AT397437B - Hybridzellinien zur herstellung monoklonaler antikörper gegen bromnicotinsäure und 1-methyl- 10alpha-methoxydihydrolysergol; antikörper und verfahren zu ihrer herstellung; ihre diagnostischeverwendung und diese antikörper enthaltende diagnostische zusammensetzung - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft neue Hybridzellinien für die Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper gegen zwei Haptene, nämlich Bromnicotinsäure (BNS) und 1 -Methyl-1 Οα-methoxy-dihydrolysergol (NIC), die durch chemischeSpaltungaus Nicergolin abgeleitet wurden,sowiedie von diesenHybridzellinien gebildeten monoklonalen Antikörper, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, diese Antikörper enthaltende Präparate und ihre diagnostische Verwendung.

DieMöglichkeit, durchFusion von Mausmyelomzellen mit Milzzellen von immunisierten Mäusen Hybridzellinien zu gewinnen, die nach entsprechender Klonierung permanent monoklonale Antikörper gewünschter Spezifität produzieren, wurde erstmals von Köhler und Milstein 1975 (Nature 256,495-497) beschrieben. Seit dieser Zeit wird diese Methode vielfach eingesetzt.

Gemäß vorliegender Erfindung werden monoklonale Antikörper gebildet, die zum Nachweis von intakten Nicergolinmolekülen diagnostisch angewendet werden können. Ausgangspunkt für die Gewinnung dieser monoklonalen Antikörper ist die Spaltung des Nicergolins in BNS und NIC und die Kupplung der einzelnen Spaltprodukte an entsprechende Trägersubstanzen, z. B. Rinderserumalbumin, zur Gewinnung immunogener Konjugate. Im weiteren «folgt die geeignete Immunisierung von Versuchstieren (Mäusen) zur Vorbereitung der Zellfusion, u. zw. Grundimmunisierung mitBNS- bzw. NIC-Konjugat, insbesondere Rinderserumalbuminkonjugat, in komplettem Freund'schen Adjuvans subkutan und nach drei Wochen die Nachimmunisierung mit dem entsprechenden Konjugat, insbesondere Rinderserumalbuminkonjugat, in inkomplettem Freund'schen Adjuvans intraperitoneal; jeweils 25 pg/Maus/Immunisierungsschritt. Die Zellfusion wird nach der zitierten Methode von Köhler und Milstein durchgeführt. Die Auslese der relevanten Hybridzellinien erfolgtnach einem ELISA (enzymelinked immunosorbentassay)-Verfahren. Hiebei werden beispielsweise Mikrotiterplatten parallel mit Rinderserumalbumin und Rinderserumalbuminkonjugat zur Testdurchführung nach Standardverfahren beschichtet Selektioniert werden nur Antikörper und die zugehörigen Zellkulturen, die mit dem Konjugat eine deutlich positive Reaktion ergeben, mit dem Träger, z. B. Rinderserumalbuminträger, allein jedoch keine positive Reaktion ergeben. Die Spezifität der ausgesuchten Klone für das intakte Nicergolin wird durch kompetitive Inhibition der Reaktion der jeweiligen Antikörper gegen das zugehörige Konjugat im ELIS A-Test durch den Zusatz des nativen Nicergolins überprüft Es wurden drei Hybridkulturen mitProdukten der gewünschten Antikörper gegen NIC (benannt NIC-1, -2, -3) und zwei Kulturen mit Antikörperproduktion gegen BNS (benannt BNS-1 und -2) gefunden. Weiters wurde gefunden, daß durch geeignete Modifikation des ELISA-Nachweissystems ein unmarkierter Antikörper der BNS-Serie mit einem markierten, z. B. biotinylierten Antikörper der NIC-Serie zu einem Meßsystem für das intakte Ausgangsmolekül kombiniert werden kann. Damit ist erstmals mit Hilfe monoklonaler Antikörper der diagnostische Nachweis des nichtmetabolisierten Nicergolins möglich.

Gegenstand der Erfindung sind somit monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus-Antikörper, welche a) in einem ELISA-Test mit einem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NICOH- Rinderserumalbuminkonjugat (l-Methyl-10a-methoxy-dihydrolysergol-17-hemisuccinat-Rinderserumalbuminkonjugat), positiv reagieren, und b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Rinderserumalbumin, nicht reagieren.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung werden die monospezifischen Antikörper, insbesondere monoklonalen Maus-Antikörper, durch Zusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Test-system in ihrer Reaktivität mit dem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbumihkonjugat, inhibiert Diese monospezifischen Antikörper besitzen also eine Spezifität für das native Nicergolin. Nach Reinigung aus Serum bzw. Aszitesflüssigkeit von Mäusen und nachfolgender Biotinylierung nach Standardverfahren unter Verwendung von Avidin-Peroxidasekonjugaten reagieren die erfindungsgemäßen Antikörper im ELISA-Test mit NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbuminkonjugat Die Biotinylierung erfolgt mit 200 pg N-Biotinsuccinimidester/mg gereinigter Antikörper in 0,1 molarem Natriumhydrogencarbonatpuffer während 4 Stunden bei Raumtemperatur.

