AT400721B - Nukleinsäure- und aminosäuresequenz von cntf - Google Patents

Description

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   Die vorliegende Erfindung betrifft neurotrophe Faktoren und insbesondere die   Nukleinsäure- und   die entsprechenden Aminosäuresequenzen für humanen, ziliären neurotrophen Faktor (CNTF) und ebenso die Verwendung derartiger Nukleinsäuresequenzen in rekombinanten Expressionssystemen zur vorübergehenden Herstellung von biologisch aktivem CNTF. 



   Schwere geistige und körperliche Behinderungen sind eine Folge des Absterbens von Nerven- oder Gliazellen im Nervensystem. Das Absterben von   Nerven- oder Gliazellen   kann durch die Nerven betreffende Degenerationskrankheiten wie Alzheimer'und Parkinson'Krankheit und multiple Sklerose, durch Ischämie 
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 hervorgerufen werden. 



   Neurotrophe Faktoren sind eine Molekülklasse, die das Überleben und die funktionale Aktivität von   Nerven- oder Gliazellen   fördern. Es gibt experimentelle Hinweise, dass neurotrophe Faktoren für die Behandlung zur Verhinderung des Absterbens von   Nerven- oder Gliazellen   oder Funktionsstörungen Infolge der oben aufgelistete Zustände von Nutzen sein werden. Appel, 1981, Ann. Neurology 10 : 499. 



   Der am besten charakterisierte solcher neurotropher Faktoren ist der Nerve Growth Factor (NGF). Es wurde gezeigt, dass NGF ein neurotropher Faktor für die cholinergischen Nervenzellen des Vorderhirns ist, die im Lauf von Alzheimer'Krankheit und mit zunehmendem Alter absterben. Der Verlust dieser Nervenzellen wird im allgemeinen als Ursache vieler Wahrnehmungsstörungen in Verbindung mit   Alzheimer'Krank-   heit und mit hohem Alter angesehen. 



   Tierversuche zeigen, dass NGF das Absterben von cholinergischen Nervenzellen Im Vorderhirn nach einer traumatischen Verletzung verhindert und dass NGF Wahrnehmungsverluste, die mit dem Alter auftre- 
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 : 275 ;329 : 65. Diese Ergebnisse lassen einen potentiellen klinischen Nutzen dieser neurotrophen Faktoren beim Menschen vermuten, und zwar bei der Behandlung von Wahrnehmungsverlusten infolge des Absterbens von cholinergischen Nervenzellen des Vorderhirns durch Krankheit. Verletzung oder Alter. 



   Die Verwendung von neurotrophen Faktoren wird durch ihre Spezifität für nur solche Subpopulation von Nervenzellen verkompliziert, die die richtigen Membranrezeptoren besitzen. Die meisten Nervenzellen im Körper besitzen keine NGF-Rezeptoren und reagieren anscheinend nicht auf diesen neurotrophen Faktor. 



  Es ist daher von ausserordentlicher Bedeutung, neue neurotrophe Faktoren zu entdecken, die das Überleben von anderen Arten von   Nerven- oder Gliazellen   unterstützen als NGF. 



   Es wurde nach neuen neurotrophen Faktoren bezüglich ihrer Fähigkeit, das Überleben von Nervenzellen, die nicht auf NGF reagieren, in Kultur zu unterstützen, gesucht. Ein weit verbreiteter Test zum Durchmustern von Proben ist darauf ausgerichtet, Faktoren zu entdecken, die das Überleben von motorischen Neuronen des Ziliarganglions fördern, die die Skelett- oder glatte Muskulatur innervieren. Diese Nervenzellen des   Ziliarganglions   gehören zum   parasympatischen   Nervensystem und ihr Überleben wird nicht durch NGF unterstützt. 



   Das Vorhandensein von Faktoren, die das Überleben von Nervenzellen des Ziliarganglions fördern, sind   bezüglich   einer Vielzahl von Geweben und Spezies berichtet worden. Viele dieser neurotrophen Aktivitäten bezüglich des Ziliarganglions besitzen die folgenden ähnlichen chemischen und biologischen Eigenschaften : (1)   die Aktivität   ist in einer hohen Konzentration in Ischiasnerven vorhanden ; (2) neurotrophe Aktivität überlebt, dem ionischen Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS) und den Reduktionsmitteln beta-Merkaptoethanol (BME) oder Dithiothreit (DTT) während einer Elektrophorese auf reduzierenden   SDS-Polyacrylamidgelen   ausgesetzt zu werden ; und (3) auf solchen Gelen wandert die Aktivität mit einem apparenten Molekulargewicht zwischen 24 - 28 kD.

   Colins, 1985,   Developmental Biology, 109 : 255-258 ;   Manthorpe et   al.,   1986, Brain Research, 367 : 282-286. 



   Aufgrund dieser ähnlichen Eigenschaften hat man vorgeschlagen, dass die gleichen oder nahe verwandte Moleküle, die typischerweise   a) s"ztiiäre   neurotrophe   Faktoren"oder"CNTF"bezeichnet   werden, für die neurotrophen Aktivitäten bezüglich des   Zdiarganglions   verantwortlich sind. Die Bezeichnung CNTF ist also 
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 Nervenzellen des Ziliarganglions in Kultur fördern. Da nicht genügend Daten vorhanden sind, nachzuweisen, dass die Proteine, die für diese Aktivitäten verantwortlich sind, Identisch sind, werden CNTF nach dem Gewebe bzw. der Art, aus der sie stammen, unterschieden. Handelt es sich bei der Art. aus der sie stammen, also um Kaninchen, so ist die Nomenklatur Kaninchenischiasnerv (rabbit sciatic   nerve)-CNTF   (Kaninchen-SN-CNTF). 



   Die höchste Konzentration an   Ischiasnerv-CNTF     wird anscheinend In penphären   Nerven wie dem Ischiasnerv gefunden Er wird nach einer Verletzung von Zellen Im Nerv abgegeben. SN-CNTF unterstützt das Überleben und das Wachstum von allen getesteten Nerven eines penphären Nervensystems, einschliesslich sensorischer, sympatischer und parasympatischer Nervenzellen. Das Spektrum der Zellen, die auf SN-CNTF reagieren war also grösser als das auf NGF. Es wurde vor kurzem gezeigt, dass Ratten-SN- 

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 CNTF die Bildung von spezifischen Arten von Gliazellen im Zentralnervensystem reguliert (Hughes et al., 1988, Nature 335 : 70). 



   Die   vernünftigste,   auf dem oben zitierten experimentellen Hinweis basierende Hypothese besteht darin, dass Ischiasnerv-CNTF ein Teil der Antwort des Nervensystems auf Verletzungen ist. SN-CNTF, der von Zellen in einem geschädigten Nerv abgegeben wird, würde erwartungsgemäss das Überleben und das Nachwachsen von verletzten Nervenzellen fördern und die funktionelle Aktivierung von Gliazellen regulieren, die zur Regeneration benötigt werden. Diese Überlegungen zeigen, dass SN-CNTF einen therapeutischen Wert für die Verringerung von Schäden am Nervensystem haben würde, die durch Krankheit oder Verletzung hervorgerufen werden. 



   Trotz eines weitverbreiteten wissenschaftlichen Interesses am SN-CNTF haben die Schwierigkeit, eine wesentliche Menge aus natürlichen Quellen aufzureinigen, und die Tatsache, dass humaner SN-CNTF nicht zur Verfügung steht, Versuche zunichte gemacht, seinen Wert zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit von Nervenzellen bel Krankheiten oder nach Verletzungen zu demonstrieren. Frühe Versuche, einen RattenSN-CNTF aufzureinigen, resultierten in einer 800-fachen Anreicherung gegenüber Nervenrohextrakt bezüglich der spezifischen Aktivität. Manthorpe et al., 1986, Brain Research 367 : 282-286. 



   Eine 800-fache Steigerung der spezifischen Aktivität reichte jedoch nicht aus. eine einzelne Proteinart herzustellen. Aus diesem Grund ist das nach der von Manthorpe et al. beschriebenen Methode erhaltene Produkt mit erhöhter Aktivität nicht ausreichend, da es eine Vielzahl von Proteinarten enthält. Es wäre wünschenswert, eine solche Aufreinigung von SN-CNTF zu erzielen, dass man eine einzelne Proteinart mit der entsprechenden biologischen Aktivität erhält. Sobald man eine einzelne Proteinart erhalten hat, werden die erhaltenen Sequenzierdaten zuverlässiger sein.

   Eine "einzelne Proteinart", soweit dieser Begriff im folgenden m dieser Spezifikation und den zugehörigen Ansprüchen verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid oder eine Reihe von Polypeptiden mit derselben Aminosäuresequenz über   Ihre Aktivitätszentren, In   anderen Worten, wenn der wirksame Anteil der Aminosäuresequenz für zwei oder mehr Polypeptide derselbe ist, so handelt es sich um "eine einzelne   Proteinart"so   wie es hier definiert ist, obwohl eine geringe Heterogenität in bezug auf Länge oder Ladung vorhanden ist. 



   Ziel der Erfindung ist es, die   Nukleinsäure- und   die entsprechenden Aminosäuresequenzen für humanen CNTF zur Verfügung zu stellen. 



   Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, rekombinante Expressionssysteme bereitzustellen, in denen die Nukleinsäuresequenz für humanen CNTF verwendet werden kann, menschliches biologisch aktives CNTFProtein vorübergehend herzustellen. 



   Diese Ziele werden dadurch erreicht, dass humane   Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen   für CNTF zur Verfügung gestellt werden. 



   Gemäss bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden diese Nukleinsäuresequenzen zur Konstruktion von Expressionsvektoren in rekombinanten Expressionssystemen zur vorübergehenden Herstellung von biologisch aktivem humanen CNTF verwendet. 



   Es sei darauf hingewiesen, dass sowohl die obige allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft sind und nur der Erklärung dienen und die Erfindung, wie beansprucht, nicht einschränken. Die beiliegenden Zeichnungen, die in die Spezifikation mit einbezogen werden und einen Teil dieser darstellen, erläutern verschiedene Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Grundlagen der Erfindung zu erklären. 



   Fig. 1 stellt beispielhafte Ergebnisse einer Chromatographie von SN-CNTF an einer Mono-P-Säule dar ;
Fig. 2 stellt einen beispielhaften Graphen der Verteilung der neurotrophen Aktivität im Eluat jedes der sieben Streifen dar, die nach der Elektrophorese aus dem   SDS-PAGE-Gel   ausgeschnitten wurden ;
Fig. 3 stellt beispielhafte Ergebnisse einer Reverse-Phase-Chromatographie dar ;
Fig. 4 stellt beispielhafte Ergebnisse eines Laufs mit silbergefärbtem reduzierendem SDS-PAGE-Gel dar mit Fraktionen, die jenen, die dem in Abbildung 3 dargestellten Peak der neurotrophen Aktivität benachbart sind, entsprechen,   einschliesslich   des Peaks ;
Fig. 5 stellt ein Profil von eluieren Peptiden nach Verdauung mit Endoprotease Asp-N dar, ;

   und
Fig. 6 stellt ein Profil von eluieren Peptiden nach Verdauung mit Endoprotease Lys-C dar
Fig. 7 stellt   be spie ! hafte   Ergebnisse einer Chromatographie einer   Ammoniumsulfatfraktion   auf einer
Phenyl-Sepharose-HIC-Säule dar. 



   Fig. 8 stellt beispielhafte Ergebnisse einer Chromatographie der   mit Mono-P-Chromatofocussing   aufge- trennten Fraktion auf einer   Alkyl-Superose-FPLC-HIC-Säule   dar. 



   Fig. 9 stellt beispielhafte Ergebnisse einer Chromatographie der präparativen SDS-PAGE-Fraktion auf einer C8   Reverse-Phase-HPLC-Säule   dar. Feld (A) zeigt die Ergebnisse des ursprünglichen   Aufreinl-   gungsvorgangs. Feld (B) zeigt die Ergebnisse des gegenwärtigen Aufreinigungsvorgangs nach dem
Hinzufügen der beiden HIC-Chromatographieschritte. 

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   Fig. 10 stellt beispielhafte Ergebnisse der SDS-PAGE und der Western Blotanalyse des Reverse-Phase aufgereinigten SN-CNTF. Bahn 1 in jedem der beiden Felder enthält Molekulargewichtsstandardproteine (SIGMA SDS-7). Bahn 2 enthält aufgereinigten SN-CNTF. Feld (A) zeigt die Ergebnisse der Silberfär- bung. Feld (B) zeigt die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse mit affinitätsaufgereinigtem Anti-Peptid A-
Antikörper. 



   Fig. 11 stellt die für Kaninchen-SN-CNTF kodierende Nukleinsäuresequenz dar. Translation dieser
Nukleinsäuresequenz ergibt die entsprechende Aminosäuresequenz, die darunter im einbuchstabigen
Kode abgedruckt ist. Unterstrichene Sequenzen wurden durch die vom SN-CNTF-Protein erhaltene
Aminosäuresequenz bestätigt.. 



   Fig. 12 stellt die   Nukleinsäure- und   die entsprechende Aminosäuresequenz (dreibuchstabiger Kode) für die kodierende Sequenz für humanen CNTF dar. Die Humansequenzen befinden sich zwischen den
Linien. Dort, wo die   Kaninchennukleinsäure- oder -aminosäuresequenzen   von den humanen abweichen, sind diese oberhalb bzw. unterhalb der Linien aufgeführt. 



   Fig. 13 stellt die Konstruktion des pCMVXVPL2 Expressionsvektors dar. 



   Fig. 14 stellt die zur Konstruktion von CNTF-Synl/3 zur Expression von CNTF benutzten Methoden dar. 



   Die Zeichnung ist repräsentativ und nicht massstabsgetreu. Details der Experimente siehe Beispiel 7. 



   Fig. 15 stellt die zur Konstruktion von CNTF-Syn2/3 zur Expression von CNTF benutzten Methoden dar. 



