AT409962B - Protein atsrp30 mit einer spleissfaktoraktivität in pflanzen - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft Proteine mit Spleissfaktoraktivität in Pflanzen. 



   Alternatives pre-mRNA-Spleissen ist Teil des Expressionsprogramms einer grossen Anzahl von Genen bei Tieren und Pflanzen Es ermöglicht die Auswahl verschiedener Kombinationen von Spleissstellen innerhalb einer vorgegebenen pre-mRNA, wodurch strukturell und funktionell ver- schiedene Protein-Isoformen gebildet werden (Breitbart et al. 1987 ; Manley und Tacke 1996; Cäceres und Krainer 1997). Es sind mehrere Protemfaktoren beschrieben worden, die an der Re- gulierung des alternativen Spleissens beteiligt sind, einschliesslich einer Familie von RNA-bindenden Proteinen mit Arginin/Serin-reichen Regionen (SR-Proteine) (für eine Ubersicht, siehe Fu 1995, Chabot 1996; Valcarcel und Green 1996; Cäceres und Krainer 1997).

   SR-Proteine sind hoch konservierte nukleare Phosphoproteine, die Mitglieder einer Proteinfamilie sind und ein Serin- Phospho-Epitop gemeinsam haben, das vom monoklonalen Antikörper mAb104 erkannt wird (Roth et al. 1991).Sie bestehen aus mindestens einer RNA-bindenden Domäne (RBD) [die typische RBD- oder RNA-Erkennungsmotiv- (RRM-) Domäne von etwa 80 Aminosäuren] (Birney et al. 1993) und besitzen mehrere Serin/Arginin- (SR-) Dipeptide in der Nähe der Carboxy-Enden (Zahler et al. 



  1992) Im Allgemeinen sind SR-Proteine eine definierte Untergruppe einer grossen Überfamilie von Nuklearproteinen mit RS-reichen Domänen variabler Sequenz und Position (Fu 1995). 



   Der menschliche SF2/ASF-Spleissfaktor, ein Prototyp eines SR-Proteins, ist essentiell für den ersten Spaltungsschritt beim pre-mRNA-Spleissen (Krainer et al. 1990b; Ge et al. 1991) und kann auch konzentrationsabhängig bestimmen, welche 5'-Spleissstelle in pre-mRNAs mit alternativen Stellen gewählt wird (Ge und Manley 1990 ; Krainer et al. 1990a) Der bevorzugten Verwendung der proximalen 5'-Spleissstelle bei höheren Konzentrationen von SF2/ASF wird von Mitgliedern der hnRNP A/B-Proteinfamilie entgegengewirkt (Mayeda und Krainer 1992 ; Mayeda et al. 1994), was darauf hinweist, dass die relative Haufigkeit dieser und möglicher anderer antagonistischer Spleiss- faktoren die Muster des alternativen Spleissens in vitro und in vivo bestimmt (Mayeda und Krainer 1992, Cäceres et al. 1994 ; Yang et al. 1994, Wang und Manley 1995 ; Hanamura et al. 1998). 



  SF2/ASF und jedes andere SR-Protein kann S 100-Extrakte mit Spleissdefizit komplementieren, denen SR-Proteine im Wesentlichen fehlen, aber einzelne SR-Proteine zeigen manchmal distinkte Spezifitat und Effizienz beim Spleissen verschiedener pre-mRNAs (Krainer et al. 1990b; Ge et al   1991 ; Fu und Maniatis 1992; Kim et al. 1992, Mayeda et al. 1992 ; Fu 1993 ; et al 1993,   Screaton et al. 1995, Wang und Manley 1995). Eine wichtige Aktivität von SF2/ASF und anderen SR-Proteinen ist weiters die Wechselwirkung mit exonischen Verstärker-Sequenzen, die die Ver- wendung einer benachbarten, schwachen Spleissstelle stimulieren (Sun et al. 1993 ; Tian und   Maniatis 1993 ; Staknis und Reed 1994 ; et al. 1995 ; Tacke und Manley 1995, Lou   et al. 1996).

   Die RNA-bindende Spezifizität wird einem SR-Protein durch die RRM-Region und be- nachbarte Sequenzen verliehen (Cäceres und Krainer 1993 ; Zuo und Manley 1993 ; Tacke und   Manley 1995 ; Allain und Howe 1997 ; et al 1997); die verschiedenen RS-Domänen sind in   erster Linie für Protein-Protein-Wechselwirkungen verantwortlich, die durch den Phosphorylie-   rungsstatus dieser Regionen moduliert werden (Wu und Maniatis 1993 ; et al. 1994 ; Kohtz   et al 1994 ; Zuo und Maniatis 1996, Xiao und Manley 1997).

   Ausserdem ist gezeigt worden, dass RS-Domanen die RNA-Bindungsaktivität und die subnukleare Lokalisierung von SR-Protemen modulieren (Li und Bingham 1991; Hedley et al. 1995; Cäceres et al. 1997) In jungster Zeit ist gezeigt worden, dass sich SF2/ASF, SRp20 und 9G8 zwischen dem Nukleus und dem Cytoplasma hin- und herbewegen, und diese Eigenschaft hängt vom Vorhandensein und vom Typ der RS- Domäne ab (Cäceres et al. 1998). 



   Die oben beschriebenen Untersuchungen führten zur Behauptung, dass SR-Proteine wirken könnten, indem sie Spleissstellen durch RNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen über- brücken und so frühe Wechselwirkungen für die Spleissstellen definition und für die Zusammen- stellung von   Spliceosomen   etablieren Diese Wechselwirkungen werden durch das Binden von SR- Proteinen an nahe Verstarkersequenzen stimuliert und durch die Phosphorylierung/Dephosphory- lierung der RS-Regionen moduliert. 



   Es gibt beschränkte Informationen über die Regulierung der SR-Proteinexpression in vivo. Bei SF2/ASF und SRp20 sind bei verschiedenen Zelltypen und Geweben signifikante Unterschiede m mRNA und Proteinwerten beobachtet worden (Jumaa et al. 1997 ; Hanamura et al. 1998). Die SC35-Expression ist in Zellinien ebenfalls sehr variabel (Fu und Maniatis 1992 ; Vellard et al 1992), und einige SR-Proteine werden von Mitogenen aktiviert (Diamond et al 1993 ; Screaton 

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 et al. 1995). Interessanterweise sind einige alternativ gespleisste SR-Protein-mRNAs beschrieben worden, die für verkürzte Proteine mit noch unbekannter Funktion codieren (Ge et al. 1991, Cava- loc et al. 1994 ; Screaton et al. 1995 ; Jumaa et al. 1997).

   Menschliches SRp20 reguliert seine Expression auf der Ebene des Spleissens selbst, indem es an seine eigene pre-mRNA bindet und so eine Überexpression des aktiven Proteins verhindert (Jumaa und Nielsen 1997). Vor kurzem ist gefunden worden, dass die Mengen alternativ gespleisster mRNAs in Caenorhabditis elegans, die für SRp30b und SRp20 codieren, zumindest teilweise auf der Ebene der mRNA-Stabilität reguliert werden können (Morrison et al 1997). 



   Bislang wurde in Organismen, die ein dem humanen SF2/ASF-Protein entsprechendes Protein aufweisen, nur jeweils eine Variante dieses Proteins gefunden. 



   Über die Mechanismen der Intronexzision in Pflanzenzellen ist nur wenig bekannt. Es wird all- gemein angenommen, dass der Grundmechanismus des Spleissens bei Pflanzen dem bei Hefe und Säugetieren ähnlich ist (Solymosy und Pollak 1993 ; Luehrsen et al. 1994 ; Filipowicz et al. 1995 ; Brown und Simpson 1998). Trotzdem werden in keinem bisher untersuchten Pflanzengewebe tieri- sche Introns prozessiert (Barta et al. 1986; Van Santen und Spritz 1987; Wiebauer et al. 1988). 