Gegenstand der Erfindung sind weiters monospezifische Antikörper, insbesondere Maus-Antikörper, welche a) ineinemELISA-TestmiteinemBNS-Konjugat,insbesondereBNS-Serumalbuminkonjugat(5-Bromnicotin-säure-Rinderserumalbuminkonjugat) positiv reagieren, und b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Serumalbumin, nicht reagieren.

Durch Zusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELIS A-Testsystem werden die Antikörper in ihrer Reaktivität mit dem BNS-Konjugat, z. B. Serumalbuminkonjugat, inhibiert. Auch diese monoklonalen Antikörper besitzen eine Spezifität für das native Nicergolin.

Nach Reinigung aus Serum bzw. der Aszitesflüssigkeit von Mäusen binden die Antikörper nach ihrer -2-

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Immobilisierung an die Oberfläche von Kunststoffen (z. B. Mikrotiterplatten, magnetische Partikel) oder anorganischen Trägem das intakte Nicergolinmolekül.

Der Umstand, daß diese erfindungsgemäßen Antikörper das intakte Nicergolinmolekül binden, kann mit biotinylierten Anti-NIC-Antikörper nachgewiesen weiden. 5 Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti körpern - gemäß der Erfindung bereitgestellt, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Erzeugung von immunologisch aktiven NIC-OH- bzw. BNS-Konjugaten, z. B. Serumalbuminkonjugaten; b) Grundimmunisierung von Mäusen mit einer Suspension oder Lösung der entsprechenden Konjugate in 10 komplettem Freund'schen Adjuvans subkutan; c) Nachimmunisierung der behandelten Mäuse mitdemselben Konjugatin inkomplettem Freund'schen Adjuvans intraperitoneal 3 Wochen nach der Grundimmunisierung; d) Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und Bereiten einer Suspension von Milzzellen; e) Fusion der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors; 15 f) Verdünnen und Vermehren der vereinigten Zellen in getrennten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einem

Selektionsmedium, welches nur das Wachstum von Hybridzellen unterstützt; g) Auswerten des Überstandes in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten mit positivem Hybridwachstum hinsichtlich des Vorliegens eines Antikörpers der gewünschten Spezifität durch paralleles Testen zweier Überstandsaliquote in einem ELISA-Testsystem mit immobilisiertem Träger als negative Kontrolle und 20 NIC-OH-bzw. BNS-Konjugat als positive Testsubstanz; h) Klonierung der Hybride mit der gewünschten Reaktivität nach der Methode der "limitierenden Verdünnung"; i) Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand; j) Überprüfung der Reaktivität der entsprechenden selektionierten Antikörper mit dem nativen Ausgangsmolekül durch Nachweis der kompetitiven Inhibition nach Zusatz von steigenden Konzentrationen des 25 Ausgangsmoleküls im ELISA-Test; k) Selektion und zweite Klonierung der überprüften Hybridzellinien, sowie die Überprüfung der Klone auf intraperitonealem Wege in Pristan-vorbehandelten Mäusen; und l) Ernten der malignen Asziten aus den genannten Mäusen, welche die gewünschten Antikörper enthalten und Reinigung der Antikörper nach Standardtechniken. 30

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Konjugate, z. B. Rinderserumalbuminkonjugate, und der damit erzeugten monoklonalen Antikörper zur Erfassung und quantitativen Bestimmung des Nicergolins. Als Testprinzip wird dabei die kompetitive Inhibition der Reaktion zwischen spezifischen monoklonalen Antikörpern und zugehörigem immobilisiertem Konjugat in einem ELIS A-System zur quantitativen Bestimmung angewandt. Als Proben 35 können wässerige Lösungen und Plasma- oder Serumproben verwendet werden. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit kann der Test auch in gleicher Art mit nach Standard verfahren jodierten Antikörpern der angegebenen Spezifität oder mit jodierten Serumalbuminkonjugaten durchgeführt werden.

Die Konjugate, z. B. Rinderserumalbuminkonjugate, und die zugehörigen monoklonalen Antikörper, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden, können in gleichartigen Standardtechniken zur quantitativen 40 Messung der als Hapten verwendeten Substanzen unterModifikation des Antigen- oder Antikörperimmobüisierungs- verfahrens (Papier, Plastikkugel, Magneipartikel u. a.), sowie des Antikörper- oder Antigennachweisverfahrens verwerdet weiden.

