AT400846B

AT400846B - Verfahren zur gewinnung und reinigung von alkalimetallsalzen der clavulansäure

Info

Publication number: AT400846B
Application number: AT40594A
Authority: AT
Inventors: Gualtieri Eugenio Tisselli
Original assignee: Fermic S A De C V
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1996-03-25
Also published as: ATA40594A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung von Clavulansäure, bei welchem diese in Form ihrer Alkalimetallsalze, insbesondere des Kaliumsalzes, direkt aus der Fermentationsbrühe erhalten wird.

Clavulansäure, die auch bekannt ist als (2R, 5R, Z)-3- (2-Hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo- 2, 3, O-heptan-2-carbonsäure, ist ein natürlich vorkommendes Breitbandantibiotikum mittlerer Wirksamkeit und wurde zuerst aus Stämmen von Streptomyces Clavuligerus isoliert (GB-PS 1 508 977).

Die Bedeutung der Clavulansäure liegt nicht so sehr in ihrer antibiotischen Wirksamkeit, sondern In ihrer Fähigkeit, beta-Lactamase zu inhibieren und dadurch die Wirksamkeit von Penicillinen und Cephalosporinen gegen viele beta-Lactamase- produzierende Bakterien zu verstärken.

In unserer Zeit findet die Clavulansäure ihre Anwendung in der Humantherapie in Kombination mit Penicillinen, wie Amoxicillin (AugmentinR, StacillinR) und Ticarcillin (BetabactylR, TimentinR).

Trotz der Tatsache, dass verschiedene Fraktionierverfahren zur Reinigung der Clavulansäure beschne- ben wurden, bleibt dennoch ihre Abtrennung in reiner Form aus den komplexen Mischungen der sie begleitenden Produkte ein Ziel, das schwer zu erreichen ist. Tatsache ist, dass die Clavulansäure In den Fermentationsbrühen von Streptomyces Clavuligerus gemeinsam mit einer Anzahl unerwünschter Komponenten vorliegt, wie Proteinen, Enzymen und anderen beta-Lactam-Antibiotika, insbesondere verschiedenen beta-Lactam-Carbonsäuren, die ein ähnliches chemisch-physikalisches Verhalten zeigen.

Bis jetzt wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, die Clavulansäure in hochreiner Form zu isolieren, was insbesondere über ihre Salzbildung erfolgte, wie über das Lithiumsalz (GB-PS 1 543 563) und das tert.-Butylaminsalz (US-PS 4 647 659).

Alle diese bekannten Methoden haben Nachteile, da sie im allgemeinen nur niedrige Ausbeuten oder Produkte mit unbefriedigender Reinheit liefern und oft sehr mühsam sind. Ausserdem erlauben diese Verfahren keine direkte Herstellung des Kaliumsalzes der Clavulansäure, das einen Bestandteil verschiedener im Handel erhältlicher therapeutischer Zusammensetzungen ist, da dessen Herstellung in reiner Form die Umwandlung des Lithiumsalze oder des tert.-Butylaminsalzes mit Hilfe zusätzlicher Stufen des lonenersatzes erfordert.

Es wurde nun ein neues, überraschend vorteilhaftes Gewinnungs- und Reinegungsverfahren gefunden, das die Herstellung von Clavulansäure aus den Fermentationsbrühen von Streptomyces Clavuligerus In Form hochreiner Alkalimetallsalze gestattet.

Das vorliegende Verfahren zur Herstellung hochreiner Alkalimetallsalze der Clavulansäure umfasst folgende Schritte :
A) einen Koagulationsschritt, der durch Zusatz eines Flockungsmittels aus der Gruppe Calciumchlond, Kaliumferrocyanid, wasserlösliche kationische Polymere und organische Polyelektrolyte zu einer Fermen- tationsbrühe von Streptomyces Clavuligerus bei einer Temperatur von 0*C bis + 10'C und bei einem pH-Wert von 4, 0-4, 5 vorgenommen wird ;
B) Ultrafiltration der oben erhaltenen, geklärten Fermentationsbrühe von Streptomyces Clavuligerus, die auf einer Temperatur zwischen O'C und + 10'C und bei einem pH-Wert zwischen 6, 0 und 6, 5 gehalten wird, durch eine Ultrafiltrationsmembran, die einen Cut-off zwischen 30. 000 und 100. 000 Dalton hat ;

C) Entfärbung des oben erhaltenen Ultrafiltrats durch Laufenlassen desselben durch eine Säule mit einem polymeren Acrylesterharz bei einer Temperatur von 0 C bis + 10. C,
D) Etnengung der flüssigen Phase aus Stufe C) mit Hilfe der reversen Osmose durch eine Membran, die einen Cut-off von 750 bis 500 Dalton hat, bei einer Temperatur von O'C bis + 10'C und einem pH-Wert von 6, 0 bis 6, 5 ;
E) Entfärbung der eingeengten Flüssigkeit mit säuregewaschener, dampfaktivierter Kohle bei einem pH-
Wert von 6, 0 bis 6, 5 und einer Temperatur von O'C bis +10'C ;
F) Salzbildung der Clavulansäure durch Zusatz einer wässerigen Lösung eines Alkalimetallsalzes zu der oben erhaltenen angereicherten wässerigen Lösung ;

