AT390267B

AT390267B - Verfahren zum markieren und identifizieren von industriell eingesetzten mikroorganismen, vorzugsweise hefestaemmen

Info

Publication number: AT390267B
Application number: AT148788A
Authority: AT
Inventors: Ulf Dipl Ing Dr Stahl; Johannes Dr Hinrichs
Original assignee: Vogelbusch Gmbh
Priority date: 1988-06-08
Filing date: 1988-06-08
Publication date: 1990-04-10
Also published as: ATA148788A

Description

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Industriestämme häufig homothallisch sind, sind unkontrolliert auftretende Kreuzungen nicht auszuschliessen - komplementiert werden. Das heisst, dass Mutationen nicht generell als stabile Markierungen bezeichnet werden können.

Die Markierung von Stämmen durch Transformation mit einem bestimmten Vektor, der eine selektive Marke beinhaltet, scheint nur dann in stabiler Form möglich, wenn der Vektor in die chromosomale DNA des Rezipientenstammes integriert wird. Andernfalls besteht die grosse Wahrscheinlichkeit, dass der so markierte Stamm, bei Wachstum auf nicht selektivem Medium, die Marke und damit das Identifizierungsmerkmal verliert.

Gemäss "Method for genetically marking yeast" von Clark-Walker und Slattery (WO 87/03298) ist die Markierung von Hefestämmen durch die innerhalb einer Kreuzung atmungsdefekter Mutanten (petites) auftretenden Rekombinationsereignisse auf Ebene der mitochondrialen DNA beschrieben. Diese Rekombinationsereignisse führen zu einer veränderten Lokalisation von Strukturgenen auf der mitochondrialen DNA. Anhand dieser unterschiedlichen Genlokalisation können im Vergleich zum Wildstamm markierte Stämme erkannt werden. Zur Identifizierung der markierten Stämme wird die isolierte, mit Restriktionsenzymen verdaute mtDNA der markierten Stämme gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach Übertragung der Restriktionsfragmente auf Nylonfilter werden diese gegen radioaktiv markierte Proben (z. B.

Restriktionsfragmente, auf denen sich lediglich ein Strukturen befindet) hybridisiert. Anhand der Hybridisationsspots kann dann über die Lokalisation von bestimmten Strukturgenen auf entsprechenden Restriktionsfragmenten geschlossen werden. Im Vergleich zum Wildstamm sind dann markierte Stämme identifizierbar.

Dieses Vefahren ist jedoch lediglich bei petite-positiven Hefen, das sind Hefen (wie z. B. S. cerevisiae), die derartige Atmungsdefektmutanten produzieren, anwendbar. Petite-negative Hefen können durch ein derartiges Verfahren nicht markiert werden. Zudem handelt es sich bei dieser Markierung um keine gesteuerte, d. h. es ist vorher nicht abzuschätzen, wie die Markierung ausfällt. Darüber hinaus besteht ferner auch noch die Möglichkeit, dass Markierungen dieser Art gleichartig ausfallen, so dass verschieden markierte Stämme nicht voneinander unterscheidbar sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine eindeutige und stabile Markierung von Hefestämmen durch gezieltes Einbringen einer bekannten Nukleotidsequenz in das Chromosom zu ermöglichen. Dabei soll der durch die integrierte Sequenz markierte Stamm durch einfache Methoden identifizierbar sein.

Erfmdungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass der die Markierungssequenz aufweisende Vektor frei von einem für den jeweiligen Mikroorganismus erforderlichen Replikationsursprung ist und dass die Markierungssequenz im Genom des zu identifizierenden Mikroorganismus durch eine Hybridisierungssonde identifiziert wird.

Saccharomyces cerevisiae-Stämme, sowohl Labor- als auch Industriestämme, werden mit einem Vektor, der in die chromosomale DNA integriert, transformiert und somit markiert. Dieser Vektor trägt einerseits einen selektiven Marker (ein bakterielles oder eukaryotisches Gen) und andererseits einen dem Hefe-Genom homologen Anteil, der die Integration des Vektors in das Chromosom ermöglicht. Darüber hinaus trägt dieser Vektor einen bakteriellen Replikationsursprung, der seine Amplifikation in Escherichia coli gestattet. Als Markierung zur Identifizierung des Hefestammes trägt der Vektor das G418-Resistenzgen, welches hier ebenfalls zur Selektion der Transformanden herangezogen wird.

Diesem Gen können je nach Wunsch bestimmte Nukleotidsequenzen, die in bestimmten Fällen als Identifizierungsmerkmal dienen sollen, durch Klonierung mit Hilfe der üblichen Methoden der Molekulorbiologie hinzugefügt werden.

