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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion und Herstellung von Vakzin- und Diagnostika- Präparationen gegen Pathogene verschiedenster Art.
Mit der systematischen Einführung von Schutzimpfungen konnten in unserem Jahrhundert viele schwere Infektionskrankheiten zurückgedrängt werden. Krankheiten, wie Kinderlähmung, Tetanus, Diphtherie, Pocken und Meningitis, die früher fatale Folgen hatten, haben durch gezielte flächendeckende Impfprogramme ihren Schrecken verloren. Pocken konnten sogar im Jahre 1980 von der WHO als ausgerottet erklärt werden. Mit der Einführung der rekombinanten DNA-Techno- logie gelang es auch, Impfstoffe zu entwickeln, die zuvor zwar prinzipiell möglich waren, deren breite Anwendung aber durch die geringe Menge an Impfstoff-Material nicht realisiert werden konnte. Beispiele hierfür sind die Vakzine gegen das Hepatitis B-Virus und gegen Keuchhusten (verursacht von Bordetella pertussis).
Leider zeigen Infektionskrankheiten gegenwärtig wieder einen starken Anstieg. Dies liegt zum einen daran, dass immer neue, komplexere Infektionskrankheiten auftreten, wie z. B. Hepatitis C, AIDS, hämorrhagische Darmerkrankungen, etc., zum anderen auch daran, dass manche Erreger gegen die etablierten Impfstoffe resistent geworden sind. Gleichzeitig sind auch viele Erreger, die bislang erfolgreich medikamentös behandelt werden konnten, resistent gegen diese Medikamente geworden. Besonders ist hier auf die Behandlung von Lungen- oder Hirnhautentzündungen, Darm- infektionen oder Krankheiten, wie Tuberkulose oder Malaria, hinzuweisen. Vor allem die zuneh- mende Antibiotika-Resistenz bakterieller Krankheitserreger stellt die weltweite Gesundheitspolitik vor grosse Probleme.
Es erscheint daher wünschenswert, gegen diese Infektionskrankheiten wirksame Vakzine zur Verfügung zu stellen. Leider ist das Auffinden von effizienten und sicheren Impfstoffen eine auf- wendige Tätigkeit. Effiziente Vakzine sind meist direkt vom Erreger abgeleitet, beispielsweise durch chemische oder physikalische Inaktivierung oder durch Attenuierung (Abschwächung) des Erregers. Derartige Vakzine steilen aber prinzipiell ein Sicherheitsrisiko dar, da es bei einer unge- nügenden Inaktivierung zu tatsächlichen Infektionen kommen kann. Auf der anderen Seite kann eine zu drastische Inaktivierung zu Denaturierungen führen, die sowohl die Effizienz des Impf- stoffes reduzieren als auch zu Nebenwirkungen führen können.
Die Herstellung von rekombinanten Vakzinen ist zwar prinzipiell einfach, vor allem hinsichtlich der Herstellung grosser Mengen, die für eine weltweite Impfkampagne erforderlich sind, jedoch ist die Effizienz des rekombinant hergestellten Impfstoffes oft nicht mit der Effizienz des biogenen Vakzins vergleichbar. Die Gründe hierfür liegen oft in der nicht-Nativität der rekombinanten Vak- zine, so dass in der vakzinierten Person nicht ganz exakt die Antikörper gebildet werden, die zu einer effizienten Bekämpfung einer Attacke mit dem Pathogen erforderlich wären.
Hierzu werden im Stand der Technik nunmehr aufwendige computerunterstützte Modellie- rungsverfahren vorgeschlagen, mit deren Hilfe rekombinante Vakzine optimiert werden sollen (Rappuoli et al., Spektrum der Wissenschaft, Spezial 6 : Pharmaforschung (1997), Seiten 60-69).
Bedingt durch die Tatsache, dass immer mehr von der genetischen Basis der wichtigsten Krank- heitserreger bekannt wird (von zahlreichen Pathogenen liegt das gesamte Genom bereits vollstän- dig sequenziert vor), erhofft man sich von diesem Ansatz besonders viel. Jedoch ist der Zeit- und Arbeitsaufwand bei derartigen Vakzinen enorm, da nicht nur das prinzipielle gezielte Design durch molekulares Modellieren erforderlich ist, sondern die aufgrund dieser Berechnungen geschaffenen Vakzine oft beim praktischen Einsatz von den vorausgesagten Bindungseigenschaften abweichen und daher zunächst umfangreichen grundlegenden Tests unterzogen werden müssen.
