg / 100 ml cholesterol mass in HDL2 and HDL3 (total HDL)
41 x 1, 48 = 60, 7 mg / 100 ml cholesterol mass in HDL3 81, 4-60, 7 = 20, 7 mg / 100 ml cholesterol mass in HDL2
100: 19 (% cholesterol) = 5, 25: conversion factor for HDL2 mass
100: 16 (% cholesterol) = 6, 25: conversion factor for HDL3 mass
20, 7 x 5, 25 = 108, 7 = mass of the HDL2
60, 7 x 6, 25 = 379, 4 = mass of the HDL3
Example 2:
Two samples of 100 p each. Another serum sample was precipitated with precipitants A and B as described in Example 1.
After the precipitation had been separated off, the phospholipids were determined in the supernatant instead of the cholesterol. The following values resulted: Supernatant after precipitation with precipitant A: 96.5 mg / 100 ml
Phospholipids = phospholipid content in HDL2 + HDL3 (total HDL) supernatant after precipitation with precipitant B: 73.4 mg / 100 ml
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Using the values given in the table, the conversion factors were:
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100: 35 = 2.86 (conversion factor for HDL2)
100: 23 = 4.35 (conversion factor for HDL3) and from this: 23.1 x 2.86 = 66.1 mg / 100 ml HDL2 mass
73.4 x 4.35 = 319.3 mg / 100 ml HDLs mass
Example 3:
Two samples of 100 111 each from a further serum sample were precipitated with the precipitants A and B as described in Example 1.
After each separation of the precipitates, instead of determining the cholesterol or phospholipids, the content of apoprotein AI was determined in the supernatant and the HDLz and HDLs mass were calculated from this:
151 mg / 100 ml apoprotein AI were found in the supernatant after precipitation with precipitant A, 122 mg / 100 ml apoprotein AI in the supernatant after precipitation with precipitant B.
Using the values given in the table, the following HDL2 and HDL3 masses resulted:
41 (% protein in HDL2) x 0.75 = 30.75 - corresponds to% of the apoprotein AI mass in HDL2
100: 30, 75 = 3, 25 = conversion factor for HDL2 mass from apoprotein AI
57 x 0.70 = 39.9 - corresponds to% of the apoprotein AI mass in HDL3
The conversion factor for HDL3 mass from apoprotein AI was found to be 100: 39, 9 = 2, 51.
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122 x 2.51 = 306.2 mg / 100 ml HDL3 mass.
PATENT CLAIMS:
1. A method for separating and optionally determining lipoprotein factors in body fluids by fractional precipitation, characterized in that polyethylene glycol is used as the precipitant, the addition of polyethylene glycol to a final concentration of 5 to 8% w / v in the precipitation medium Precipitation containing VLDL and LDL fractions is obtained, while the HDL2 and HDL3 fractions remain in the supernatant, or by adding polyethylene glycol to a final concentration of 9 to 11% w / v in the precipitation medium
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HDL2 fractions HDLs fraction remains in the supernatant.