Dieser Vektor zeichnet sich dadurch aus, dass er einerseits aufgrund des Fehlens eines HefeReplikationsursprunges nur als in das Chromosom integriert zur Expression kommen kann, andererseits besitzt er eine Erkennungssequenz, die die Identifizierung des Hefestammes ermöglicht
Ein Laborstamm und verschiedene Industriestämme werden mit diesem Vektor, unter Anwendung bekannter Methoden, transformiert, und die Transformanden werden durch DNA-DNA-Hybridisierung mit der Erkennungssequenz identifiziert. Die auf diese Weise transformierten Stämme tragen die Erkennungssequenz als stabiles Merkmal.

Die erzielbaren Vorteile liegen vor allem darin begründet, dass durch das stabile Einführen einer bestimmten Erkennungssequenz dem Markierer eines Stammes ermöglicht wird, diesen immer wieder als von ihm markiert identifizieren zu können. Dabei kann z. B. der gleiche Stamm für unterschiedliche Bedürfnisse verschieden markiert werden. Dies erlaubt eine Identifizierung selbst genetisch und physiologisch gleicher Stämme.

Vorteilhafterweise kann die Hybridisierungssonde radioaktiv markiert sein, wodurch auf einfache Weise, z. B. durch Schwärzung von strahlungsempfindlichen Platten, die markierten Stämme detektiert werden können. Es kann jedoch auch die Hybridisierungssonde durch einen, vorzugsweise fluoreszierenden, Farbstoff markiert sein, wodurch der Einsatz radioaktiver Substanzen vermieden werden kann.

Um die integrierte DNA als stabiles Merkmal zu integrieren, kann es von Vorteil sein, die Industriestämme, die in der Regel ein diploides bzw. polyploides Genom tragen, zuvor zu haploidisieren.

Um Unbefugten eine Überprüfung der Hefe unmöglich zu machen, kann die Markierungssequenz das phänotypische Erscheinungsbild des Mikroorganismus unverändert lassen. Dafür ist es besonders vorteilhaft, wenn die Markierungssequenz durch Herausschneiden mittels Restriktionsenzyms aus einer organismusfremden DNA erzeugt wird.

Anwendungsbeispiele
Material und Methoden
Medien und Anzucht a) Hefe : Vollmedium YE (2 % Glucose, 0, 5 % Hefeextrakt, pH 6, 3 ; bei festem Medium + 2 % Agar-Agar) ; Minimalmedium MM (YNB + Ammoniumsulfat + Aminosäuren (s. Difco Manual 10 (1984)), dem 20 lig/ml Uracil hinzugefügt wurden ; bei festem Medium + 2 % Agar-Agar). Die Anzucht erfolgte bei 270 C im Brutraum ; Flüssigkulturen auf dem Schüttler (100 U/min) bei 27 C.
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Chloramphenicol 30 g/ml, Kanamycin 150 g/ml, Tetrazyklin 25) lg/ml). Die Anzucht erfolgte bei 37 C im Brutschrank bei festem Medium und auf einem Reziprokschüttler (100 U/min) bei 37 C bei Flüssigmedium.

DNA-Isolation a) Hefe : DNA-Schnellaufarbeitung nach Nasmyth und Reed (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,2119-2133 (1980)). b) E. coli Vektoren : Plasmid-DNA-Schnellaufarbeitung nach Grinsted und Bennett (Meth. Microbiol. 17, 123-131 (1984)) ; Plasmid-DNA-Aufarbeitung (für grössere DNA Mengen) nach Bimboim und Doly (Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)).

Restriktionen. Gelelektrophoresen und Ligationen von DNA-Fragmenten
Diese Methoden wurden nach den entsprechenden Kapiteln aus Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1932) durchgeführt.

Transformationen a) Hefe : Kationenmethode nach Ito et al., J. Bacteriol. 153,163-168 (1983) ; Protoplastenmethoden nach Webster und Dickson, Gene 26, 243-252 (1983). b) E. coli : nach Himeno et al., Agric. Biol. Chem. 48, 657-662 (1984).

Radioaktive DNA-Markierung und Filter-Hvbridisierun
Zur radioaktiven Markierung von DNA wurde die"Nick-Translations"-Methode von Rigby et al., J. Mol.

Biol. 113,237-251 (1977), eingesetzt. Die DNA-DNA Filter-Hybridisierung wurde nach Southern, Meth.

Enzymol. 68,152-176 (1979), durchgeführt.