  Offensichtlich ist das Verfahren der Intronerkennung in diesen beiden Gebieten unterschiedlich. 



  Eines der entscheidenden Merkmale von Introns in Pflanzen scheint ein U- oder AU-reicher Cha- rakter zu sein, während die Exons eher GC-reich sind (für eine Übersicht, siehe Brown und Simp- son 1998). Da SR-Proteine bei Säugetieren bei der Auswahl der richtigen Spleissstelle eine kriti- sche Rolle spielen, ist es interessant, die korrespondierende Proteinfamilie bei Pflanzen zu charak- terisieren. Bei der Suche nach ähnlichen Proteinen in Pflanzen unter Verwendung von mAb104- Antikörper oder einen spezifischen monoklonalen Antikörper, der gegen menschliches SF2/ASF gezüchtet worden war, konnte gezeigt werden, dass Pflanzen sehr wohl SR-Proteine einschliesslich SF2/ASF-ähnliche Proteine besitzen (Lopato et al. 1996a). Die pflanzlichen SR-Proteine sind jedoch von unterschiedlicher Grösse und sind kleiner als 55 kD.

   Es konnte weiters gezeigt werden, dass pflanzliche SR-Proteine beim konstitutiven und alternativen Spleissen aktiv sind, wenn sie in heterologen HeLa-Zellextrakten untersucht werden. 



   Beim Versuch, einzelne pflanzliche Spleissfaktoren zu isolieren, wurden Arginin/Serin-reiche Proteine von Arabidopsis charakterisiert, die zu zwei verschiedenen Familien gehören (Lopato et al 1996b ; 1999). Beide Familien weisen eine gute Homologie mit tierischen SR-Proteinen im Amino-terminalen RRM auf, ihre Carboxy-terminalen Domänen sind jedoch reicher an Arginin als an Serin, weisen wenige SR-Dipeptide auf, und daher wurden sie als RS-Proteine bezeichnet. 



  Trotzdem werden diese Proteine vom mAb104-Antikörper erkannt und können HeLa S100-Extrak- te, denen SR-Protein fehlt, effizient komplementieren. 



   In Arabidopsis thaliana konnte ein Protein mit Ähnlichkeit zum humanen   SF2/ASF-Protem   iden- tifiziert werden (Lazar et al., 1995), das unter der Bezeichnung SR1, atSRp34 oder atSRp34/SR1 bekannt ist. 



   Die Beeinflussung des Spleissprozesses bei Pflanzen stellt eine der Möglichkeiten dar, um zu verbesserten Pflanzen zu kommen. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher im zur Ver- fügung stellen von neuen pflanzlichen Spleissfaktoren, die im Rahmen der Biotechnologie verwen- det werden können. 



   Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Protein mit einer atSRp30-Spleissfaktor- Aktivität in Pflanzen, welches bei Uberexpression zu einer trunkierten mRNA-Isoform eines atSRP34/SR1-Proteins führt, wobei das Protein mit atSRp30-Spleissfaktor-Aktivität - die Aminosäuresequenz des Proteins gemäss Seq.ID.No 19 aufweist, oder - zumindest 90 % Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des 
Proteins gemäss Seq ID.No. 19 aufweist, oder - das dem in Seq ID.No. 19 entsprechende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabidopsis thaliana entspricht 
Das erfindungsgemässe Protein zeichnet sich bevorzugter Weise dadurch aus, dass es die Se- quenz der Aminosäuren 1 bis 4,7 bis 19,22 bis 72, 74 bis 85,96 bis 141,149 bis 153,156 bis 172, wobei Aminosäure 168 variabel, jedoch nicht Asp oder Asn ist, des Proteins gemäss Seq.ID No. 19 aufweist.

   Die angegebenen hochkonservierten Sequenzen sind vorzugsweise derart ange- 

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 ordnet, dass die Abstände in etwa zwischen den benannten Sequenzen denjenigen gemäss 
Seq.ID.No. 19 entsprechen, wobei vorteilhafterweise nicht mehr als 5 Aminosäuredeletionen oder Aminosauremsertionen vorgesehen werden. Besonders bevorzugt sind Sequenzen, bei welchen entweder keine oder nur eine einzige Deletion oder Insertion zwischen den konservierten Sequenzen vorhanden ist 
Das erfindungsgemässe Protein kann gegenüber dem in Seq.ID.No. 19 gezeigten Protein ein oder mehrere Aminosauresubstitutionen aufweisen, solange die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 
7 bis 19, 45 bis 52, 111 bis 116 und 149 bis 153 des Proteins gemäss Seq.ID.No 19 oder die Funk- tion des Proteins als atSRp30-Spleissfaktor nicht betroffen ist.

   Die Funktion als Spleissfaktor ist dann als betroffen, anzusehen, wenn das Protein beispielsweise nur mehr 10 bis 20 % der natürlichen atSRp30-Aktivität des Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 beträgt. 



   Aminosäuresubstitutionen können insbesondere im Bereich der nicht als konserviert markierten Aminosauren in Fig.2 vorgesehen werden, insbesondere dann, wenn sie die dreidimensionale Struktur oder die Ladungsverteilung des Proteins nicht wesentlich beeinflussen. In diesen Regio- nen ist beispielsweise der Austausch von hydrophoben Aminosäuren untereinander oder der Aus- tausch von aromatischen Aminosäuren untereinander möglich, wenn dadurch die natürliche   Aktivi-   tat nicht verlorengeht. 



   Erfindungsgemäss bevorzugt sind alle Proteine, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die zu- mindest 90 % Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäss Seq ID.No. 19 aufweist. 



   Besonders bevorzugt sind Proteine, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die zumindest 95 %, insbesondere zumindest 98 %, Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 aufweist. 



   Mit den erfindungsgemässen Proteinen konnte erstmalig in einem Organismus ein zweites SF2/ASF-ähnliches Protein gefunden werden (neben atSRp34/SR1), womit sich die Möglichkeit einer kombinierten Beeinflussung des Spleissprozesses ergibt. In den Beispielen ist gezeigt, dass die beiden Proteine eine gegenseitige Beeinflussung des Spleissprozesses aber auch eine Wirkung auf andere Proteine zeigen, die darüberhinaus bei entsprechender genetischer Kontrolle m uberra- schenden Möglichkeiten der Veränderung der Spleisseigenschaften der Pflanze oder der Pflanzen- zelle resultiert 
Die S-reiche Sequenz zwischen Aminosäure 95 und 102 der Sequenz gemäss Seq.ID.No 19 enthält vorzugsweise mindestens 4, insbesondere mindestens 7, Serinreste. Vorteilhafterweise ist sie G-frei, insbesondere frei von GGR oder GGR-Repeats. 



   Das erfindungsgemässe Protein kann durch Standard-Methoden der Molekularbiologie bedingt durch die hohe Homologie derartiger Proteine auch aus anderen Pflanzen zur Verfügung gestellt werden, etwa durch PCR-gekoppelte Klonierungsmethoden oder durch sonstiges Screenen von Genbibliotheken beispielsweise mit der Sequenz gemäss Seq.ID.No. 19. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die entweder - eine Nukleinsäuresequenz gemäss Seq.ID.No. 18 umfassen oder - eine   Nukleinsäuresequenz   umfassen, die für ein erfindungsgemässes Protein kodiert oder - eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die unter stnngenten Bedingungen an das   Nuklem-   sauremolekül gemäss Seq.ID.No. 18 bindet und für ein in Pflanzen aktives Spleissprotein ko- diert oder dazu komplementär ist. 



   Unter stnngenten Bedingungen wird beispielsweise das Hybridisieren in 7 % SDS, 0,5 M Na- P04, pH 7,0,1 mM EDTA bei 50 C mit anschliessender Waschung mit 3 % SDS verstanden. 



