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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität und Verminderung von Fettsäureverunreinigungen von pankreatischen Lipasen.
Lipasen (Triacylglycerinhydrolasen [EC 3. 1. 1. 3]) sind Enzyme, die wasserunlösliche Triglyceride an der Grenzfläche Wasser/01 hydrolysieren. Diese Enzyme spielen nicht nur physiologisch eine wichtige Rolle (in dem sie beispielsweise Fett im Verdauungstrakt hydrolysieren) sondern werden auch industriell grossflächig eingesetzt, um Triglyceride umzuestern. Lipasen sind überraschend vielseitige Biokatalysatoren, die in der Lage sind, eine grosse Anzahl synthetischer Substrate zu acylieren oder zu deacylieren, wobei sie im allgemeinen hoch regioselektiv wirken (R. D.
Schmid, etal., Angew. Chemie 110 (1998), S. 1695-1720).
Lipasen können aus einer Vielzahl unterschiedlicher Quellen isoliert werden, aber nach Wahl werden Schweinepankreas oder bestimmte Mikroorganismen genutzt (Enzymes in Industry : Production and Applications, Hrsg. W. Gerhartz, VCH Weinheim (1990), S. 89).
Heute werden Lipasen grosstechnisch in der Fettchemie (zur Herstellung von Seifen, Fettsäuren, Fetten mit verbesserter Streichfähigkeit, Kakaobutteräquivalenten, Tnglyceriden mit hohem Verdauungswert), in Waschmitteln (zur Entfernung von Fettverschmutzungen sowie zur in situHerstellung von Persäuren als Bleichmittel), in der Papierherstellung, in der Milchindustrie (insbesondere in der Käseherstellung) oder als Biokatalysatoren in der organischen Synthese sowie In der Medizin verwendet (Schmid et al., Angew. Chem. 110 (1998), S. 1695-1720).
Da die Isolierung von reinen Lipasen sehr aufwendig ist, werden für industrielle Anwendungen, bei welchen die Verwendung grösserer Mengen der Enzyme notwendig ist, vorwiegend rohe Lipasepräparationen (geringer Reinheit) verwendet. Diese enthalten in der Regel noch hohe Anteile an anderen Proteinen, Lipide, Fettsäuren und Kohlehydratanteile
Insbesondere Fettsäureverunreinigungen haben sich bei kommerzielle Lipasen als durchwegs störend herausgestellt (S. Misra et al., Lipids 19 (4) (1984), S. 302-303)
Pankreatische Lipasepräparationen werden z. B. aus Schweinepankreas isoliert und können auch noch Esterasen, Proteasen und Amylasen enthalten. Von den tierischen Lipasen ist bekannt, dass sie vorzugsweise die Hydrolyse von Fettsäuren mit mehr als 12 C-Atomen bewirken und dies zum Grossteil an der C-1-Position des Triglycerids.
Die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt beträchtlich In der Substratreihenfolge Tri-, DI- und Monoglyceride (Emzymes in Industry : ProductIon and Appiications, Hrsg. W. Gerhartz, VCH Weinheim (1990), S. 89-90).
Schweinepankreaslipase ist eine Triacylglycerinlipase mit einer Sequenz von 449 Aminosäuren und sieben Dlsulfidbrücken. Schweinepankreaslipase ist die am genauesten beschriebene pankreatische Lipase. Sie wird als Biokatalysator In der Lebensmittelindustrie und zur Geschmacksstoffherstellung verwendet sowie für organische Synthesen, z. B. für regioselektive Esterifizierungen, fur enantioselektive Hydrolyse von Mesoverbindungen, zur regioselektiven Acylierung von Hydroxyverbindungen, für lipasekatalysierte Synthese von Zuckerestern und für viele andere Verwendungen In industriellem Massstab. Schweinepankreaslipase wurde auch als Biokatalysator zur Veresterung von Glycidol (J. F. Martins, Biotechnol. Bioeng. 44 (1994), S. 119-124 und J. F. Martins, Enzyme Microb.
