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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines lebende Mikroorganismen, insbesondere Lactobacillen, in einer Konzentration von mindestens 108 Keimen/g enthaltenden, insbesondere pulverförmigen, Produktes, wobei die Mikroorganismen sich durch eine gute Stabilität bei Umwelttemperatur und ausgeprägter Säuerungsaktivität auf einem Eiweiss und Kohlehydrat enthaltenden Nährmedium auszeichnen, grampositiv, Katalase negativ sind, auf Lactobacillen-Agar wachsen sowie eine gewisse Toleranz gegenüber Säuren und Gallesalzen besitzen.
Die Tierproduktion war in den letzten Jahrzehnten gekennzeichnet durch eine ständige Ausweitung und Vergrösserung der Produktionsbetriebe. Obwohl in Genetik, Tierhaltung und Tierfütterung grosse Fortschritte gemacht wurden, hat die Intensivierung der Produktion neue Risken mit sich gebracht, u. zw. vor allem die Gefahr der Ausbreitung pathogener Keime.
Unabhängig von der Gefahr der Verbreitung krankmachender Keime wurde festgestellt, dass gewisse Bakterien, die normalerweise Bestandteil der Verdauungsflora sind, die Produktionsleistung der Tiere nachteilig beeinflussen können, ohne dass irgendwelche Krankheitssymptome zu beobachten sind. Die Erkenntnis dieser Tatsache hat zur Entwicklung von Substanzen geführt, deren Zweck es ist, die nachteiligen Einflüsse gewisser Bakterien im Verdauungsbereich nach Möglichkeit auszuschalten. Es handelt sich hiebei vorwiegend um antibakteriell wirkende Substanzen, u. zw. vor allem Antibiotica bzw. chemische Substanzen.
Vor nunmehr gut 30 Jahren sind die ersten"Fütterungsantibiotica"auf den Markt gekommen, und ihre Verwendung hat zunächst stark zugenommen. Seit einiger Zeit wird die Verwendung von antibiotischen Substanzen jedoch immer mehr von der Öffentlichkeit kritisiert, und selbst ursprüngliche Verfechter der Verwendung von antibiotischen Wirkstoffen als "Leistungsförderer" in der Tierernährung äussern sich heute in zunehmendem Masse kritisch. Es geht dabei nicht nur um die Gefahr möglicher Rückstände in den tierischen Produkten, sondern selbst die ursprünglichen Überlegungen, die zur Verwendung von antibiotischen Wirkstoffen geführt haben, werden ange-
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:schalten.
Das zu lösende Problem ist das folgende : Es geht darum, die massive Ausbreitung unerwünschter Keime im Verdauungsbereich zu verhindern ; weniger darum, alle pathogenen Keime von vornherein auszuschalten. Es ist bekannt, dass an der Verwendung eine grosse Anzahl von Bakterien beteiligt ist, eine Flora die nicht nur zahlenmässig, sondern auch artenmässig überaus reichhaltig ist.
Aus Untersuchungen der Verdauungsflora weiss man, dass vor allem drei Gruppen von anaeroben bzw. fakultativ anaeroben Bakterien an der Verdauung beteiligt sind : - die Coliformen : z. B. E. Coli, Klebsiella Specien, Aerobacter sp., Proteus sp., Citro- bacter sp., Pasteurella sp., usw.
- die Lactobacillen : L. acidophilus, L. salvarius, L. fermentum, L. delbruekii, L. brevis, L. plantarum, L. lachmanii, L. lactis - die Streptokokken : S. faecium, S. faecalis, S. avium, S. bovis, usw.
Im Normalfall befindet sich die Verdauungsflora biologisch gesehen im Gleichgewicht und selbst das Vorhandensein potentiell pathogener Keime hat keinerlei Bedeutung für den Gesundheitszustand des Tieres. Erst Stressbedingungen, ungünstige Ernährung oder sonstige ungünstige Umwelteinflüsse können dieses Gleichgewicht stören, es kommt zu einer unkontrollierten Proliferation gewisser Keime. Die Folge sind Verdauungsstörungen, die in extremen Fällen auch zum Tod des Tieres führen können.