G) Ausfällung des Alkalimetallsalzes der Clavulansäure aus der oben erhaltenen wässerigen Lösung durch Zusatz eines niedrigen Alkohols aus der Gruppe Methanol und Ethanoi und anschliessenden Zusatz
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Clavulansäure-Alkalimetallsalze der Qualität USP XXII zu erhalten, wobei das Verfahren einfacher, praktischer und zeitsparender im Vergleich zu den Reinigungsverfahren des Standes der Technik ist.

Die Verwendung ausgewählter Flockungsmittel, die Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen mit einem speziellen Cut-off und die Auswahl spezieller Entfärbungsmaterialien gestatten es, eine ausserordentlich gereinigte Lösung zu erhalten, die für den anschliessenden Ausfältungsschritt besonders geeignet ist.

Soweit bekannt ist, wurden Ultrafiltrationsmembranen mit einem Cut-off von 30. 000 bis 100. 000 bisher noch nie zur Reinigung von Clavulansäure verwendet.

Im Hinblick auf den Ausfällungsschritt sei betont, dass dessen Wirksamkeit bezüglich der Trennung von Clavulansäure-Alkalimetallsalzen von den unerwünschten Verunreinigungen mit der Auswahl spezieller
Mischungen von Lösungsmitteln zusammenhängt, die eine Ausfällung der genannten Salze in einer sehr reinen Form gestatten, wobei sie die gummiartigen Nebenprodukte in Lösung halten.

Die derart ausgefällten Alkalimetallsalze der Clavulansäure sind besonders gut kristallisierte, weisse Feststoffe.

Die vorliegende Reinigungsmethode wurde mit Erfolg insbesondere bei Fermentationsbrühen angewendet, die von dem Stamm Streptomyces Clavuligerus var. FAC, der in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist, erhalten wurden.

Ausgehend von Streptomyces Clavuiigerus Type Stamm ATCC 27064 und unter Einsatz bekannter Genmanipulationsverfahren konnte der transformierte Stamm Streptomyces Clavuligerus var. FAC erhalten werden, der eine unerwartet stärkere Produktionskapaz ! tät im Vergleich zum Originalstamm besitzt (siehe Beispiel 2).

Die Produktion von Clavulansäure aus Streptomyces Clavuligerus var. FAC erfolgt durch Züchtung desselben In Gegenwart von assimilierbaren Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen sowie gegebenenfalls von Tnglyceriden. Vorzugsweise wird die Züchtung unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von + 20. C bis + 37. C, insbesondere von +20'C bis +30*C, unter Rühren vorgenommen.

Bevorzugte Proteinquellen sind Maismehl, Erdnussmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl ; besonders bevorzugt ist ein spezielles entfettete Baumwollsamenmehl. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Dextrin, Dextrose und Maisstärke. Die Menge der Proteinquellen, Kohlenstoffquellen und Tnglyceride In den Kulturmedien beträgt im allgemeinen 1 % bis 10 %, in der Regel 2 % bis 5 %.

Dem Kulturmedium werden meist Mineralsalze zugesetzt, insbesondere Kalium-, Calcium-, Natriumsal- ze, wie etwa Carbonate und Phosphate.

Spurenelemente in Form anorganischer Salze von Co, Fe, Mg, Ni, Zn und Cu (Sulfate und Chloride) können den Kulturmedien ebenfalls zugesetzt werden.

Es kann erforderlichenfalls auch ein schaumverhinderndes Mittel zugesetzt werden, um eine übermässige Schaumbildung zu vermeiden.

Vorzugsweise wird in der Fermentationsstufe Streptomyces Clavuligerus FAC unter aeroben Bedingungen unter Rühren bei einer Temperatur von +24'C bis +27'C und einem pH-wert von 6, 8 bis 7, 0 in Gegenwart eines Mediums gezüchtet, das eine Proteinquelle aus der Gruppe Sojabohnenmehl, Erdnussmehl und Baumwollsamenmehl ; eine Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Dextrin, Dextrose und Maisstärke ; Triglyceride und Spurenelemente aus der Gruppe der anorganischen Salze von Fe, Mg, Zn und Cu enthält.

Während der Fermentation wird der pH-Wert durch Zusatz von Alkali kontrolliert und die Kohlenstoffquelle wird zur Verbesserung der Produktion kontinuierlich zugeführt.

Der Fermentationsstufe gehen Im allgemeinen einige Wachstumsstufen voran. Insbesondere wird die Züchtung von Streptomyces Clavuligerus var. FAC in den folgenden Schritten durchgeführt : a) Errichtung einer Sporensuspension von Streptomyces Clavuligerus var. FAC ; b) Inokulierung der Kultur in einem geeigneten Samentank ; c) Übertragung der reifen Samentankkultur in einen belüfteten und gerührten Fermenter, in welchem die
Kultur der oben beschriebenen Fermentationsstufe ausgesetzt wird.