Bei einem anderen Ansatz wird versucht, zunächst über DNS-Vakzine, die aufgrund vorher- gesagter ORFs geschaffen worden sind, in Mäusen eine Immunantwort zu erzeugen und über die Voraussage von HLA-Superfamilien bindenden T-Zell-Epitopen geeignete Vakzin-Kandidaten zu ermitteln (Hoffman et al., Nature Med. 4 (1998), Seiten 1351-1353).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur Herstellung von Vakzinen gegen Pathogene zur Verfügung zu stellen, mit weichem effiziente Vakzine rasch und kostengün- stig entwickelt werden können. Dabei soll möglichst das Wissen um die genetische Information der
Pathogene optimal genutzt werden. Weiters sollen Vakzine geschaffen werden, die vom Immun- system des Geimpften leicht in einen sicheren Schutz gegen das jeweilige Pathogen transformiert werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren zur Selektion und Herstellung
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von Vakzin- und Diagnostika-Präparationen gegen einen bestimmten pathogenen Organismus, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Immunisieren eines nicht-humanen Vertebraten mit einer Präparation des pathogenen
Organismus, - Entnehmen von Proben, die Antikörper gegen die Pathogen-Präparation enthalten, vom immunisierten Vertebraten und gegebenenfalls Aufarbeiten dieser Proben, - Herstellen einer in Wirtszellen exprimierbaren Genbank des Genoms des pathogenen
Organismus, wobei die Pathogen-Polypeptidsequenzen exprimierenden Genbank-Wirts- zellen, hinsichtlich ihrer Bindung zu einem Antikörper selektierbar sind, - Identifizieren von antigenen Polypeptiden durch Kontaktieren der Genbank mit der ent- nommenen,
Antikörper-hältigen Probe und Selektieren der Genbank auf diejenigen Klone, deren exprimierte Polypeptide eine Antikörper-Bindung eingehen, - Isolieren und Fertigstellen der identifizierten antigenen Polypeptide zu einer Vakzin- oder
Diagnostika-Präparation.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es in schneller und effizienter Weise möglich, ein Vakzin oder ein Diagnostikum gegen ein beliebiges Pathogen zu entwickeln, das von einem zu impfenden Organismus optimal zu einer verlässlichen Immunisierung führt. Mit der Selektion der Genbank des Pathogens auf Bindung (= Erkennung) zu einem Antikörper, dessen Bildung durch das (native) Pathogen bereits im infizierten nicht-humanen Vertebraten sichergestellt worden ist, erhält man erfindungsgemäss jedenfalls ein Polypeptid, das natürlicherweise antigen ist, wobei dessen Antigenizität eben durch die Selektion selbst sichergestellt wird.
Die erfindunggemässen Vakzine oder Diagnostika können zur Immunisierung oder Diagnose von beliebigen Tierarten herangezogen werden, jedoch ist die bevorzugte Anwendung im humanen Bereich. Bevorzugte Tierpathogene sind Pathogene für landwirtschaftliche Nutztiere oder für Haus- tiere.
Mit den erfindungsgemässen Diagnostika kann ein verlässliches Nachweissystem für die Infek- tion mit einem bestimmten Pathogen zur Verfügung gestellt werden, das - versehen mit einem geeigneten Marker - zur routinemässigen Testung von potentiell mit diesem Pathogen infizierten Organismen verwendet werden kann.
Auf diese Weise erhält man mit dem erfindungsgemässen Verfahren Polypeptide, die in der Lage sind, Antikörper in einem Vertebraten zu erzeugen. Für die Herstellung der erfindungsge- mässen Vakzine können dabei die unmittelbar aus der Genbank selektierten Polypeptide heran- gezogen werden, indem beispielsweise diese direkt durch Amplifizieren der Wirtszellen und anschliessender Gewinnung des Polypeptides aus diesen Zellen aufgereinigt werden. Es ist aber auch möglich, aufgrund der selektierten Polypeptide bzw. deren genetischer Information (die Teil der Wirtszellen ist und daher direkt erhalten werden kann) geeignete Vakzine zu designen Beispielsweise können die selektierten Polypeptide im Gesamtgenom des Pathogens lokalisiert und bestimmten Pathogen-Proteinen zugeordnet werden, insbesondere wenn das gesamte Genom bereits sequenziert ist.