   Die Zeichnung ist repräsentativ und nicht massstabsgetreu. Details der Experimente siehe Beispiel 7. 



   Fig. 16 stellt die bei der Konstruktion von CNTF-Synl/3 und CNTF-Syn2/3 benutzten synthetischen
Oligonukleotide 1 bis 4 dar. 



   Fig. 17 stellt die bei der Konstruktion von CNTF-Syn2/3 benutzten synthetischen Oligonukleotide 5 bis 10 dar. 



   Fig. 18 stellt bestimmte charakteristische Merkmale des bakteriellen Expressionsvektors pT5T dar, der ein zur Expression von CNTF geeignetes DNA-Insert enthält. Die Zeichnung ist repräsentativ und nicht massstabsgetreu. Details der Experimente siehe Beispiel 7. 



   Fig. 19 stellt bestimmte charakteristische Merkmale des bakteriellen Expressionsvektors   pT3XI-2   dar, der ein zur Expression von CNTF geeignetes DNA-Insert enthält. Die Zeichnung IS repräsentativ und nicht massstabsgetreu. Details der Experimente siehe Beispiel 7. 



   Fig. 20 stellt ein   reduzierendes SDS-Polyacrylamidgel   dar, in dem Extrakte von mit verschiedenen
Expressionskonstrukten transformierten Zellen Elektrophorese unterzogen und mit Coomassie Brilliant
Blue angefärbt wurden. 



   Fig. 21   stellt ein reduzierendes SDS-Polyacrylamidgel dar,   in dem Extrakte von mit verschiedenen
Expressionskonstrukten transformierten Zellen Elektrophorese und Immunoblot mit   affinitätsgeremigtem  
Anti-CNTF Peptid A-Antikörper unterzogen wurden. 



   Fig. 22 stellt den Bloassay einer Verdünnungsreihe von Überständen von pT5T : CNTF-Syn1/3 oder   pT3XI-2 : CNTF-Syn2/3 exprimlerenden bakteriellen Zellen   dar. Das Nebenbild stellt den Bioassay der extrahierten ausgeschnittenen Stücke aus einem reduzierenden SDS-Polyacrylamidgel des pT5T : CNTF-
Syn1/3 Überstands im Bereich des Gels unmittelbar oberhalb und unterhalb 24 kD dar. 



   Es wird jetzt Im Detail auf die gegenwärtigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen werden, die, zusammen mit den darauffolgenden Beispielen, dazu dienen, die Grundlagen der Erfindung zu erklären
Bel SN-CNTF handelt es sich um eine einzelne Proteinart im Sinne der hier gegebenen Definition Als eine einzelne Proteinart kann die Aminosäuresequenz des SN-CNTF bestimmt werden und zur Konstruktion von DNA-Sonden zur Gewinnung von genomischen oder   cDNA-Klonen   zur Verwendung bei der rekombinanten Herstellung von SN-CNTF verwendet werden. 



   Die Aminosäuresequenz der einzelnen Proteinart des SN-CNTF wurde teilweise bestimmt. Diese Sequenz lautet : 
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   - R - 5 - D - L - T - A - L - T - E - S -D - G - V - P - M - A - G - K - L - W - G - L - K -      Zusätzlich   wurde eine   Aminosäuresequenz   aus aufgereinigtem Kaninchen-SN-CNTF bestimmt, die im Beispiel 2 angegeben ist. Diese zusätzliche Sequenz erlaubt es, einen Teil der oben angegebenen Aminosäuresequenz Innerhalb eines einzelnen grossen Peptids zu lokalisieren (Beispiel 2). Diese Sequenz 

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 eines einzelnen Peptids wurde dazu verwendet, drei degenerierte Oligonukleotidsonden zu erzeugen (Nr. 1,
13 und 7 in Beispiel 4), die zum Priming der Polymerasekettenreaktion von grossem Nutzen sind, da ihre Position für zueinander bekannt ist. 



   Die Kaninchen- und humanen CNTF kodierenden Nukleinsäuresequenzen (entsprechend mRNA) wurden bestimmt und sind in Fig. 11 und 12 angegeben. 



   Ein rekombinantes System zur vorübergehenden Expression von biologisch aktivem CNTF wurde entwickelt und wird in Beispiel 5 beschrieben. 



   Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz von CNTF bzw. der für CNTF kodierenden Nukleinsäuresequenz kann SN-CNTF wie folgt aufgereinigt werden :
Nach Verarbeitung des Materials, Kaninchenischiasnerv, zu Pulver, wird der Rohextrakt dann zentrifugiert. Der Überstand wird angesäuert und der resultierende Niederschlag wird abzentrifugiert. Der Überstand wird dann mit NaOH titriert und der resultierende Niederschlag wird wiederum abzentrifugiert. 



   Nach den pH-Fällungen wird gesättigte Ammoniumsulfatlösung zum Überstand gegeben und der Niederschlag wird abzentrifugiert. Die weitere Zugabe von Ammoniumsulfat zum Überstand ergibt einen Niederschlag einer Proteinfraktion, die den grössten Teil der SN-CNTF-Aktivität enthält. 



   Das obige Präparat wird dann auf eine   Mono-P-FPLC-Säule   zum Chromatofocussing aufgetragen. Die Säulenfraktionen werden dann gesammelt und auf pH und CNTF-Aktivität untersucht. Die in Abbildung 1 mit einem Balken aufgezeigten Fraktionen mit der grössten SN-CNTF-Aktivität werden, wie unten genauer beschrieben, weiterbehandelt. 



   Die focussierten Fraktionen aus mehrfachen Läufen über die Mono-P-Säule werden waagerechter Elektrophorese in einem   SDS-Polyacrylamidgel   unterzogen und ein Molekulargewichten zwischen 22 und 27 kD entsprechender Bereich des Gels wird über die Breite des Gels in mehrere Streifen geschnitten. Die einzelnen Streifen werden In kleinere Stücke zerschnitten und die Proteine werden elektrophoretisch eluiert Die   eluierten   Proteine werden gesammelt und die Fraktion mit der höchsten   Aktivität   wird unter Verwendung von Reverse-Phase-HPLC weiter aufgereinigt. Dieses Verfahren wird in den Beispielen unten genauer beschrieben. 



   Ausserdem können zusätzliche Schritte in den oben angegebenen Aufreinigungsvorgang eingeschoben werden und erlauben eine bequeme Aufarbeitung von mehr Ausgangsmaterial. Beispielsweise kann hydrophobe Chromatographie auf Phenyl-Sepharose zwischen   Ammoniumsulfattrennung   und Chromatofocussing eingeschoben werden und hydrophobe Chromatographie auf einer   FPLC-Alkyl-Superosesäule zwischen   Chromatofocussing und präparativer SDS-PAGE (Beispiel 1)
Diese Methode resultiert in SN-CNTF in einer aufgereinigten Form mit einem mehr als 25   000-fachen   Anstieg der spezifischen Aktivität im Vergleich zum Rohextrakt. Weiterhin handelt es sich bei dem hergestellten Endprodukt um eine einzelne Proteinart.

   Dies stellt einen mehr als 30-fachen Anstieg gegenüber dem SN-CNTF dar, der mehrere Proteinarten enthält und von dessen Aufreinigung bel Manthorpe et al., wie oben beschrieben, berichtet wird. Da SN-CNTF auf Reverse-Phase-HPLC hin teilweise desaktiviert wird, stellt die Berechnung bel einer mindestens 25   000-fachen   Aufreinigung eine Minimalaufreinigung dar und die tatsächliche Aufreinigung kann sogar 100   000-fach   oder grösser sein. Diese gesteigerte Aufreinigung erleichtert die Bestimmung der Aminosäuresequenz von SN-CNTF. Gemäss diesen Aufreinigungsverfahren wurde bereits genügend Aminosäuresequenz erhalten, um Oligonukleotidsonden zu erzeugen, die das Durchmustern von cDNA- und genomischen Bibliotheken erleichtern werden, um die für SNCNTF kodierenden tierischen bzw. humanen Gene zu   kloneren.   



   Diese Methoden resultierten In der Bestimmung der kodierenden Sequenz (entspricht mRNA) für Kaninchen- und humanem CNTF. 



   Wie unten genauer erläutert werden wird, werden diese Gene Ihrerseits die Herstellung von (1) tierischem   SN-CNTF,   der für Untersuchungen von seiner   Fähigkeit   zur Behandlung von Tiermodellen von Nervenschäden geeignet ist. und (2) humanen   SN-CNTF,   der geeignet ist. in pharmazeutischen Formulierungen mitverwendet zu werden, die bei der Behandlung von Schäden am humanen Nervensystem von Nutzen sind, in grossem Massstab möglich machen. 



   Die von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten   Nuk ! e ! n- bzw.   Aminosäuresequenzen   resultieren   In der Herstellung von biologisch aktivem tierischen CNTF In einem rekombinanten Expressionssystem. 



   Mit diesen aufgereinigten Proteinen kann die Aminosäuresequenz der hervorstehenden Peptide bestimmt werden. Die Proteine werden zunächst mit Endoprotease   Asp-N,   Endoprotease Lys-C, Endoprotease Glu-C oder Chymotrypsin behandelt. Nach dem Verdau kann die Aminosäuresequenz der hervorstehenden Peptide mit einem   Gasphaseproteinsequenator   von Applied Blosystems bestimmt werden. 



   Antikörper, die mit aufgereinigtem SN-CNTF reagieren, können zum Durchmustern von Expressionsbibliotheken verwendet werden, um das für SN-CNTF kodierende Gen zu erhalten. Man kann unter 

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 Verwendung eines automatischen Proteinsynthetisators von Applied Biosystems synthetische Peptide synthetisieren, die Bereichen der Sequenz von SN-CNTF entsprechen. Solche Peptide können zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Antikörper gegen synthetische Peptide wurden hergestellt und es wurde mit Western Blot-Analyse gezeigt, dass sie mit aufgereinigtem CNTF reagieren (Fig. 10). 



   Ist die Sequenz des Gens einmal bekannt, können für SN-CNTF kodierende Gene in tierischen oder bakteriellen Zellen exprimiert werden. Gemäss der vorliegenden Erfindung wurden die für CNTF kodierenden Kaninchen- und humanen Gensequenzen bestimmt. Ein System für vorübergehende Expression zur Herstellung von biologisch aktivem CNTF wurde entwickelt. 



   Die folgenden Beispiele dienen dazu, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu erläutern und schränken die beanspruchte Erfindung nicht ein. Alle in diesen Beispielen angegebenen Literaturstellen sind hier spezifisch durch Bezugnahme mit einbezogen. 



    Beispiel 1   Proteingewinnung Materialien 
Ischiasnerven erwachsener Kaninchen wurden von Pel-Freez Biologicals, Rogers, Arkansas erhalten. 



  Ultrareines Ammoniumsulfat wurde von Schwartz/Mann Biotech, Cleveland, Ohio erworben. Phenylethyl-   sulfonylfluorid (PMSF), epsilon-Aminocapronsäure, Benzamidin,   Pepstatin, Dithiothreit (DTT),   poly-L-Ornithin   (P3655) und   3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazolbromid   (MTT) wurden von Sigma Chemical   Co.,   St. Louis, Missoun, erhalten. Mono-P-FPLC-Säulen zum Chromatofocussing wurden von Pharmacia, Inc, Piscataway, New Jersey, erhalten. C8-HPLC-Säulen für Reverse-Phase-Chromatographie wurden von Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana, erhalten. Acetonitril wurde von J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, New Jersey, erworben. Trifluoressigsäure wurde von Pierce Chemicals, Rockford, Illinois erhalten.

   Endoproteasen Asp-N und Lys-C wurden von Boehringer Mannheim Biochemical,   Indianapolis,   Indiana, erhalten. 



  Foetales Kälberserum wurde von   Hyclone   Laboratories,   Logan,   Utah, erworben. Kulturmedium und   Salzlö-   sungen wurden von Irvine Scientific, Santa Ana, California, erhalten. Kulturschalen wurden Costar, Cambridge, Massachusetts, erhalten. Pathogenfreie fruchtbare Eier von Gebrauchsgrad mit Hühnerembryonen wurden von Spafas, Roanoake, Illinois, erhalten. 



  B Assay für SN-CNTF 
Kulturen aus primären Ziliärganglien von Hühnerembryonen wurden Wie bereits beschrieben hergestellt 
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 : 50 ;Ziliärganglien aus fruchtbaren, pathogenfreien Hühnereiern entfernt, die in einer Feuchtatmosphäre 9-10 Tage bei   38'C inkubiert   worden waren. Die Ganglien wurden chemisch getrennt, Indem sie zunächst Hanks'Balanced Salt Solution ohne zweiwertige Kationen, die 10mM HEPES-Puffer, pH 7, 2, enthielt, 10 min bei   37. C   und dann einer Lösung aus 0, 125% Bactotrypsin 1 : 250 (Difco, Detroit, Michigan) in Hanks' Balanced Salt Solution, die wie oben modifiziert worden war, 12 min bei   37. C   ausgesetzt wurden. Die Trypsinbehandlung wurde durch Zugabe von   foetalem   Kälberserum bel einer Endkonzentration von 10% gestoppt. 



   Nach dieser Behandlung wurden die Ganglien in eine Lösung übertragen, die   Dulbecco's   Modified Eagle Medium mit einem hohen Glukosegehalt ohne Hydrogencarbonat mit 10%   foetalem   Kälberserum und 10mM HEPES, pH 7, 2, enthielt, übertragen und mechanisch durch ungefähr 10maliges Zerreiben durch eine Pasteurpipette aus Glas getrennt, deren Öffnung mit einer Flamme poliert und auf solch einen Durchmesser verengt wurde, dass es 2 Sekunden dauert, die Pipette zu füllen. 