Technol. 16 (1994), S. 785-790) und zur enzymatischen Hydrolyse von Triolen und dessen partiellen Glyceriden im überkritischen COs verwendet (G. Glowacz, Chem. Phys. Lipids 79 (1996), S. 101-106)
Die Behandlung von Enzympräparationen mit überkritischen Fluiden wird im Stand der Technik für zwei wesentliche Prozesse beschrieben. Zum einen werden überkritische Fluide zur Extraktion aus biologischen Präparationen von Fettsäuren und Lipiden verwendet. Proteine sind in überkritischen Fluiden schlecht löslich und verbleiben nach der Extraktion im Rückstand (J. P. K. Weder, Cafe Cacao The 34 (2) (1990), S. 87-96). Dieses Verfahren wurde auch zur ersten Aufreinigung von einer Esterasepräparation geringer Reinheit verwendet (Steinberger et al., Gemeinsame Jahrestagung 1998 OBG/OGGGT).
Zum zweiten kann die enzymatische Aktivität von Proteinen in Anwesenheit von überkritischen Fluiden verändert und gezielt gesteuert werden Dieser Umstand spielt insbesondere in der Entwicklung neuer Strategien zur organischen Synthese unter Verwendung von Biokatalysatoren eine Rolle (Cernia et al., Methods in Enzymol. 286 (1997), S. 495-508 ; Kamat et al., Crit. Rev. Biotechnol. 15 (1) (1995), S. 41-71).
Obgleich bei der organischen Synthese In der Regel Biokatalysatoren hoher Stabilität eingesetzt werden (Proteasen, Lipasen oder Hydrolasen gelten im allgemeinen als stabile Enzyme),
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kommt es in Abhängigkeit von den gewählten Bedingungen (Druck, Temperatur etc. ) und Prozessschritten (Entspannungs- und Kompressionsschritte) zu einer beträchtlichen Enzymaktivierung.
Giessauf et al., Progress in Biotechnology 15, Hrsg. A. Ballesteros, F. J. Plou, J. L. Iborra, P. J. Hal- ling, Elsevier, Amsterdam (1998), S. 471-476, berichteten, dass verschiedene Lipasen und Esterasen bei Behandlung mit überkritischem CO2 um bis zur Hälfte ihrer Ausgangsaktivität verlieren können (vgl. auch Kamat et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995), S. 610-620)). Bei vielen industriell verwendeten Enzymen hat sich aber gezeigt, dass diese durchaus in überkritischen Fluiden hinsichtlich ihrer Aktivität keine Einbussen an Aktivität erleiden müssen.
Speziell überkritisches CO2 gilt als ein sehr vorteilhaftes Lösungsmedium, da es eine niedrige Toxizität besitzt, keine Rückstände im behandelten Material verbleiben und in seinem Gebrauch geringe Kosten verursacht und daher auch für Prozesse verwendet werden kann, bei welchen Nahrungsmittelkomponenten für Mensch und Tier hergestellt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Enzymen mit überkritischen Flui- den so zu nutzen, dass damit qualitativ verbesserte Biokatalysatoren hergestellt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von pankreatischen Lipasen, welches sich dadurch auszeichnet, dass eine Präparation, enthaltend pankreatische Lipasen, mit überkritischen Fluiden behandelt wird.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass Enzyme, wie pankreatische Lipasen, insbeson- dere die Lipase isoliert aus Schweinepankreas, durch Behandlung mit überkritischen Fluiden eine massgebliche Aktivitätserhöhung erfahren.
Während bislang im Stand der Technik angenommen worden ist, dass eine Behandlung mit überkritischen Fluiden bestenfalls zur Erhaltung der Ausgangsaktivität dienen kann und eher mit zum Teil erheblichen Aktivitätsverlusten gerechnet werden muss, zeigte sich erfindungsgemäss, dass mit der Behandlung mit überkritischen Fluiden, insbesondere mit überkritischem CO2, eine massgebliche Aktivitätssteigerung von pankreatischen Lipasepräparationen herbeigeführt werden kann.
Da kleine Aktivitätsunterschiede (10-20 %) nach Behandlung mit überkritischen Fluiden aufgrund der möglichen Messvarianz nicht unbedingt als relevant erachtet werden können, wird erfindungsgemäss unter Aktivitätserhöhung eine Erhöhung von zumindest 50 %, ausgehend von der Ausgangsaktivität, verstanden.
Erfindungsgemäss hat sich gezeigt, dass die Aktivitätserhöhung mit der erfindungsgemässen Behandlung um 100 %, insbesondere um 400 %, ja sogar auf über 600 %, gesteigert werden kann.