Die Erfindung besteht ferner in einem Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung des nichtmetabolisierten Nicergolins unter Verwendung von gereinigten Anti-BNS-Antikörpem (BNS-1 oder 2) in 45 Kombination mit Anti-NIC-Antikörpern, wobei entweder die Anti-BNS-Antikörper oder die Anti-NIC-Antikörper in geeigneter Weise, z. B. durch Biotinylierung oder radioaktive Markierung, zum Nachweis modifiziert wurden. Als Proben können auch hier wässerige Lösungen und Plasma- oder Serumproben verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert: 50 Beispiel 1

Alkalische Hvdrolvse von Nicergolin 5,0 g (16,6 mMol) Nicergolin werden in 150 ml 12%iger methanolisch-wässeriger Kalilauge unter Lichtausschluß und Rückfluß 2 Stunden gekocht.

Die erkaltete, hellgelbe Lösung wird zweimal mit je 75 ml Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroform- 55 auszüge werden solange mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Chloroformphase einrotiert und der gelbliche, harzartige Rückstand aus wenig Aceton kristallisiert: l-Methyl-10a-methoxy-dihydrolysergol. -3-

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Ausbeute: 2,85 g (91 % der Theorie, 98,9 % rein - HPLC)

Schmelzpunkt: 214 - 216 °C (Zers.), nicht korrigiert. UV-Spektrum: Absorptionsmaximum bei 225 nm: = 32500

Absorptionsmaximum bei 292 nm: =8340

Infrarotspektrum: Carbonylvalenzschwingung (Ester) bei 1720 cm'1 fehlt 13C-Kemresonanzspektrum: 135,20 ppm C16 70/28 ppm C5 130,32 ppm Cll 66,04 ppm 07 126,48 ppm C15 60,75 ppm C7 123,08 ppm 03 49,33 ppm OCH3 an CIO 121,40 ppm C2 43,86 ppm CH3 an N6 115,00 ppm 02 3436 ppm CHt an NI 110,60 ppm C3 32,61 ppm C8 108,68 ppm 04 30,37 ppm C9 73,73 ppm CIO 2239 ppm C4

Massenspektrum: m/e = 300 Molekülpeak (= Basispeak) m/e = 285 Molekülion - Methyl m/e = 270 Molekülion - zwei Methylgruppen Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60:

Fließmittel Chloroform/Methanol/Wasser 90+10+1 hRf Nicergolin - 50 hRfMMD= 13

Fließmittel Methanol hRf Nicergolin = 39 hRfMMD = 22 HPLC: an RP18,7 pm mit Fließmittel Acetonitril/Wasser/Triethylamin 44 + 45 + 1

Retentionszeit Nicergolin: 7,98 Minuten Retentionszeit MMD: 1,91 Minuten

Die mit dem Waschwasser vereinigte alkalische wässerige Phase wird mitrauchender Salzsäure auf pH 1 gestellt, mitPropanol versetzt und eingeengt. Anschließend wird dreimal mit je 100 ml Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformextrakte mit 0,1 M Salzsäure gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und einrotiert. Der farblose, mikrokristalline Rückstand wird aus wenig heißem Wasser umkristallisiert: 5-Bromnicotinsäure.

Ausbeute: 251 mg (12 % der Theorie)

Schmelzpunkt: 176 °C, nicht korrigiert UV-Spektrum: Absoiptionsmaximum 273 nm: = 3150

Infrarotspektrum: ident mit Vergleichssubstanz Char.Banden: Carbonylvalenzschwingung (Carbonsäure) 1675 cm'1

Kombinationsschwingung C-Br 1015 cm'1 Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60:

Fließmittel Chloroform/Methanol/Wasser 90+10+1 hRf Bromnicotinsäure = 8 Fließmittel Methanol hRf Bromnicotinsäure = 62 HPLC an RP 18,7 μη» mit Fließmittel Acetonitril/Wasser/Triethylamin 44 +45 + 1 Retentionszeit Bromnicotinsäure: 0,91 Minuten

Beispiel 2

Antigensvnthese mit 5-Bromnicotinsäure als Hapten

Zur Herstellung der Haptenlösung werden 404 mg 5-Bromnicotinsäure (2 mMol) in 25 ml getrocknetem Dioxan suspendiert, auf Zusatz von 480 μΐ Tri-N-Butylamin (2 mMol) tritt Lösung ein. Die auf 12 °C gekühlte Lösung wird -4-