   Diese Moleküle können sowohl DNS- als auch RNS-Moleküle sein. Im Falle von RNS-Mole-   külen   stellen die alternativ gespleissten Formen, insbesondere diejenigen, wie sie in den Beispielen beschrieben werden, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. 



   Gegenstand der Erfindung ist auch ein biologisch funktioneller Vektor, welcher dadurch ge- kennzeichnet ist, dass er ein erfindungsgemässes Nukleinsäuremolekül umfasst. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung weiters ein System, umfassend eine Nuk- leinsäure, die fur ein erfindungsgemässes Protein kodiert, und eine Nukleinsäure, die - für das atSRp34/SR1-Protein aus Arabidopsis thaliana oder - für das dem in Seq.ID.No. 20 entsprechende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabi- 

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 dopsis thaliana kodiert, wobei mindestens eine der Nukleinsäuren unter Kontrolle eines nicht natürlicherweise mit diesen Nukleinsäuren verbundenen Promotors steht. 



   Unter von atSRp34/SR1 abgeleiteten Proteinen sind auch diejenigen Proteine zu verstehen, die diese Proteine ausgehend von dem in Seq.ID No. 20 dargestellten Protein in analoger Weise definieren. 



   Vorzugsweise werden beide Nukleinsäuren von Promotoren kontrolliert, die nicht natürlicher- weise mit diesen Nukleinsäuren verbunden sind. 



   Bevorzugterweise ist zumindest einer der Promotoren, unter deren Kontrolle die Nukleinsäuren stehen, ein induzierbarer Promotor. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht die Nukleinsau- re, die für ein erfindungsgemässes Protein kodiert, unter Kontrolle eines Promotors, der eine Über- expression dieses Proteins bewirkt. 



   Vorzugsweise steht die Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemässes Protein kodiert, unter Kontrolle eines Promotors, der unter definierten Bedingungen die Expression dieses Proteins unterbindet und unter definierten anderen Bedingungen die Expression dieses Proteins ermöglicht. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemässes Protein exprimieren und ein erfindungsgemässes Nuk- leinsäuremolekül, einen erfindungsgemässen Vektor oder ein erfindungsgemässes System umfas- sen. 



   Weiters betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemässen Proteins, einer erfindungsgemässen Nukleinsäure, eines erfindungsgemässen Vektors oder eines erfindungs- gemässen Systems zur Veränderung der Spleisseigenschaften einer Pflanzenzelle oder einer Pflan- ze 
Weiters können die erfindungsgemässen Gegenstände zur Veränderung des Entwicklungsver- haltens einer Pflanze verwendet werden. 



   Ein besonderer Aspekt liegt dabei bei der Verwendung zur Verzögerung des Blütenansatzes von Pflanzen. 



   Erfindungsgemäss hat sich gezeigt, dass mit dieser Verwendung eine Verzögerung des Blüten- ansatzes einer Pflanze gegenüber dem Wildtyp von zumindest 15 %, vorzugsweise von zumindest 25 %, herbeigeführt werden kann, beispielsweise wenn das erfindungsgemässe Protein unter die Kontrolle eines starken Promotors gestellt wird. 



   Besonders bevorzugte Pflanzen stellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung die wirtschaftli- chen Nutzpflanzen dar, wie Getreide, Bohnen, Reis oder Obstpflanzen. 



   Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren näher er- läutert, ohne dass sie jedoch auf diese eingeschränkt werden soll. 



   Es zeigen:   Fig. 1A: Genomsequenz von atSRp30 ; und Intronsequenzen sind in Kleinbuchsta-   ben, cDNA-Sequenzen sind in Grossbuchstaben angegeben, und die TATA-Box in fetter Kursiv- schrift. Die abgeleitete Proteinsequenz ist unter der DNA im Einbuchstaben-Code angegeben. Die fett gedruckte Sequenz im zehnten Intron ist in alternativ gespleissten mRNAs enthalten, und die unterstrichene Sequenz ist enthalten, wenn beide kryptischen 3'- und 5'-Spleissstellen verwendet werden. Die konservierten RNP-Submotive beider RRMs sind in einem Kästchen dargestellt. Die offenen Pfeile markieren die Enden von Promotorsequenzen, die für Expressionsstudien verwen- det wurden. Durchgehende horizontale Pfeile zeigen die Enden des PCR-Produkts an, das mit degenerierten Primern erhalten und als Sonde für das Screenen der Bibliothek verwendet wurde. 



    (#)   Das Ende des GatSRp30-Klons Die Sequenzdaten des atSRp30-Gens wurden der EMBL-Da- tenbank eingegeben (Zugangsnummer   AJ131214).   



   Fig. 1B: Schematische Darstellung von GatSRp30, seiner mRNA-Isoformen, und abgeleiteter Proteine. Exons sind als Kastchen und Introns als Linien dargestellt (fette Linien- Introns, die in den alternativ gespleissten mRNAs enthalten sind). Exonische 5'- und 3'-unübersetzte Regionen sind grau schattiert, und die codierenden Regionen sind schwarz. (*) Das neue Stopkodon in den alter- nativ gespleissten Produkten. 



   Fig. 1C: Schematische Darstellung von GatSRp34, seiner mRNA-Isoformen und abgeleiteter Proteine. Die Zeichnungen sind wie in B (Zugangsnummer AF001035). 

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   Fig. 1D: Genomische Teilsequenz von atSRp34/SR1, beginnend mit Exon 10 bis zum Stop- kodon Die fett gedruckte Sequenz im langen Intron ist in alternativ gespleissten mRNAs enthalten, die unterstrichene Sequenz ist enthalten, wenn beide kryptischen 3'- und 5'-Spleissstellen verwen- det werden. 



   Fig. 2: Aufreihung von Arabidopsis atSRp30, atSRp34/SR1 und menschlichen SF2/ASF Pro- teinsequenzen (einfarbiger Bereich). Positionen, in denen ein einzelnder Rest in mindestens zwei der Sequenzen vorkommt (schattierte Bereiche) Konservative Substitutionen, wie RK, IVL, ED, FY, ST. Die Positionen des konservierten RNP-1- und RNP-2-Submotivs und die glycinreiche Re- gion sind angegeben. 



   Fig. 3: Expression von atSRp30 und atSRp34/SR1 in Arabidopsis thaliana vom Wildtyp. (A) Expression in verschiedenen Pflanzengeweben. Northern Blot-Analysen von Poly(A)+RNA von Blättern (L), Stängeln (S), Wurzeln (R) und Blüten (F) sind gezeigt. Ein Mikrogramm RNA wurde pro Spur geladen, und die Blots wurden entweder mit einer Sonde, die dem zehnten Intron von GatSRp30 entspricht, oder mit den cDNAs von atSRp30 oder atSRp34/SR1 sondiert. (B, C) Ent-   wicklungsmässige   Expression von atSRp30. Gesamt-RNA wurde an verschiedenen Tagen wahrend der Entwicklung, angefangen vom Tag der Keimung, aus der ganzen Pflanzen isoliert. Die RNA wurde entweder für die Northern Blot-Analyse mit 10 ug/ Spur Gesamt-RNA verwendet und die Membran mit atSRp30 cDNA sondiert (B), oder sie wurde für die Analyse der RT-PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegel verwendet (C).

   Die beiden Primer für die PCR-Reaktion befanden sich in den Exons neben dem zehnten Intron. 



   Fig. 4: Immunnachweis von phosphorylierten und dephosphorylierten SR-Protemen von Zell- kulturen von Arabidopsis. (A) Immunnachweis von Proteinen in SR-Proteinpräparationen (Spuren 1 bis 4) (Spur 1) Monoklonaler Antikörper mAb104, der für ein gemeinsames Phosphoepitop von SR-Protemen spezifisch ist; (Spur 2) Polyklonaler Antikörper, gezüchtet gegen rekombinantes atSRp30; (Spur 3) Polyklonaler Antikörper, gezüchtet gegen rekombinantes atSRp34/SR1 ;    4) Monoklonaler Antikörper, spezifisch für menschliches SF2/ASP. Proteinmarker sind an der lin-   ken Seite angegeben.