Prinzipiell ist diese Vorgangsweise aber auch für Pathogene möglich, von denen nur eine grobe Kartierung vorliegt. Dann können diese Pathogen-Proteine entweder als Ganzes oder in trunkierter Form zur Vakzin-Herstellung herangezogen werden. Welche Teile des Proteins gegebenenfalls trunkiert werden können, richtet sich nach den erfindungsgemäss selek- tierten Polypeptiden, die bevorzugterweise möglichst vollständig in ihrer antigenen Form im herge- stellten Vakzin verbleiben sollten. Falls zwei oder mehrere antigene Polypeptide einem Pathogen- Protein zugeordnet werden können, kann die Kombination zumindest dieser Polypeptide oftmals zu einem besonders vorteilhaften Vakzin führen.
Falls die antigenen Polypeptide im Pathogen-Protein nicht aneinandergrenzend sind, kann es sich auch empfehlen, einen Spacer zwischen den Poly- peptiden vorzusehen, bevor das Vakzin fertiggestellt wird.
Die erfindungsgemässe Isolierung und Fertigstellung der Vakzine oder Diagnostika kann daher die obigen Schritte der Designanpassung mitumfassen. Die Isolierung kann auch ausschliesslich auf DNA-Niveau vorgenommen werden, d. h. dass die genetische Information bezüglich der anti- genen Polypeptide aus den selektierten Wirtszellen beispielsweise in einen weiteren Expressions- vektor übernommen, in pharmazeutisch geeigneten Expressionszellen expnmiert und zu einer pharmazeutischen Präparation aufgearbeitet wird. Auch das Vakzin oder das Diagnostikum selbst kann auf DNA-Niveau zur Verfügung gestellt werden ; die Technologie für DNA-Vakzine ist
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prinzipiell bekannt und entsprechende Träger- oder Verabreichungssysteme, wie z. B. durch Pow- der-Ject-Injektionen, sind beschrieben.
Mit dem erfindungsgemässen System können Vakzine oder Diagnostika gegen alle infektiösen Pathogene entwickelt werden, also beispielsweise gegen Bakterien, Viren, Pilze, Protozoen, etc..
Das erfindungsgemässe Verfahren ist aber besonders gut für Pathogene geeignet, die ein ver- gleichsweise kleines Genom haben, das entweder leicht sequenziert werden kann oder schon voll- ständig sequenziert ist. Demgemäss sind erfindungsgemäss vor allem Vakzine oder Diagnostika gegen bakterielle oder virale Pathogene bevorzugt.
Als nicht-humaner Vertebrat, der erfindungsgemäss mit der Pathogen-Präparation infiziert wird, eignen sich alle Tiere, die auf Infektion mit einem Pathogen eine ausreichende Generierung von Antikörpern zeigen, also z. B. Amphibien, Reptilien, Vögel oder Säugetiere. Dabei kommen bevor- zugt Tiere zum Einsatz, die bereits im immunologischen Labor etabliert sind, wie Frösche (z.B.
Xenopus laevis), Hühner oder Nagetiere, insbesondere Hasen, Ratten oder Mäuse. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-humanes Säugetier mit einer Präparation des pathogenen Organismus immunisiert. In vielen Fällen kann davon ausge- gangen werden, dass es vorteilhaft ist, wenn das Versuchstier dem Organismus, der das erfin- dungsgemässe Vakzin erhalten soll, dem infizierten Tier möglichst nahe verwandt ist, da so die Immunreaktionen weitgehend ähnlich verlaufen.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird zunächst einem nichthumanen Vertebraten eine Präparation des ausgewählten Pathogens verabreicht, so dass im Vertebraten eine Immunreaktion ausgelöst wird. Wesentlich ist, dass bei dieser Immunreaktion, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung der Einfachheit halber mit "Immunisierung" bezeichnet wird, Antikörper gegen das Pathogen im Vertebraten gebildet werden. Diese Antikörper werden im Anschluss an die Immuni- sierung dem Vertebraten entnommen und gegebenenfalls zu einer gereinigten Antikörper-Präpara- tion mit üblichen Methoden aufgereinigt. Beispielsweise kann dem Vertebraten Serum entnommen werden, woraus die zur Selektion der Genbank verwendete Antikörper-Präparation hergestellt wird.