   Die getrennten Ganglien wurden dann in Gewebskulturschalen mit 100 mm Durchmesser (40 getrennte Ganglien pro Schale) drei Stunden In Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium ergänzt durch 10% foetales Kälberserum, 4 mM Glutamin, 60   mg/     Penicillin-G,   25 mM HEPES, pH   7, 2) ausplattiert.   Diese vorbereitende Ausplattieren wurde durchgeführt, um nicht neuronale Zellen, die an der Schale haften, von Nervenzellen zu trennen, die nicht an der Schale haften. Nach drei Stunden wurden die nicht adhärenten Nervenzellen durch Zentrifugation geerntet, im Kulturmedium resuspendiert und mit 50 ut pro Well auf eine 96-Well Mikrotiter-Gewebskulturplatte mit halber Oberfläche bei einer Dichte 1500 Nervenzellen pro Well ausgebracht.

   Die Mikrotiterwells waren vorher einer 1   mg/ml   Lösung aus poly-L-Ornithin In 10mM Natriumborat. pH 8, 4, über Nacht ausgesetzt gewesen, mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet worden. 

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 MTT in   Dulbecco's   Modified Eagle Medium mit einem hohen Glokosegehalt ohne Hydrogencarbonat mit 10mM HEPES, pH 7, 2, zugegeben und die Kulturen für 4 Stunden in den   37. C   warmen Brutschrank   zurückgestellt.   Dann wurden 75 ul einer Lösung aus 6, 7 ml 12M   HCI   pro Liter Isopropanol zugegeben und der Inhalt jedes Wells 30mal trituriert, um die Zellen aufzuschliessen und den Farbstoff zu suspendieren.

   Die Absorption bei 570nm wurde unter Verwendung eines automatischen   Mikrotiterplattenmessgeräts   (Dynatech, Chantilly, Virginia) für jeden Weil in bezug auf seinen Referenzwert bei 690nm bestimmt. Die Absorption der Wells, die kein neurotrophes Mittel erhalten hatten   (Negativkontrollen),   wurde von der Absorption der Wells mit Proben abgezogen. Die resultierende Absorption ist der Anzahl an lebenden Zellen in jedem Weil 
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 der Trophic Units (trophischen Einheiten) an neurotropher Aktivität wurde als Reziprokwert der Verdünnung definiert, die 50% maximales Überleben der Nervenzellen ergab. Die Konzentration an trophischer Aktivität in Trophic Units pro ml wurde durch Division der gesamten Trophic Units durch das Volumen des Assays   (60ut)   erhalten.

   Die spezifische Aktivität wurde durch Division der Anzahl an Trophic Units durch die in der Probe vorhandene Proteinmenge bestimmt. 



  C. Aufreinigung von SN-CNTF 
Am Ende jedes der folgenden Schritte wurde das Präparat entweder sofort weiterverarbeitet oder bei   - 70.   C bis zu einer Woche bis zur Verwendung aufbewahrt. 



    Schritt   1. Herstellung von Rohextrakt 
Einhundert Gramm (Nassgewicht) Kaninchenischiasnerv (circa 300 Nerven) wurde aufgetaut und in einem Polytron-Rotorhomogenisator (Kinematica, Schweiz) 1 Minute in 10   Voiumen (WIV)   Wasser mit 10mM EDTA, 1 mM epsilon-Aminocapronsäure, 1 mM Benzamidin und 0, 1 mM PMSF pulverisiert und 30 Minuten bei 4*C und 140   OOOxg   zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Glaswolle gefiltert, um schwimmendes Lipid zu entfernen. 



  Schntt 2. Säurebehandlung und Auftrennung mit Ammoniumsulfat 
Die unten erwähnten Zentrifugationsschritte wurden 20 Minuten lang bel 17   OOOxg   und alle Schritte bei   4. C   ausgeführt, falls nichts anderes angegeben ist. Der Rohextrakt wurde   zentnfuglert.   Der Überstand wurde auf pH   3, 6   mit 5N HCI angesäuert und der resultierende Niederschlag wurde abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit   1N NaOH   auf pH   6. 3 titriert   und der resultierende Niederschlag wurde wiederum abzentrifugiert. Zum obigen Überstand wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung zu 30%iger Sättigung gegeben und der Niederschlag wurde abzentrifugiert.

   Weitere Zugabe von Ammoniumsulfat zum Überstand bis zu 60%iger Sättigung resultierte im Niederschlag einer Proteinfraktion, die den grössten Tell der SNCNTF-Aktivität enthielt. Der Niederschlag wurde in 20 mM Natrium, pH 6, 7, mit 1 mM EDTA, 0. 1 mM PMSF und   0, 1 uM Pepstatin   gelöst, so dass eine Proteinkonzentration von 8-13   mglmi   erhalten wurde. 



    Schntt   3. Chromatofocussing 
Das obige Präparat wurde über Nacht gegen ein 500mal grösseres Volumen von 10mM Natriumphosphat. pH 6, 7, unter einem Pufferwechsel dialysiert und bei 140   OOOxg   30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen Nylonfilter mit einem Porendurchmesser von 0, 22 um gegeben und 3mal mit 
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 Pharmacia) chromatographiert. 



   Die Säulenfraktionen wurden gesammelt und auf pH und   CNTF-Aktivität   untersucht. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Chromatographie auf Mono-P. Das Profil der eluieren Proteine Ist als die optische Dichte   (0. D.) bei   280 nm aufgetragen. Darüber sind die Graphen des pH und der   SN-CNTF-Aktivität,   die In jeder Fraktion gemessen wurden, aufgetragen. Die mit einem Balken gekennzeichneten Fraktionen mit der höchsten   SN-CNTF-Aktivität   (circa pH 5) wurden vereinigt und mit festem Ammoniumsuifat bis zu einer 

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 95%igen Sättigung versetzt und das Pellet wurde durch Zentrifugation gesammelt, in gesättigter Ammoniumsulfatlösung resuspendiert und wiederum zentrifugiert, um den Polypuffer zu entfernen.

   Der Niederschlag wurde in ausreichend 10mM Natriumphosphatpuffer, pH   6,   7, gelöst, so dass eine Proteinendkonzentration von 3-5 mg/ml erhalten wurde (als die "fokussierte Fraktion" bezeichnet). Typischerweise wurde 1 Liter des ursprünglichen Rohextrakts in 8 verschiedenen Läufen auf der Mono-P-Säule verarbeitet. 



  Schritt 4. Präparative Natriumdodecylsulfat   (SDS) - Gelelektrophorese   
Die fokussierten Fraktionen aus mehreren Läufen über die Mono-P-Säule wurden vereinigt und gegen ein 100mal grösseres Volumen von 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6, 7, 8 Stunden lang unter einem Pufferwechsel dialysiert und dann auf einem 15%igen reduzierenden   SDS-Polyacrylamidgel   für waagerechte Elektrophorese gemäss der Methode von   Laemmli, 1970, laufengelassen.   Jedes Trenngel war 0, 3 cm dick, 14 cm hoch und   11, 5 cm   breit.   5, 5   mg Protein wurde auf jedes Gel aufgetragen. 



   Die Elektrophorese wurde bei   150 C   und 40   mA/Gel durchgeführt, bis   der vorgefärbte 20 kD-Molekulargewichtsstandard eben den unteren Rand des Trenngels erreichte. 



   Um die Krümmung der einzelnen Proteinbanden über die Breite des waagerechten Gels aufzudecken, wurde auf das Gel ein Blatt Nitrozellulose (in Rollen, mit einer Porengrösse von 0, 45 um, erhalten von Miihpore Corporation, Bedford, Massachusetts), das vorher mit Wasser angefeuchtet worden war, 2 Blätter vorher angefeuchtetes und 2 Blätter trockenes Chromatographiepapier (3 MM   Chr   erhalten von Whatman, Hillsboro, Oregon) und eine Glasplatte gelegt, auf die eine 500 ml Glasflasche als Gewicht gestellt wurde. 



  Nach 30-45 Minuten wurden die Umrisse des Gels auf das Nitrozellulosepapier mit einem wasserunlöslichen Stift kopiert. Das Papier wurde 3mal mit 10 mM   Tris-HCI-Puffer,   pH 8, 0, mit 0, 15 M NaCI und 0, 3% Detergens NP-40 gewaschen und dann 15-30 Minuten mit einer 1 : 1000 Verdünnung von Kohinuor Rapidograph ink (erhältlich in Schreibwarenläden) im obigen Puffer gefärbt. 



   Das Originalgel wurde auf eine Glasplatte gelegt und mit seinem Umriss an das gefärbte Nitrozellulosepapier unter dem Glas angelegt. Der Bereich des Gels, der Molekulargewichten zwischen 22-27 kD entsprach, wurde durch Vergleich mit den vorgefärbten Molekulargewichtsstandards   (BRL,   Bethesda, MD), die in schmalen Bahnen an beiden Enden jedes Gels laufengelassen worden waren, lokalisiert. Dieser Bereich wurde über die Breite des Gels in sieben 2, 5 mm breite parallele Streifen geschnitten, wobei die durch das gefärbte Nitrozellulosepapier aufgedeckte Krümmung der Banden verwendet wurde. Jeder einzelne Gelstreifen wurde in kleinere Stücke (2, 5x2 mm) geschnitten und die Proteine wurden elektrophoretisch 6 Stunden In einer 1 : 1 Verdünnung von dem Laufpuffer nach Laemmli mit einer elektrophoretischen Anreicherungsanlage (ISCO, Lincoln, Nebraska) eluiert.

   Die eluieren Proteine wurden in einem Volumen von   0, 2 ml gesammelt. In   Abbildung 2 ist die Verteilung der neurotrophen Aktivität im Eluat aus jedem der sieben Streifen (mit a-g nach abnehmendem Molekulargewicht) aufgetragen. Die Fraktion mit der höchsten Aktivität (Streifen d) wurde mit Reverse-Phase-HPLC weiter aufgereinigt. 



  Schritt 5. Reverse-Phase-HPLC 
Zum Eluat aus dem Gel wurden Dithiothreit (DTT) und   10%ige Trifluoressigsäure   (TFA) bis zur Endkonzentration von 2% bzw. 0, 3% zugegeben. Die Probe wurde durch einen   0, 22 um Nylonfilter gefiltert,   auf eine C8-HPLC-Säule für Reverse-Phase-Chromatographie aufgetragen und mit einem   H2 0/0, 1 %   
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 : Acetonitril/0, 1%enthaltenden, mit Silikon behandelten Reagenzgläsern gesammelt. Aliquots jeder Fraktion wurden auf den Gehalt an neurotropher Aktivität hin untersucht. Die Proteinkonzentration ist als Absorption bel 215nm gezeigt und die Verteilung der neurotrophen Aktivität ist darüber aufgetragen.

   Die Fraktionen mit der höchsten   SN-CNTF-Aktivität   (Fraktionen 37-40, Fig. 3) wurden für die In Beispiel 2   beschnebene   Sequen-   zlerung   gesammelt. In einer getrennten Zubereitung wurden auch die Fraktionen, die der höchsten CNTF-   Aktivität   benachbart waren und die diese einschlossen, entsprechend Fraktionen 36-44 In Fig. 3, mit   S ! ! bergefärbter reduzierender SDS-PAGE anaiysiert   (Fig 4). 



   Es wurden auch zwei zusätzliche Chromatographieschritte ausgeführt. Diese Schritte bestätigten die Reinheit des obigen CNTF-Präparats. 



   In den bel den zusätzlichen Chromatographieschritten wird das Prinzip der hydrophoben Chromatographie (HIC) verwendet. Der erste HIC-Schritt ist ein nach   Schntt   2   (pH- und Ammoniumsulfatauftrennung)   eingeschobener gewöhnlicher Säulenchromatographieprozess Das nach der   Ammoniumsulfatfällung gelöste   Material wurde weiter mit 10mM   Natnumphosphatpuffer.   pH 6, 7 (Puffer B), weiterverdünnt, bis die lonenstärke (mit einem Leitfähigkeitsmesser gemessen) der von Puffer B mit   0. 3   M Ammoniumsulfat und 5% Isopropanol (Puffer A) gleich war.

   Dann wurde Isopropanol bis zu einer Endkonzentration von 5% zu der 

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 verdünnten Probe gegeben und die Mischung wurde auf eine mit Puffer A äquilibrierte Phenyl-SepharoseCL4B-Säule (Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey) aufgetragen. Es wurden nicht mehr als 3 mg Testprotein pro   ml Säulenbettvolumen   aufgetragen. Üblicherweise ergab 1 Liter Ischiasnervrohextrakt 50 ml 
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 110   ml   Phenyl-Sepharosesäule aufgetragen wurde. Die Säule wurde schrittweise eluiert, wobei mit einem 3fachen Gelbettvolumen an Puffer A begonnen wurde, gefolgt von einem 3fachen Gelbettvolumen an Puffer B, gefolgt von einem 2fachen Gelbettvolumen an Puffer B mit 50% Ethylenglykol (Puffer C), und dann mit einem 5fachen Gelbettvolumen an Wasser gewaschen wurde. Das eluierte Material wurde in 18-mlFraktionen gesammelt. 



   Fig 7 zeigt die Ergebnisse eines solchen Chromatographielaufs. Das Profil der eluieren Proteine wurde ununterbrochen bei O. D. 280 (durchgezogene Linie) überwacht. Über dem   O. D.-Verlauf   ist das Profil der eluieren SN-CNTF-Bioaktivität in jeder Fraktion aufgetragen (x-verbindende Linie), wie sie in dem auf dem Überlebensassay von Ziliärganglien basierenden, der in der ursprünglichen Patentanmeldung beschrieben ist, gemessen wurde. SN-CNTF-Bioaktivität wurde aus der Säule während der Elation mit Puffer C erhalten. Die Säulenfraktionen, die den grössten Anteil an Bioaktivität (in Abbildung 7 mit einem Balken gezeigt) enthielten, wurden vereinigt und durch Dialyse unter Druck mit einer Amicon-YM-10-Membran (Amicon Division, W. R.