   (B, C) Dephosphorylierung von SR-Proteinen mit alkalischer Phosphatase    (Spuren 1,2) SR-Proteine, inkubiert bei 37 C ohne Enzym für 0 bzw 24 Stunden ; 3,4) SR-Proteine, inkubiert mit 0,2 und 1,0 EH/ul Enzym für 3 Stunden ; 5,6) SR-Proteme,   inkubiert mit 1,0 und 2,0 EH/ul Enzym für 24 Stunden. Proteine wurden entweder mit anti-p30 (B) oder anti-p34 (C) sondiert. 



   Fig. 5: Transkriptionsanalyse von atSRp30 (A-D) und atSRp34/SR1 (E-H) Promotor-GUS- Fusionen in transgener Arabidopsis. GUS-Färbung von (A, E) Blüten im Stadium nach der Blute, (B, F) Färbemuster in den Blättern, (C, G) pnmäre und sich entwickelnde Lateralwurzeln; (D, H) Setzlinge (2 Tage nach dem Keimen). 



   Fig. 6: Überexpression von atSRp30 in transgenen Arabidopsis-Pflanzen Die cDNA und die genomischen Sequenzen von atSRp30 wurden unter der Kontrolle des starken 35S CaMV-Pro- motors (Konstrukte pC30 bzw. pG30) kloniert und verwendet, um Arabidopsis-Pflanzen zu trans- formieren (A) Northern Blot-Analyse von Gesamt-RNA, isoliert von unabhängigen transgenen Lini- en, sondiert mit atSRp30 cDNA. (Spuren 1 bis 4) mit dem pG30-Konstrukt transformierte Pflanzen,    (Spuren 5 bis 9) mit pC30 transformierte Pflanzen ; 10) mit pB1121 (35S CaMV-GUS-Kon-   strukt) transformierte Kontrollpflanzen. mRNA-Isoformen sind angegeben (B) RT-PCR-Analyse der gleichen transgenen Linien. Die verwendeten Primer sind mit Pfeilen im Diagramm von GatSRp30 angegeben (Spur 10) In diese Kontrollspur wurde 4 Mal mehr Material geladen.

   (C) Immundetek- tion von atSRp30 in Gesamtproteinextrakten von überexprimierenden transgenen Pflanzen. (Spur 1) SR-Proteinpräparationen von Arabidopsis-Zellkultur (Wildtyp); (Spur 2) mit pG30 transformierte Linie ; (Spuren 3 bis 7) mit pC30 transformierte Linien ; (Spur 8) pC30-transgene Linie, die mRNA1 nicht überexprimiert. Gegen atSRp30 (anti-p30) gezüchteter Antikörper wurde für den Immun- nachweis verwendet. 



    Fig. 7 : des Phänotyps bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren. (A) Pflan-   zen, die atSRp30 überexprimieren; (B) Pflanzen vom Wildtyp; (C) atSRp30   überexpnmierende   Pflanzen, die unter   Kurztagbedmgungen   gezüchtet wurden, zeigen keine   apikaie   Dominanz, was zu einem buschigen Phanotyp führt   Fig. 8 : des alternativen Spleissmusters von atSRp31 und U1-70K in Pflanzen,   die atSRp30 überexprimieren Die relevanten alternativen Spleissereignisse sind in den Diagram- 

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 men oben dargestellt. RT-PCR erfolgte unter Verwendung von Primern (mit Pfeilen markiert), die von den benachbarten Exons abgeleitet wurden. (A) Veränderungen im Spleissen des zweiten Introns von GatRSp31.

   (Spur 1) mit   pB1121   (35SCaMV-GUS-Konstrukt) transformierte Kontrolllinie,   (Spuren 2 bis 5) mit pG30-Konstrukt transformierte Linien ; 6 bis 10) mit pC30 transformier-   te Linien (B) Korrekt gespleisste mRNA, die für das U1-70K-Protein codiert, wird bei der Überex- pression von atSRp30 erzeugt. (Spur 1) mit   pB1121   (35SCaMV-GUS-Konstrukt) transformierte Kontrollpflanze, (Spuren 2,3) mit dem pG30-Konstrukt transformierte Linien, (Spuren 4 bis 8) mit pC30 transformierte Pflanzen; (Spur 9) transgene pC30-Kontrollpflanze, die mRNA1 nicht über expnmiert; (Spur 10) 19 Tage alte Pflanze vom Wildtyp. 



   Fig.9: Veränderungen des Expressionsmusters von atSRp34/SR1 bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren. (A) Bevorzugte Verwendung einer alternativen 5'-Spleissstelle im elften Intron von atSRp34/SR1. Das Gen, die relevanten alternativen   Spleissereignisse   und die abgeleite- ten Proteine sind oben dargestellt, wobei das Gel RT-PCR-Produkte zeigt, die mit Primern von den benachbarten Exons erhalten wurden. (Spur 1) Kontrolle, nicht transformierte Pflanze vom Wildtyp; (Spuren 2 bis 5) mit dem pG30-Konstrukt transformierte Linien, (Spuren 6 bis 11) mit pC30 trans-   formierte Pflanzen ; 11) transgene pC30 Kontrollpflanze, die mRNA1 nicht uberexprimiert. (B)   Immunnachweis von atSRp34 und atSRp34s in Gesamtproteinextrakten von transgenen Pflanzen. 



  (Spuren 1, 2) von Arabidopsis-Pflanzen bzw. Zellkultur-isolierte SR-Proteinpräparationen ; (Spur 3) mit pC30 transformierte Kontrollpflanze, die mRNA1 nicht überexprimiert; (Spur 4) mit pC30 trans-   formierte Linie ; 5) mit dem pG30-Konstrukt transformierte Linie. Anti-p34-Antikörper wurden   für den Immunnachweis verwendet 
Beispiele: 
MATERIALIEN UND METHODEN 
Reinigung von SR-Proteinen und Proteinsequenzierung 
Die Reinigung der SR-Proteine wurde vorher beschrieben (Lopato et al. 1996a). Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach dem Färben mit Coomassie-G wurden die Protein- bande herausgeschnitten und einem In-Gel-Verdau mit Lys-C-Endopeptidase unterworfen. Die resultierenden Peptide wurden mittels HPLC aufgetrennt und mit Hilfe des automatisierten Edman- Abbaus sequenziert, wie früher beschrieben (Wang et al. 1996). 



   Isolierung und Sequenzierung von genomischer DNA und cDNA von atSRp30 und atSRp34/SR 
Die Gesamt-DNA von Karotte, Tabak und Arabidopsis wurde mit dem Cetyltrimethylammoni- umbromid (CTAB) -Verfahren isoliert (Murray und Thompson 1980). Der am meisten konservierte Teil des sequenzierten Peptids YVGNLPGDI wurde verwendet, um zwei degenenerte Vorwärts- Primer zusammenzustellen. Zwei reverse degenerierte Primer wurden von der Peptidsequenz SWQDLKDHM abgeleitet, die auch Teil eines sequenzierten Peptids war. Alle vier Kombinationen von degenerierten Primern wurden in PCR-Reaktionen mit genomischer DNA von verschiedenen Pflanzen als Templat verwendet. PCR-Produkte wurden subkloniert und sequenziert. Das PCR- Produkt von Arabidopsis wurden als Sonde für das Screenen einer genomischen   #ZAP11   Bibliothek von A. thaliana var. Columbia (Stratagene) verwendet.