Demgegenüber war im Stand der Technik, wie erwähnt, beschrieben, dass die Aktivität von Enzymen bei einer Behandlung mit überkritischen Fluiden bestenfalls erhalten blieb. Beschrieben wurde für Lipasen bislang als höchster Wert eine Steigerung von 10 4, 1 % (Giessauf et al. (gemeinsame Jahrestagung 1998 OBG/ÖGGGT) ; dieser Wert kann jedoch auf Grund der erwähnten Messungenauigkeiten nicht wirklich als Erhöhung der Aktivität angesehen werden).
Überkritische Fluide sind dadurch charakterisiert, dass sie unter Temperatur- und Druckbedingungen existieren, die über deren kritischen Punkt liegen. Der kritische Punkt ist definiert als der Punkt, bei welchem die flüssige und die gasförmige Phase nicht unterscheidbar werden. Ein Fluid ist überkritisch, wenn dessen Temperatur und dessen Druck über dem kritischen Punkt liegt. Die Eigenschaften liegen zwischen Flüssigkeiten und Gasen : Dichte fast wie bei Flüssigkeiten, hohe Löslichkeiten, hohe molekulare Diffusion, niedere Viskosität, hohe Kompressibilität, etc..
Als überkritisches Fluid, mit welchem die erfindungsgemässe Behandlung vorgenommen wird, kann prinzipiell jedes geeignete Medium verwendet werden, insbesondere das für Lipasesysteme schon beschriebene CO2, weiters Fluoroform, Ethan, Schwefelhexafluorid, Ethylen und Propan, wobei überkritisches CO2 erfindungsgemäss besonders bevorzugt ist.
Die Temperatur, bei welcher die Behandlung durchgeführt wird, richtet sich vor allem nach dem überkritischen Fluid, besonders hohe Aktivitätssteigerungen lassen sich durchführen, wenn die Behandlung in eine Temperaturbereich zwischen 65 bis 85 C durchgeführt wird. Temperaturen > 120 C sind in der Regel nicht mehr relevant, da eine thermische Zersetzung und Inaktivierung der Enzyme zu erwarten ist.
Auch der Druck, der bei der Behandlung angewendet wird, richtet sich in der Hauptsache nach der Natur des überkritischen Fluids, bevorzugt ist ein Bereich von 100 bis 600 bar. Drücke > 1000 bar sind aus technischen Gründen in der Regel nicht mehr relevant.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemässe Behandlung durch
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Druckänderung durchgeführt.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich besonders gut zur Behandlung von Präparationen geringer Reinheit (Proteingehalt < 80 %), die nach der Behandlung direkt für industrielle Zwecke verwendet werden können, ohne dass weitere aufwendige Reinigungsschritte noch vorgesehen werden müssten. Die erfindungsgemässe Aktivitätserhöhung führt dann in einfacher Weise zu einer Verdoppelung, Verdreifachung oder gar Versechsfachung der Enzymaktivität dieser rohen Aufarbeitungen.
Demgemäss werden erfindungsgemäss besonders bevorzugt rohe Lipasepräparationen behandelt, die einen Proteingehalt von unter 80 Gew.-%, vorzugsweise von unter 20 Gew.-% aufweisen.
Damit können die gängigen Rohpräparate an pankreatischer Lipase (diese enthalten in der Regel um 5 bis 15 % Protein) besonders vorteilhaft im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden.
Die eingesetzte Lipasepräparation ist dabei vorzugsweise Iyophilisiert und weist dabei einen Feuchtigkeitsgehalt von unter 50 Gew.-%, vorzugsweise unter 20 Gew.-%, auf.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lipasepräparation, die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlich ist. Wenn pankreatische Lipasen erfindungsgemäss beispielsweise mit überkritischem CO2 behandelt werden, zeichnen sie sich durch ihre erhöhte Aktivität aus und dadurch, dass die Aktivität dieser Präparationen durch einen erneuten Behandlungszyklus mit überkritischen Fluiden nicht mehr im gleichen Ausmass wie bei der ersten Behandlung gesteigert werden kann, insbesondere, wenn die erfindungsgemässe Behandlung vollständig erfolgt ist, was in der Regel der Fall ist, wenn die Präparation etwa 24 Stunden oder länger behandelt wurde.