Die Sporensuspension wird vorzugsweise durch Züchtung von Streptomyces Clavuligerus var. FAC auf einem festen Agarmedium mit einem Gehalt an einer Kohlenstoffquelle (Dextrin oder Dextrose), einem
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Produktion werden dann selektiert, nachdem zuerst In einem vegetativen Medium, das eine Proteinquelle aus der Gruppe Malsmehl und Erdnussmehl, Maisstärke als Kohlenstoffquelle und Kaliumsalz als Mineralsalz enthält, gezüchtet und dann in einem Fermentationsmedium, das Sojabohnenmehl oder Erdnussmehl als Proteinquelle, Dextrose als Kohlenstoffquelle, ein Kaliumsalz als Mineratsalz und Ni- und Co-Salze als Spurenelemente enthält, weitergezüchtet worden war. Die am besten produzierenden Kolonien werden dann auf einem festen Medium vermehrt.

Die Züchtung in dem Samentank wird in einem Medium durchgeführt, das Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl und Maismehl als Proteinquelle, Dextrose oder Dextrin als Kohlenstoffquelle und ein Natriums- alz als Mineralsalz enthält.

Alle oben genannten Züchtungsschritte werden bel Temperaturen von +20'C b ! S +37'C. vorzugswei- se von + 25'C bis + 30. C, unter aeroben Bedingungen und, wenn im flüssigen Medium gearbeitet wird, unter Rühren durchgeführt.

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0g/l bis 4, 5 g/l, ausgedrückt als Gramm Clavulansäure in jedem Liter Brühe.

Die Stärke wurde durch Bestimmung des Clavulansäuregehalts durch HPLC gemäss US XXII (S. 316) festgestellt.

Nach einem bevorzugten Verfahren werden die Stufen A bis E bei einer Temperatur von +2'C bis + 5'C durchgeführt.

Vor dem Ultrafiltrationsschritt wird die Fermentationsbrühe durch Denaturieren und Koagulation der darin enthaltenen Proteine geklärt. Der Koagulationsschritt ermöglicht ein Zusammenballen der fein verteilten, in der Fermentationsbrühe suspendierten Feststoffteilchen zu Klumpen und verursacht auch eine Abtrennung der löslichen Polypeptide.

Mit Hilfe des erfindungsgemässen Koagulationsschrittes wird eine hoch gereinigte Fermentationsbrühe erhalten. Das Koagulationsmittel wird im allgemeinen in Mengen von 0, 5 % bis 2 % (Gew.Nol.) in bezug auf das Volumen der Fermentationsbrühe eingesetzt. Ein bevorzugtes Koagulationsmittel ist ein koagulierend wirkendes, wasserlösliches kationisches Polymer, insbesonders ein flüssiges kationisches Flockungsmittel mit einem spezifischen Gewicht bei 20. C von 1, 14 bis 1, 18 kg/dm3, einem Titer von 29 bis 31%, einer Brookfield-Viskosität bei 25 C von 200 bis 500 cps, einem pH-Wert von 5 bis 8, einer völligen Löslichkeit In Wasser und einem Gefrierpunkt von -18 (+ 1-3).

C, das in der Regel in einer Menge von 1% eingesetzt wird.

Das Polyelektrolyt ist beispielsweise ein wasserlösliches kationisches Polymer mit einem spezifischem Gewicht bei 20. C von 1, 14 bis 1, 18 kg/dm3, einem Titer von 29 bis 31%, einer Brookfield-Viskosität bei 25. C von 200 bis 500 cps, einem pH-Wert von 5 bis 8, einer völligen Löslichkeit in Wasser und einem Gefrierpunkt von-18 (+/-3)'C.

Der pH-Wert während des Koagulationsschrittes wird durch Zusatz einer organischen Säure, wie Propionsäure, Essigsäure oder Zitronensäure, eingestellt. Der bevorzugte pH-Wert liegt bei 4, 2.

Nach dem Koagulationsschritt wird das ausgeflockte Material dann durch übliche Verfahren, wie beispielsweise durch Filtration, abgetrennt.

Der Ultrafiltrationsschritt gemäss dem vorliegenden Verfahren ist zur Reinigung der Fermentationsbrühe besonders wirkungsvoll. Bei der Ultrafiltration werden nicht nur die suspendierten Feststoffe abgetrennt, sondern, was viel wichtiger ist, auch einige wasserlösliche Moleküle mit hohen Molekulargewichten (Zucker und lösliche Peptide, die als Nährstoffe in den Kulturdemien von Streptomyces Clavuligerus anwesend waren ; Mycelproteine), die bel dem anschliessenden Reinigungsschritt störend wirken könnten.