AT 397 437 B mit 260 [d Chlorameisensäureisobutylester (2 mMol) versetzt und 30 Minuten bei 12 °C gerührt

Zur Herstellung der Trägerlösung werden 2,0 g Rinderserumalbumin (0,02 μΜοΙ) in 67 ml destilliertem Wasser gelöst der pH-Wert wird mit 1M Natronlauge auf pH 9,5 gestellt Nach Zusatz von 45 ml Dioxan wird auf 4 °C gekühlt 5 Die Haptenlösung wird mit der Trägerlösung vereinigt und der pH-Wert während der ersten zwei Stunden mit

Natronlauge nachgestellt Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wird die Lösung unter zehnmaligem Wechsel gegen 2 Liter destilliertem Wasser dialysiert danach auf pH 4,6 gestellt der Niederschlag bei 7500 rpm (SS34) abzentrifugiert und der Überstand mit dem vierfachen Volumen versetzt Die trübe Lösung wird über Nacht bei 4 °C stehen gelassen und anschließend der Niederschlag wie oben abzentrifugiert 10 Die vereinigten Niederschläge werden lyophilisiert.

Ausbeute: 861 mg Konjugat (43 % der Theorie) UV-Differenzspektrum: in 0,6 % Tris/HCl-Puffer pH 8,6, der 0,3 % Natriumdodecylsulfatenthält41 Mol Bromnicotinsäure pro Mol Rinderserumalbumin (Meßwellenlänge: 273 nm) 15 Dinitrofluorbenzol-Test nach F. SÄNGER, Biochem. J. 45,565 (1949): 26,4 derivatisierte Aminogruppen pro Mol Rinderserumalbumin

Trinitrobenzolsulfonsäure-Test nach A. F. S. A. HABEEB, Anal. Biochem. 14,328 (1966), modifiziert 46,2 derivatisierte Aminogruppen pro Mol Rinderserumalbumin SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoiese unter reduzierenden Bedingungen nach U. K. LAEMMLI, Nature 227. 20 680(1970)

Deutliche Beeinflussung der Wanderungsweite (Rindersaumalbumin 66 kDa, Bromnicotinsäurekonjugat 57kDa)

Beispiel 3 25 Synthese von l-Metvhl-10a-methoxv-dihvdrolvsergol-17-hemisuccinat 300 mg l-Methyl-10a-methoxy-dihydrolysergol (1 mMol) und 400 mg Bemsteinsäureanhydrid (4 mMol) werden in 30 ml getrocknetem Pyridin suspendiert und unter Lichtschutz und Feuchtigkeitsausschluß vier Stunden bei 62 °C unter Rückfluß erwärmt.

Die Reaktionslösung wird einrotiert und am Rotavapor getrocknet, bis kein Pyridingeruch mehr wahrnehmbar 30 ist Der gelbliche Rückstand wird in 50 ml destilliertem Wasser aufgenommen und zweimal mit je 50 ml Ether ausgeschüttelt, um bräunliche Zersetzungsprodukte zu entfernen. Die wäßrige Lösung wirdeinroäeit, in Chloroform aufgenommen und die überschüssige Bemsteinsäure abfiltriert (Ausbeute: 382 mg, 95 % der Theorie).

Durch Chromatographie an 180 g Kieselgel 60 mit Methanol - Wasser (4 + 1) wird eine fatblose, hairartige Substanz erhalten, die aus Aceton - Wasser umkristallisiert wird. 35

Ausbeute: 290 mg (76 % der Theorie)

Schmelzpunkt: 91 °C, nicht korrigiert. UV-Spektrum: Absorptionsmaximum bei 232 nm: Emojar = 18600 - Absorptionsmaximum bei 295 nm: E^^=5200 40 Infirarotspektrum: Carbonylvalenzschwingung (gesättigte Ester) 1730 cm'^

Massenspektrum: m/e - 400 Molekülpeak m/e = 385 Molekülion - Methyl m/e = 300 l-Methyl-10a-methoxydihydrolysergol 45 m/e = 268 Basispeak

IO JC-Kemresonanzspektrum:

176,53 ppm C4’ 68,71 ppm C5 172,93 ppm CI' 66,29 ppm C17 50 135,13 ppm C16 58,92 ppm C7 128,76 ppm Cll 49,37 ppm OCH3 an CIO 126,17 ppm C15 41,96 ppm CHo anN6 123,52 ppm C13 32,70 ppm C8 121,55 ppm C2 30,69 ppm C2’,C4’ 55 115,05 ppm C12 30,19 ppm C9 109,25 ppm C14 21,57 ppm C4 73,56 ppm CIO 5-

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Da die Signale für C13 und CHj an NI fehlen, werden 100 mg des Hemisuccinates der alkalischen Hydrolyse wie unter 1) beschrieben unterworfen und analog aufgearbeitet.