   Grace & Co.,   Danvers,   MA) auf ungefähr 1/10 des ursprünglichen Volumens eingeengt, was typischerweise in einer Proteinendkonzentration von   2, 5-3, 0 mg/mi   resultierte. Das Konzentrat wurde insgesamt 6 h lang unter 3fachem Wechsel gegen ein 55mal grösseres Volumen von B dialysiert. 



  Das dialysierte Material wurde durch einen Acrodiscfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2  m (Gelman Sciences,   Inc.,   Ann Arbor, MI) gegeben, durch mehrfaches Einspritzen von jeweils 2 ml auf eine Mono-PSäule zum Chromatofocussing aufgetragen, wie in der ursprünglichen Patentanmeldung beschrieben. 



   Ohne diesen   HIC-Säulenschritt   benötigte 1 Liter Ischiasnervrohextrakt 8 getrennte Läufe auf der MonoP-Säule zum Chromatofocussing, wie in der ursprünglichen Patentanmeldung beschrieben, wegen der begrenzten   Proteinauftragskapazltät   der Säule. Mit der Einführung des   HIC-Säulen-Schritts   konnte 1 Liter Rohextrakt in einem einzigen Chromatofocussing-Lauf verarbeitet werden. 



   Der zweite HIC-Schritt wurde nach dem ursprünglichen Schritt 3 (Chromatofocussing auf Mono-P) eingeschoben. Zu jedem 1 mi des dem Chromatofocussing unterzogenen Materials (bei 3-5   mg/mi   Protein) wurden 2 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 6, 7, mit 15 M Ammoniumsulfat (Puffer D) gegeben. Die Mischung wurde dann durch ein Acrodiscfilter mit einem Porendurchmesser von 0, 2 um gegeben und durch mehrfaches Einspritzen von jeweils 2 ml auf eine Alkyl-Superose-HR10/10-FPLC-Säure (Pharmacia) aufgetragen, die mit Puffer D   äquilibriert   war. Die Säule wurde mit Puffer D gewaschen, bis die Absorption des Ablaufs bei   0. 0.   280 zur Basislinie zurückgekehrt war.

   Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten über 60 ml eluiert, der von Puffer D In Puffer E (50 mM Phosphatpuffer, pH   6, 7) überging,   und 1 mlFraktionen wurden gesammelt. 



   Fig. 8 erläutert die Ergebnisse eines solchen FPLC-Laufs mit einer   HIC-Säule.   Die durchgezogene Linie stellt das bel   0. 0.   280 gemessene Profil des eluieren Proteins dar. Darüber ist ein Graph der SN-CNTFBioaktivität in jeder Gradientenfraktion aufgetragen Die Bioaktivität enthaltenden Fraktionen (in Abbildung 8 mit einem Balken gezeigt) wurden vereinigt und in einem Centncon-10 Anrelcherungsappparat (Amicon) auf   0, 5 ml eingeengt.   Die Probe wurde durch Zugabe von 2 ml Puffer B zum oberen Reservoir verdünnt und durch Zentrifugation erneut auf ein Endvolumen von 0, 5 ml eingeengt.

   Der   Verdünnungs- bzw, Wiedereln-   engungsschritt wurde noch 2m al wiederholt und die endgültige konzentrierte Probe wurde auf einem   präparat ! ven   reduzierenden SDS-Gel für waagerechte Elektrophorese mit 15% Polyacrylamid wie oben beschrieben laufengelassen, ausser dass eine vorhergehende Dialyse nicht notwendig war. 



   In Fig 9 werden der endgültige Aufreinigungsschritt auf Reverse-Phase-HPLC In dem ursprünglichen Aufreinigungsvorgang (oberes Feld) und in dem Aufreinigungsvorgang nach dem Einfügen der beiden HICSchritte (unteres Feld) verglichen. In jedem Feld ist das Profil der eluieren Proteine (durchgezogene Linie bei   0. 0.   280) und die darüber aufgetragene   SN-CNTF-Bioaktivität   (x-verbindende Linie) gezeigt. Aus der Abbildung ist offensichtlich, dass in der Reverse-Phase-HPLC unterzogenen Probe In dem neuen Aufreinigungsvorgang wesentlich weniger verunreinigendes Protein vorhanden ist.

   Es ist bedeutsam, anzumerken, dass die spezifische Aktivität des mit dem neuen Vorgang hergestellten CNTF Innerhalb des experimentellen Fehlers mit der spezifischen Aktivität des mit dem vorhergehenden Vorgang hergestellten CNTF identisch ist   (Tabelle 1),   was zeigt, dass der durch den oben beschriebenen ursprünglichen Vorgang hergestellte CNTF bis zur Homogenität aufgereinigt war. Der Vorteil des neuen Aufreinigungsvorganges ist, dass 8 Liter   Ausgangsmatenal   nun so bequem wie 1 Liter mit dem ursprünglichen Vorgang verarbeitet werden können. 

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  Beispiel 2 Sequenzierung des aufgereinigten neurotrophen Faktors 
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 ! tät (Nr.Probenschleife auf eine Aguapore RP-300   C8-Säule   für Reverse-Phase-HPLC mit dünner Bohrung (Brownlee Labs), 2, 1x220 mm, aufgetragen und mit einem   H2010, 1% TFAAcetonitril1 0, 1%   TFA-Gradienten eluiert. Peptidhaltige Fraktionen wurden von Hand in   Eppendorfröhrchen,   basierend auf der Absorption bei 215 nm, gesammelt. Fig. 5 zeigt das Profil der eluieren Peptide nach Verdau mit Endoprotease Asp-N, wie über die Absorption bei 215nm bestimmt. Fig. 6 zeigt das Profil der eluieren Peptide nach Verdau mit
Endoprotease Lys-C, gefolgt von Reduktion und Carboxymethylierung. Die Aminosäuresequenz der hervorstehenden Peptide wurde unter Verwendung eines Appiied Biosystems Gasphaseproteinsequenators bestimmt. 



   Zusätzliche Aminosäuresequenz wurde mit den Spaltenden Enzymen Chymotrypsin und Endoprotease Glu-C (Boehringer Mannhelm Biochemical, Indianapolis, IN) erhalten. Diese zusätzliche Proteinsequenz erlaubt es, einige der oben erwähnten Aminosäuresequenzen in grössere Peptide aus überlappenden Aminosäureabschnitten zusammenzusetzen.

   Die neuen Aminosäuresequenzen und diejenigen, die mit den vorhergehenden Sequenzen verbunden wurden, sind unten angegeben :   H-S-A-L-T-P-H-R-R-E L-A-R-K-I-R-S-D-L-T-A-L-T-E-S-Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N-I-N-L-   
D-S-V-D-G-V-P-M-A    D-Q-Q-V-H-F-T-P-A-E-G D-G-L-F-E-K-K-L-W-G-L-K-V-L-Q-E-L-S-H-W-T-V D-L-R-V-I   Beispiel 3 Herstellung von Antikörpern gegen den neurotrophen Faktor 
Antikörper, die mit aufgereinigtem Kaninchen-SN-CNTF reagieren, werden zum Durchmustern von Expressionsbibliotheken nützlich sein, um das Gen, das für Kaninchen-SN-CNTF kodiert, zu erhalten. 



  Zusätzlich werden Antikörper, die seine biologische Aktivität neutralisieren, in gesunden Tieren verwendet werden, um die biologische Rolle dieses neurotrophen Faktors zu bestimmen. 



   Zur Herstellung solcher Antikörper werden mit einem automatischen Proteinsynthesizer von Applied Biosystems synthetische Peptide synthetisiert, die Bereichen aus der Sequenz von SN-CNTF entsprechen. 



  Solche synthetischen Peptide werden kovalent an das Trägerprotein Keyhole Limpet Haemocyanin gebunden. Das konjugierte Peptid wird in Meerschweinchen in komplettem Freundschem Adjuvan injiziert, wobei nach 3 und 6 Wochen In unkomplettem   Adjuvans"geboostert"wird.   Jedem Meerschweinchen werden Serumproben entnommen werden und in einem Western-Blot gegen aufgereinigten SN-CNTF verwendet werden, um zu bestimmen, ob Antikörper im Serum mit dem aufgereinigten Protein reagiert. Im WesternBlot-Assay positive Seren werden weiter auf ihre Fähigkeit, die neurotrophe Aktivität In dem zur Aufreinigung verwendeten Bioassay zu neutralisieren, getestet.

   Seren, die entweder In dem Western-Blot-Assay oder in dem Neutralisierungsassay positiv sind, werden wie folgt weiter aufgereinigt : (1) die Seren werden mit dem Trägerprotein Keyhole Limpet Haemocyanin absorbiert, um gegen dieses Protein gerichtete Antikörper zu entfernen, dann werden die Seren erneut in den obigen Assays getestet ; (2) die IgGAntikörperfraktion wird aus dem Serum mit Standardmethoden aufgereinigt und erneut in den obigen Assays getestet. Diese beiden Schritte werden zu einem polyklonalen Antikörper führen, der rein genug ist, um zum Durchmustern von Expressionsbibliotheken verwendet zu werden, um die Messenger-RNA und das 

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 mit 0, 02% Natriumazid äquilibriert.

   Der Unterschied in der Konzentration an freien Aminogruppen wurde mit Fluorescamin (Chen, et   al., 1978, Arch. Biochem, Biophys, 189 : 241 ; Nowicki, 1979, Anal. Letters 12 : 1019)   in der ursprünglichen Peptid-A-Lösung und in dem Überstand nach der Konjugation bestimmt. Diese Analyse zeigte, dass 92-95% des Peptids nicht mehr in der Lösung waren und mit der Sepharosegelmatrix konjugiert wurden. 



   Vor der Affinitätsaufreinigung des Anti-Peptid-A-Antikörpers wurden 8 ml Serum von immunisierten Kaninchen über Nacht gegen 2 Liter PBS dialysiert. Die   Peptid-A-Sepharosesäule   wurde nacheinander mit den 10fachen Gelbettvolumen der folgenden Lösungen gewaschen : 0, 1 M Glycin-HCI, pH   2, 5 ; PBS ; 0, 1   M Triethylamin, pH 11, 5 ; und dann PBS. Das dialysierte Serum wurde dreimal durch die Säule laufen gelassen, um eine vollständige Bindung der Anti-Peptid-A-Antikörper zu gewährleisten. Die Säule wurde mit dem 20fachen Gelbettvolumen an PBS gewaschen und dann nacheinander mit Jeweils dem 4fachen 
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 : 0, 111, 5 ; und dann PBS. Ein mi-Fraktionen wurden gesammelt.

   Die Eluate aus den Waschschritten mit Glycin und Triethylamin wurden sofort mit 1 M Tris, pH 9 bzw. 7, neutralisiert, und Aliquots wurden mit einem   ELISA   unter Verwendung von mit Peptid A beschichteten Wells auf Anti-Peptid-A-Antikörper untersucht. Die Fraktionen mit dem höchsten Titer (typischerweise in 3   Gelbettvolumen   am Anfang der   Eluation   mit Glycin bzw. Triethylamin) wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert. Nachdem Partikel durch kurze Zentrifugation entfernt worden waren, wurde der Überstand mit   affinitätsaufgereinigtem   Anti-Peptid-A-Antikörper   bei -70'C   aufbewahrt. 



  Beispiel 4   Klonierung   der Gene für SN-CNTF 
Da es sich bei den erhaltenen Peptidsequenzen um solche für Kaninchen-SN-CNTF handelt und die Kaninchen- bzw. Humansequenzen nicht identisch sein könnten, ist es sinnvoll, zunächst über Hybridisierung mit synthetischen Oligonukleotiden, die auf der Proteinsequenz basieren, Klone des Kaninchengens zu gewinnen und die Kaninchenklone als Hybridisierungssonden beim Durchmustern nach dem humanen Gen einzusetzen. 



   Sowohl die genomische als auch Messenger-RNA (mRNA)-Sequenzen, die für Kaninchen- und humanen SN-CNTF kodieren, werden gewonnen. Die mRNA-Sequenz wird für die Expression des Proteins von Nutzen sein, während die genomische Sequenz für das Verständnis der Struktur und der Regulation des Gens für SN-CNTF von essentieller Bedeutung sein wird. Um diese Sequenzen zu erhalten, werden genomische Bibliotheken sowohl vom Kaninchen als auch vom Menschen und cDNA-Bibliotheken sowohl vom Kaninchen als auch vom Menschen auf aus Ischiasnerven isolierte mRNA durchgemustert. Während dieses Vorgangs, um das der Sequenz von Kaninchen- oder humanen SN-CNTF entsprechende Gen zu erhalten, kann man auch auf strukturell nahe verwandte Gene testen, die   zusätzliche   Mitglieder dieser Familie von neurotrophen Faktoren   darstellen könnten.   



  A. Das SN-CNTF-Gen 
Zur Isolierung der für SN-CNTF kodierenden genanischen Kaninchensequenzen wird eine genomische   Kaninchenbibliothek (Clontech)   auf den Bakterienstamm E. coli nm538 aufgebracht und es werden umgefähr 1 000 000 rekombinante Klone durchgemustert. Bereiche der Proteinsequenz von Kaninchen-SNCNTF, die von der geringsten Anzahl an Codons repräsentiert werden können, werden revers-translatiert und entsprechende degenerierte Oligonukleotidsonden synthetisiert. Die Kaninchenoligonukleotide werden mit Kinase nach dem Standardprotokoll von Maniatis, et   al. (1982, Molecular Cloning,   A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory) markiert. Die DNA-Kinase wird von US Biochemical Corp. und das mit Gammastrahlung markierte ATP wird von   ICN   erhalten.

   Die Oligonukleotide werden bis zu einer spezifischen   Aktivität   von mindestens 1 000 000 cmp pro Picomol markiert. 