Während der Ultrafiltration wird der pH-Wert durch Zusatz einer Base, in der Regel einer wässerigen Lösung von Natriumhydroxid. welche vorher auf die ausgewählte Temperatur abgekühlt worden war, auf den vorbestimmten Werten gehalten.

Für das erfindungsgemässe Verfahren besonders gut verwendbare Ultrafiltrationsmembranen haben einen Cut-off von 30. 000-40. 000 und werden aus Celluloseacetat oder Polysulfon hergestellt, wobei das letztgenannte bevorzugt ist. Polysulfonmembranen, die einen Cut-off von 35. 000 Dalton aufweisen, sind besonders bevorzugt.

Gemäss dem vorliegenden Verfahren wird die Ultrafiltration nach der Diafiltrationstechnik vorgenommen, einem speziellen Ultrafiltrationsverfahren, bei welchem die permeablen Feststoffe durch Zusatz von Wasser zu dem Retentat noch weiter extrahiert werden. Insbesondere wird zuerst ein Teil der Flüssigkeit (etwa 1/3 bis 2/3) durch die ausgewählte Membran ultrafiltriert, worauf der verbleibende Teil durch die selbe Membran diafiltnert wird, Indem dem Retentat entionisiertes Wasser bei gleicher Filtrationsrate zugesetzt wird.

Die Diafiltration wird in der Regel abgebrochen, wenn der Verdünnungsfaktor bei 1 : 1, 2 bis 1 : 2, 4 liegt, was, ausgehend von einer Fermentationsbrühe mit einer Stärke von 4, 0 bis 4, 5, einer Starke der diafiltrierten Flüssigkeit von etwa 1, 2 g/l bis 1, 5 g/l entspricht.

Die reverse Osmose Ist ein gut bekanntes Verfahren (das beispielsweise zur Entsalzung von Wasser verwendet wird). Sie wird hier als eine milde und selektive Einengungsmethode verwendet, um die Konzentration der Clavulansäure in der wässerigen Phase zu erhöhen und den günstigsten Wert für den anschliessenden Fällungsschritt zu erreichen. Während der reversen Osmose wird das Wasser gezwungen, aus der Lösung heraus, durch eine semipermeable Membran hindurchzutreten, durch welche gelöste Stoffe nicht hindurchgelangen, wobei auf die Oberfläche der wässerigen Lösung ein entsprechender Druck aufgebracht wird.

Bei dem vorliegenden Verfahren werden semipermeable Membranen verwendet, durch die die Clavulansäure nicht hindurch gelassen wird. Es kann eine Reihe von verschiedenen Materialien verwendet werden, sofern nur ihr Cut-off innerhalb des ausgewählten Bereichs liegt.

Vorzugsweise werden Membranen aus Celluloseacetat mit einem Cut-off von 500 Dalton verwendet.

Die reverse Osmose wird im allgemeinen dann abgebrochen, wenn die konzentrierte Lösung die gewünschte Clavulansäurekonzentration für den nachfolgenden Ausfällungsschritt erreicht hat. das heisst eine Stärke von 10 g/t bis 30 g/l, vorzugsweise von 15 g/ ! bis 20 g/l, aufweist.

Drücke von 30 bar bis 40 bar (entsprechend 3. 106 Pa bis 4. 106 Pa) sind Im allgemeinen erforderlich.

Das in Stufe C verwendete Acrylesterharz ist vorzugsweise ein Harz mit einem Porenvolumen von 55 %, einem mittleren Porendurchmesser von 80. 10-4 um und einer Maschengrösse entsprechend Öffnungen von 1, 27 bis 0, 508 mm (20- 50 Öffnungen alle 25, 4mm), z. B. einen Acrylester-Polymeradsorptionsmittel, das ein Porenvolumen von 55%, eine echte Nassdichte von 1, 05 g/ml, eine Oberflächenfläche von 450 m2/g, einen mittleren Porendurchmesser von 80. 10-4 u, eine Skelettdichte von 1, 24 g/ml, eine Maschengrösse entsprechend Öffnungen von 1, 27 bis 0, 508 mm und einen schwach polaren Charakter aufweist.

Die in Stufe E verwendete aktivierte Kohle ist vorzugsweise eine Aktivkohle, von der 10 % bis 15 % eine Teilchengrösse von mehr als 74 um und 70 % - 75 % eine Teilchengrösse von mehr als 10 um aufweisen, die Molasse-Entfärbungszahl unter 200 liegt und die Oberfläche mehr als 1000 m2/g beträgt, die insbesondere eine Molasse-Entfärbungszahl von 175 und eine Oberfläche von 1150 m2/g aufweist, wie etwa ein säuregewaschener, dampfaktivierter Kohlenstoff, der eine Methylenblau-Adsorption von mindestens 20 g/100g, einen maximalen Feuchtigkeitsgehalt bei Verpacken von 10%, einen maximalen Aschengehalt von 8%, ein säurelöslichen Inhalt von maximal 1 %, einen Calciumgehalt von maximal 200 ppm, einen Eisengehalt von maximal 200 ppm, einen Aschegehalt von 5%,

einen wasserlöslichen Inhalt von 0, 3%, einen pH-Wert des Wasserextrakts von 6 bis 8, eine Packungsschüttdichte von 0, 290 g/ml, eine Partikelgrö- sse grösser als 74 um bei 10-15% und eine Partikelgrösse grösser als 10um bei 70-75% aufweist.