Vektorentwicklung
Siehe dazu auch Fig. 1, in welcher bedeutet : weiss = bakterieller DNA-Anteil ; gepunktet = dem Hefechromosom homologe DNA-Anteile ; schwarz = Erkennungssequenz, hier : Kanamycin-Resistenzgen (entspricht dem G418-Resistenzgen in Hefe) ;
Antibiotikaresistenzen für Ampicillin (Ar), Chloramphenicol (Cr), Kanamycin (Kr) und Tetrazyklin (tir);
Replikationsursprung für E coli (0. E.) ;
LEU 2 und URA 3 = Hefegene für Leucin und Uracil ; Restriktionsschnittstellen für Hind m (H) und BamH I (B) ;
H-Restr. bzw. B-Restr. = Hind m bzw. BamH I Restriktion.

Die 2 J. l mDNA im Plasmid pFL 1 repräsentiert einen Replikationsursprung für Saccharomyces cerevisiae.

Der zu entwickelnde Vektor sollte einerseits dem Hefechromosom homologe Sequenzen besitzen, um eine Integration in das Chromosom zu ermöglichen, und andererseits sollte der Vektor eine Erkennungssequenz enthalten, durch die die jeweiligen Transformanden identifiziert werden können.

Zur Konstruktion eines Vektors mit dem Hefechromosom homologen Sequenzen wurde das Plasmid pDAM 1 (Beach et al., Nature 284,185-187 (1980)) mit dem Restriktionsenzym Hind III verdaut. Eine Restriktionsenzymverdauung mit Hind m wurde ebenfalls bei dem Plasmid pFL 1 (Chevallier et al., Gene 11, 11-19 (1980)) durchgeführt. Nach Vereinigung beider Ansätze und Ligation der DNA-Fragmente resultierte daraus der Vektor pDFM 1. Dieser neue Vektor trägt neben den Antibiotikaresistenzgenen für Ampicillin und Chloramphenicol und dem Replikationsursprung für eine Replikation in E. coli die beiden dem Hefechromosom homologen Sequenzen LEU 2 und URA 3 ; denn bei diesen handelt es sich um ursprünglich aus S. cerevisiae isolierte Gene.

In diesen Vektor wurde in die einzige BamH I-Restriktionsschnittstelle das KanamycinResistenzgen aus dem Plasmid pATK 1531 (Hinrichs, Fibl. Mycol. 118 (1987)) kloniert. Dieses Resistenzgen dient als Erkennungssequenz zur Identifizierung der Transformanden. Zudem kann es auch als Selektionsmarke bei den Transformationen in Hefe eingesetzt werden ; denn dieses bakterielle Resistenzgen verleiht der Hefe Resistenz

gegenüber dem Antibiotikum G418. Aus diesem Grund kann dieses Gen auch in Hefe als G418-Resistenzgen bezeichnet werden. Der resultierende Vektor mit der Bezeichnung pDFKM 2 beinhaltet damit die erforderlichen Sequenzen (s. o. ). Zudem kann er nur als Integrat des Chromosoms zur Expression kommen, da ihm ein Replikationsursprung für die autonome Replikation in Hefe fehlt.

Zudem bietet dieser Vektor die Möglichkeit, an
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Der Laborstamm DBY 747, bei dem es sich u. a. um eine Leucin-Auxotrophie-Mutante (Leu 2) handelt, wurde zunächst nach der Kationen-Methode mit dem Vektor pDFKM 2 zur Leucin-Prototrophie transformiert. Die resultierenden Transformanden wurden danach auf G418-haltiges (280 tg/ml) Vollmedium gesetzt und auf Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum geprüft. Da der Stamm DBY 747 gegenüber dieser G418-Konzentration sensitiv ist, können auf diesen Platten lediglich die Transformanden wachsen. Dies konnte bei allen zur Leucin-Prototrophie transformierten Stämmen beobachtet werden.

Zur Überprüfung der Integration des Plasmids in die chromosomale DNA wurde die Gesamt-DNA der Transformanden isoliert. Mit dieser DNA wurde der E. coli-Stamm SF8 transformiert. Da aus diesen E. coliRücktransformationen keine Kanamycin-resistenten Klone resultierten, konnte angenommen werden, dass die Plasmid-DNA integriert wurde.

Daraufhin wurde die isolierte DNA der Transformanden mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach Übertragung der Restriktionsfragmente auf Nitrozellulose-Filter wurden diese Filter gegen das radioaktiv markierte G418-Resistenzgen hybridisiert. An Hand dieser Hybridisierungsdaten konnte die Erkennungssequenz als in das Chromosom integriert identifiziert werden.