Die besten Resultate werden erfindungsgemäss mit der Lipase aus Schweinepankreas und ähnlichen Lipasen erzielt, da diese besonders viele Disulfidbrucken besitzt. Die pankreatische Lipase aus Schwein (Mastschwein) weist 449 Aminosäuren auf und ist beispielsweise in Fournier et al. Eur. J. Biochem. 170 (1987), 369-171 beschrieben. Dieses Enzym weist sechs Disulfidbrü- cken auf. Es hat sich gezeigt, dass ein erhöhter Gehalt an Disulfidbrücken, also mehr als 3, vorzugsweise mehr als 5 Disulfidbrücken, in der erfindungsgemäss zu behandelnden Lipase zu deutlicheren Aktivitätssteigerungen führt.
Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Behandlung mit überkritischen Fluiden zur Steigerung der Aktivität von Enzympräparationen. Erfindungsgemäss konnte erstmals gezeigt werden, dass die Behandlung mit überkritischen Fluiden zu einer signifikanten Erhöhung der Aktivität von pankreatischen Lipasen (also Steigerungen um 50 % oder mehr) geführt hat. Damit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit überkritischen Fluiden, insbesondere mit überkritischem CO2, tatsächlich zu einer Erhöhung einer Enzymaktivität führen kann, und nicht, wie bislang im Stand der Technik allgemein angenommen-nur eine Gefahr von Aktivitätsveriusten beinhaltet.
Die erfindungsgemässe Behandlung mit überkritischen Fluiden kann vorzugsweise auch zur Verminderung von Fettsäureverunreinigungen bei Lipasen (vgl. Misra et al., Lipids 19 (4) (1984), S. 302-303) verwendet werden, ohne dass es dabei zu (weiteren) Aktivitatsverlusten kommt.
Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt werden soll, näher erläutert.
Es zeigen :
Fig. 1a : Die Änderung der Aktivität nach Behandlung von Schweinepankreaslipase mit über- kritischem CO2 in Abhängigkeit von der Temperatur (Dauer der Behandlung 1 Stun- de).
Fig. 1b : Die Abhängigkeit der Aktivitätszunahme von der Zeit bei 75 C, und
Fig. 1c : Die Abhängigkeit der Aktivitätszunahme von Entspannungs- und Kompressions- schritten bei 35 C.
Beispiel :
In Vorstudien wurden bereits die Stabilitäten von verschiedenen Enzymen (Lipase von Candida rugosa, Lipase AY von Candida rugosa, Lipase PS von Pseudomonas species und Esterase EP10 bei der Behandlung mit überkritischem CO2 miteinander verglichen, wobei bestenfalls gleichbleibende Aktivitäten bei einer 24-stündigen Inkubation bei 75 C und 150 bar erzielt werden konn-
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ten (Giessauf et al. gemeinsame Jahrestagung 1998 ÖBG/ÖGGGT)).
Behandlung von Schweinepankreaslipase mit überkritischem CO2
Für die Bestimmung der Aktivitätszunahme in Abhängigkeit von der Temperatur wurden rund 40 mg Enzym (mit-20 U/mg Pulver von FLUKA (CH), It. Katalog [1 U entspricht der Enzymmenge, die 1 ! Mol Ölsäure pro Minute bei pH = 8, 0 und 370C freisetzt und 20 U/mg von SERVA (Heidelberg) in ein Papierfilter gegeben und dieser in einen Enzymreaktor (mit 140 mi Innenvolumen) gelegt. Der Enzymreaktor, der mittels eines Waserbades (gefüllt mit Wasser oder Ethylenglykol) thermostatisiert wurde, ist mit CO2 auf einen Druck von 150 bar aufgepumpt worden und das Enzym ist bei unterschiedlichen Temperaturen (Fig. 1a) für unterschiedliche Zeitspannen (Fig. 1b) und in Abhängigkeit von Druckänderungsschritten (Fig. 1c) im überkritischen CO2 inkubiert worden.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1a-1c dargestellt. Es zeigte sich, dass eine einstündige Inkubation bei Temperaturen unter 650C zu keinem signifikanten Verlust oder Erhöhung der Enzymaktivitäten führte, wie es bei anderen Enzymen beobachtet worden ist. Eine einstündige Inkubation bei 75 C und 150 bar führt zu einer Erhöhung der Aktivität auf einen Wert von 242, 6 % des Ausgangswertes (0, 453 U/g Enzympulver). Im Vergleich dazu zeigten die Esterase aus Pseudomonas marginata, die Lipase von Candida rugosa und die Lipase AY von Candida rugosa keinen derartigen Effekt. Bei diesen Enzymen konnte nur eine Verringerung oder kein Effekt auf die enzymatische Aktivität durch Behandlung mit überkritischem CO2 bei Temperaturen von über 750C beobachtet werden.