Die Alkalimetallsalze können entweder anorganische oder organische Salze von Alkalimetallen, wie Natrium, Kalium und Lithium, sein. Unter den anorganischen Salzen sind es die Carbonate und Bicarbonate, die verwendet werden können. Von den organischen Salzen können die Propionate, Acetate und die 2Ethylhexanoate verwendet werden.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können insbesondere Kaliums- alze, vorzugsweise Kaliumacetat, verwendet werden, worauf das Kaliumclavulanat in besonders reiner Form ausgefällt wird. Das Alkalimetallsalz wird in einer Menge zugesetzt, die zumindest zur Salzbildung der Clavulansäure ausreicht, vorzugsweise in Mengen von 1, 3 bis 2, 0 Äquivalente in bezug auf die entsprechende Säure.

Im allgemeinen ist es zur Erzielung einer grösseren prozentmässigen Ausbeute an Clavulansäure bevorzugt, die Konzentration des Alkalimetallsalzes der Clavulansäure in der wässerigen Lösung vor dem Zusatz des niedrigeren Alkohols auf Werte zwischen 10 g/) und 30 gil, vorzugsweise von 15 g/i bis 20 g/t, insbesondere 17 g/l, ausgedrückt als Stärke der Clavulansäure, einzustellen.

Um eine übermässige Verdünnung der wässerigen entfärbten Lösungen aus Stufe E) zu vermeiden, werden die organischen und anorganischen Alkalimetallsalze in der Regel in Form von sehr konzentrierten, sogar gesättigten Lösungen zugesetzt. Beispielsweise wird das Alkalimetallsalz, wenn Kaliumacetat als solches verwendet wird und die angereicherte wässerige Lösung Clavulansäure in einer Menge von 15 g/i bis 20 g/i enthält, in Form einer gesättigten Lösung zugesetzt, und die Menge des Alkalimetallsalzes wird durch Einstellung des pH-Wertes zwischen 8, 0 und 8, 5 reguliert.

Die Menge des Methanols ebenso wie die des Isopropanols oder Acetons, die während des Ausfällungsschrittes verwendet wird, wird so eingestellt, dass Menge und Qualität des zu gewinnenden Alkalimetallsalzes der Clavulansäure optimiert werden. Vorzugsweise ist Methanol der verwendete niedrige Alkohol.

In der Regel werden 0, 5 bis 1, 5 Volumsteile Methanol für jeden Volumsteil der angereicherten wässerigen Lösung zugesetzt, während Isopropanol in Mengen eingesetzt wird, die im Bereich von 0, 5 bis 3 Volumsteilen liegen, und Aceton in Mengen von 15 bis 50 Volumsteilen, bezogen auf die hydroalkoholische Phase, verwendet wird.

Wenn die angereicherte Lösung das Kaliumsalz der Clavulansäure in einer Menge von 15 gli bis 20 g/i enthält, wird vorzugsweise 1 Volumsteil Methanol verwendet, ist das organische Lösungsmittel Aceton und wird in einer Menge von 40 Volumsteilen, bezogen auf die hydroalkoholische Phase, eingesetzt.

Die bevorzugte Temperatur des Ausfällungsschrittes beträgt + 5'C.

Die ausgefällten Alkalimetallclavulanate können auf übliche Weise abgetrennt werden, wie durch Filtration, und können dann im Vakuum (z. B. dem Vakuum, das durch eine Wasserstrahlpumpe erzeugt wird) bel Raumtemperatur getrocknet werden.

Das vorliegende Verfahren liefert die Alkalimetallsalze der Clavulansäure In kristalliner und hochreiner Form und in sehr guten Ausbeuten.

Im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren ist das vorliegende Verfahren insofern sehr vorteilhaft, als es mit einer niedrigen Anzahl von Verfahrensschntten, ohne Zwischenisolierung der Clavuiansäure oder

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Verfahren zur Gewinnung von Streptomyces Clavuligerus var. FAC
Streptomyces Clavuligerus var. FAC wurde durch Genmanipulation von Streptomyces Clavuligerus Type Stamm ATCC (American Type Culture Collection) 27064 (Int. J. Syst. Bact. 21, 331,1971) gewonnen.