Ausbeute: 85,6 mg (85,6 % der Theorie)

Das Hydrolysepiodukt (l-Methyl-10a-methoxy-dihydrolysergol) ergibt folgende Signale: 135,14 ppm C16 70,22 ppm C5 130,23 ppm Cll 65,98 ppm C17 126,40 ppm C15 60,70 ppm C7 123,10 ppm C13 49,32 ppm OCH3 an CIO 121,39 ppm C2 43,85 ppm CH3 an N6 114,98 ppm C12 34,30 ppm CH3 an NI 110,49 ppm C3 32,63 ppm C8 108,70 ppm C14 30,29 ppm C9 73,68 ppm CIO 22,33 ppm C4 Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60: Fließmittel Methanol/Wasser4 +1 Fließmittel hRf 1-Methyl-lOa-methoxydihydrolysergol = 12 hRf MMD-17-Hemisuccinat = 43 Methanol/Wasser 1 + 1 Beispiel 4 hRf MMD = 1 hRf MMD-17-Hemisuccinat = 50,5

Antigensvnthese mit 1 -Meth vl-1 Οα-methoxvdihvdrolvsergol-17-hemisuccinat als Hapten

Zur Herstellung der Haptenlösung werden 420 mg MMD-17-Hemisuccinat (1,05 mMol) in 8,4 ml getrocknetem Dioxan suspendiert, auf Zusatz von 251 μΐ Tri-N-Butylamin tritt Lösung ein. Die auf 12 °C gekühlte Lösung wird mit 138 μΐ Chlorameisensäureisobutylester (1,05 mMol) versetzt und 30 Minuten bei 12 °C gerührt.

Zur Herstellung der Trägerlösung werden 640 mg Rinderserumalbumin (9,84 pmMol) in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Mit 1N NaOH wird der pH-Wert auf 9,0 eingestellt Nach Zusatz von 13,3 ml Dioxan wird auf 4 °C gekühlt

Die entsprechenden Volumina Hapten- und Trägerlösung (siehe Tabelle) werden vereinigt und der pH-Wert während der ersten 2 Stunden durch Zusatz von 1N Natronlauge zwischen 7,0 und 8,0 gehalten. Danach wird über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (zehnmaliger Wechsel) wird die Lösung lyophilisiert

Molares Verh. H2 N-Träger/Hapten μΐ Trägerlösung μΐ Wasser-Dioxan (3 + 2) μΐ Haptenlösung Mol Hapten/ Mol Träger (* 1:0,5 5120 2589 381 12,0 1:1 5120 2209 761 13,7 1:1,5 5120 1829 1141 32,8 1:2 5120 1448 1522 36,4 1:2,5 5120 1067 1903 46,8 1:3 5120 687 2283 19,9 (*: Bestimmung durch UV-Differenzspektroskopie bei 295 nm)

Es ist daher die Belegungsrate durch Variation des molaren Verhältnisses der Reaktionspartner zueinander steuerbar.

Zur Immunisierung wird ein Konjugat im Verhältnis von 1:1,3 verwendet (Ausbeute: 62 %).

Belegung mit Hanten: a) Differenzspektrum: 23,2 Mol Hapten/Mol Träger b) Dinitrofluorbenzoltest: 25,4 Mol/ Mol Träger -6-

AT 397 437 B c) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese: ^Konjugat ~ ™ einer Kopplungsrate von 30 Mol Hapten/Mol Träger

Zum Nachweis, daß das Hapten durch die Kopplungsreaktion nicht verändert wird, wird eine Reaktion 5 entsprechend Beispiel 4 durchgeführt, wobei anstatt Rinderserumalbumin als Träger die doppelte molare Menge 6-

Aminocapronsäure verwendet wird.

Zur Aufarbeitung wird der Reaktionsansatz nach Stehen über Nacht bei 4 °C mit 1M Salzsäure neutralisiert und nach Zusatz von Propanol einrotiert Der Rückstand wird in Chloroform/Methanol 1 + 1 aufgenommen und durch präparative Dünnschichtchromatographieauf Kieselgel 60 mitChloroform/Wasser 1 + 1 als Fließmittel aufgereinigt 10 Die Bande wird mit der Chloroform-Methanol-Mischung eluiert (hRf = 23). 21 mg des Amides mit 6-Aminocapronsäure werden wie unter 1) beschrieben alkalisch hydrolysiert

Ausbeute: 9,7 mg öliger Rückstand Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60: In den Fließmitteln Methanol und Methanol/Wasser 4+1 zeigen das Hydrolyseprodukt und 1 -Methyl-1 Οα-methoxydihydrolysergol den gleichen Rf Wert 15 Im folgenden Formelschema ist die Antigensynthese gezeigt: 20 25 30