   Ein positiver Klon, GatSRp30, wurde gefun- den, vermessen, subkloniert und sequenziert (EMBL-Zugangsnummer AJ131214). Eine teilweise cDNA-Sequenz wurde mit einer BLAST-Suche durch die EST-Datenbanken mit der Zugangsnum- mer R65514,4018 Arabidopsis thaliana cDNA Klon 17J1T7 gefunden und vom Arabidopsis Biolo- gical Resource Center an der Ohio State University freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Sequenzhomologie wurde unter Verwendung des Sequenzanalyse-Softwarepaketes Version 7.1- UNIX von Genetics Computer Group (GCG, University of Madison, Madison, Wl) analysiert Die Sequenzierung der cDNA und der genomischen Klons erfolgte unter Verwendung eines   A.L F.   



  DNA-Sequencer and Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia). Um einen cDNA-Klon von atSRp34/SR1 zu erhalten, wurde der EST-Klon mit der Zugangsnummer ACT76795,11573 

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 atcDNA Klon 15119T7 sequenziert. Die Genomsequenzen fur atSRp34/SR1 (Zugangsnummer AF001035) wurden mittels PCR isoliert und sequenziert 
Analyse alternativ   qespleisster   Isoformen 
Die RNA-Blot-Analysen erfolgten wie beschrieben (Lopato et al 1996b) Für alternativ gespleisste Isoformen codierende cDNAs wurden durch RT-PCR unter Verwendung von GesamtRNA-Praparationen von A thaliana-Pflanzen verschiedener Entwicklungsstadien und von der unubersetzten 3'-Region (für die reverse Transknption) abgeleiteten Pnmern erhalten (1 )   5'-AAATGAGCTCAAATGTATATGTATGGAAAAACC-  
3'(atSRp30) und (2)

     S'-AATGAGCTCGAAACGATATCTTCAAAAAAAAAC-  
3' (atSRp34/SR1) (Die unterstrichenen Nukleotide entsprechen Restriktionsstellen) und vom An- fang der unübersetzten 5'-Region am Ende der codierenden Region (fur PCR) (3)   S'-AAACTGGATCCAGAACAATCTAACGCTTTCTCG  
3' (atSRp30) und (4) 5'-ATATAGGATCCTCAACCAGAUAUCACAGGTG-3' (atSRp30) ; und (5) 5'-AAATATCTAGAGATCTCAAATCGACGACC-3' (atSRp34/SR1) und (6)   5'-ATATAGGATCCCATTTTACCTCGATGGAC-3'     (atSRp34/SR1).   



   Alle Produkte wurden sequenziert Das alternative Spleissen der langen Introns wurde unter Verwendung von Pnmern untersucht, die von benachbarten Exons abgeleitet wurden : (7) 5'-AATGAGCTCTGTGTCACCTGCTAGATCC-3' (atSRp30) und (8) 5'-ATATAGGATCCAGATATCACAGGTGAAAC-3' (atSRp30); und (9)   5'-ATAGGATCCAGGAGCAGAAGTCCCAAGGCAAAG-  
3' (atSRp34/SR1) und 
 EMI7.1 
   (atSRp34/SR1).   



   Die Fragmente wurden auf 1,2% Agarosegel analysiert 
Konstrukte fur   Promotoranalyse   und Uberexpression
Etwa 1 kb Promotorsequenzen von atSRp30 und atSRp34/SR1 plus ihre kompletten unubersetzten 5'-Regionen (einschliesslich des ersten Introns im Fall von atSRp34/SR1) wurden mittels PCR vom Genomklon GatSRp30 bzw. genomischer DNA von A thaliana als Templat unter Verwendung von Pnmern (11)   5'-AAACTAAGCTTGGTATCTTCTTCCCTGCAAG-3'   (atSRp30); (12)   5'-AAACCTAGGCGGCTACTCAGCTGATACCTCAG-  
AGCAG-3' (atSRp30);

   (13)   S'-AAACTAAGCTTAAATATTGAACCGGCCTCGGT-  
TC-3'   (atSRp34/SR1);   

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 (14) 5'-AAACTGGATCCTCTTCCTGTTGGTCGTCGACG- 
ATTTG-3' (atSRp34/SR1); und (15) 5'-AAACTGGATCCTCTTCCTTTATCAAATCC-3' (atSRp34/SR1) enthaltend   Hindill   und   BamHI   Restriktionsstellen erhalten. Diese Fragmente wurden mit   Hindill   und   BamHI   digeriert und mit dem GUS-Reportergen (Jeffer- son 1987) in   pB1101   (Clontech) fusioniert. 



   Die cDNA und die genomischen Sequenzen von atSRp30 wurden von cDNA und genomischer DNA von A. thaliana unter Verwendung der Primer 3 und 1, enthaltend   BamHI   bzw. Sacl Restrikti- onsstellen, amplifiziert. Die DNA-Fragmente wurden sequenziert und in die BamHI-Sacl Restrikti- onsstellen des   pB1121   (Clontech) Vektors (wobei das GUS-Gen gelöscht ist) unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors eingebracht, was zu pC30 bzw. pG30 genannten Konstrukten führte. 



   Kultivierung von Pflanzen und Suspensionskulturen und Pflanzentransformationsprozess 
Die Bedingungen zur Aufrechterhaltung von Karotten- und Tabak-BY2-Suspensionskulturen wurden früher beschrieben (Lopato et al. 1996a). Die Suspensionskultur von A thaliana Ecotyp Columbia war ein Geschenk von Czaba Koncz (Max Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln, Deutschland) und wurde aufrechterhalten, wie in Lopato et al. (1999) beschrieben ist. A. thaliana Ecotyp Columbia wurde in allen Transferexperimenten verwendet. Die Samen wurden durch 30 min Durchtränkung mit Wasser oberflächensterilisiert, gefolgt von 1 min Inkubation in 70% Ethanol, 10 min in 10% Bleiche und 5 Spülungen mit sterilem Wasser. Die sterilisierten Samen wurden in MS-Medium (Murashige und Skoog 1962) gezüchtet, das mit 1 % Saccharose angerei- chert war.

   Die Pflanzen wurden üblicherweise in einem Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit bei 23  gehalten, wenn nicht anders angegeben. Die Zellkultur wurde in Medium ge- züchtet, das Murashige-und-Skoog-Salze, 2 x Gamborg's Vitamine (Gamborg et al. 1968), 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 3% (M/V) Saccharose enthielt. Die Zellkulturen wurden in 50 ml Medium in konischen 250 ml Kolben in einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 110 Upm und 23 C in schwachem Licht inkubiert. Die Zellsuspensionen wurden alle 7 Tage subkultiviert und bei jeder Subkultur dreifach mit frischem Medium verdünnt. 



   Alle Konstrukte wurden unter Verwendung eines triparentalen Paarungsverfahrens mit dem Helferplasmid pRK2013 (Ditta et al. 1980) in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al. 



  1983) eingebracht. Wurzelexplantate von A. thaliana wurden unter Verwendung des von Valvekens    et al. (1988) beschriebenen Verfahrens mit einer Modifikation transformiert : DieWurzelexplantate   wurden von 15 Tage alten Setzlingen genommen, die auf vertikal an geordneten Agarplatten (Huang und Ma 1992) gezuchtet worden waren. Die Samen der transgenen Pflanzen wurden in Gegenwart von 50 ug/m1 Kanamycin keimen gelassen 
Histochemischer Assay der GUS-Expression 
Histochemische Assays der GUS-Expression wurden mit   5-Brom-4-chlor-3-Indolylglucuronid   (X-Gluc, Duchefa) als Substrat durchgeführt und erfolgten an intakten Setzlingen oder ausge- schnittenen Organen reifer Pflanzen, die in vivo gezüchtet worden waren, wie von Jefferson (1987) beschrieben wurde.

   Die Proben wurden 2 bis 6 Stunden lang mit 70% Ethanol behandelt, um erforderlichenfalls Chlorophyll aus den Geweben zu entfernen. 