Der Mikroorganismus wurde nach folgendem Verfahren erhalten : Protoplasten von Streptomyces Clavuligerus wurden folgendermassen erhalten : die Sporen von S. Clavuligerus wurden in Medium YEME (3 g/) Hefeextrakt, 3 g/) Malzextrakt, 5 g/t Pepton, 10 g/) Glucose, 340 g/) Saccharose, 1 g/) MgCz ; Zusatz von 20 % Glycin-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 2 %) während 36 bis 40 Stunden bei 30. C in einer alternierenden Schüttelvorrichtung gezüchtet.

Die Biomasse wird bei 3000 Upm 10 min zentrifugiert und das Pellet zweimal In 50 ml einer 10, 2 %- igen Saccharose-Lösung gewaschen. Das endgültige Pellet wird in 4 ml Phosphatpuffer und 1 mg/mi Lysozym resuspendiert.

Die Suspension wird bei 30'C 1 bis 1, 5 Stunden inkubiert, bis das Mycel vollständig verdaut ist und nur Protoplasten vorliegen. Die Protoplasten werden filtriert und mit Phosphatpuffer gewaschen, um restliches Lysozym zu entfernen ; schliesslich werden sie in Puffer resuspendiert und bei-80 * C gelagert.

Die Protoplasten wurden mit einem speziellen Vektor transformiert, der für diesen Zweck entwickelt wurde.

Es wurde die "Gewehrschuss (shotgun) -Klonierungsmethode" verwendet, um ein Fragment des ganzen Streptomyces Clavuligerus Genoms, das von dem Restriktionsenzym, wie etwa von Bgll und Sac I, erzeugt wurde, zu gewinnen. Das verwendete Plasmid war PIJ 702, das aus Streptomyces Lividans erhalten wurde.

Die Auswahl dieses Plasmids beruhte auf dessen einfacher Isolierung und der Anwesenheit von Markern (Thiostrepton-Resistenz und insertionelle Inaktivierung).

Auf diese Weise wurden Vektoren durch Ligation des Plasmids PIJ 702 und des DNA-Fragments des Gesamtgenoms in der Grösse von 5 kD bis 10 kD hergestellt.

Die Transformanten wurden in R5 Medium (100 g/) Saccharose, 5, 1 gfl MgC12. 6H20, 1 g/i Casaminosäuren, 0,05 MgSO4.7H2O, 2,5 g/l L-Arginin-HCl, 1 ml Spurenelemente - Zn, Fe, Cu, Mg, Na2 BOe und Ammoniummolybdat - 20 9/l Agar) regeneriert und in einem Medium getestet, das 50 mg/ml Thiostrepton enthielt.

Die gut gewachsenen Kolonien werden selektiert und gemäss dem hierin beschriebenen Verfahren auf Clavulansäure-Produktion getestet.

Beispiel 1
Ausgehend von einer Iyophilisierten Ampulle von Streptomyces Clavuligerus var. FAC wird Kolniese- lektion durchgeführt, indem auf einem festen Medium mit der folgenden Zusammensetzung ausgestrichen wird :
EMI6.1

<tb>
<tb> Kohlenhydratquelle <SEP> (Dextrin <SEP> oder <SEP> Dextrose) <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g/ <SEP> ! <SEP>
<tb> Spurenelemente <SEP> (COCI2, <SEP> FeS04) <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Agar <SEP> Agar <SEP> 20 <SEP> g/)
<tb>

Nach der Inkubation der Platten bei einer konstanten Temperatur werden die typischen Kolonien ausgewählt. Typische Kolonien sind rund, erhaben und mit einem obenauf liegenden grünen Sporenrasen.

Sie werden auf Schrägmedium aus dem gleichen festen Medium übertragen und 7 bis 10 Tage bei einer Temperatur von 26 C inkubiert, bis der Sporenrasen gut gewachsen ist.

Die reifen Schrägkulturen werden in Flaschen unter Verwendung eines vegetativen Mediums mit der folgenden Zusammensetzung getestet :
EMI6.2

<tb>
<tb> Proteinquelle <SEP> (Maismehl <SEP> oder <SEP> Erdnussmehl) <SEP> 25 <SEP> go) <SEP>
<tb> Kohlenhydratquelle <SEP> (Malsstärke) <SEP> 10 <SEP> g/)
<tb> Kaliumphosphat <SEP> 0,5 <SEP> g/l
<tb> Sojabohnenöl <SEP> 2 <SEP> g/ <SEP> ! <SEP>
<tb>

Das inokulierte Medium wird unter Rühren 45 bis 60 h inkubiert und dann aseptisch In ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung übertragen :

EMI7.1

<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> (oder <SEP> Erdnussmehl) <SEP> 35 <SEP> g/)
<tb> Dextrose <SEP> 8 <SEP> g/l
<tb> Kaliumphosphat <SEP> 1 <SEP> g/l
<tb> Spurenelemente <SEP> (NiSO4;

<SEP> CoSO4, <SEP> Lösung <SEP> 1 <SEP> %) <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>

Die Flaschen werden unter Rühren 3 bis 5 Tage bei konstanter Temperatur (25. C) inkubiert und auf die Clavulansäure-Aktivität titriert. Die am besten produzierenden Kolonien werden dann auf einem festen Medium propagiert, um eine ausreichende Biomasse für die industrielle Produktion zu erhalten.