   Auf das Ausbringen der genomischen Bibliothek hin werden circa 1 Million Plaques auf Duplikate von 
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 Verwendung von Sequenase (US Biochemical Corp. ) sequenziert, um diejenigen Klone zu identifizieren, die für die SN-CNTF-Proteinsequenz kodieren. 



  B. SN-CNTF-mRNA-Sequenzen 
Zelluläre Gesamt-RNA wird aus Kaninchen- und humanen Ischiasnerven erhalten. Das Gewebe wird in einer   Guanidinthiocyanat/beta-Mercaptoethanoi-Lösung   homogenisiert und die RNA wird durch Sedimentation in einem   Caeslumchloridgradienten   aufgereinigt (Glison, et al., 1974, Biochemistry 13 : 2633). Es wird für polyadenylierte RNA durch Chromatographie auf Oligo (dT) zellulose selektioniert (Avid und Leder, 1972, Proc. Natl. Acad. Sei. 69 : 408).

   Quantitative Analyse der RNA im Hybridisierungsblot wird   mit"Antisense"-   Oligonukleotidsonden durchgeführt, um das Vorherrschen von SN-CNTF-Sequenzen in jedem RNA-Präparat abzuschätzen und dadurch die Anzahl der unabhängigen Klone abzuschätzen, die man zum Durchmustern benötigen würde, um mit mindestens 99%iger Wahrscheinlichkeit CNTF-Klone zu erhalten. Eine ausrichen- 
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 beschrieben, synthetisiert und in den Lambda-gem2-Vektor (Promega Biotech) nach Palazzolo und Meyero-   witz,   1987, Gene 52 : 197 eingefügt. 



   Für Kaninchen-SN-CNTF kodierende Klone werden durch Hybridisierung von rekombinanten Phagenpiaques, wie oben beschrieben, identifiziert. Die Identität der Klone wird durch Bestimmung der   Nukleosid-   sequenzen verifiziert, um zu bestimmen, in wieweit sie der gesamten bekannten Proteinsequenz entsprechen. Durchmustern der humanen   Ischiasnerv-cDNA-Sonden   (Feinberg und   Vogelstein, 1983, Anal. Blo-   chem. 132 : 6), was eine verlässlichere Vorgehensweise zum Nachweis von   Kreuzhybndislerung   zwischen verschiedenen Arten ist als die Verwendung der kleineren Oligonukleotide, die zum durchmustern der Kaninchen-cDNA-Bibliotheken verwendet wurden. 



   Die Polymerasekettenreaktion   (PCR)   (Saiki, et al., 1988, Science 239 : 487) wurde zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten verwendet, die Kaninchen-CNTF-Aminosäuresequenzen entsprechen. Solche DNA-Fragmente wurden aus genomischer humaner und Kaninchen-DNA und aus Kaninchenischiasnerv- und sympathischer Ganglion-cDNA amplifiziert. Von den amplifizierten DNA-Fragmenten wurden Subklone hergestellt und die Fragmente wurden mit Standardmethoden sequenziert (Maniatis, et   al., 1982, Molecular Cloning'A   Laboratory Manual, Gold Spring Harbor, New   York).   



   Die mit PCR erhaltenen DNA-Fragmente wurden auch als Sonden zum Durchmustern einer Kaninchen-   schiasnervcDNA-Bibliothek   und einer humanen genomischen DNA-Bibliothek verwendet. Ein positiver   Kaninchen-cDNA-Klon   und positive humane genomische Klone wurden aufgereinigt und teilweise sequenziert. Die Sequenz des der kodierenden (entspricht mRNA) Sequenz für Kanichen- oder humanem CNTF entsprechenden offenen Leserahmens bestätigte die Sequenz der DNA-Fragmente des kodierenden Bereichs, der mit PCR erhalten wurde. Die erhaltenen kodierenden Sequenzen für Kaninchen- und humanen CNTF sind in Fig. 11 bzw. 12 angegeben. 



   Teile der aus Kaninchen-SN-CNTF erhaltenen Aminosäuresequenz wurden revers in die degenenerten Oligonukleotide Nr. 1, 13, 7 und 12 und ihre Komplementärnukleotide Nr. 3, 14, 8 und 17 translatiert. Die Aminosäuresequenz (ganz oben) und der Ort und die Nummerierung der entsprechenden degenenerten Sense- und Antisense-Oligonukleotide (unterhalb) ist unten angegeben : 
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   ****1****** K-L-W-G-L-K-V-L-Q-E-L-S (5') ****12***** (3')    (3')   ****17***** (5')   Die Nukleotidsequenz der Sense-Version jedes der degenerierten Oligonukleotide ist unten angegeben (N entspncht hier einem beliebigen Nukleotid) :

   Nr. 1 5'-TA (T/C) GTN AA (AiG) CA (T/C) CA (A/G) GG-3' Nr.13 5'-AA(T/C) AA(A/G) AA(T/C) AT(A/T/C) AA (T/C) (C/T) T-3' 

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   Nr. 7 5'-GA (T/C)   GGN GTN CCN ATG GC-3'   Nr. 12A 5'-AA (A/G) TT (A/G) TGG   GGN TT (A/G) AA-3'   Nr. 12B 5'-AA (A/G) TT (A/G) TGG   GGN CTN AA-3'   Nr. 12C 5'-AA (A/G)   CTN TGG GGN TT (A/G) AA-3'   Nr. 12D 5'-AA (A/G)   CTN TGG GGN CTN AA-3'
Getrennte Polymerasekettenreaktionen wurden mit genomischer DNA entweder vom Menschen oder vom Kaninchen als Matrize und den Oligonukleotiden Nr. 1 und 8 oder Nr. 1 und 17 als Primern durchgeführt, um die entsprechenden Bereiche der humanen bzw. Kaninchen-CNTF-Gene zu amplifizieren. 



  Southern Blots der Reaktionsprodukte (mit radioaktiv markiertem Oligonukleotid Nr. 13 als Sonde) zeigten, dass markierte Banden mit einer Grösse von ca. 66 Basenpaaren (Nr. 1 und 8) und ca. 366 Basenpaaren (Nr. 



  1 und 17) existieren. 



   Die gleichen, oben beschriebenen   PCR-Reaktionen   wurden mit aus Kaninchenischiasnerv oder sympathischer   Kaninchenganglion-mRNA   hergestellter cDNA durchgeführt. RNA wurde aus Kaninchenischiasnerven oder sympathischen Ganglien hergestellt und durch eine Oligo-dT-Säule laufen gelassen, um für Messenger-RNA (mRNA), wie oben beschrieben, zu selektionieren. Komplementäre DNA (cDNA) wurde mit reverser Transkriptase unter Verwendung der mRNA als Matrize und Oligo-dT als Primer hergestellt. Bei der Durchführung von PCR mit einer der cDNAs als Matrize und einem der Oligonukleotide Nr. 1 und 8 oder Nr. 1 und 17 als Pnmer wurden Fragmente amplifiziert, die die. gleiche Sequenz wie jene hatten, die aus der genomischen Kaninchen-DNA amplifizert worden waren (Abbildung 11).

   Dies zeigt, dass in dem für Protein kodierenden Bereich des CNTF-Gens zwischen Oligonukleotiden Nr. 1 und 17 keine Intervenierenden Sequenzen (Introns) vorhanden sind. 
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 schiasnerv-mRNA als Matrize und einem   Oligo-dT/Not   l-Linker-Adapter   als Primer hergestellt. Anschliessend   wurde ein   EcoR)/Xmnt-Linker-Adapter     (5'-AATTCGAACCCCTTCG-3')   an das 5'-Ende der doppelsträngigen cDNA durch Ligieren der stumpfen Enden (Maniatis, et   a !., a. a. O.) angefügt.   Die Polymerasekettenreaktion wurde unter Verwendung dieser cDNA als Matrize und den Oligonukleotiden Nr. 8 und   EcoRI/Xmnl-Linker-   Adapter als Pnmer durchgeführt.

   Ein Southern Blot der Reaktionsprodukte (mit radioaktiv markiertem Oligonukleotid Nr. 13 als Sonde) zeigte, dass eine markierte Bande mit einer Grösse von ungefähr 200 Basenpaaren vorhanden ist. 



   Um cD NA-Klone für Kaninchen-CNTF zu erhalten, wurde eine cDNA-Bibliothek auf   Poly (A) +mRNA   aus Kaninchenischiasnerv mit den oben beschriebenen Methoden hergestellt, ausser dass ein   Lambda-gt10-   Vektor (Stratagen) anstelle von Lambda-gem2 verwendet wurde. Ungefähr   4x106   Plaques dieser Bibliothek wurden unter Verwendung einer Sonde durchgemustert, die durch   willkürliches   Markieren eines M13Subklons eines   PCR-Fragments   hergestellt worden war, das aus sympathischer   Kaninchengangfion-cDNA   als Matrize und Oligos Nr. 8 und   EcoRt/Xmnt-Linker-Adapter   als Primer (siehe oben) erhalten worden war. 



  Das einzige primär positive Ergebnis war ein über dreifaches Durchmustern gereinigter Plaque. Auf Verdau mit EcoRI ergab die DNA aus diesem   Klon drei   Fragmente zusätzlich zu den   Lambda-Armen : ca. 2. 0. 1. 5   und 0, 6 kb lang. Durch Southern-Blot-Analyse wurde gezeigt, dass das 1, 5 kb-Fragment mit anderen, oben erwähnten, für CNTF spezifischen Oligonukleotiden und PCR-Fragmenten hybridisiert. Die DNA-Sequenz dieses 1, 5 kb-cDNA-Fragments bestätigte, dass es die gesamte kodierende Sequenz für Kaninchen-CNTF enthielt (Fig. 11). 



   Um genomische DNA-Klone für humanen CNTF zu erhalten, wurden ungefähr   3x106   Plaques einer humanen genomischen   DNA-Bibliothek   mit dem Vektor Lambda EMBL3 mit einer Probe durchgemustert, die durch willkürliches Markieren eines M13-Subklons eines   PCR-Fragments   hergestellt worden war, das aus humaner genomischer DNA als Matrize und Oligos Nr. 1 und Nr. 17 als Primer (siehe oben) erhalten worden war Sechs der primär positiven Klone wurden über Plaques durch anschliessendes Durchmustern aufgereinigt, und es wurde gefunden, dass diese mit   zusätzlichen   für CNTF spezifischen Oligonukleotiden und   PCR-Fragmenten   hybridisieren.

   Aus einem 0. 6 kb langen Bam   HI-Restriktionsfragment   aus einem der mit Oligo Nr. 13 hybridisierenden Klone wurden Subklone in mit Bam   HI   geschnittenem M13mp19 hergestellt und das Fragment wurde sequenziert. 



   Die DNA-Sequenzen der Fragmente, die durch PCR aus Kaninchenmatenal aus dem Kaninchen-cDNAKlon erhalten wurden, wurden auf der Basis von Bereichen mit überlappender Sequenz zusammengesetzt zur   Klonlerungs (entspncht mRNA) sequenz   für Kaninchen-SN-CNTF, die in Fig. 11 dargestellt   1St.   Die DNASequenzen der Fragmente, die durch PCR aus humaner genomischer DNA und aus humanen genomischen Klonen erhalten worden waren, wurden auf der Basis von Bereichen mit überlappender Sequenz zu der kodierenden Sequenz für humanen SN-CNTF zusammengesetzt, die In Fig. 12 dargestellt ist. Die Kaninchen-und humanen   Nukleinsäuresequenzen   für CNTF sind zu ca. 89% Identisch (Fig. 12), was darauf 

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 hinweist, dass die Kaninchen- und humanen Sequenzen aus für CNTF kodierenden homologen Genen stammen.

   Wie in Fig. 11 gezeigt ist, werden Teile der Nukleinsäuresequenzen für Kaninchen-CNTF durch die Aminosäuresequenzen, die aus aufgereinigtem SN-CNTF erhalten wurden und in früheren Beispielen erwähnt wurden, bestätigt. 



   Die Polymerasekettenreaktion wurde mit den oben beschriebenen Matrizen und Primern ausgeführt. 



  Das Schema für die Reaktionen war wie folgt : Denaturierungszyklus. 1 min bei   95. C ; Verschmelzungszy-   klus, 1,5 min bei   40 *C ;   und   Vedängerungszykius,   4 min bei   72. C.   Die Reaktion wurde 30 Zyklen lang durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden Elektrophorese auf 2%igen Agarosegelen unterworfen und auf Zeta-Bind-Membranen (BioRad, Richmond, CA) zum Southern Blot übertragen. Um die amplifizierten Anteile der für CNTF kodierenden Sequenz zu identifizieren, wurde in den Southern Blots ein radioaktiv markiertes Oligonukleotid Nr. 13 verwendet, von dem von der CNTF-Protein-sequenz bekannt war, dass es zwischen den Oligonukleotiden, die in der Reaktion als Primer verwendet worden waren, liegt.

   Die nach dem Southern Blot erhaltenen markierten Banden wurden aus den Originalgelen ausgeschnitten und zum   Kloneren   durch Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) in der Gegenwart aller vier dNTPs und durch Behandlung der DNA mit T4Polynukleotidkinase (US Biochemical Corp., Cleveland. OH) und ATP vorbereitet. Aus den geeigneten DNAStücken wurden dann Subklone in mit Smal-geschnittenem M13mp10 Vektor hergestellt (dephosphoryliert ; erhältlich von Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Die das Fragment von Interesse enthaltenden rekombinanten Phagen wurden mit der Vorgehensweise zum Durchmustern nach Benton & Davis   (1977.   



  Science   196 : 180)   unter Verwendung des radioaktiv markierten   Oligonukleotlds Nr.   13 als Sonde identifiziert. 



  Diese rekombinanten Klone wurden angezüchtet, um genügende Mengen an einzelsträngiger DNA zur Sequenzierung zu erhalten und wurden dann mit der Dideoxymethode sequenziert (Sanger, et   al.,     a. a. O.).   