Bei der Erhöhung der Aktivität von Schweinepankreaslipase konnte ein zeitabhängiger Effekt beobachtet werden.
Wie in Fig. 1 b gezeigt wird, kommt es innerhalb der ersten Stunden der Inkubation zu einem schnellen Anstieg der Aktivität, bis eine Aktivität von 3, 90 U/g Enzympulver nach 24 Stunden Inkubation erhalten wurde. Dies entspricht einer 860 %igen Aktivitätssteigerung.
Stabilität gegen Druckerhöhung/Druckabfallschritten
Hierbei wurden die Enzyme vor jedem Druckabfall für 1 Stunde bei 150 bar und 350 behandelt.
Unmittelbar nachdem der Druck die atmosphärischen Werte wieder erreicht hatte, wurde erneut der Druck erhöht. Diese Druckerhöhungs/Druckabfall-Zyklen wurden 30 mal durchgeführt, wobei die Lipaseproben über Nacht bei 4 C gelagert wurden.
Die Ergebnisse der Tests bezüglich der Druckbeständigkeit von Schweinepankreaslipase sind in Fig. 1c dargestellt. Sogar nach mehreren Druckzyklen zeigte dieses Enzym eine Erhöhung der Aktivität bis zu einem Wert von 0, 88 U/g Enzympulver, was einer Aktivitätserhöhung von 191 % entspricht und dies, obwohl gemäss dem Stand der Technik derartige Druckänderungszyklen oft für massgebliche Aktivitätsverluste verantwortlich gemacht wurden (Kasche et al., Biotechnol. Lett. 10 (1988), S. 569-574). (So konnte bislang lediglich für a-Amylase bei Anwesenheit von Mikroorganismen eine geringfügige (21 und 35 %) Aktivitätssteigerung bei Behandlung mit überkritischem CO2 (200 Atmosphären, 2 Stunden, 35 C) beobachtet werden (Kamihira et al., Agric. Biol. Chem.
51 (1987), S. 407-412)).
Behandlung mit überkritischem CO2
Für die übrige Untersuchung der Erhöhung der Aktivität der Enzyme zu überkritischem Kohlendioxid (75 C/24h und 150 bar) wurden rund 500 mg von Enzym eingesetzt und in der üblichen Apparatur behandelt. Jedoch wurde das Enzym anstatt es in einem Papierfilter einzuwickeln in ein kleines Becherglas gegeben, das mittels Papierfilter (welcher mit Draht fixiert wurde) verschlossen war.
Tabelle 1
Steigerung der Aktivität von PPL (Fluka) durch Inkubation von 500 mg in überkritischem
EMI4.1
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EMI5.1
<tb>
<tb> Inkubationszeit <SEP> Aktivitätssteigerung <SEP> relative <SEP> Aktivität
<tb> [U/g] <SEP> [%]
<tb> unbehandeltes <SEP> Enzym <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> : <SEP> t <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> 335
<tb> 8 <SEP> 2, <SEP> 53 <SEP> :
<SEP> t <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 447
<tb> 24 <SEP> 3, <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 605
<tb> 50 <SEP> 3, <SEP> 40 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> 600 <SEP>
<tb>
Die Erhöhung der Aktivität von Schweinepankreaslipase ist in Tabelle 1 gezeigt, wobei das Enzympulver, das 24 Stunden bei 750C inkubiert wurde, die höchste Aktivitätssteigerung zeigte und in der weiteren Folge der Experimente als Vergleich zwischen behandelter und unbehandelter Schweinepankreaslipase herangezogen wurde. Es zeigte sich, dass keine weitere Erhöhung der Aktivität durch Verlängerung der Inkubationsdauer von 24 Stunden auf 50 Stunden erreicht werden konnte.