35 1-Methyl-lOa-methoxy-dihydrolysergol 40 45 50 5-Bromnicotinsäure

5-Bromnicotinsäure- Rinderserumalbumin-Konjugat 1-Methyl- 10a-methoxy-dihydrolysergol-17-hemisuccinat

z -7- 55

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l-Methyl-10a-methoxy-dihydrolysergol-17- hemisuccinat-Rinderserumalbumin-Konjugat

Beispiel 5

Selektion eines spezifisch reaktiven Hvbrids gegen das NIC-Rinderserumalbuminkoniugat 25 Mg NIC-Rindcrscramalbuminkonjugat weiden in 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufge-nommen und mit einer ansprechenden Menge dieser Lösung werden die Näpfe einer Mikrotiteiplatte (ΙΟΟμΙ/Napf) beschichtet (24 Stunden,4 °C). Als Kontrollplatte werden die Näpfe einer Mikrotiterplattemitdem nichtderivatisieiten Rinderserumalbumin beschichtet. Nach dem Waschen der Platten mit PBS werden jeweils ein Napf der Test- und Kontrollplatte mit 50 μΐ desselben Hybridüberstandes inkubiert (2 Stunden, 37 °C). Überschüssiger Antikörper wird wieder ausgewaschen (3 x PBS) und die Platten mit Anti-Maus (IgG + IgM) •Antiköiper-Peroxidasekonjugat ναι der Ziege wie oben inkubiert. Die Menge an gebundenem Enzym wird durch die Substratreaktion mit Diamino-benzidin/Wasserstoffperoxid als Farbstoff nachgewiesen. Weiterkultiviert werden nur diejenigen Hybridlinien, die nur mit dem Hapten-Rinderserumalbuminkonjugat, nicht aber mit dem Rinderserumalbumin eine positive Reaktion zeigen.

Beispiel 6

Nachweis der Snezifität der selektionieiten Antikömer für das intakte Nicergolin

Der ELIS A-Test wird wie in Beispiel 5 beschrieben mit BNS-Rinderserumalbuminkonjugat durchgeführt. Ein zusätzlicher Probesatz enthält neben dem Gewebekulturiiberstand mit dem zu untersuchenden Hybridüberstand einen großen Überschuß der intakten Ausgangssubstanz (gesättigte Lösung von Nicergolin in PBS, 50 μΐ Hybridüberstand mit 50 μΐ Nicergolinlösung). Weiter verwendet werden nur Hybridlinien, die bei Zusatz des intakten Nicergolins im ELISA-Test eine verringerte Reaktivität gegen das entsprechende Rinderserumalbuminkonjugat zeigen und damit auch mit dem Nicergolin reaktiv sein müssen.

Beispiel 7

Quantitative Bestimmung von intaktem Nicergolin mit Hilfe der beschriebenen monoklonalen Antikörper

Mikrotiterplatten werden wie oben beschrieben mit gereinigtem Anti-BNS-Antikörper beschichtet. Die gewaschenen Mikrotiterplatten (3 x PBS) werden mit einer Standardverdünnungsreihe von Nicergolin in PBS (1 ng -10 pg/ml) und mit geeigneten Probenverdünnungen (Saum) 2 Stunden bei 37 °C inkubiert Nach erneutem Waschen werden die Mikrotiterplatten mit einer 1 : 100 Verdünnung des biotinylierten Anti-NIC-Antikörpers (0,5 mg/ml) für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach dem nächsten Waschschritt erfolgt eine erneute Inkubation mit einer geeigneten Verdünnung eines kommerziell erhältlichen Avidin-Peroxidase-Konjugates und anschließend wird die Substratreaktion mit Diammdbenzidin/Wasserstoffperoxid durchgeführt Die optische Dichte wird bei 490 nm bestimmt. Aus den Werten für die Standardkonzentrationen wird die Eichkurve berechnet und damit durch Vergleich der Gehalt an Nicergolin in den Serumproben ermittelt

Beispiel 8

Herstellung polvklonaler Antikörper

Grundimmunisierung: 1 mgNIC-OH- oder BNS-Konjugat in 1 ml 0,9%iger Kochsalzlösung werden mit 1 mlkomplettem Freund'schem Adjuvans gemischt und an 10 bis 12 Stellen am Rücken eines männlichen Kaninchens (etwa4 kg) subkutan injiziert -

Nachimmunisierung:

Nach4 Wochen werden 0,5 mgKonjugatin 0,5 ml 0,9 %iger Kochsalzlösung gelöst miteinem gleichen Volumen an inkomplettem Freund'schem Adjuvans gemischt und jeweils an den Hinterläufen in die Nähe der poliplietalen Lymphknoten intramuskulär appliziert Insgesamt wird die Nachimmunisierung viermal wiederholt -8-

Claims (14)

1. AT 397 437 B Serumgewinnung: Durch Inzision der Ohrvene wird 1 Woche nach der letzten Nachimmunisierung Plasma gewonnen, nach Koagulation bei 2000 g zentrifugiert und das so gewonnene Serum zur Analytik verwendet 5 PATENTANSPRÜCHE 10 1. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus-Antikörper, welche a) in einem ELISA-Test mit einem NlC-OH-Konjugat, insbesondere NICOH-Rinderserumalbuminkonjugat (1-Methyl-10a-methoxy-dihydrolysergol-17-hemisuccinat-Rinderserumalbuminkonjugat), positiv reagieren, und b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Rinderserumalbumin, nicht reagieren. 15
2. 2. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus-Antikörper nach Anspruch 1, welche durch Zusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Testsystem in ihrer Reaktivität mit dem NIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbuminkonjugat inhibiert werden.
3. 3. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus-Antikörper nach den Ansprüchen 1 und 2, welche nach Reinigung aus Serum bzw. Aszitesflüssigkeit von Mäusen und nachfolgender Biotinylierung nach Standard-verfahren unter Verwendung von Avidin-Peroxidasekonjugaten im ELISA-Test mitNIC-OH-Konjugat, insbesondere NIC-OH-Rinderserumalbuminkonjugat reagieren.
4. 4. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Maus-Antikörper, welche a) ineinemELISA-TestmiteinemBNS-Konjugat,insbescxidereBNS-SerumalbuminkOTjugat(5-Bromnicotinsäure-Rinderserumalbuminkonjugat) positiv reagieren, und b) im gleichartigen Testsystem mit underivatisiertem Träger, z. B. Serumalbumin, nicht reagieren.
5. 5. Monospezifische Antikörper, insbesondere monoklonaleMaus-Antikörper nach Anspruch4, welchedurchZusatz von nativem Nicergolin in steigender Dosierung zum ELISA-Testsystem in ihrer Reaktivität mit dem BNS-Konjugat, z. B. BNS-Serumalbumin inhibiert werden.
6. 6. Monospezifische Antikörper nach Anspruch 5, welche nach Reinigung aus Serum bzw. Aszitesflüssigkeit von 35 Mäusen nach ihrer Immobilisierung an der Oberfläche von Kunststoffen, (z. B. Mikrotiterplatten, magnetische Partikel) oder anorganischen Trägem das intakte Nicergolinmolekül binden.
7. 7. Verfahren zur Herstellung polygonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß man NIC-OH- oder BNS-Konjugat mit komplettem Freund'schen Adjuvans mischt und Kaninchen subkutan und nach mindestens 40 4 Wochen mehrmals intramuskulär injiziert, und anschließend das Serum gewinnt. S. Hybridzellinien, welche monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 produzieren und durch Fusion vonZellen von einer zuvor mitBNS- bzw. NIC-OH-Konjugat, insbesondere Serumalbuminkonjugat immunisierten Maus und Zellen einer Maus-Myelom-Linie gebildet sind. 45
8. 9. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen: a) Erzeugung von immunologisch aktiven NIC-OH- bzw. BNS-Konjugaten, z. B. Serumalbuminkonjugaten; b) Grundimmunisierung von Mäusen mit einer Suspension oder Lösung der entsprechenden Konjugate in komplet- 50 tem Freund'schen Adjuvans subkutan; c) Nachimmunisierung der behandelten Mäuse mit demselben Konjugat in inkomplettem Freund'schen Adjuvans intraperitoneal 3 Wochen nach der Grundimmunisierung; d) Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und Bereiten einer Suspension von Milzzellen; e) Fusion der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors; 55 f) Verdünnen und Vermehren der vereinigten Zellen in getrennten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einem Selektionsmedium, welches nur das Wachstum von Hybridzellen unterstützt; g) Auswerten des Überstandes in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten mit positivem Hybridwachstum hinsicht- -9- AT 397 437 B lieh des V orliegenseines Antikörpers der gewünschten Spezifität durch paralleles Testen zweierüberstandsaliquote in einem ELISA-Testsystem mit immobilisiertem Träger als negative Kontrolle und NIC-OH- bzw. BNS-Konjugat ab positive Testsubstanz; h) Klonierung der Hybride mit der gewünschten Reaktivität nach der Methode der "limitierenden Verdünnung"; 5 i) Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand,
9. 10. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antiköipem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen: a) Erzeugung von immunologisch aktiven NIC-OH- bzw. BNS-Konjugaten, z. B. Serumalbuminkonjugaten; 10 b) Grundimmunisierung von Mäusen miteiner Suspension oder Lösung der entsprechenden Konjugate in komplettem Freund'schen Adjuvans subkutan; c) Nachimmunisierung der behandelten Mäuse mit demselben Konjugat in inkomplettem Freund'schen Adjuvans intraperitoneal 3 Wochen nach der Grundimmunisierung; d) Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und Bereiten einer Suspension von Milzzellen; 15 e) Fusion der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors; f) Verdünnen und Vermehren der vereinigten Zellen in getrennten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einem Selektionsmedium, welches nur das Wachstum von Hybridzellen unterstützt; g) Auswerten des Überstandes in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten mit positivem Hybridwachstum hinsichtlich des Vorliegens eines Antikörpers der gewünschten Spezifität durch paralleles Testen zweierüberstandsaliquote 20 in einem ELISA-Testsystem mit immobiliertem Träger als negative KontrolleundNIC-OH-bzw.BNS-Konjugat ab positive Testsubstanz; h) Klonierung der Hybride mit der gewünschten Reaktivität nach der Methode der "limitierenden Verdünnung"; i) Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand; j) Überprüfung der Reaktivität der entsprechenden selektionierten Antikörper mit dem nativen Ausgangsmolekül 25 durch Nachweb der kompetitiven Inhibition nach Zusatz von steigenden Konzentrationen des Ausgangs moleküls im ELISA-Test; k) Selektion und zweite Klonierung der überprüften Hybridzellinien, sowie die Übeiprüfung der Klone auf intraperitonealem Wege in Pristan-vorbehandelten Mäusen; und l) Ernten der malignen Asziten aus den genannten Mäusen, welche die gewünschten Antikörper enthalten und 30 Reinigung der Antikörper nach Standardtechniken. 11.5-Bromnicotinsäure-Trägerkonjugate, insbesondere Rinderserumalbuminkonjugate der Formel: 35 0 H ΒΓγ^γ'%'χ·'^ΤΓ!*βΓ 40 wobei X ein Kohlenwasserstofffest mit 1 bis 6 C-Atomen ist, der gegebenenfalls durch S, Ο, N unterbrochen sein kann. 45 12. 1-Methyl-lOa-methoxy-dihydrolysergol-Konjugate, insbesondere 1-Methyl-lOa-methoxy-dihydrolysergol-17-hemisuccinat-Serumalbuminkonjugate, der Formel