Die Immunisierung der Vertebraten kann mit subletalen oder mit letalen Dosen durchgeführt werden; die Entnahme der Antikörper kann einmalig, z. B. nach Tötung der Tiere, oder in mehreren Chargen, z. B. nach mehreren Verabreichungen der Pathogen-Präparation, erfolgen.
Vorteilhafterweise werden die Vertebraten derart ausgewählt, dass neben der Bildung von Anti- körpem auch eine Bildung von Antigen-erkennenden Zellen des zellulären Systems des Immun- systems durch die Verabreichung der Pathogen-Präparation verursacht wird. Diese Zellen können dann erfindungsgemäss zur weiteren Selektion der erfindungsgemäss identifizierten Polypeptide herangezogen werden, indem beispielsweise diese Peptide oder die diesen Peptiden zugehö- renden Pathogen-Proteine auf ihre Bindungsfähigkeit gegenüber diesen Zellen getestet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden daher neben Antikörper-enthaltenden Proben zusätzlich Antigen-erkennende Zellen des zellulären Sys- tems des Immunsystems aus dem immunisierten Vertebraten entnommen, mit welchen die identi- fizierten antigenen Polypeptide weiter selektiert werden, indem die identifizierten antigenen Poly- peptide oder die den identifizierten antigenen Polypeptiden zuzuordnenden vollständigen Proteine des Pathogens auf ihre Bindungsfähigkeit zu den Antigen-erkennenden Zellen getestet werden und diejenigen Polypeptide oder Proteine zum Fertigstellen ausgewählt werden, die eine Bindungs- fähigkeit zu den Zellen zeigen.
Für diese Ausführungsform werden bevorzugterweise Vertebraten vorgesehen, bei welchen die zellulären Komponenten des Immunsystems leicht zu entnehmen und handzuhaben sind. Dazu gehören besonders Vögel und Säugetiere, die mit Thymus, Milz, (Bursa) und Lymphknoten leicht zu entnehmende Quellen für derartige Zellen haben, deren Entnahme seit langem etabliert ist.
Bevorzugterweise werden T-Zellen als Antigen-erkennende Zellen des zellulären Systems des Immunsystems aus dem immunisierten Vertebraten entnommen. Erfindungsgemäss können daher vorzugsweise dem immunisierten Vertebraten Milz und Lymphknoten entnommen werden, woraus eine Antigen-erkennende Zellen-hältige Suspension hergestellt wird, mit der die Bindungsfähigkeit der identifizierten Polypeptide oder der zugeordneten Proteine gegenüber den Antigen-erkennen- den Zellen getestet wird.
Bei der weiteren Selektion der identifizierten antigenen Polypeptide unter Verwendung der
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Antigen-erkennenden Zellen kann entweder die Bindungsfähigkeit der Polypeptide selbst gegen- über diesen Zellen untersucht werden, oder es kann getestet werden, ob bestimmte andere Berei- che des Pathogen-Proteins, dem das Polypeptid zugeordnet werden kann, Bindungsfähigkeit gegenüber diesen Zellen aufweisen. Oft sind nämlich jene Bereiche des Pathogen-Proteins, die eine humorale Immunantwort auslösen können, nicht mit jenen identisch, die eine Bindungsfähig- keit zur zellulären Immunantwort aufweisen. Hierbei können daher Teile oder das gesamte Patho- gen-Protein, welchem ein oder mehrere identifizierte antigene Polypeptide zugeordnet werden können, dem Bindungstest gegenüber den Antigen-erkennenden Zellen zugrundegelegt werden.
Die Auswahl der Teilsequenzen wird daher praktischerweise anhand der bekannten oder vorher- gesagten Proteinstruktur derart vorgenommen, dass antigene Motive möglichst vollständig erhalten bleiben. Ein bevorzugtes Verfahren zeichnet sich daher dadurch aus, dass eine Kombination aus Teilsequenzen des den antigenen Polypeptiden zugeordneten vollständigen Pathogen-Proteinen der Selektion hinsichtlich der Bindungsfähigkeit zugrunde gelegt werden
Vorteilhafterweise wird zur einleitenden Infektion des Vertebraten eine Pathogen-Präparation eingesetzt, die das vollständige Pathogen enthält. Damit kann der Vertebrat eine Immunantwort produzieren, die ganz auf das native Pathogen gerichtet ist und daher gewährleistet, dass die erfin- dungsgemäss aufgefundenen Vakzine einen verlässlichen Impfschutz gegen das native Pathogen verleihen.