In einer Reihe von praktischen und wissenschaftlichen Untersuchungen wurde festgestellt, dass Lactobacillen für die Erhaltung des biologischen Gleichgewichtes der Verdauungsflora von grosser Bedeutung sind. Auch ist bekannt, dass Lactobacillen den Wiederaufbau einer gestörten Verdauungsflora begünstigen. Bereits 1906 hat Prof. E. Metschnikoff (Institut Pasteur/Paris) über die günstige Wirkung von Milchsäurebakterien (in Form von Sauermilch) zur Vermeidung schädlicher Fäulnisvorgänge im Darm berichtet.
Es hat in diesem Jahrhundert auch nicht an Versuchen gefehlt, die ernährungsphysiologisch günstige Wirkung von Milchsäurebakterien in der Tierernährung zu nutzen, und tatsächlich sind
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Erfindungsgemäss wird somit ein Produkt erhalten, das eine hohe Konzentration an milchsäu- reproduzierenden Mikroorganismen, hauptsächlich Lactobacillen, enthält, welche, aus der Natur gewonnen und nach gezielter Selektion standardisiert, vor allem folgende Eigenschaften aufwei- sen : a) Es handelt sich um Milchsäurebakterien (Lactobacillen), definiert durch ihre wesent- lichen biologischen Eigenschaften : grampositiv, Katalase negativ, mit gewisser Toleranz gegenüber Salzsäure und Gallesalzen, Milchsäure produzierend, und wachsend auf Milch- säurebakterien-Selektivagar, z. B.
MRS-Agar (10 g Pepton, 5 g Fleischextrakt, 5 g Hefe- extrakt, 20 g Glukose, 1 g Polyoxymethylensorbitanmonooleat, 2 g di-Ammoniumhydrogen- citrat, 5 g Natriumacetat, 0, 1 g Magnesiumsulfat, 0, 05 g Mangansulfat, 2 g di-Kalium- hydrogenphosphat, 12 g Agar-agar, alles pro Liter). b) Gute Stabilität bei normalen Umweltbedingungen : bei normaler Lagerung haltbar min- destens 6 Monate. c) Hitzestabil : Erhaltung der biologischen Aktivität nach Temperatureinwirkung 10 min
80 C. d) Breites Vergärungsspektrum in unterschiedlichen pH-Bereichen (PH = 3, 5 bis 6) und Ver- mehrung auch in eiweiss- und kohlehydratreichen milchbestandteilfreien Nährmedien.
Erfindungsgemäss stehen die genannten Eigenschaften der im Produkt enthaltenen Lactobacil- len im Vordergrund, wobei die Zuordnung nach Specien zunächst eine geringere Bedeutung hat.
Wie bereits erwähnt, erfolgt die erfindùngsgemässe Gewinnung der Grundkultur durch ge- zielte Selektion, wobei folgende Selektionskriterien aufgestellt wurden : - Stabilität bei normaler Lagerung : nicht nur strikt anaerobes Wachstum, - gute Überlebensfähigkeit bei höheren Temperaturen : es interessieren hauptsächlich ther- mophile Bakterien, - breites Vergärungsspektrum ohne Milchbestandteile : es interessieren Specien mit den ent- sprechenden proteolytischen und amylolytischen Eigenschaften, - physiologische Nützlichkeit speziell als Antagonisten gegen potentiell pathogene Keime :
da pathogene Keime in der Regel sich hauptsächlich bei höheren PH-Werten (etwa neutral) vermehren, interessieren vor allem Milchsäurebakterienarten mit einer ausgeprägten
Säuerungsaktivität, - Toleranz gegenüber Salzsäure (bis etwa 0, 01 Mol) und Gallesalzen (bis etwa 10 g/l).
Das Herstellungsverfahren kann etwa folgendermassen ablaufen.
1. Phase : Gewinnung-Selektion-Standardisierung
2. Phase : Reaktivierung und massive Weitervermehrung
3. Phase : Stabilisierung.
Herstellung im Detail :
Gewinnung der Milchsäurebakterienkulturen-Selektion und Standardisierung
Aus dem Darmbereich von Monogastriden und Pansen von Wiederkäuern wird Inhalt entnom- men und nach vorheriger Anreicherung in Lactobacillen-Bouillon auf Lactobacillen-Agar (z. B.
MRS-Agar) nach den üblichen Methoden Reinkulturen gezüchtet.
Ebenso können Milchsäurebakterienkulturen aus andern natürlichen Quellen, wie Getreide- oder Getreidederivaten und Gras, gewonnen werden.