Die Sporensuspension der propagierten Kolonien wird in einen Samentank inokuliert, der ein steriles Medium der folgenden Zusammensetzung enthält :
EMI7.2

<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> (oder <SEP> andere <SEP> Proteinquellen) <SEP> 50 <SEP> g/ <SEP> ! <SEP>
<tb> Natriumphosphat <SEP> 1 <SEP> g/l
<tb> Dextrose <SEP> (oder <SEP> Dextrin) <SEP> 40 <SEP> g/ <SEP> ! <SEP>
<tb> Silikon-Antischaummittel <SEP> 0,5 <SEP> g/l
<tb>

Andere Proteinquellen, die zufnedenstellende Ergebnisse liefern, sind Baumwollsamenmehl oder Malsmehl.

Ein industneller Samentank entwickelt sich normalerweise in 45 h bei einer Temperatur von 25 C bis 30 C (vorzugsweise 26 C) unter kontinuierlichem Rühren und unter Belüftung.

Sobald sich die Biomasse entwickelt hat, wird sie aseptisch in einen gerührten sterilen Fermenter übertragen, in dem die folgende typische Medienzusammensetzung vorliegt :
EMI7.3

<tb>
<tb> SOjabohnen <SEP> mehl <SEP> 35 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Dextrin <SEP> 35 <SEP> g/l
<tb> Triglyceride <SEP> 25 <SEP> gil
<tb> Spurenelemente <SEP> (Lösung <SEP> 1 <SEP> % <SEP> von <SEP> MgS04, <SEP> FeS04, <SEP> ZnS04, <SEP> CUS04) <SEP> 1 <SEP> ml <SEP>
<tb>

Die Fermentation wird 5 bis 7 Tage bei einer konstanten Temperatur von 24. C bis 27'C fortgesetzt und der pH-wert wird durch Alkalizusatz auf einen Wert zwischen 6, 8 und 7, 0 eingestellt.

Während der Fermentation werden die Kohlenstoffquellen kontinuierlich zugesetzt, um die Produktion zu verbessern.

Das geeignetste Fermentationsgefäss ist ein üblicher aerober Fermenter, der mit Rührung und Belüftung ausgestattet ist.

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Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Alkalimetallsalzen der Clavulansäure aus einer Fermenta- tionsbrühe von Streptomyces Clavuligerus, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte : A) einen Koagulationsschritt, der durch Zusatz eines Flockungsmittels aus der Gruppe Calciumchlo- rtd, Kaliumferrocyanid, wasserlösliche kationische Polymere und organische Polyelektrolyte zu einer Fermentationsbrühe von Streptomyces Clavuligerus bei einer Temperatur von O'C bis + 10'C und bei einem pH-Wert von 4, 0 bis 4. 5 vorgenommen wird ;

B) Ultrafiltration der oben erhaltenen, geklärten Fermentationsbrühe von Streptomyces Clavuligerus, die auf einer Temperatur zwischen O'C und +10'C und bei einem pH-Wert zwischen 6, 0 und 6, 5 gehalten wird, durch eine Ultrafiltrationsmembran, die einen Cut-off zwischen 30.000 und 100. 000 Dalton hat ; C) Entfärbung des oben erhaltenen Ultrafiltrats durch Laufenlassen desselben durch eine Säule mit einem polymeren Acrylesterharz bel einer Temperatur von O'C bis + 10'C ; D) Einengung der flüssigen Phase aus Stufe C) mit Hilfe der reversen Osmose durch eine Membran, die einen Cut-off von 750 bis 500 Dalton hat, bei einer Temperatur von O'C bis + 10'C und einem pH-Wert von 6. 0 bis 6, 5 ;

E) Entfärbung der eingeengten Flüssigkeit mit säuregewaschener, dampfaktivierter Kohle bel einem pH-Wert von 6, 0 bis 6, 5 und einer Temperatur von 0 C bis + 10. C ; <Desc/Clms Page number 8> F) Salzbildung der Clavulansäure durch Zusatz einer wässerigen Lösung eines Alkalimetallsalzes zu der oben erhaltenen angereicherten wässerigen Lösung ; G) Ausfällung des Alkalimetallsalzes der Clavulansäure aus der oben erhaltenen wässerigen Lösung durch Zusatz eines niedrigen Alkohols aus der Gruppe Methanol und Ethanol und anschliessenden Zusatz eines aus der Gruppe Isopropanol und Aceton ausgewählten Lösungsmittels zu der dort erhaltenen hydroalkoholischen Phase bei einer Temperatur von +5 C bis + 15 C. EMI8.1 Stamm Streptomyces Clavuligerus var.