Oft ist aber die Infektion des Vertebraten mit dem Gesamt-Pathogen nicht möglich, z. B. wenn es den Vertebraten tötet, bevor eine ausreichende zelluläre und humorale Immunantwort aufgetre- ten ist, so dass ein weiteres erfindungsgemässes Vorgehen nicht stattfinden kann. Dann muss von einer inaktivierten Präparation des Pathogens ausgegangen werden. In dieser Hinsicht hat sich erfindungsgemäss bewährt, ein Homogenisat des Pathogens zum initialen Immunisieren des Vertebraten einzusetzen. Es hat sich gezeigt, dass auch hierbei ein effizienter Schutz gegen das native Pathogen erzielt werden kann, insbesondere, wenn bei der Homogenisierung darauf geach- tet wird, die Pathogene nicht mit denaturierenden Methoden zu behandeln.
Auch fixiertes pathogenes Material (z.B. inaktiviertes oder cross-linked Material) ist erfindungs- gemäss zur Immunisierung des Vertebraten verwendbar. Diese Vorgangsweise kann sich z. B. bei sehr infektiösen Pathogenen, deren Handhabung umständlich und gefährlich ist, empfehlen.
Eine besonders effiziente Immunantwort kann bei Vertebraten ausgelöst werden, wenn die zum Immunisieren eingesetzte Pathogen-Präparation ein Adjuvans umfasst. Vorteilhafterweise werden organische Polykationen oder eine Mischung organischer Kationen als Adjuvantien einge- setzt. Besonders bevorzugte Adjuvantien sind basische Polypeptide, insbesondere Polyarginin oder Polylysin.
Mit der vorliegenden Erfindung können wie erwähnt Vakzine und Diagnostika gegen eine Viel- zahl von Pathogenen hergestellt werden. Bevorzugterweise werden allerdings Vakzine gegen Human-Pathogene zur Verfügung gestellt, für die keine oder nur eine unzureichende Immunisie- rungsalternative vorhanden ist und/oder bei denen Resistenzen bei vorhandenen chemischen oder immunologischen Behandlungen auftreten. Bevorzugte Pathogene, die im Rahmen der vorliegen- den Erfindung bekämpft werden sollen, können daher aus der Gruppe Borrelia burgdorferi, Chlamydia spp., Gruppe A-Streptokokken, Nicht-typisierbare Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumomae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylokokkus aureus, Pseudo- monas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Shigella spp., Toxoplasma gondi, oder Treponema palli- dum ausgewählt werden.
Weitere bevorzugte Pathogene sind pathogene Aspergillus-, Candida-, Mycobacterium-, Rhizo- pus-, Trichophyton-, Microsporum-, Trypanosoma-, Pneumocystis-, Plasmodium-, Meningokokkus- und Chlostridien-Stämme sowie Retroviren oder hämatogene Viren.
Da bei der zellulären Erkennung der pathogenen Proteine die exakte native räumliche Struktur nicht erheblich ist, werden bevorzugterweise dem Test zur Bindungsfähigkeit gegenüber den Anti- gen-erkennenden Zellen Polypeptide zugrundegelegt, die mit einem Polypeptid-Sequenzer herge- stellt worden sind.
Die Wahl der Genbank oder der Wirtszellen kann beliebig erfolgen ; ist, dass die Genbank-Wirtszellen aufgrund der Bindung der exprimierten Polypeptide zu den dem Vertebraten entnommenen Antikörper selektiert werden. Demgemäss sollten einfacherweise die exprimierten Polypeptide an der Aussenseite der Zellen präsentiert werden, etwa als Teil einer äusseren Domäne
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eines Membranproteins. Die Länge der exprimierten Polypeptide wird dann anhand der jeweiligen Erfordernisse des Genbank/Wirtszell-Systems gewählt, liegt aber oft im Bereich zwischen 10 und 200 Aminosäuren, insbesondere zwischen 20 und 100 Aminosäuren.