   Die Hybridisierungsbedingungen bei   langen, willkürlich   markierten DNA-Sonden waren 5x SSCP, 2x Denhardt's, 2mM EDTA,   0, 05% Natriumpyrophosphat, 0, 1 % Natriumdodecylsulfat (SOS),   250   ng/ml   Heringssperma-DNA   (unspezifischer Konkurrent),   pH 8, 0. Die Hybridisierung wurde bei 65   C   durchgeführt und die Blots bzw. Filter wurden bei   65. C   in 0, 1x SSCP und   0, 1% SDS   gewaschen. Die Hybridisierungsbedingungen für kürzere Oligonukleotidsonden waren 6X SSCP, 2X Denhardt's, 2mM EDTA, 0, 05% Natriumpyrophosphat, 0, 1% SDS, 100   j. lg/ml   Hefe-tRNA (unspezifischer Konkurrent), pH 8, 0.

   Die Temperatur der Hybridisierung und die Bedingungen für das Waschen der Blots und der Filter wurden individuell an den   Ge-Gehalt   des jeweiligen Oligonukleotid angepasst (Maniatis et   al., a. a. 0.).   



  Beispiel 5 Expression der für SN-CNTF kodierenden Gene in tierischen Zellen 
Die folgenden Schritte sind für die Expression von SN-CNTF in tierischen Zellen erforderlich : a. Konstruktion eines Expressionsvektors ; b. Auswahl einer   Wirtszellinie ;   c. Einführung des Expressionsvektors in Wirtszellen ; und d. Manipulation der rekombinanten Wirtszelle, um das Expressionsniveau von SN-CNTF zu erhöhen. 



   (a) SN-CNTF Expressionsvektoren, die für die Verwendung in tierischen Zellen konstruiert wurden, können mehreren Typen angehören, einschliesslich Konstrukte mit starker konstitutiver Expression,
Konstrukte mit induzierbaren Genen und auch solche Vektoren, die zur Expression in bestimmten
Zelltypen konstruiert wurden. In allen Fällen werden Promotoren und andere genregulierende Regionen wie Enhancer (gegebenenfalls induzierbar) und Polyadenylierungssignale an der geeigneten Stelle in bezug auf   die cDNA-Sequenzen   in Vektoren auf   Plasmidbasis   plaziert.

   Es folgen zwei Beispiele solcher
Konstrukte : (1) Ein Konstrukt mit einem starken konstitutiven Promotorbereich sollte unter Verwendung der genetischen Kontrollsignale des Simian Virus 40 (SV40) in einer Anordnung hergestellt werden, wie 
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 Bezugnahme mit einbezogen ist, beschriebenen Plasmid pSV2CAT zu finden ist. Dieses Plasmid sollte in einer solchen Weise manipuliert werden, dass die für   Chloramphenicolacetyltransferase   (CAT) kodierenden Sequenzen durch die SN-CNTF-cDNA unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden (Maniatis et al., siehe oben) ersetzt werden. (2) Ein induzierbares Genkonstrukt sollte unter Verwendung des Plasmids PMK hergestellt werden, das den Promotorbereich für Maus-Metallothionein (MT-1) enthält (Brinster et al., Cell 27 : 228-231, 1981).

   Dieses Plasmid kann als Ausgangsmaterial verwendet werden und sollte so manipuliert werden, dass man ein mit   Metall induzlerbares   Genkonstrukt erhält. 

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 sollteBeispiel 6 
Aufreinigung von   SN-CNTF   aus rekombinanten tierischen Zellen 
Da von SN-CNTF erwartet wird, dass er von Zellen wie das natürliche Material synthetisiert wird, wird es erwartet, dass die eingangs erwähnten Methoden zur Aufreinigung des natürlichen Proteins eine ähnliche Aufreinigung und Charakterisierung des rekombinanten Proteins erlauben werden. 



   Es ist für Fachleute offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen und Veränderungen bei den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung gemacht werden können. Die vorliegende Erfindung soll daher die erfindungsgemässen Modifikationen und Veränderungen mit einbeziehen, vorausgesetzt, dass sie in den Schutzumfang der beigefügten bzw. gleichwertiger Ansprüche fallen. Ausserdem soll der   Begrift   SN-CNTF die Herkunft von jeglichen Spezies umfassen, ausser der Bezeichnung ist eine spezifische Artsherkunft unmittelbar vorangestellt. 



  Beispiel 7 Herstellung von rekombinantem humanem CNTF 
Ein System zur Herstellung von rekombinantem humanen CNTF in dem Bakterium Escherichia coti wurde etabliert. Zwei alternative Methoden für die Konstruktion der zu exprimierenden DNA und zwei verschiedene Expressionsvektoren wurden verwendet. Alle diese Expressionssystemvarianten produzieren lösliches CNTF-Protein in einer hohen Ausbeute, das in dem Bakterienzellextrakt biologisch aktiv ist. Die Methoden zur Etablierung dieser Produktionssysteme sind unten beschrieben. Wir bitten, im folgenden zu beachten, dass die in Klammern angegebene Position eines charakteristischen Merkmals (z. B. [233]) sich auf die Anzahl von Basen bezieht, bei der das charakteristische Merkmal downstream des A [1] in dem ATGStartkodon in der humanen kodierenden Sequenz für CNTF beginnt (Fig. 12). 



   1. Herstellung von DNA zur Expression von CNTF ; Strategie 1 zur Konstruktion des 5'-Endes (Fig.   14) :   Der humane genomische   DNA-Klon   für CNTF im Phagen Lambda EMBL3 aus Beispiel 4 wurde mit den Restriktionsenzymen   Sal I   und Hlnd 111 verdaut und ein 4, 3 kb langes Fragment, das die für CNTF kodierenden Sequenzen upstream der Hind III-Stelle [233] enthält, wurde über ein Gel aufgereinigt. Dieses 4, 3 kb lange Fragment enthält ebenso ein einzelnes, ungefähr 1, 3 kb langes   Intron [114-115]   in der kodierenden Sequenz. Um eine Expression in Bakterienzellen zu erlauben, wurde das Intron durch   ortsspeztfische   Mutagenese unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotid in vitro wie von J. A. 



  McClary, F. Whitey, J. Geisselsoder (1989) Biotechniques 7 : 282-289 beschrieben, entfernt. 



  A. Deletion des   Introns   durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung eines Phagemidvektors und genetischer Selektion 
Ortsspezifische Mutagenese wurde zur Deletion des ca.   1, 3 kb langen Introns In   dem 4, 3 kb langen Sal I/Hind   III-DNA-Fragments,   von dem in einem   Phagemidvektor, Bluescript   SK M13 (-) (Stratagen), Subklone hergestellt worden waren, durchgeführt. Dieser Vektor wurde gewählt, da er das grosse (ca. 4, 3 kb) Sal 
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 Baktenophage f1 enthalten, die es erlaubt, einzelsträngige DNA zu gewinnen. Zusätzlich haben Phagemidvektoren eine Anzahl von Vorteilen gegenüber   einzelsträngigen   M13-Bakteriophagenvektoren.

   Da die Phagemids weniger als halb so gross wie M13-Vektoren sind, die weniger als ca.   2, 3   kb grosse Inserts vorziehen, können Subklone von grösseren Inserts leichter In Phagemids hergestellt werden und die Wahrscheinlichkeit spontaner Deletion ist verringert. Ein anderer Vorteil von Phagemids ist es, dass die Inserts direkt von doppelsträngiger   Supercoll-DNA   sequenziert werden können, wodurch ihre   Charaktensle-   rung vereinfacht wird. 



   Die Mutagenese wurde mit dem Muta-Gene in Vitro Mutagenesis Kit von BioRad ausgeführt. Die Wirtszelle zur Herstellung der Matrize für die Mutagenese ist der E. coli-Stamm CJ236 (Genotyp : dut, ung, 
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 so möglich, einzelsträngige Phagemid-DNA mit einem geeigneten Helferphagen zu gewinnen, wobei R408 In der vorliegenden Arbeit verwendet wurde. Die gewonnene   einzelsträngige Phagemid-DNA Ist teilweise   
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   Um die Mutagenese auszuführen, wurde das über ein Gel aufgereinigte 4, 3 kb lange   Sal I/Hind 111-   Fragment in mit Sal I/Hind 111 verdauten und über ein Gel aufgereinigten Bluescript SK   M13 (-) ligiert.   Die ligiert DNA wurde in CJ236 eingeführt, der nach der in J.   Mol. Bio !. 166 : 557   (1983) beschriebenen Methode von Hanahan kompetent gemacht worden war. Auf Platten mit 50 ug/ml Ampicillin (um für das Phagemid zu selektionieren) und 30   j, Lg/ml Chloramphenicol   (um für den erhaltenen F'-Faktor zu   selektionie-   ren) wurde für Transformanten selektioniert. Die Transformanten wurden auf das Vorhandensein des richtigen Inserts durch Restriktionsenzymanalyse der transformierten DNAs untersucht.

   Eine Transformante, die das richtige Insert trug   (pSHM-D19),   wurde im darauffolgenden Mutageneseexperiment verwendet. 



   Einzelsträngige Matrize aus   pSHM-D19   wurde mit dem Phagen R408 als Helferphagen gewonnen. pSHM-D19 enthaltender CJ236 wurde In Luria-Broth mit Ampicillin (50   tig/ml)   und Chloramphenicol (30   ugiml)   bis zu einer   Arno   von ca.   0, 3   angezüchtet. Die Zellen wurden mit dem   Helferphagen   R408 bei einer Multiplizität der Infektion von 20 infiziert und dann 8-14 Stunden bei   37. C   geschüttelt.   Einzelsträngige   Matrize wurde aus den gewonnenen Phagemids extrahiert. Ortsspezifische Mutagenese durch Introndeletion wurde mit einem 71 Basen langen Oligonukleotid (Oligonukleotid 1 in Fig. 16) durchgeführt.

   Die Basen 1-30 von Oligonukleotid 1 sind unmittelbar downstream des aus der genomischen CNTF-DNA zu deletierenden   Introns   (3') komplementär zum kodierenden Strang und die Basen 31-71 unmittelbar upstream (5'). Zur Verwendung in Mutagenesereaktionen wurde das Oligonukleotid mit   T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert.   



  Die Mutagenesereaktionen unter Verwendung des BioRad MutaGene Kits wurden nach den Angaben des Herstellers durchgeführt, ausser dass die DNA von den Mutagenesereaktionen zur Transformation von E. coli Stamm DH5a verwendet wurde. Deletionsmutanten wurden durch Restriktionsenzymkartierung der DNAs und DNA-Sequenzierung von doppelsträngigen DNAs aus Mutanten mit den entsprechenden Restriktionskarten charakterisiert. pMCN-21 war eine korrekt deletierte Mutante ohne Intron in dem BluescriptPhagemid. 



  B. Rekonstruktion des 5'-Endes des CNTF-Gens zur Expression 
Das 5'-Ende der für CNTF kodierenden Sequenz wurde rekonstruiert, um einige Veränderungen vorzunehmen, die die Aminosäuresequenz, die kodiert wird, nicht verändern, aber die wahrscheinlich die Effizienz der Expression in Bakterien steigern. Die teilweise überlappenden komplementären Oligonukleotide 2 und 3 (Abb. 16) wurden synthetisiert, über ein Gel aufgereinigt und miteinander verschmolzen. 



  Oligonukleotid 2 kodiert für die im humanen CNTF upstream der Nhe l-Stelle [66] vorhandenen Aminosäuren. Die kodierende Sequenz von Oligonukleotid 2 enthält mehrere Basen, die sich von den im humanen Gen vorhandenen unterscheiden (vergleiche Fig. 12 und 16). Diese Veränderungen wurden entweder deshalb vorgenommen, um die humane Verwendung von Kodons zu der von vorzugsweise E. coli verwendeten zu ändern (nach deBoer und Kastelein in From Gene to Protein : Steps Dictating the Maximal Level of Gene Expression (1986) Davis und Reznikoff, Hrsg., S. 225-238, Butterworths, NY) oder um eine Bgl li-Steile zu erzeugen (Fig.   16),   die in die Sequenz eingefügt wurde, um anschliessende genetische Manipulationen zu erleichtern.

   Oligonukleotid 2 kodiert auch für einen   Translationskoppler   zum 5'-Ende hin (Fig. 16), um eine effektive Translation zu fördern. Die verschmolzenen Oligonukleotide 2 und 3 haben einen Bam   HI-Überhang   am 5'-Ende und einen Nhe   l-Überhang   am 3'-Ende, um das nachfolgende Ligieren und   Kloneren   zu erleichtern (Fig. 14 & 16). Eine Analyse der DNA-Sequenz des humanen CNTF-Gens mit Restnktionsenzymen zeigte eine einzelne Nhe   t-Erkennungssequenz   (66] (Fig. 12). Daher wurden die Oligonukleotide 2 und 3 mit einem Nhe   l-Überhang   konstruiert, um zu erlauben, dass sie mit dem verbleibenden 3'-Fragment des Gens, nach Verdau mit Nhe I, verbunden werden. 



  C. Verbinden der Oligonukleotide 2 und 3 mit den von Introns befreiten kodierenden Sequenzen 
Die Oligonukleotide 2 und 3, die das wiederhergestellte Aminoende des CNTF-Gens enthielten, wurden miteinander verschmolzen und mit mit Nhe   I   geschnittenen pMCN-2a ligiert. Ligiert DNA wurde dann mit Bam Hi und Hind 111 verdaut, um das als CNTF-Syn1 bezeichnete DNA-Fragment freizugeben, das zur Expression in E. coli geeignete DNA-Sequenzen enthält, die für humanen CNTF upstream der Hind   li-Steile   [233] kodieren. 