   50 -10- 55 AT 397 437 B wobei X ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen ist, der gegebenenfalls durch S, Ο, N unterbrochen sein kann.
10. 13. Verfahren zur Herstellung von 5-Bromnicotinsäurekonjugaten, insbesondere Serumalbuminkonjugaten, dadurch gekennzeichnet, daß 5-Bromnicotinsäure mit dem Träger (Serumalbumin) umgesetzt wird.
11. 14. Verfahren zur Herstellung von l-Methyl-10a-methoxy-dihydrolyseigol-17-hemisuccinat-Träger-Konjugat (Serumalbuminkonjugat), dadurch gekennzeichnet, daß 1 -Methyl-1 Οα-methoxy-dihydrolysergol mit Bernstein-Säureanhydrid und das erhaltene l-Methyl-10a-methoxydihydrolysergol-17-hemisuccinat mit den jeweiligen Haptenträgem umgesetzt wird.
12. 15. Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Nicergolins mit Antiköipem, dadurch gekennzeichnet, daß die kompetitive Inhibition derReaktivitätzwischen spezifischen Antikörpern nach Anspruch 2 oder 5 und zugehörigem immobilisiertem Konjugat in einem ELISA-System bestimmt wird.
13. 16. Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung des nichtmetabolisierten Nicergolins, dadurch gekennzeichnet, daß gereinigte Anti-BNS-Antikörper (BNS-1 oder -2) in Kombination mit Anti-NIC-Antikörpern eingesetzt werden, wobei entweder die Anti-BNS-Antikörper oder die Anti-NIC-Antikörper in geeignet«· Weise, z. B. durch Biotinyliemng oder radioaktive Markierung, zum Nachweis modifiziert sind.
14. 17. Diagnostisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es Anti-BNS-Antikörper nach Anspruch 3 und/oder Anti-NIC-Antikörper nach Anspruch 6 in getrennt« Weise enthält, wobei entwed« die Anti-BNS-Antikörper oder die Anti-NIC-Antikörper in geeigneter Weise, z. B. durch Biotinyliemng od« reaktive Markierung, zum Nachweis modifiziert sind. -11-