   Reinigung von SR-Protemen von Arabidopsis und Immunblot 
SR-Proteine wurden von 3 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen oder 5 Tage alten Suspensi- onskulturen unter Verwendung eines zweistufigen Salzausfällverfahrens gereinigt, wie beschneben (Lopato et al. 1996a) Gesamtproteinextrakte wurden mit dem Puffer fur die SR-Proteimsolierung (Zahler et al. 1992) hergestellt. Die Proteine vom Magnesiumniederschlag und die Gesamtpro- teinextrakte wurden auf 12,5% SDS-Gel aufgetrennt Die Protokolle fur den Immunblot und den 

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 Nachweis sind früher beschrieben worden (Lopato et al. 1999). Die Proteindephosphorylierung er- folgte mit alkalischer Phosphatase von Kälberdarm (Biolabs). 



   Expression von atSRp30 und   atpSR34/SR1   in Baktenen 
Die codierende Region von atSP30cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer 5'- ATATACCATGGGTAGCCGATGGAATCGTAC-3' und (4) amplifiziert. 



   Die codierende Region von atSRp34/SR1cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Pri- mer 5'-ATATACCATGGGCAGTCGTTCGAG-3' und (6) amplifiziert. Die Primer enthalten Ncol und   BamHI     Restnktionsstellen.   Um die Ncol-Restriktionsstelle zu erhalten, wurde das vierte Nukleotid der codierenden Region in beiden Fällen auf G geändert. So exprimiertes atSRp30 und atSRp34/SR1 weisen Ser2-Arg bzw. Ser2-Gly-Substitutionen auf. Die Fragmente wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pET-3d (Novagen) geklont und in den E. coli-Stamm   BL21 (DE3)pLysS   (Novagen) transformiert 
Einzelne Kolonien wurden in 100 ml LB-Medium zu einer Dichte von 0,4 bis 0,5   OD55o   gezüch- tet, auf 900 ml fnsches, vorgewärmtes Medium transferiert und 1 Stunde lang inkubiert.

   Die Kultu- ren wurden mit 0,4 mM IPTG induziert und weitere 5 Stunden lang gezüchtet. Das Baktenenpellet wurde zwei Mal in 500 ml eiskaltem Waschpuffer (100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI bei pH 7,5) gewaschen und für die Einschlusskörperisolierung verwendet : 2 g Bakterienpellet wurde in 18 ml eiskaltem Puffer A (10 mM   Tris-HCI   bei pH 7,9,100 mM KCI, 2 mM DTT, 35% Saccharose) re- suspendiert 4,5 ml eiskalter Puffer B (333 mM Tris-HCI bei pH 8,0,100 mM EDTA bei pH 8,0, 40 mg Lysozym) wurden zugesetzt und auf Eis mindestens 10 min lang inkubiert.

   Lysepuffer (22,5 ml, 1 M Lc/ 20 mM EDTA, 0,5% NP-40) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde insgesamt 2 min lang bei voller Stärke beschallt (15 sek Ausbrüche mit Kühlperioden von 1 min dazwischen) Nach 10 min Zentrifugieren (Sorvall, SS34,13000 Upm) wurde das Pellet zwei Mal in 25 ml Puffer C (10 mM   Tris-HCI   bei pH 8,0,0,1 mM EDTA, 0,5 M LiCI, 0,05% NP-40, 1 mM DTT) und dann zwei Mal mit dem gleichen Puffer ohne LiCI gewaschen Die isolierten Einschlusskorper enthielten > 95% reines Protein und wurden für die Herstellung polyklonaler Antikörper (Lopato et al. 1999) verwen- det. 



   ERGEBNISSE 
Isolierung und Sequenzierung von genomischen und cDNA-Klons von atSRp30 
Zuerst identifizierten wir pflanzliche SR-Proteine in Magnesiumchloridpellets von Proteinextrak- ten von Karotten- und Tabakzellkulturen und von Arabidopsis-Pflanzen. Die Proteine wurden mit dem monoklonalen Antikörper mAb104, der für ein gemeinsames Phosphoepitop in allen SR- Proteinen spezifisch ist, und mit einem monoklonalen Antikörper, der für den menschlichen SF2/ASF-Spleissfaktor spezifisch ist, nachgewiesen (Lopato et al. 1996a). Ein Protein von etwa 50 kD von der Karotten-SR-Präparation, das von beiden Antikörpern erkannt wurde, wurde isoliert und teilweise sequenziert.

   Es wurden zwei Peptide mit signifikanter Homologie mit menschlichem SF2/ASF und atSRp34/SR1 gefunden Das erste Peptid umfasste das RNP-2 Submotiv des ersten RRM, und das zweite Peptid hatte eine hohe Homologie mit einer Sequenz zwischen RNP-2 und RNP-1 des zweiten RRM (siehe Materialien und Methoden; Fig. 2, unten). Auf Basis dieser Se- quenzen wurden degenerierte Primer synthetisiert und für PCR an gereinigter genomischer DNA von Karotten, Tabak und Arabidopsis verwendet Die Sequenzierung der geklonten PCR-Produkte ergab zwei sehr homologe Sequenzen von Arabidopsis und Tabak Das Arabidopsis-Fragment war 838 Bp lang und enthielt 5 Introns. Die Fragment grenzen des Arabidopsis-Fragments sind in Fig. 1A mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. Die von der PCR-Sequenz abgeleitete Protein- sequenz hatte eine extensive Homologie mit menschlichem SF2/ASF und atSRp34/SR1 (Fig. 2). 



  Das PCR-Produkt von Arabidopsis wurde als eine Sonde verwendet, um eine   #ZARll-Genombiblblo-   thek von A. thaliana zu screenen. Es wurde ein genomischer Klon gefunden und als atSRp30 bezeichnet (genomischer Klon von Senn/Arginin-reichem Protein von Arabidopsis thaliana mit einer abgeleiteten Molekulmasse von etwa 30 kD). Er war > 4,5 kb lang, hatte eine Promotorregion von 1805 Bp, endete jedoch 12 Bp oberhalb des Stopkodons. Eine korrespondierende cDNA wur- de von emer cDNA-Bibliothek mit   exprimierten   Sequenz-Tags (EST) von A. thaliana Ecotyp Colum- 

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 bia erhalten und sequenziert. Die dieser cDNA entsprechende mRNA wurde als mRNA1 von atSRp30 bezeichnet.

   Es wurden Primer aus der 3'-nicht-translatierten Region dieser cDNA ver- wendet, um die fehlenden Sequenzen des genomischen Klons durch PCR-Amplifikation auf gerei- nigter genomischer DNA zu erhalten. Das DNA-Fragment enthielt ein zusätzliches Intron, und der Rest war mit der entsprechenden Sequenz der cDNA1 ident. Die Sequenz von GatSRp30 und die abgeleitete Proteinsequenz sind in Fig. 1A dargestellt. 



   Um den Vergleich von Merkmalen von atSRp30 und dessen eng verwandten atSRp34/SR1- Protein von Arabidopsis zu erleichtern (Lazar et al. 1995), wurde die Genomsequenz dieses Prote- ins unter Verwendung von PCR ermittelt. GatSRp34 hat eine sehr ähnliche Genstruktur wie GatSRp30, ausser dass das erstere ein Intron in der 5' nicht übersetzten Region aufweist. Das Fragment von GatSRp34, das den Teil von Exon 11bis zum Stopkodon umfasst, ist in Fig. 1 C dar- gestellt, wo die alternativen Spleissereignisse unter Einbeziehung von Intron 11 ebenfalls angege- ben sind. 



   Vergleich von atSRp30 mit anderen SR-Proteinen 
Die abgeleiteten Proteinsequenzen von atSRp30 und atSRp34/SR1 sind sehr homolog (80,7% ähnlich und 67,1% ident) miteinander und weisen beide sehr hohe Ähnlichkeit (75,3% bzw. 77,8%) und Identität (58,1% bzw. 59,4%) mit menschlichem SF2/ASF auf (Fig. 2). Da atSRp30 und atSRp34/SR1 weniger homolog mit anderen bisher identifizierten tierischen oder pflanzlichen SR- Proteinen sind, können beide Proteine als echte Orthologe von menschlichem SF2/ASF angese- hen werden. In ihren Amino-terminalen Teilen enthalten alle drei Proteine zwei RRMs mit ihren konservierten RNP-2- und RNP-1-Submotiven, wobei das zweite RRM atypisch ist und die invari- ante SWQDLKD-Signatur, die charakteristisch für   SF2/ASF-ähnliche   SP-Proteine ist, enthält (Bir- ney at al. 1993).