Mit dieser Resistenz gegen weitere Aktivitätssteigerungen mit dem erfindungsgemässen Verfahren unterscheiden sich erfindungsgemäss erhältliche Enzympräparationen von den im Stand der Technik geoffenbarten Präparationen.
Es wurden ähnliche Resultate erzielt, wenn das Experiment in einem 140 mi-Enzymreaktor, der sich in einem mit Wasser oder Diethylenglykol gefüllten Wasserbad befindet, oder in einem 300 mlExtraktor durchgeführt wurde. Die Behandlung von 500 mg Enzympulver für 24 Stunden bei 750C und 150 bar resultierte im Extraktor in 615 % Aktivitätssteigerung und im 140 ml-Enzymreaktor in einer 605 %-igen Aktivitätssteigerung. Die Aktivitätszunahme bleibt bei gleicher Lagerung, wie für die unbehandelten Enzyme von den Herstellern (Vertreibern) empfohlen, über mindestens 6 Monate erhalten.
Weiters wurde Schweinepankreaslipase für 24 Stunden bei 75 C in einem Trockner behandelt (mit Luft/Sauerstoff bei Atmosphärendruck), um die Möglichkeit auszuschalten, dass der erfinderische Effekt durch partielle thermale Umfaltung des Proteins herbeigeführt wird. Hierbei wurde nur eine geringe Erhöhung der Aktivität von 0, 57 U/g (unbehandelt) auf 0, 91 0, 09 U/g festgestellt (159, 7 % Aktivitätssteigerung bei Behandlung mit 750C im Trockenschrank) gegenüber der Aktivität nach Behandlung mit überkritischem CO2 (3, 4 U/g).
Bestimmung der Enzymaktivitäten
Nach der Behandlung mit überkritischem CO2 wurden die Filter, auf den sich die Enzympräparationen befanden, aus dem Enzymreaktor entfernt, in mit Drehverschlüssen verschliessbaren Plastikröhrchen verstaut und im Kühlschrank oder Gefrierschrank mindestens 12 Stunden vor der Analyse gelagert.
Beim Lipase-Assay wurden 100 ut einer Substratlösung (6 mg DGGR (1, 2-0-Dilauryl-racglycero-3-glutarsäure-resorufinester), aufgelöst in 12 ml einer 1-1 Mischung aus Dioxan und Thesit (10 % w/v) in destilliertem Wasser) zu 900 J der Enzymlösung (0, 1 M KH2P04, pH 6, 8, bei einer Enzymkonzentration von 0, 555 mg Lipase/mt) zugegeben. Die Zunahme der Absorption bei . =572 nm nach einer Wartezeit von 100 Sekunden wurde für die Messung der Enzymaktivitäten verwendet. Alle Absorptionsmessungen wurden bei 250C mit einem Shimadzu UV 160A-Spektrophotometer mit Lauda RM6-Temperaturkontrolle durchgeführt.
Eine Lipaseeinheit wurde als die Enzymaktivität, die pro min bei pH 6, 8 und 24 C 1, 0 Mol Resorufln aus DGGR freisetzt, definiert.
Proteinbestimmung
Zur Messung des Proteingehaltes wurde das Verfahren von Bradford (M. M. Bradford, Anal.
Biochem. 72 (1976), 248-254) verwendet. Hierbei wurde die Reagenslösung durch Auflösung von 100 mg SERVA Blau G in 50 ml 95 % Ethanol hergestellt. Nach Zugabe von 100 ml 85 %iger (w/v) H3P04 wurde die Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1 I verdünnt. Alle Testlösungen (und Rinderserumalbumin-Standardlösungen) wurden durch Auflösen der Proteine in 0, 15 M NaCI-Lösung hergestellt. 1 00 I der Standardlösungen (Proteinkonzentration 0, 1 - 1 mg/mi) und die Testlösungen (1 mg/mi) wurden mit 5 mi der Bradford-Reagenslösung vermischt und nach
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5 min die Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert bestimmt.