Die gewonnenen Reinkulturen werden auf geeigneten, sterilen Nährmedien weitervermehrt, wobei die Zusammensetzung des Nährmediums folgende sein kann : 93 Teile Wasser, 7 Teile Nähr- substrat, bestehend aus gleichen Teilen Milchpulver, Malzextrakt und Sojaprotein.
Die gewonnenen Milchsäurebakterienkulturen zeigen eine besonders ausgeprägte Säuerungsak- tivität und weisen bei einer Inkubationstemperatur bis 450C gutes Wachstum auf.
Die auf diese Weise gewonnene Lactobacillenkultur zeichnet sich erfindungsgemäss durch eine für Milchsäurebakterien gute Stabilität, Wachstum auch unter nicht strikt anaeroben Kulturbe- dingungen, ausgeprägte Säuerungsaktivität, breites Vergärungsspektrum, insbesondere auf kohle- hydrat- und proteinreiche Nährmedien, und Wachstum bei unterschiedlichen PH-Werten aus. Unter
Anwendung der Identifizierungskriterien laut Sharpe und Fryer (1963), Reuter (1972) und Demter
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(1967) handelt es sich vorwiegend um Lactobacillen der Specien L. plantarum, L. fermentum, L. Lactis, L. brevis und L. casei.
Die auf diese Weise gezüchteten Kulturen werden anschliessend zusammengemischt und in einer gemeinsamen weiteren Fermentation auf einem nur noch geringe Mengen an Milchbestandteilen enthaltenden Nährmedium weitervermehrt. Die Zusammensetzung des Nährmediums kann folgende sein : pro 1 l Nährlösung :
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<tb>
<tb> 950 <SEP> ml <SEP> Wasser
<tb> 20 <SEP> g <SEP> Malzextrakt
<tb> 20 <SEP> g <SEP> Soj <SEP> aprotein <SEP>
<tb> 10 <SEP> g <SEP> Milchpulver
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Die Nährlösung wird sterilisiert und nach Einimpfung der Kulturen bei 420C bebrütet. Nach Erreichung der maximalen Entwicklung der Keime und Erreichung eines PH-Wertes von weniger als PH = 4 erfolgt die Stabilisierung mittels Trocknung im Vakuum oder Gefriertrocknung.
Die auf diese Weise gewonnene und stabilisierte Grundkultur wird anschliessend für die weitere Vermehrung verwendet.
Reaktivierung und massive Weitervermehrung.
Auf eine sterilisierte Nährlösung mit folgender Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> 950 <SEP> ml <SEP> Wasser
<tb> 20 <SEP> g <SEP> Malzextrakt
<tb> 20 <SEP> g <SEP> Sojaprotein
<tb> 10 <SEP> g <SEP> Milchpulver
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werden 10 g des in Phase 1. gewonnenen Produktes geimpft und bei 42 C bebrütet. Nach etwa 15 h kann ein markantes Absinken des PH-Wertes beobachtet werden und die mikroskopische Untersuchung zeigt eine zunächst noch verschiedenartige Flora, insbesondere Kokken- und Stäbchen- formen, die bei fallendem PH-Wert einheitlicher wird. Die Bebrütung wird solange fortgeführt, bis ein PH-Wert von weniger als PH = 4 erreicht wird. Die nunmehr dominierenden Formen sind stäbchenförmig und grampositiv.
Nach Erreichung eines PH-Wertes von unter 4 erfolgt eine weitere Vermehrung in grösserem Umfange, wobei die Nährlösung etwa folgende sein kann :
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<tb>
<tb> 25 <SEP> l <SEP> Wasser
<tb> 1,2 <SEP> kg <SEP> Malzextrakt
<tb> 1, <SEP> 2 <SEP> kg <SEP> Sojaprotein
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> kg <SEP> Milchpulver
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Es folgt eine neuerliche Bebrütung bei 40 bis 42 C, bis wieder ein PH-Wert von unter 4 erreicht ist, was in der Regel in weniger als 5 h der Fall ist.
Auf dieselbe Art erfolgt eine weitere Vermehrung, wobei der Trockensubstanzgehalt der Nährlösung progressiv erhöht werden kann und die Zusammensetzung des Substrats progressiv verändert wird : Der Anteil von Sojaprotein wird progressiv erhöht, der Anteil von Malz reduziert und der Anteil von Milchpulver komplett eliminiert. In der letzten Fermentationsstufe ist die Zusammensetzung des Nährmediums etwa : 90% Sojaprotein oder Sojaschrot, 10% Malzextrakt. Dabei wird vorteilhaft die abschliessende Fermentation bei höherem Trockensubstanzgehalt, u. zw. 20 bis 60%, vorzugsweise 50%, durchgeführt.