   Strategie 2 zur Konstruktion des 5'-Endes (Abb.   15) : eine   alternative Strategie wurde durchgeführt, bel der das Intron nicht durch ortsspezifische Mutagenese entfernt wurde, sondern dafür eine insgesamt synthetische DNA-Sequenz, die für CNTF upstream der Hind   III-Stelle [233]   kodiert, hergestellt wurde, jedoch ohne das Intron. Um dieses synthetische DNA-Konstrukt zu bilden, wurden die Oligonukleotide 5 bis 10 In Fig. 17 synthetisiert. Die folgenden Oligonukleotide wurden als teilweise überlappende, doppelsträngi- 
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 so konstruiert sind, dass sie erlauben, dass 5 & 6-7 & 8-9 & 10 in dieser Ordnung miteinander ligiert werden.

   Die Oligonukleotide wurden über ein Gel aufgereinigt, verschmolzen und miteinander zu einem einzigen. 261 Basenpaar langen, doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid ligiert, das als CNTF-Syn2 bezeichnet wird. Diese synthetische DNA enthielt ausserdem : (1) geänderte Kodons, um der bevorzugten Verwendung von Kodons durch E. coli Genüge zu tun (vergleiche Fig. 12 und   17) ;   (2) den oben verwendeten   S'-Transtationskoppier   (Abb. 16 und 17); und (3) einen   5'-Bam     HI-Überhang   und einen   3'Hind III-Überhang,   um das Ligieren und Klonieren zu erleichtern (Fig. 17). 
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 :geschnitten und ein 2, 1 kb langes Fragment, das die für CNTF kodierenden Sequenzen downstream der
Hind   III-Stelle [233] enthält,   wurde über ein Gel aufgereinigt.

   Dieses 2, 1 kb lange Fragment wurde in das mit Hind   111   geschnittene Plasmid pEMBL8   (Dente   et   al., 1983, Nucleic   Acids Res.   11 : 1645) kloniert.   Eine   Spe I-Stelle [613]   wurde in die   2, 1 kb lange Insert-DNA   durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese 13 Basenpaare downstream des Stopkodons, das die CNTF-Sequenz beendet, unter Verwendung des synthetischen Oligonukleotids 4 eingefügt (Fig. 16). Das mutierte Plasmid wurde mit Hind   111   und Spe) geschnitten, um das kodierende downstream-Fragment freizugeben, das im Gel aufgereinigt wurde und als CNTF-Syn3 bezeichnet wird (enthält die kodierenden Sequenzen für humanen CNTF downstream der Hind III-Stelle [233]). 



   Herstellung des vollständigen   Expressionskonstrukts : CNTF-Syn1   wurde mit CNTF-Syn3 zu CNTF-   Syn1/3   ligiert (Fig. 14) und CNTF-Syn2 wurde mit   CNTF-Syn3   zu   CNTF-Syn2/3     ligiert (Fig, 15),   um zwei alternative DNA-Fragmente zu konstruieren, von denen Jedes für humanen CNTF kodiert und geeignete Modifikationen der DNA-Sequenz besitzt, um eine effiziente Expression in E. coli zu fördern. Diese DNAFragmente wurden dann in E. coli exprimiert, nachdem in : (A) einem bakteriellen Expressionsvektor pT5T, basierend auf dem   T7-Phagenpromotor ;   oder (B) einem baktenellen Expressionsvektor,   pT3XI-2,   basierend auf einem Hybridpromotor aus dem Lactose- und Tryptophanoperon ('Tac'), Subklone hergestellt worden waren. 



  2. Expression von CNTF unter Verwendung eines auf   dem "T7-Promotor"-System basIerenden   Expres-   sionsvektors   (Die charakteristischen Merkmale des Vektors sind Fig. 17 zu entnehmen) : A Beschreibung von pT5T 
Der auf T7-Promotor basierende Expresionsvektor pT5T ist im wesentlichen der gleiche wie   pJU1003,   der von Squires et al., J. Biol. Chem. (1988) 263 : 16297-16302 beschrieben wird, ausser dass zwischen der einzigen Bgi   li-Steile 5'vom   T7-Promotor und der Cla   t-Stelle Im Tetracycinresistenzgen   ein kurzes Stück DNA vorhanden ist. 



  Die Sequenz dieser DNA ist :   ATCGATGATA     AGCTGCAAA   CATGAGAATT GAGCTCCCCG   GAGATCCTTA  
GCGAAGCTA
Cla I
AGGATTTTTT   TTAGATCT  
Bgl II B Konstruktion des vollständigen Expressionsvektors 
Der über ein   Gel aufgereinigte   Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen Bam   Hf   und Spe   I   linearislert. 



  CNTF-Syn1/3 wurde mit dem linearislerten Vektor vermischt und zum Expressionskonstrukt pT5T : CNTF-   Syn1/3   ligiert. (Allgemeiner Abriss der Vektorkonstruktion, siehe Fig. 14). 



  C. Expression von rekombinantem humanem CNTF in E. coli pT5T : CNTF-Syn1/3 wurde in den E. coli Stamm BL21 (DE3) zur Expression transformiert. Dieser Stamm, der bel Studier und Moffat J. Mol. Biol. (1986)   189 : 113-130 beschrieben ist,   enthält das T7-RNA- 

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 Polymerasegen unter Kontrolle des durch IPTG induzierbaren lac-Promotors auf einem nicht ausschneidbaren   Iysogenen Lambda-Bakteriophagen,   Unter 10 durchgemusterten Transformanten wurden 2 Klone gefunden, die ein durch IPTG induzierbares Protein exprimierten, das mit einem Molekulargewicht im CNTF entsprechenden Bereich wandert (ca. 24 kD). Diese beiden Klone wurden als pT5T : CNTF-Syn1/3-5a und 5c bezeichnet. Die Sequenzierung der DNA von pT5T : CNTF-Syn1/3-5a und 5c bestätigte, dass die Sequenzen der Rekombinanten korrekt waren. 



   Ein hohes Expressionsniveau an rekombinantem CNTF wurde dadurch erzielt, dass man die Zellen in Luria-Broth mit 15   u. g/ml Tetracyclin   bis zu einer Zelldichte wachsen liess, die einer   Ä600   von   0, 5-0. 8   entsprach. Die Zellen wurden 1, 5-4 Stunden entweder ohne IPTG ("uninduziert") oder mit Zugabe von   IPTG   bis zu einer Endkonzentration von 1, 0 mM ("induziert") wachsen gelassen. IPTG   (Iso-propyl-ss-D-thiogalakto-   pyranosid) ist ein Induktor das lac-Operons, dessen Gegenwart zu einer indirekten Aktivierung der T7Polymerase des Expressionsvektors und einem erhöhten Niveau der CNTF-Expression führen sollte. 



  D. Analyse expnmierten Proteins durch   SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese   mit nachfolgender Färbung mit Coomassie-Farbstoff oder Immunoblot 
Die Zellen wurden durch kurze Zentrifugation geerntet und direkt in Probenpuffer für das SDSPolyacrylamidgel (0. 025% Bromphenol blau. 10% Glycerin,   1% ss-Mercaptoethanol,   2% SDS, 0, 0625 M 
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 transformierten und mit   IPTG   2 Stunden induzierten Zellen (Bahn 5, Fig. 20) ist eine mit   Coomassle-   Farbstoff dunkel angefärbte Bande vorhanden, die in der für CNTF erwarteten Position (ca. 24 kD) verläuft. 



  Lässt man die Zellen ohne IPTG wachsen, (Bahn 4, Fig. 20), ist viel weniger dieser Bande vorhanden, wie dies für ein Protein zu erwarten ist, dessen Expression unter der Kontrolle des lac-Operons steht. Mit dem Vektor pT5T ohne ein CNTF-Insert transformierte Zellen zeigen diese Bande nicht, weder induziert (Bahn 3, Fig. 20) noch uninduziert (Bahn 2, Fig. 20). Bahn 1 enthält Molekulargewichtsstandards. 



   Ein identisches   SDS-Polyacrylamidgel   wurde auf Nitrocellulose übertragen und einem Immunoblot mit affinitätsaufgereinigten   Antikörpern   gegen CNTF-Peptid A   (E-S-Y-V-K-H-Q-G-L-N-K-N)   unterzogen. Bei mit pT5T : CNTF-Syn1/3-5a transformierten und mit IPTG 2 Stunden induzierten Zellen (Bahn 5, Fig. 21) ist eine dichte, von affinitätsaufgereinigten Antikörpern gegen CNTF-Peptid A erkannte Bande vorhanden, die an der für CNTF erwarteten Stelle verläuft (ca. 24 kD). Lässt man die Zellen ohne IPTG wachsen, (Bahn 4, Flg. 



  21), ist viel weniger dieser Bande vorhanden. Mit dem Vektor pT5T ohne ein CNTF-Insert transformierte Zelle zeigen diese Bande nicht, weder induziert (Bahn 3, Fig. 20) noch uninduziert (Bahn 2, Fig. 20). Bahn 1 enthält Molekulargewichtsstandards. 



   Ausserdem wurden die mit pT5T : CNTF-Syn1/3-5a transformierten und mit ITPG 2 Stunden induzierten Zellen durch dreifachen Durchgang durch eine French-Druckzelle aufgeschlossen. Ein Aliquot des Zellrohlysats wurde durch Zentrifugation bei 20 000 UpM in einem JA-20-Rotor (Beckman) für 15 min in die 
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 die der gleichen Menge an Ausgangssuspension der Zellen entsprachen, wurden auch auf demselben SDSPolyacrylamidgel laufengelassen, auf Nitrocellulose übertragen und einem Immunoblot mit   affinitätsaufgerei-   nigten Anti-Peptid A-Antikörpernunterzogen. Der Überstand des Lysats (Bahn 8, Fig. 21) enthielt viel mehr immunreaktiven CNTF als das Pellet des Lysats (Bahn 9, Fig. 21). Das CNTF-Niveau im Überstand war dem Im nicht fraktionierten Lysat vergleichbar (Bahn 7, Fig. 21). 



  E. Bioaktivität von exprimiertem CNTF 
Durch kurze Zentrifugation geerntete Zellen wurden in 20mM   Tris-HCI,   pH   8, 2, mit   1/35 des ursprünglichen Volumens der Zellsuspension resuspendiert, durch einen dreifachen Durchgang durch eine FrenchDruckzelle aufgeschlossen und das Zellrohlysat in   Überstands- bzw. Pelletfraktion   durch Zentrifugation bel 20 000 UpM im JA-20-Rotor (Beckman) für 15 min aufgetrennt. Eine Verdünnungsreihe der Überstandsfrak- 
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 fördern (wie In Beispiel 1 beschrieben). Der Überstand zeigte eine signifikante Bioaktivität bis zu einer Verdünnung von 1 : 1 000 000 Fig. 22). Die spezifische Aktivität von rekombinantem humanem CNTF wurde auf ungefähr   275fTU/ng   geschätzt, basierend auf der Bioaktivität und der von Immunoblots geschätzten Länge an CNTF-Protein.

   Diese spezifische Aktivität ist ungefähr doppelt so gross wie die spezifische Aktivität des aufgereinigten Kaninchen-CNTF-Proteins, was darauf hinweist, dass der rekombinante CNTF Im 
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   Der Überstand wurde auch auf einem reduzierenden,   15%igen Polyacrylamid-SDS-Gel   Elektrophorese unterzogen und in 1 mm breite Streifen geschnitten, die über Nacht in Zellkulturmedium bei   4. C   unter Schwenken extrahiert wurden und einem Bioasssay, wie in Beispiel 1 beschrieben. Unterzogen wurden. Das Nebenbild in Abbildung 22 zeigt, dass bei Fraktionen, die, wie für CNTF erwartet, 24 kD entsprechen, ein Peak der Bioaktivität vorhanden ist. 



  F. Aminosäuresequenz von exprimiertem CNTF 
Der Bereich um 24 kD wurde aus einem   SDS-Polyacrylamidgel   ausgeschnitten, das dem für Abb. 20 laufen gelassenen ähnlich war, jedoch ohne Coomassie-Färbung. Dieses Material wurde durch EdmanAbbau in einem Protein-Sequenator von Applied Biosystems sequenziert (wie in Beispiel 2 beschrieben). 



  Die folgende Aminosäuresequenz wurde erhalten :   AFTEHSPLTPHRRDL [ ?] S....   Das Fragezeichen entspricht einem C in der humanen Sequenz (Fig. 12), das mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden kann. Diese Sequenz entspricht der für humanen CNTF erwarteten (Fig. 12) und ist ein zusätzlicher Beweis dafür, dass CNTF richtig exprimiert wird. Sie weist auch darauf hin, dass das amino-terminale Methionin während der Expression entfernt wird, wobei Alanin als die amino-terminale Aminosäure in dem exprimierten Protein verbleibt. 



   Das obige Ergebnis zeigt, dass immunologisch kreuzreaktiver CNTF mit einem hohen Niveau in einer biologisch aktiven Form exprimiert wurde, die grösstenteils nach Lyse der bakteriellen Zellen löslich ist. 



  3. Expression von CNTF unter Verwendung eines Expressionsvektors der auf einem   Hybridpromotor- ('Tac')-   System aus dem Lactose- und dem Tryotophan-Operon basiert (charakteristische Merkmale des Vektors, siehe Fig. 19) A. Beschreibung von pT3XI-2 (Modifikation von pKK223-3) 
Das Ausgangsplasmid für diese Konstruktion war das von Pharmacia erworbene Plasmid pKK223-3. 



  Das Plasmid pKK233-3 trägt einen Teil des Gens für Tetracyclinresistenz. Dieses nicht funktionierende Gen wurde durch ein vollständiges Tetracyclinresistenzgen ersetzt, das von dem Plasmid pBR322 getragen wird. Das Plasmid pKK223-3 wurde mit Sph   I   vollständig verdaut, und teilweise mit Bam Hl. Ein 4, 4 Kilobasenpaar langes Fragment wurde im Gel aufgereinigt und mit einem synthetischen Adapter mit der Sequenz : 
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 und einem 539 Basenpaare langen Fragment DNA aus einem Cla I, Sph   i-Verdau   des Tetracyclinresistenzgens aus pBR322 (PL Biochemical, 27-4891-01) verbunden. Das resultierende Plasmid wurde als pCJ1 bezeichnet. 