Bei diesem Integrat handelt es sich um ein sehr stabiles ; denn nach 4wöchiger Haltung auf nicht selektivem Medium (Vollmedium ohne G418 Zugaben), dabei wurden die Stämme wöchentlich auf frisches Medium gesetzt, waren noch 97, 5 % (das sind 233 von 239 Transformanden) G418 resistent. Das heisst, die integrierte Erkennungssequenz wird auch bei längerem Wachstum auf nicht selektivem Medium im integrativen Zustand beibehalten.

Beispiel 2
Markierung des Industriestammes ATH II mit dem G418 Resistenzgen
Der Industriestamm ATH II wurde zunächst auf Sensitivität gegenüber G418 überprüft. Es zeigte sich, dass dieser Stamm bei der hier angewandten Konzentration von 280 Jlglml sensitiv gegenüber dem Antibiotikum ist.

Der Stamm ATH II wurde nach der Protoplastenmethode mit dem Vektor pDFKM 2 (s. Abb. 1) transformiert. Bei dieser Transformation wurde die Erkennungssequenz, das G418-Resistenzgen, gleichzeitig auch als selektive Marke herangezogen. Von den resultierenden Transformanden, diejenigen Stämme, die auf G418-haltigem Medium wuchsen, wurde die Gesamt-DNA isoliert und in E. coli- Rücktransformationen eingesetzt. Da keine Rücktransformanden festgestellt werden konnten, konnte von einer Integration des Vektors in die chromosomale DNA des Industriestammes ausgegangen werden. Diese These wurde durch Hybridisationsexperimente gegen das radioaktiv markierte G418-Resistenzgen bestätigt.

Zur Überprüfung der stabilen Integration der Erkennungssequenz in das chromosomale Genom wurden 52 Transformanden auf selektivem (YE-Medium + G418) und nicht selektivem Medium (YE ohne G418) angezogen. Jeweils nach 4 Tagen wurden die Ansätze auf frisches Medium gesetzt. Diese Untersuchungen wurden sowohl auf festen als auch in flüssigen Medien durchgeführt. Nach 13 Passagierungen trugen von den 52 Transformanden noch 4 (das entspricht 7, 7 %) das G418-Resistenzgen und damit die Erkennungssequenz. Diese 4 Transformanden blieben auch nach 14 Passagierungen unverändert stabil.

Die Experimente zeigen, dass Industriestämme mit einer Erkennungssequenz, wenn integriert in das Chromosom, stabil markiert werden können, wenn auch der Prozentsatz der stabilen Transformanden bei Industriestämmen deutlich geringer ist als bei dem Laborstamm.

Beispiel 3
Markierung des Industriestammes ATH n mit einer Erkennungs- 8eQJ1enz
Als Erkennungssequenz zur Identifizierung des markierten Industriestammes ATH II (s. Bsp. 2) wurde ein 0, 8 kb Pst I-Restriktionsfragment aus der Sulfonamid-Resistenz des Plasmides R300B (dieses Plasmid ist identisch mit den Plasmiden RSF1010 und R1162) (Haring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,6090-6094 (1985)) in den mit Pst I partiell verdauten Vektor pDFKM 2 so kloniert, dass die bisher auf dem Vektor pDFKM 2 lokalisierten genetischen Marken (wie das G418-Resistenzgen oder das LEU 2 Gen) nicht beeinträchtigt werden.

Siehe dazu Fig. 2, in welcher bedeutet : weiss = bakterieller DNA-Anteil ; gepunktet = dem Hefechromosom homologe DNA-Anteile ; schwarz = Selektionsmarke in Hefe, hier

Kanamycin-Resistenzgen (entspricht dem G418-Resistenzgen in Hefe) ; gestreift = Erkennungssequenz, hier : ein Teil des Sulfonamid-Resistenzgenes aus dem bakteriellen Vektor R300B ;
Antibiotikaresistenzen für Ampicillin (Ar), Chloramphenicol (Cr), Kanamycin (Kr), Sulfonamid (Sur) und
Streptomycin (Smr)
Replikationsursprung für E. coli (o. E.) ;
LEU 2 und URA 3 = Hefegene für Leucin und Uracil ;
Restriktionsschnittstellen für das Enzym Pst I (Pst I) ; Pst I-Restr. = Restriktion mit dem Enzym Pst I.

Mit diesem neu erhaltenen Vektor wurde der Industriestamm ATH U transformiert. Eine Selektion auf mögliche Transformanden erfolgte auf G418 enthaltendem Medium (s. Bsp. 2). Von den resultierenden Transformanden wurde die Gesamt-DNA isoliert und in E. coli-Rücklransformationsexperimenten eingesetzt. Da keine E. coli-Rüchtransformanden auftraten, konnte eine Integration des Vektors in die chromosomale DNA des Stammes ATH II angenommen werden. Diese Annahme wurde durch DNA-DNA-Hybridisierungsexperimente mit radioaktiv markierter, isolierter 0, 8 kb Pst I-Restriktionsfragment DNA gegen die isolierte Gesamt-DNA der Transformanden bestätigt.