In der letzten Vermehrungsstufe erfolgt eine anaerobe Gärung, die solange fortgeführt wird, bis ein PH-Wert der Masse von etwa PH = 4 erreicht wird. Anschliessend erfolgt die Trocknung des Produktes, wobei als Trocknungsverfahren jede schonende Trocknung mit normaler Luft oder Vakuumtrocknung, natürlich auch Gefriertrocknung, geeignet ist.
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Zwecks Erreichung einer guten Stabilität des Endproduktes ist es zweckmässig, dass die
Teilchengrösse der Fermentationsmasse und/oder die Partikelgrösse des Endproduktes nicht allzu klein ist, vorteilhaft wird in der Fermentationsmasse eine Partikelgrösse von mindestens 1 mm, vorzugsweise 3 bis 5 mm, eingestellt. Dies kann z. B. einfach durch entsprechende Auswahl bzw.
Mahlung des eingesetzten Sojaschrots erfolgen. Im Endprodukt, das mikroverkapselt bzw. be- schichtet werden kann, wird vorteilhaft eine Partikelgrösse von vorwiegend mindestens 0, 2 mm, vorzugsweise jedoch 1 bis 2 mm, eingestellt. Dies erfolgt wieder durch Steuerung der Trocknung und/oder durch Mahlung.
Das erfindungsgemäss erhaltene Endprodukt ist ein teilchen- bzw. pulverförmiges Produkt, das reaktivierungsfähige Mikroorganismen in einer Konzentration von mindestens 10. Keime/g ent- hält, wobei folgende die wesentlichen Merkmale der Keime sind :
Es sind Keime, die auf einem Nährmedium bestehend aus Sojaprotein, Malzextrakt und (vor- teilhaft) geringen Mengen Milchpulver gutes Wachstum zeigen, Milchsäure bilden, grampositiv,
Katalase negativ reagieren und auf Lactobacillen-Agar (z.
B. MRS-Agar von Merck) vorwiegend kleine cremefarbige Kolonien bilden, die ihre wesentlichen Merkmale (wie oben) erhalten, wenn das Produkt nicht länger als 10 min einer Temperatur von 800C ausgesetzt wird, die auf einem Test-Nährmedium, bestehend aus 93 Teilen Wasser, 3 Teilen Sojaprotein, 2 Teilen
Malz und 2 Teilen Milch- oder Molkepulver, bei Impfung von 100 mg des Produktes auf 100 ml
Nährlösung bei Bebrütung bei 42 C in 18 h eine pH-Absenkung von 6 auf etwa 4 bewirken, und die eine gewisse Beständigkeit gegenüber Salzsäure (bis etwa 0, 01 Mol) und Gallesalzen (bis etwa
10 g/l) besitzen.
Das Produkt ist weiter dadurch ausgezeichnet, dass die darin enthaltenen Keime bei normaler
Umwelttemperatur mindestens 6 Monate vermehrungsfähig bleiben, wobei ein gewisser Abbau der Aktivität allerdings möglich ist, dass das Produkt Milchsäure in einer Konzentration von 1 bis
5% enthält und dass die Stabilisierung der Kultur hauptsächlich durch Lufteinwirkung oder im Vakuum erfolgte.
Ein Produkt, das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wurde in zahlreichen Praxis- und Institutsversuchen erprobt, wobei vor allem folgende Wirkungen festgestellt wurden :
1) Bei Ferkeln :
Bessere gesundheitliche Kondition der Tiere, insbesondere während der Abspänphase : geringe Durchfallserscheinungen, bessere Verträglichkeit bei Futterwechsel (von Milch auf Schrote) - besseres Wachstum.
2) Bei Geflügel :
Vermindertes Auftreten von Krankheitserscheinungen in der Intensivhaltung, besserer
Schutz gegen Coccidiose, bessere Ausschlachtungsprozente.
3) Bei Milchmastkälbern :
Verbesserte Futteraufnahme, kaum Blähungen und Durchfall. Besseres Wachstum.
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