Für die eingesetzten Schweinepankreaslipasen wurden demgemäss ein Proteingehalt von 5, 7 : f : 0, 7 % (Serva) und 15, 3 i 0, 4 % (Fluka) festgestellt. Nach 24-stündiger Behandlung mit überkritischem CO2 bei 75 C und 150 bar wurde für die Lipase von Fluka ein Proteingehalt von 14, 9 0, 5 % festgestellt, wodurch sich ergibt, dass kein signifikanter Unterschied (p < 0, 05) des Proteingehaltes vor oder nach der Behandlung mit überkritischem CO2 eintritt, wodurch wiederum belegt wurde, dass die relative Aktivitätsänderung der Aktivität in Einheiten pro g Festsubstanz Identisch mit den Änderungen der spezifischen Aktivität in Units/g Protein ist.
Messung des Gewichtsverlustes
Zur Bestimmung des Gewichtsverlustes von Schweinepankreaslipase wurden rund 500 mg (siehe Tabelle 1) abgewogen in einem 25 ml-Becherglas mittels Papierfilter verschlossen. Dieses Becherglas wurde in einen vorgeheizten Extraktor (300 ml) gegeben und für 24 h bei 150 bar und 750C unter Verwendung eines Speed SFE-Instruments (Applied Separations) inkubiert. Das Becherglas und das Enzympulver wurden vor und unmittelbar nach der Behandlung mit überkritischem CO2 abgewogen. Der Extrakt wurde in einem Schott-Röhrchen, welches mit dem CO2-Aus- lass verbunden war, disengagiert. Vor und nach Druckabfall wurde das Röhrchen abgewogen. Nach Beendigung wurde der Extrakt bei-20 C in einem Gefrierschrank gelagert.
Tabelle 2
Gewichtsverlust von Lipase aus Schweinepankreas durch Behandlung mit überkritischen CO2
EMI6.1
<tb>
<tb> Gew. <SEP> Anteil <SEP> der <SEP> Röhrchen+Enzym <SEP> vor <SEP> Röhrchen+Enzym <SEP> nach <SEP> Gewichts- <SEP> Extrakt <SEP>
<tb> eingesetzten <SEP> Behandlung <SEP> mit <SEP> Behandlung <SEP> mit <SEP> über-verlust <SEP>
<tb> Lipase <SEP> uberkritischem <SEP> CO2 <SEP> kritischem <SEP> CO2
<tb> 498,0 <SEP> mg <SEP> 13,7710 <SEP> g <SEP> 13,7503 <SEP> g <SEP> 20,7 <SEP> mg <SEP> 1,2 <SEP> mg
<tb> (4,2%*)
<tb> 504, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 13, <SEP> 4615 <SEP> g <SEP> 13, <SEP> 4432 <SEP> g <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP> mg <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> mg <SEP>
<tb> (4, <SEP> 1%*)
<tb> 519, <SEP> 9mg <SEP> 24, <SEP> 9536g <SEP> 24, <SEP> 9243g <SEP> 29, <SEP> 3mg <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP>
<tb> (5.
<SEP> 6%*) <SEP>
<tb>
* Relativer Gewichtsverlust in %, bezogen auf die Einwaage (Die Bestimmung des gewichtsverlustes wurde sofort nach der Entspannung durchgeführt).
In Tabelle 2 ist der Gewichtsverlust von Schweinepankreaslipase nach Behandlung mit trockenem überkritischen CO2 von drei Extraktionen mit rund 500 mg Enzympulver angeführt. Ein mittlerer Gewichtsverlust von 4, 6 : ! : 0, 8 % (durch mehrminütiges Aussetzen an Luftfeuchtigkeit aber sinkt dieser Wert wieder) konnte beobachtet werden. Im Glasröhrchen, das mit dem Auslass verbunden war, wurden nur 0, 47 0, 28 % des Extraktes gefunden. Durch Verwendung eines Feuchtigkeitsanalysators (Sartorius MA30-Feuchtigkeitsanalysator) konnte ein Gewichtsverlust (Feuchtigkeitsgehalt) von 4, 99 % für die unbehandelte Lipase (Literaturwert : 5, 5 % gemäss Karl-Fischer-Titration), und nur 3, 13 % für die mit kritischem CO2 behandelte Lipase festgestellt werden.
Damit wurde gezeigt, dass der Lipasepräparation durch Behandlung mit überkritischem CO2 Feuchtigkeit entzogen wurde.