Die stabile Integration der Erkennungssequenz in das Chromosom des Stammes ATH n wurde durch Anzucht der Transformanden auf selektivem (YE + G418) und nicht selektivem Medium (YE ohne G418) überprüft. Dabei zeigten nach 20 Generationen Wachstum auf nicht selektivem Medium 5 - 10 % der Transformanden Resistenz gegenüber G418. Diese wurden dann durch Hybridisation (s. o. ) auf die Anwesenheit der Erkennungssequenz, integriert ins Chromosom, überprüft. Es zeigte sich, dass sämtliche stabilen Transformanden die Erkennungssequenz trugen.

Identifizierung der Erkennungsseqpenz durch nicht-radioaktive Hybridisierung
Als Alternative zur Identifizierung der in das Hefechromosom integrierten Erkennungssequenz durch radioaktive Hybridisierung kann ebenso eine nicht-radioaktive Hybridisierung herangezogen werden.

Dabei kann die Markierung der DNA auf enzymatischem (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,
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erfolgen. Die so in die DNA eingeführte Markierung kann visuell detektiert werden. Unter diesen Methoden wird bei der vielversprechendsten Biotin (Vitamin H) als nicht-radioaktive Markierung genutzt (Langer et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 80,4045-4049 (1983)). Bei dieser Methode werden Nukleotide über die Position 5 des Pyrimidinrings und einen Allylamin-Arm an ein Molekül Biotin gekoppelt. Diese Nukleotidderivate verhalten sich in der "Nick translation" wie ihre unsubstituierten Analoga und werden an deren Stelle in die DNA eingebaut. Die Detektion der markierten DNA erfolgt über ein Avidin-Enzym- bzw. Streptavidin-EnzymKonjugat. Die Interaktion zwischen Avidin oder Streptavidin und Biotin besitzt eine sehr hohe Bindungskonstante. Durch Bindung z. B. eines fluoreszierenden Farbstoffes an Avidin oder Streptavidin können dann bereits geringste Mengen Biotin als Farbspot auf dem Träger sichtbar gemacht werden.

Diese Methode wurde bis heute derartig optimiert, dass sie in der Effektivität einer radioaktiven Hybridisierung kaum nachsteht
Die beschriebene Methode der genetischen Markierung von Stämmen durch integrierte DNA-Sequenzen lässt sich nach Schaffung gewisser Voraussetzungen auch auf von Hefen verschiedenen Organismen anwenden. Zu diesen Voraussetzungen gehören die Erstellung eines geeigneten Transformation- und Selektionssystems je nach ausgewähltem Organismus, sowie die Konstruktion von entsprechenden Vektoren. So ist eine derartige Markierung z. B. bei dem Schleimpilz Dictyostelium discoideum denkbar. Hier könnte z. B. das klonierte AlphaAktinin-Gen als homologe Sequenz und das Neomycin-Resistenzgen als selektive Marke dienen (s. dazu Witke et al., EMBO J. 6,4143-4148 (1987)).

Bei Verfahren, bei welchen die Selektionssequenz von der Markierungssequenz verschieden und getrennt ist, kann die Selekdonssequenz am Ende des Verfahrens wieder aus dem Genom, z. B. durch Verlustmutation od. dgl., entfernt werden, wodurch erreicht wird, dass der Mikroorganismenstamm keinen äusserlichen Hinweis auf eine etwaige Markierung zeigt.

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Markieren und Identifizieren von industriell eingesetzten Mikroorganismen, vorzugsweise Hefestämmen, wobei eine Markierungssequenz in das Genom des Mikroorganismus eingeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der die Markierungssequenz aufweisende Vektor frei von einem für den jeweiligen Mikroorganismus erforderlichen Replikationsursprung ist, und dass die Markierungssequenz im Genom des zu identifizierenden Mikroorganismus durch eine Hybridisierungssonde identifiziert wird. <Desc/Clms Page number 6>
2. Verfahren noch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde radioaktiv markiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde durch einen, vorzugsweise fluoreszierenden, Farbstoff markiert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zu markierenden Mikroorganismenstämme vor der Integration des Vektors haploidisiert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssequenz das phänotypische Erscheinungsbild des Mikroorganismus unverändert lässt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssequenz durch Herausschneiden mittels Restriktionsenzymen einer organismusfremden DNA erzeugt wird.