   Als nächstes wurde ein von New England Biolabs erworbener   Xho)-Linker < n   die Pvu li-Steile des Plasmids pCJ1 eingefügt, so dass das Plasmid pCJX-1 gebildet wurde. Dieses eingeschobene Stück unterbricht das rop-Gen, das die Kopienzahl des Plasmids steuert Ein Eco RI-Fragment, das das   lac l-Gen   enthält, wurde aus dem Plasmid pMC9 (Calos et   al.,   Proc. Natl. Acad. Sci.

   USA (1983), 80 : 3015-3019] aufgereinigt und dann In die Xho   !-Stet)   eingefügt mit Adaptern (Xho   I   zu Eco   RI)   mit der Sequenz :   :'TCGAGTCTÄGA---3'  
3'CAGATCTTTAA 5' 
Die Polylinker-Sequenz zwischen den Eco RI- und Pst l-Stellen im Plasmid pKK223-3 wurde als 
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 Der so erhaltene   Plasmidvektor   wird als pCJXI-1 bezeichnet. 



   Schliesslich wurde das Tetracyclinresistenzgen durch ein ähnliches Gen ersetzt, in dem die Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme Hind   111, Sam HI   und Sal   I   durch Mutagenese mit Bisulfit zerstört worden waren. Die folgende Vorgehensweise wurde verwendet, um das   Tetracyclinresistenzgen   von pBR322 zu mutieren. Das Plasmid pBR322 wurde mit Hind   111   geschnitten und dann einer Mutagenese mit   Natriumbf-   sulfit unterzogen shortie und   Nathans,   Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1978) 5 : 2170-2174]. Die durch Mutagenese veränderte DNA wurde zu einer ringförmigen DNA ligiert und dann mit Hind 111 geschnitten, um alle Plasmide zu linearisieren, die der Mutagenese entgingen.

   E. coli JM109 [Yanisch-Perron et al., Gene- (1985) 33 : 103-119] wurde mit dem Plasmid transformiert und dann auf Selektivmedien ausplattiert. Aus tetracyclinresistenten Kolonien wurden Plasmide isoliert und auf den Verlust der Hind III-Stelle im Tetracyclinresistenzgen überprüft. Das erfolgreich mutierte Plasmid wurde mit   pT1   bezeichnet. Zur Mutagenese der Bam HI-Stelle in pT1 wurde ein Ehnliches Verfarhen verwendet, was das Plasmid pT2 ergab. Das Plasmid pT2 wurde seinerseits einer Mutagenese unterzogen, um die Sal l-Stelle zu entfernen, wobei das Plasmid pT3 gebildet wird. Ein das mutierte Tetracyclinresistenzgen tragendes Cla I/Bam l-Fragment von pT3 wurde isoliert und dazu verwendet, das homologe Fragment von pCJXI-1 zu ersetzen, um   pT3XI-2   zu bilden.

   Das mutierte Tetracyclinresistenzgen kodiert immer noch für ein funktionierendes Protein. 



  C. Bildung von   p T3XI-2- 1 OTC3FGFsyn (Herstellung   des Vektors mit tac-Promotor für CNTF) 
Zunächst wurde   ein "Gen" für   basischen Fibroblastenwuchsfaktor (bFGF) synthetisiert. Dieses "Gen" kodiert für die gleiche Sequenz, wie die von Sommer et al., (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 



  141 : 67) für FGF berichtete, aber verwendet Kodons, die man vorzugsweise in stark exprimierten Genen bei E. coli findet. Die Struktur dieses Gens Ist solchermassen, dass dem kodierenden Anteil eine Translations Kopplersequenz vorangestellt ist (siehe Squires et al., 1988,   a. a. O.),   um einen effizienten Translationsstart zu gewährleisten. 



   Das synthetische FGF-Gen wurde zunächst in M13mp18 zwischen den Eco RI- und Hind III-Stellen eingefügt und sequenziert. Die Struktur dieses Gens ist : 

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 EMI22.1 
   ACCGACGTAGT   EcoRIBamHiRBSFCFstart
Translationskoppler 3 CTACCCTGCC GGCACTGCCG GAAGACGGTG GCTCCGGTGC TTTCCCGCCG GGCCACTTCA GATGGGACGG CCGTGACGGC CTTCTGCCAC CGAGGCCACG AAAGGGCGGC   CCGGTGAAGT     AAGACCCGAA     ACGTCTSTAC   TGTAAAAACG GTGGCTTCTT CCTGCGTATC   CACCCGGATG   
 EMI22.2 
 
CACCGAAGAA GGACGCATAGGCTGCAGGCTG CAGCACAGCT TGCCGCATGC ACTTTTTTCC TGGGCGTGT AGTTTGACGT CGACCTCCGAC AAGAACGTG   GTGTTGEATC   TATCAAAGGC GTTTGCGCAA ACCGTTACCT GGCTATGAAAG 
 EMI22.3 
 

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 EMI23.1 
   ATAGTTTCCG CAAACGCGTT TGGCAATGGACTTCGAACGTC TTCTGCCAG 

  CAGACGACCG ATCGTTTACA CATTGACTGC TTACAAAGAA GAAGCTTGCAG   TGGAAAGCAACAACTACAACACCTACCGTTCTCGTAAATACACTTCTTG GTACCTTGCTC 
 EMI23.2 
 
GTGGACTTTCGTTAGG   TGTTCCTGC   CGATGAGCGC TAAATCTTAA ACTAGTA
ACAAGGACG GCTACTCGCG ATTTAGAATT TGATCATTCGA   FG ? atOp KindIII    Relevante Charakteristika des Gens sind hervorgehoben. 



   Es wurde dann durch Verdau mit Bam   H)   und Hind   111   isoliert und in mit Bam   HI/Hind     111   geschnittenen 
 EMI23.3 
 Das neue Plasmid wird   als pT3XI-2# 10TC3FGFsyn   bezeichnet. 



  D Einfügen von CNTF-Expressionskonstrukten in den Vektor mit Tac-Promotor   pT3XI-2-c10TC3FGFsyn   wurde mit Bam   Ht   und Spe   I   geschnitten, was In der Linearislerung des 7, 4 kb langen Expressionsvektors und der Freisetzung des ca. 0, 5 kb langen FGF-DNA-Fragments resultierte In getrennten Reaktionen wurden   CNTF-Syn1l3   und CNTF-Syn2/3 in das über   ein Gel aufgereinigte. mit Bam     H !/Spe !   geschnittene DNA-Fragment des Vektors ligiert, was in den Plasmiden   pT3XI-2 : CNTF-Syn1l3   und pT3XI-2 :CNTF-Syn2/3resultierte. 



  E. Expression In E. coli pT3XI-2:CNTF-Syn1/3 wurde in einem phagenresistenten E. cola K-Stamm, JM107, transformiert. 



  Vierzehn Transformanten wurden angezüchtet und mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Färben mit Coomassie Brilliant Blue auf CNTF-Expression untersucht. Vier Transformanten zeigten eine dunkel gefärbte Bande an der ungefähren Position von CNTF Eine Expression von rekombinantem CNTF auf hohem Niveau wurde durch Anzüchten der   Zellen In Luna-Broth mit   15   u. g/ml Tetracyclin bis   zu einer Zelldichte, die einer A600 von 0,8 entsprach, erzielt. IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 1, 0mM zugegeben und die Zellen wurden 2 Stunden wachsen gelassen. Diese vier Transformanten zeigten alle ungefähr die 

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 gleiche Dichte sowohl in mit Coomassie angefärbten Gelen als auch in einem Immunoblot unterzogenen Gelen.

   Das apparente Niveau der CNTF-Expression in diesen Transformanten war. basierend auf diesen Gelen, ungefähr ein Viertel von den mit pTST:CNTF-Syn1/3-5a erhaltenen, wenn wie oben erwähnt angezüchtet wurde. Die Restriktionsanalyse der DNAs dieser vier Transformanten bestätigte, dass alle das menschliche CNTF-Gen trugen. 



   Der E. coii-Stamm TG1 wurde mit   pT3XI-2 : CNTF-Syn2l3   zum Zwecke der Expression transformiert. 



  Transformanten wurden durch   Ausplattieren   auf Lb-Agar, welcher 15  g/ml Tetracyclin enthielt, selektiert. 



  Vier Transformanten, pT3XI-2:CNTF-Syn2/3-A, -B, -C, -D wurde selektiert, angezüchtet und deren Natur durch Restriktionsanalyse bestätigt. Einer der Transformanten,   pT3XI-2 : CNTF-Syn2/3-A,   wurde für weitere Untersuchungen   ausgewählt.   Dieser Transformant wurde über Nacht in 500 ml 2XYT broth mit 10  g/ml Tetracyclin und 1 mM   IPTG   angezüchtet. Die Zellen wurden wie oben durch Zentrifugieren geerntet und durch eine 15-sekündige Ultraschallbehandlung auf Eis mittels einer Mikrospitze auf der Stufe &num;3 in 10 mM Phosphatpuffer, pH 6, 7, enthaltend 1 mM EDTA, 0. 1 M PMSF und 0, 1 mM Pepstatin, extrahiert. Nach 15minütiger Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge wurde der Überstand gesammelt und die Bioaktivität des 
 EMI24.1 
 war im Überstand (Fig. 22), der 1,5 mg/ml Protein enthielt, vorhanden. 



   Die hier vorgelegten Resultate indizieren, dass zwei verschiedene DNA-Konstrukte in zwei verschiedenen Expressionsvektoren die Expression von biologisch aktivem CNTF erlauben, welches entsprechend auf reduzierten   SDS-Polyacrylamidgelen   wanderte, durch   affinitätsgereinigte   Antikörper gegen CNTF detektiert werden konnte und eine entsprechende aminoterminale Aminosäuresequenz aufwies. 



  4. Reinigung von rekombinantem CNTF 
Ein kleines Inoculum von pT5T : CNTF-Syn1/3-5a wurde über Nacht bei 37 C unter Schütteln in Luna broth-Medium, welches 10  g/ml Tetracyclin enthielt, angezüchtet. Sieben   ml   dieser Zellsuspension pro 50   ml   Luria-Broth wird in grosse Kolben gegeben und bei 37 C unter Schütteln angezüchet, bis die   Aeoo   ungefähr 0, 5 erreicht. Dann wird IPTG zu einer Endkonzentration von 0, 5 mM zugegeben, um die Expression von CNTF zu induzieren, und es wird weitergezüchtet, bis die   Aeoo   ungefähr 1, 2 erreicht, was typischerweise 4-6-Stunden dauert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (JA-20-Rotor) für 5 min bei 7 000 UpM und   4.

   C   geerntet und noch einmal durch Zentrifugation In 50 mM Phosphatpuffer, pH 8, 0 (Puffer A) bei   4 C   gewaschen. Der Überstand wird entfernt und das Zellpellet wird als Paste   bei -20. C   eingefroren. 



   Die Zellpaste wird In Puffer B [Puffer A mit 1 mM EGTA (Ethylenglykol-bis (-aminoethylether)-   N. N. N'. N'-tetraessigsäure)   und 1 mM EDTA   (Ethylendiamintetraessigsäure)     bel 0,5 9   Paste pro ml Puffer und   4. C   suspendiert und dreimal durch eine French-Druckzelle geschickt, um die Bakterien aufzuschliessen. 
 EMI24.2 
 geschüttelt. Der Niederschlag wird in einer Microfuge 15 min bei Höchstgeschwindigkeit abzentnfugiert. 



  Dieser Schritt verringert typischerweise den   Nukleinsäuregehalt,   gemessen als Verhältnis von   Ao/Aso   von ungefähr 25% auf weniger als   5%.   



   Die Probe wird dann auf eine mit Puffer B   äquilibrierte   Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen. 



  CNTF ist ein so überwiegender Bestandteil des Zellysats der French-Presse, dass er während der Chromatographie durch mit Coomassie Brilliant Blue gefärbte   SDS-Polyacrylamidgele   von   Säulenfraktionen   verfolgt werden kann. CNTF ist eine stärkere mit Coomassie angefärbte Bande bei ungefähr 24 kD. Unter Venwendung dieses Assays läuft CNTF durch die Q-Sepharose-Säure in Puffer B. 



   Die Durchlauffraktionen, die den grössten Anteil des CNTF-Proteins enthalten, werden vereinigt, gegen Puffer C (5 mM Phosphatpuffer, pH 8, 0. mit 1 mM EGTA und 1 mM EDTA) dialysiert und auf eine mit Puffer C   äquilibnerte     Q-Sepharose-Säule   aufgetragen. Die Säule wird mit Puffer C gewaschen, bis die A280 zur   Basishnie   zurückkehrt, was darauf hinweist, dass nicht adhärente Proteine durch die Säule hindurchgewaschen wurden, In Puffer C bindet CNTF an die Q-Sepharose-Säule und wird dann mit einem 0-0, 1 M NaCI-Gradienten in Puffer C eluiert. CNTF verlässt die Säule bei ungefähr 40 mM NaCI und besitzt, nach mit Coomassie angefärbten SDS-Polyacrylamidgelen der CNTF-Peakfraktionen zu urteilen, eine Reinheit von mehr als 90%. 



  

Claims (3)

1. Patentansprüche 1. Für humanen CNTF kodierende Nukleinsäuresequenz, wie in Flg. 12 dargelegt. **WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.
2. 2. Aminosäuresequenz von humanem CNTF, wie in Fig. 12 dargelegt. <Desc/Clms Page number 25>
3. 3. Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1 oder von Teilen hievon zur Konstruktion eines Expressionsvektors für tierische Zellen in einem rekombinanten Expressionssystem mit tierischen Zellen zur vorübergehenden Herstellung von biologisch aktivem CNTF. EMI25.1