FAC erhalten wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Koagulationsmittel ein wasserlösliches kationisches Polymer ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltrationsmem- branen einen Cut-off von 30. 000 bis 40. 000 haben und aus Celluloseacetat oder aus Poylsulfon bestehen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltrationsmem- bran eine Polysulfon-Membran mit einem Cut-off von 35. 000 Dalton und die Membran der reversen Osmose eine Celluloseacetat-Membran mit einem Cut-off von 500 Dalton ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltration nach der Diafiltrationstechnik ausgeführt wird, wobei dieselbe Membran verwendet und dem Retentat entionisiertes Wasser bel gleicher Filtrationsrate zugesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zuerst 1/3 bis 2/3 einer EMI8.2 dann der verbleibende Teil durch dieselbe Membran diafiltriert wird, wobei die Diafiltration abgebrochen wird, wenn der Verdünnungsfaktor von 1 : 2, 1 bis 1 : 2, 4 erreicht ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Acrylesterharz ein Porenvolumen von 55 %, einen mittleren Porendurchmesser von 80. 10-4 um und eine Maschengrösse von 1, 27 bis 0, 508 mm aufweist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die reverse Osmose abgebrochen wird, wenn die Stärke der wässerigen Lösung bei 10 g/ ! bis 30 gil hegt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass von der aktivierten Kohle 10 % bis 15 % eine Teilchengrösse von mehr als 74 u. m und 70 % bis 75 % eine Teilchengrösse von mehr als 10 um aufweisen und dass die Kohle eine Molasse-Entfärbungszahl von 175 und eine Oberfläche von 1150 m2/g hat.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die wässerige Lösung, EMI8.3 Clavulansäure-Konzentrationbis 20 g/i hat.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Calvulansäure-Konzentration 17 g/ ! beträgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkalimetallsalze anorganische oder organische Salze von Natrium, Kalium oder Lithium sind und ausgewählt werden aus der Gruppe der Carbonate, Bicarbonate, Proplonate und 2-Ethylhexanoate.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz Kahumacetat ist <Desc/Clms Page number 9> 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz in einer Menge von 1, 3 bis 2, 0 Äquivalenten in bezug auf die entsprechende Säure eingesetzt wird ; dass der niedrige Alkohol in einer Menge von 0, 5 bis 1, 5 Volumsteilen pro Volumsteil der angereicherten wässerigen Lösung verwendet wird ; dass Isopropanol in Mengen von 0, 5 bis 3 Volumsteilen und Aceton in Mengen von 15 bis 50 Volumsteilen, bezogen auf die hydroalkoholische Phase, eingesetzt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die angereicherte wässerige Lösung das Kaliumsalz der Clavulansäure in einer Menge von 15 g/ ! bis 20 g/i. ausgedrückt als Clavulansäure-Starke, enthält, dass 1 Volumsteil Methanol verwendet wird, dass das organische Lösungsmittel Aceton ist und in einer Menge von 40 Volumsteilen, bezogen auf die hydroalkoholische Phase, eingesetzt wird und dass die Ausfallung bei + 5. C durchgeführt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die zu reinigende Fermentationsbrühe eine Starke von 3, 5 g/I bis 4, 5 g/1 aufweist, dass das Koagulationsmittel ein wasserlösliches kationisches Polymer ist und in einer Menge von 1 % eingesetzt wird und dass der pH- Wert während der Koagulation der Brühe auf 4, 2 gehalten und durch Zusatz einer organischen Säure aus der Gruppe Propionsäure, Essigsäure und Zitronensäure kontrolliert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche kationische Polymer ein kationisches Flockungsmittel mit einem spezifischen Gewicht bei 20'C von 1, 14 bis 1, 18 kg/dm3, einem Titer von 29 bis 31 %, einer Brookfield-Viskosität bei 25 C von 200 bis 500 cps, einem pH von 5 bis 8, einer völligen Löslichkeit in Wasser und einem Gefrierpunkt von - 18 (+/-3). C ist.

20. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Acrylester ein Porenvolumen von 55%, eine echte Nassdichte von 1, 05 g/mi, eine Oberflächenfläche von 450 m2/g, einen mittleren Porendurchmesser von 80. 10-4 um, eine Skelettdichte von 1, 24 g/ml, eine Maschengrösse entspre- chend Öffnungen von 1, 27 bis 0, 508 mm und einen schwach polaren Charakter aufweist.

21. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der aktivierte Kohlenstoff ein säuregewa- schener, dampfaktivierter Kohlenstoff ist, der eine Methylenblau-Adsorption von mindestens 20 g/100g, einen maximalen Feuchtigkeitsgehalt bei Verpacken von 10%, einen maximalen Aschegehalt von 8%, einen säurelöslichen Inhalt von maximal 1%, einen Calciumgehalt von maximal 200 ppm, einen Eisengehalt von maximal 200 ppm, einen bevorzugten Aschegehalt von 5%, einen wasserlöslichen Inhalt von 0, 3%, einen pH-Wert des Wasserextrakts von 6 bis 8, eine Packungsschüttdichte von 0, 290 EMI9.1