Die Selektion der Zellen kann dabei beispielsweise über ein System erfolgen, bei welchem durch die Bindung des Antikörpers an das exprimierte Polypeptid die Bindungsstelle für ein Selektions-Agens oder ein Transport-Kanal für das Selektions-Agens blockiert wird. Ein besonders vorteilhaftes System für eine derartige Selektion ist in der WO 99/30151 A beschrieben, deren Inhalt hiermit in die vorliegende Anmeldung inkludiert wird. Vorzugsweise werden daher die exprimierten Polypeptide als Teil eines Membran- proteins der Genbank-Wirtszellen nach aussen präsentiert. Weiters ist ein Selektions-System bevor- zugt, bei welchem die Genbank-Wirtszellen aufgrund der Bindung eines Antikörpers zum expri- mierten Polypeptid gegen ein Selektions-Agens resistent werden.
Besonders bewährt in diesem bevorzugten System haben sich diejenigen Ausführungsformen, bei welchen die Selektion durch ein virales Agens erzielt wird, das für die Genbank-Wirtszellen pathogen ist. Hierbei kann der Virus-Rezeptor in den Zellen derart konstruiert werden, dass dieser durch die Bindung des Antikörpers zum exprimierten Polypeptid blockiert wird, beispielsweise durch intermolekulare Wechselwirkung oder durch sterische Blockierung. Vorzugsweise weisen derartige Genbank-Wirtszellen ein OmpA-, LamB- oder FhuA-Selektionssystem auf.
Wenn durch die Genbank-Selektion ein oder mehrere Polypeptide identifiziert worden sind, die eine Bindung zu einem der im Vertebraten gebildeten Antikörpern eingehen, können diese im Genom des Pathogens lokalisiert und bestimmten Pathogen-Proteinen (oder ORFs) zugeordnet werden. Voraussetzung ist dabei natürlich, dass bereits zumindest eine grobe Genkartierung des Pathogens vorliegt. Besonders vorteilhaft ist allerdings, wenn bereits die vollständige Gensequenz des Pathogens vorliegt. Bevorzugterweise werden demgemäss die selektierten antigenen Polypep- tide unter Zugrundelegen einer Genomanalyse des pathogenen Organismus definierten Proteinen dieses pathogenen Organismus zugeordnet werden und diejenigen antigenen Polypeptide, die demselben Protein zugeordnet worden sind, kombiniert.
Diese Polypeptid-Kombinationen können dann dem Bindungstest gegenüber Antigen-erken- nenden Zellen zugrunde gelegt werden, gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Teilsequen- zen des zugeordneten Pathogen-Proteins (oder auch als Gesamtprotein)
Die Bestimmung der Bindungseigenschaft kann mit einer Vielzahl von Tests vorgenommen werden. Die derzeit gebräuchlichsten sind in Romero et al. (Mol.Med.Today 4 (1998), Seiten 305-312) beschrieben, darunter auch der Elisspot-Assay, mit welchem T-Zellen, die eine Bindung mit einem (MHC-II-präsentierten) Antigen eingehen, aufgrund ihrer Cytokin-Ausschüttung (zumeist Interferon-y) identifiziert werden können.
Dieser Test ist nicht nur etabliert, standardisierbar und einfach handhabbar, er ist auch überaus empfindlich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, insbesondere da für diesen Test keinerlei zelluläre in vitro Proliferation erforderlich ist. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird daher die Bindungs- fähigkeit gegenüber den entnommenen Antigen-erkennenden Zellen unter Verwendung des Elisspot-Assays bestimmt.
Bevorzugterweise umfasst die Fertigstellung der erfindungsgemässen Vakzine oder Diagnostika das Zumischen eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers sowie weiterer Hilfs-Komponenten.
Die initiale Immunisierung ist für den Gegenstand der vorliegenden Erfindung nicht auf nicht- humane Vertebraten beschränkt. Gemäss einer bevorzugten Variante des Gegenstandes der vorlie- genden Erfindung werden sowohl die Antikörper als auch gegebenenfalls die Antigen-erkennenden Zellen aus Menschen gewonnen und dem erfindungsgemässen Selektions- und Herstellungsver- fahren unterzogen. In diesem Fall wird die primäre Immunisierung allerdings entweder der Natur überlassen, d. h. es werden Antikörper und T-Zellen aus bereits immunisierten Patienten entnom- men, oder aber es wird mit nicht-infektiösen Pathogen-Präparationen gearbeitet.