   Im Gegensatz zu atSRp34/SR1 und SF2/ASF sind die RRMs von atSRp30 jedoch nicht durch eine glycinreiche "Gelenk"-Region getrennt, sondern durch eine serinreiche Sequenz. 



  Die RS-Domäne von atSRp30 ist aufgrund einer Verlängerung am 3'-Ende von atSRp34, die eine vorher beschriebene, positiv geladene Prolin/Serin/Lysin-reiche (PSK) Domäne unbekannter Funk- tion einschliesst (Lazar et al. 1995), kürzer als die von atSRp34. Wenn diese unike 3'-Verlängerung nicht in Betracht gezogen wird, ist atSRp34/SR1 geringfügig homologer mit menschlichem SF2/ASF, hauptsachlich aufgrund ihrer gemeinsamen G-reichen Gelenkregion.

   In ihrer Gesamtheit weisen diese Analysen darauf hin, dass im Gegensatz zu Säugetieren, für die bisher nur ein SF2/ASF-Protein beschrieben worden ist, in Arabidopsis zwei SF2/ASF-Homologe vorhanden sind 
RNA-Verteilung und alternative Spleissformen von atSRp30 und atSRp34/SR1 
RNA-Blots von Poly(A)+ mRNA von verschiedenen Geweben von Arabidopsis-Pflanzen vom Wildtyp wurden mit radioaktiv markierten atSRp30 oder atSRp34/SR1 cDNAs sondiert und wiesen in jedem Fall mindestens zwei mRNA-Spezies auf (Fig. 3A). Das Ausmass der Expression jedes Gens variierte in verschiedenen Geweben erheblich, war jedoch in beiden Fällen bei Blüten am grössten, gefolgt von Wurzeln (Fig. 3A). Ausserdem war das Verhältnis der beiden unterscheidbaren mRNAs, mRNA3 und mRNA1, für jedes Gen in den unterschiedlichen Organen verschieden.

   Für atSRp30 schien mRNA3 in grösseren Mengen in Blättern, Stängeln und Blüten vorhanden zu sein, während mRNA1 in Wurzeln vorherrschend war Im Gegensatz dazu betrug das Verhältnis der beiden wichtigsten mRNAs von atSRp34/SR1 etwa 1:1 in Blättern und Stängeln, während in den Wurzeln und Blüten mRNA1 dominierte. Eine weitere Sondierung des RNA-Blots mit dem langen zehnten Intron von atSRp30 zeigte, dass mRNA3 Sequenzen dieses Introns behielt, was darauf hinweist, dass das alternative Spleissen diese Region von atSRp30 pre-mRNA mit einbezieht. 



   Die gesamten Sequenzen der verschiedenen mRNA-Isoformen wurden durch RT-PCR-Klonen von Gesamt-RNA unter Verwendung von Primern der 5'- und 3'-Enden der Gene erhalten (siehe Materialien und Methoden). mRNA1 entsprach der cDNA-Sequenz von atSRp30, während auf Grund der Verwendung einer alternativen 3'-Spleissstelle mRNA3 einen Teil des zehnten Introns behielt (Fig. 1A, B). Die mRNA2-Isoform mit den beiden alternativen 3'- und 5'-Spleissstellen inner- halb von Intron 10 (Fig. 1A, B) war in den Northern der Pflanzen vom Wildtyp nicht erkennbar (siehe Fig. 3A) und wurde nur durch RT-PCR durch Erhöhung der Zyklenzahl nachgewiesen 

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 (Daten nicht angegeben). 



   Es wurde der gleiche Ansatz verwendet, um die mRNA-Isoformen von atSRp34/SR1 zu sequenzieren (Fig. 1C). Die längste mRNA-Spezies, die auch die in Pflanzen vom Wildtyp haufigste ist, wurde mRNA5 genannt und behielt das meiste von Intron 11 (das in der Position ist, die Intron
10 von atSRp30 entspricht) mit Ausnahme eines internen Introns von etwa 80 Nukleotiden. Während der frühen Entwicklung der Pflanzen konnten zwei andere, kleinere alternative mRNAs festgestellt werden, jedoch nur mittels RT-PCR (Daten nicht angegeben) mRNA4 verwendet eine zusätzliche alternative 3'-Spleissstelle, mRNA2 verwendet alternative 5'- und 3'-Spleissstellen (Fig. 1C, D); und mRNA3, die die wichtigste alternativ gespleisste mRNA in Pflanzen ist, wenn atSRp30 vom 35SCaMV-Promotor überexprimiert wird (Fig. 5 unten), verwendet eine alternative 5'-Spleissstelle. 



   Die obigen, alternativ gespleissten mRNAs von atSRp30 und atSRp34/SR1 hatten alle ein Stopkodon innerhalb des Rahmens in der Nähe des 5'-Endes der behaltenen Intronsequenz. Den hypothetischen, kürzeren Proteinen, die als atSRp30s und atSRp34s bezeichnet werden, fehlt der Carboxy-terminale Teil der RS-Domäne, und sie haben statt dessen andere Sequenzen, die in Fig. 1 A für atSRp30s und in Fig. 1 C fur atSRp34s fett gedruckt dargestellt sind. 



   Um Informationen über Veränderungen in den Transkriptions- und alternativen Spleissmustern von atSRp30 während der Entwicklung der Pflanze zu erhalten, wurde die Gesamt-RNA von ganzen Pflanzen verschiedenen Alters isoliert und für RNA-Bloth-Hybridisierung und RT-PCR-Analyse (Fig. 3B, C) verwendet. Für RT-PCR wurden von Exons neben dem zehnten Intron erhaltene Primer verwendet. Die Ergebnisse beider Verfahren waren ziemlich übereinstimmend und zeigten, dass die Expression von mRNA1 in jüngeren Pflanzen am höchsten ist und etwa um Tag 12 abzunehmen beginnt, während die Expression von mRNA3 bei jungen Setzlingen extrem niedrig ist, zwischen Tag 9 und 14 ihren Höhepunkt erreicht und danach langsam abnimmt.

   Obwohl wir nicht wissen, wie das Verhältnis dieser beiden Transknpte reguliert wird, konnten diese regelnden Ereignisse die Menge echten atSRp30-Proteins in einzelnen Zellen bestimmen 
Antikörpernachweis von Arabidopsis SR-Proteinen 
In Hühnern wurden polyklonale Antikörper gegen gereinigtes rekombinantes atSRp30 und atSRp34/SR1 gezüchtet und eingesetzt, um Antigene in verschiedenen Ammoniumsulfatfraktionen von Arabidopsis-Extrakten zu identifizieren. Die Extrakte wurden durch sequenzielles Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Magnesiumchlond fraktioniert, um SR-Proteine anzureichern (Roth et al 1990) Die anti-p30- und anti-p34-Antikörper erkannten Proteine im Abschnitt von 60-90% Ammoniumsulfat Die immunreaktiven Proteine im dialysierten   60-90%-Abschnitt   fielen in Gegenwart von 20 mM Magnesiumchlorid quantitativ aus.

   Es wurden keine Kreuzreaktionen von Pflanzen proteinen mit der pre-immunen Immunglobulinfraktion gefunden (Daten nicht angegeben). 



   Der   Magnesiumniederschlag   wurde einem Immunblot zugeführt und mit vier verschiedenen Antikörpern sondiert Mit anti-p30 wurden sechs Proteinbande als drei Doubletts detektiert, wobei das 43- bis 46-kD-Doublett die höchste Intensität aufwies. Die beiden anderen Doubletts wanderten mit erkennbaren Molekülmassen von 38-40 bzw. 31-34 kD (Fig 4A, Spur 2).