Extrakt-Analyse
Die Analyse der Veresterung bei freien Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern (FAME) wurde mittels BFs/MeOH als Veresterungsreagens mit geringfügigen Änderungen gegenüber der von Sattler et al. für Lipoproteinextrakte beschriebenen Methode durchgeführt (Anal. Biochem. 198 (1991), 184-190). Zum Extrakt wurden 0,5 mi Toluol und 1, 0 ml BF3/MeOH zugegeben und die
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Veresterung bei 1100C 90 min lang in verschraubbaren Röhrchen mit Teflondichtung in einem Trockner durchgeführt. Nach Abkühlung wurden 2 mi destilliertes Wasser zugegeben und dreimal mit n-Hexan (3 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffstrom getrocknet und in 300 ml Methylenchlorid aufgenommen und der Gaschromatographieanalyse zugeführt.
Die Ester wurden auf einer 60 m x 0, 323 mm i. d. DB-WAX-Säule (J. & W. Scientific) mit einer Filmdicke von 0, 5) im chromatographiert. Die Analyse wurde mit einem Hewlett-Packard HP5890 Series it-Chromatographen mit temperaturkontrolliertem Autosampler (2 C) und einem Flammenionisierungsdetektor (FID/Detektortemperatur 300 C) durchgeführt. Wasserstoff wurde als Carriergas mit einer Flussrate von 0, 934 ml/min verwendet Das folgende Temperaturprogramm wurde verwendet : 2100C (4 min), 210-240 C (5 C pro min) und 240 C.
Nach der Derivatisierung, wie für die Analyse der freien Fettsäuren verwendet, wurden im Extrakt die in Tabelle 3 aufgelisteten Fettsäuren identifiziert.
Tabelle 3
Fettsäureanalyse des PPL-Extraktes, analysiert mittels Gaschromatographie
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<tb>
<tb> Freie <SEP> Fettsäureretative <SEP> Peakf <SEP> ! <SEP> äche <SEP>
<tb> Myristinsäure <SEP> (C14 <SEP> : <SEP> 0) <SEP> 3, <SEP> 3% <SEP>
<tb> Palmitinsäure <SEP> (C16 <SEP> : <SEP> 0) <SEP> 35, <SEP> 3 <SEP> % <SEP>
<tb> Palmitoleinsäure <SEP> (C16 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> 1, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Stearinsäure <SEP> (C18 <SEP> : <SEP> 0) <SEP> 23, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Oleinsäure <SEP> (C18 <SEP> 1) <SEP> 18, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Linolsäure <SEP> (C18 <SEP> :
<SEP> 2) <SEP> 3, <SEP> 6% <SEP>
<tb> relative <SEP> Fläche <SEP> aller <SEP> identifi-85, <SEP> 9 <SEP> % <SEP>
<tb> relative <SEP> Fläche <SEP> aller <SEP> identifi- <SEP> 85,9%
<tb> zierter <SEP> Peaks
<tb>
Die gesamte Peakfläche während einer Retentionszeit von 16 min wurde als 100 % festgesetzt.
Als Hauptkomponenten konnten Palmitinsäure, Stearinsäure und Oleinsäure festgestellt werden. Damit konnte auch gezeigt werden, dass durch Behandlung mit überkritischem Kohlendioxid Fettsäureverunreinigungen zumindest verringert werden können.
Weiters wurden Untersuchungen bezüglich der Disulfidbrücken (durch gemäss Ellman, Arch Biochem. Biophys. 82 (1959) 70-77), der freien Aminogruppen (Lysine) (gemäss Kakade et al., Anal. Biochem. 27 (1969), 273-280), des Carbonylgehaltes (Fields et al., Biochem. J. 121 (1971), 587-589) und der Tryptophanfluoreszenz (Emissionsspektrum bei 300C mit einem Perkin-Elmer LS50 B-Spektrofluorimeter, Anregungen durch 280 nm, Emission durch 300-420 nm, Anre- gung/Emissionsschlitz 3 nm, Scangeschwindigkelt 100 nm/min) durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit überkritischem CO2 zu keiner Veränderung der Anzahl der Disulfidbrücken, der Anzahl an Lysinen und der Tryptophanfluoreszenzemission führte und keine Zunahme an Carbonylgruppen als etwaiges Resultat oxidativer Änderungen auftrat.