Speziell für die
Herstellung von effizienten Vakzinen gegen Human-Pathogene stellt die Entnahme von Antikör- pern und T-Zellen aus Menschen, die bereits erfolgreich eine Infektion mit diesem Pathogen über- standen und einen ausreichenden zellulären und humoralen Schutz aufgebaut haben, eine beson- ders bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ebenfalls eine Verfahrensvariante, bei welcher anstelle des Schrittes "immunisieren eines nicht-humanen Vertebraten" der Verfahrensschritt "Auswählen einer Person, die eine Infektion mit dem bestimmten Pathogen überstanden und Antikörper sowie
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Antigen-erkenende Zellen gebildet hat" gesetzt wird. Bei der Entnahme von Antikörpern oder Antigen-erkennenden Zellen muss selbstverständlich darauf Bedacht genommen werden, dass diese nach etablierten Methoden der Human-Medizin erfolgt und keine gravierenden Folgen für die Spenderperson hat.
Aus dem obigen ergibt sich, dass ein derartiges Verfahren für die Spender- person weder ein therapeutisches noch ein diagnostisches oder chirurgisches Verfahren darstellt, da diese Spenderperson bereits als immunisiert gilt und durch die Entnahme keinerlei therapeuti- schen Effekt erfährt.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Vakzin-Präparation, ent- haltend ein ausgewähltes Polypeptid oder ein dieses Polypeptid enthaltendes Protein oder die DNA derselben, hergestellt oder erhältlich durch das erfindungsgemässe Verfahren.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung eine Diagnostika-Präparation, enthaltend ein ausge- wähltes Polypeptid, hergestellt oder erhältlich durch das erfindungsgemässe Verfahren, welches einen Marker zum Nachweisen des Polypeptids aufweist.
Als Marker, die zum Nachweis des Polypeptids verwendet werden können, kommen alle zum Nachweis von Bindungen zweier Substanzen in Betracht, vorzugsweise werden aber radioaktive, fluoreszente, chromogene oder amplifizierbare Marker an das erfindungsgemässe Diagnostikum gekoppelt. Die Diagnose kann sich - wie die Vakzinierung - auch auf Nukleinsäure-Niveau abspie- len. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Diagnose-Set, umfassend eine erfindungsgemässe Diagnostika-Präparation und Nachweisreagenzien für den Marker.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Set zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens umfassend - eine Genbank des Genoms des pathogenen Organismus, - Wirtszellen, in welchen die Genbank exprimierbar ist, wobei die Pathogen-Polypeptid- sequenzen exprimierenden Genbank-Wirtszellen, hinsichtlich ihrer Bindung zu einem Anti- körper selektierbar sind, und - ein Selektions-Agens.
Das Potential der Antigen-Selektion der vorliegenden Erfindung ist aber nicht auf Vakzine und Diagnostika gegen bestimmte Pathogene beschränkt. Es hat sich gezeigt, dass das erfindungsge- mässe Verfahren auch zur Herstellung von effizienten Tumor-Antigenen geeignet ist. Insbesondere mit der erfindungsgemäss bevorzugten Kombination aus humoraler und zellulärer Selektion können besonders geeignete Tumor-Antigene aufgefunden werden. Mit den erfindungsgemäss aufgefun- denen Tumor-Antigenen lassen sich besonders wirkungsvolle Tumor-Vakzinierungen vornehmen.
Anstelle der Immunisierung des nicht-humanen Vertebraten mit der Pathogen-Präparation wird allerdings der Vertebrat mit einer Präparation der jeweiligen Tumor-Zelle immunisiert oder Antikör- per und gegebenenfalls Antigen-erkennende Zellen aus einem humanen Tumor-Patienten entnom- men.
Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Schema-Beispiels sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigen : das erfindungsgemässe Verfahren zur Identifizierung von Antigenen (schematisch); Fig.2 : Konstruktion einer Genbank für ein mikrobielles Genom ; Fig.3 und 4 : Selektion der Antikörper-bindenden Zellen durch OmpA oder LamB-Selektion; Fig. 5 und 6 die Zuordnung der identifizierten Polypeptide zu Pathogen-Proteinen via Genomics; Fig.7: die Generierung von über- lappenden Peptid-Fragmenten zur weiteren Charakterisierung mittels T-Zell-Bindungstest; und Fig.8: das Screenen der Antigen-bindenden Polypeptide mittels Elisspot-Assay.
Beispiel :
Eine Maus wird mit einer homogenisierten pathogenen Mikrobe immunisiert, wobei dem Homo- genisat Polyarginin zugesetzt worden ist. Nach erfolgter Immunisierung wird der Maus Serum entnommen, sowie Milz und Lymphknoten entfernt. Das Serum wird zur Identifizierung von Anti- genen, die von den Antikörpern im Serum erkannt werden, verwendet; aus Milz und Lymphknoten wird eine Suspension von T-Zellen hergestellt (Fig. 1).
Eine Expressionsgenbank wird gemäss der WO 99/30151 A hergestellt, wobei das mikrobielle Genom auf etwa 150 bp lange Fragmente verdaut und in geeignete Selektions-/Expressions- Vektoren eingesetzt wird. Mit diesen Expressions-Vektoren werden Wirtszellen transformiert, wobei
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eine selektierbare Genbank generiert wird (Fig.2).
Die der Maus entnommenen Antikörper werden mit den Genbankwirtszellen versetzt, wobei die Antikörper an geeignete exprimierte Strukturen binden können (Fig.3). Fig. 4 zeigt ein System, bei welchem mit Phagen selektiert wird. Durch Bindung des Antikörpers an das exprimierte Polypeptid an der Aussenseite der Zellen kommt es zu einer sterischen Blockierung der Phagen-Bindungs- stelle. Dadurch kann die Zelle nicht mit dem normalerweise letalen Phagen infiziert werden und wird positiv selektiert, womit es zu einer Anreicherung (z. B. um den Faktor 103 bis 106; höhere oder niedrigere Anreicherungen je nach Selektionssystem) derjenigen Klone, die antigene mikrobielle Peptide aufweisen.
Aufgrund der Sequenz des exprimierten Polypeptids wird über eine genomische Datenbank des mikrobiellen Pathogens die Lokalisation des Polypeptids im Pathogen-Genom vorgenommen und das Polypeptid einem bestimmten Protein oder ORF zugeordnet (Fig.5). Da humorale und zelluläre Antigene oft getrennte Strukturen auf einem Protein sind (Fig.6), werden überlappende Peptid-Fragmente der über die genomische Datenbank aufgefundene Gesamt-Proteinsequenz generiert, z. B. durch automatisierte Peptid-Synthesizer (Fig.7).
Die identifizierten antigenen Polypeptide und die generierten Proben werden mit einem Elis- spot-Assay auf ihre Bindung zu T-Zellen untersucht. Dabei werden die Polypeptid-Proben in einem geeigneten Reaktionsgefäss, z.B. einer Mikrotiterplatte, die mit einem Cytokin-spezifischen Anti- körper gecoated ist, vorgesehen und mit der Milz- und Lymphknoten-Suspension aus der Maus versetzt. T-Zellen, die an ein Antigen binden (das ihnen beispielsweise durch MHC-II-tragende Antigen-präsentierende Zellen präsentiert wird), geben bei Bindung an das Antigen Cytokine ab, z. B. Interferon-y. Dieses bindet an den immobilisierten Antikörper und kann z. B. durch einen mar- kierten sekundär-Antikörper detektiert werden. Diejenigen Näpfchen in der Mikrotiter-Platte, bei welchen eine T-Zell-Bindung erfolgt ist, zeigt eine positive Cytokin-Reaktion.
Es zeigt sich, dass mit der vorliegenden Erfindung ein besonders effizientes High-Throughput- Verfahren zum Auffinden und Herstellen von geeigneten, stark immunogenen Vakzinen und ver- lässlichen Diagnostika für Infektionen mit Pathogenen zur Verfügung gestellt wird.
Mit diesem System können in kurzer Zeit ganze Genome pathogener Organismen hinsichtlich ihrer ganz besonders antigenen Proteine oder Polypeptidsequenzen durchsucht werden, wodurch umgehend geeignete antigene Vakzin-Kandidaten für die praktische Anwendung erschlossen wer- den können.