   Das Immunfärbemuster mit dem monoklonalen Antikörper mAb104 (Fig. 4A, Spur 1), das für ein bei SR-Proteinen übliches Senn-Phosphoepitop spezifisch ist (Roth et al. 1990), war sehr ähnlich, obwohl das kleinste Band deutlicher war als bei anti-p30 (Spur 2) Dies könnte auf ein zusätzliches SR-Protein von etwa 30 kD hinweisen, oder es konnte das Vorhandensein mehrerer oder stärkerer Phosphoepitope innerhalb von p30   widerspiegeln.   Wir fanden mit dem mAb104-Antikörper keine Proteine mit gro- &num;

  er Molekülmasse, obwohl Lazar et al (1995) von immunreaktiven Proteinen bis zu 120 kD berichtet haben
Die anti-p34-Antikörper erkennen hautpsächlich drei Proteine von etwa 46-47,40 und 34 kD Da der gleiche Antikörper eine minimale Kreuzreaktion mit rekombinantem atSRp30 zeigt (Daten nicht angegeben), stellen diese Bande möglicherweise mit atSRp34/SR1 verwandte Proteine dar und stimmen gut mit veröffentlichten Daten über die Überexpression überein, bei welchen das Protein mit einer Grösse von 47-48 kD immundetektiert wurde (Lazar et al. 1995). Das 40 kDProtein wandert mit einer alternativ gespleissten Isoform von atSRp34/SR1 mit (siehe unten), während die Natur des 34 kD-Polypeptids noch zu bestimmen ist.

   Interessanterweise ist der Immunblot mit anti-p34 jenem sehr ähnlich, der mit einem für menschliches SF2/ASF spezifischen monoklona- 

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 len Antikörper erhalten wurde (Fig 4A, vgl. Spur 3 und 4). Daher findet zwischen anti-hSF2, das ein diskontinuierliches Epitop innerhalb von RRM1 von hSF2/ASF, nicht aber andere menschliche SR-Proteine erkennt (Hanamura et al. 1998) und dem gleichen Set von Arabidopsis-Proteinen wie anti-p34 eine Kreuzreaktion statt, was die Vermutung stützt, dass hSF2/ASF dem atSRp34/SR1 in dieser Region ähnlicher ist als dem atSRp30. 



   Die Tatsache, dass atSRp30 und atSRp34/SR1 in der SR-Proteinzubereitung vorhanden sind und mit spezifischen Banden im   mAb104-Immunblot   mitwandern, weist darauf hin, dass beide Pro- teine phosphoryliert sind. Um diesen Hinweis zu überprüfen, behandelten wir die SR-Proteinzube- reitung für verschiedene Zeiten mit steigenden Konzentrationen von alkalischer Phosphatase (Fig. 4B, C) Im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (Spuren 1,2) führten diese Behandlun- gen zu einem Anstieg der Mobilität aller immungefärbten Bande Unter diesen Bedingungen er- kannte anti-p30 hautpsächlich drei Proteine (27,31, 38 kD), während anti-p34 zwei Proteine er- kannte (31 und 38kD).

   Wie erwartet waren alle diese Proteine nicht mehr mit mAb104 gefärbt, mit Ausnahme des 38 kD-Bandes, das möglicherweise einen teilweise dephosphorylierten Zwischen- stoff darstellt, der gegen weitere Dephosphorylierung resistent ist (Daten nicht angegeben). Inte- ressanterweise führte die Dephosphorylierung zum Auftreten neuer Bande von grösserer offensicht- licher Molekülmasse, was mit unserer Beobachtung übereinstimmt, dass nicht phosphoryliertes rekombinantes atSRp30 und atSRp34/SR1 sehr unlöslich sind und eine starke Tendenz zur Ag- gregation haben. 



   Transkriptionelle Aktivität von   SR-Proteinpromotoren   bei Arabidopsis 
Es ist bemerkenswert, dass Arabidopsis im Gegensatz zu Säugetieren zwei SF2/ASF-ähnliche Proteine besitzt. Wie die Northern Blot-Analyse zeigte, werden die Gene beider Proteine in allen Pflanzenorganen transkribiert. Es war daher interessant, zu untersuchen, ob beide Gene allgemein in allen Geweben oder spezifisch in verschiedenen Geweben transkribiert werden, oder in wel- chem Ausmass sie überlappende Aktivitäten haben.

   Zu diesem Zweck wurden die Promotoren von GatSRp30 und GatSRp34 einschliesslich der 5'-unübersetzten Regionen bis zum Startkodon mit der codierenden Region eines   Reporter-&num;-Glucuronidase-Gens   fusioniert und mittels von Agrobac- terium tumefaciens medilerter Wurzeltransformation in A thaliana-Pflanzen transferiert.   &num;-Glucuro-   nidase (GUS)-Aktivität wurde in keinem getesteten, nicht-transgenen Arabidopsis-Gewebe jeweils beobachtet, auch nicht in transgenen Pflanzen, die ein promotorloses GUS-Gen besitzen. Kon- trollpflanzen, die eine 35S Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) -Promotor-GUS-Fusion enthielten, wa- ren leicht zu färben, was zeigt, dass der Substratzugang die GUS-Aktivität nicht einschränkte.

   Um jeglichen Einfluss der transgenen Position auf die Promotoraktivität auszuschliessen, wurden die Analysen mit verschiedenen unabhängigen transgenen Linien durchgeführt. 



   Unter Verwendung detaillierter histochemischer Analysen fanden wir, dass beide Gene distink- te, jedoch auch überlappende Muster transkriptioneller Aktivität aufwiesen. Blumen im Stadium nach der Blüte (Fig. 5A, E) zeigten im Wesentlichen die gleichen Farbemuster für beide Gene, wobei die deutlichste Expression bei den Pollenkornern auftrat und Kelchblätter und Griffel nur schwach färben. Ausserdem wurde bei der Abszissionszone der Blüte bei atSRp30-GUS-trans- genen Pflanzen schwache Aktivität beobachtet (Fig 5A). Die Blätter von atSRp30-GUS-Pflanzen zeigten die stärkste Färbung in vaskulären Bündeln und in den Stützzellen jedes Trichoms (Fig 5B), während die Fusion atSRp34-GUS nur in sekundären Venen und in den umgebenden Zellen schwach aktiv war, jedoch niemals eine Aktivität in Trichomen oder Stützzellen beobachtet wurde (Fig. 5F).

   Die Unterschiede in den GUS-Färbemustern dieser Gene waren während der verschiedenen Stadien der lateralen Wurzelentwicklung besonders evident. Sowohl atSRp30 als auch atSRp34-GUS-Fusionen waren in den allerersten Stadien der lateralen Wurzelbildung aktiv, wenn Perizykelzellen stimuliert werden, dedifferenzieren und sich vermehren. Dann in den spä- teren Stadien, wenn es zur Redifferenzierung kommt, um das Lateralwurzelmeristem zu bilden, wurde atSRp30-GUS in den vergrösserten Basalzellen der sich bildenden Lateralwurzel exprimiert (Fig. 5C), während die Expression von atSRp34-GUS für das aktivierte Wurzelmeristem charak- teristisch war (Fig. 5G). Die Färbemuster während der frühen Entwicklung der Setzlinge bot zu- sätzliche Beweise für die unterschiedlichen transkriptionellen Aktivitäten von atSRp30 und atSRp34/SR1.

   Jedes der Gene wurde in spezifischen Regionen entlang der Achse Spitze-Basis 

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 des Setzlings exprimiert. Bei den atSRp30-GUS-Setzhngen war die Expression auf die Keimblätter beschränkt (Fig. 5D), während bei den atSRp34-GUS-Setzlingen Expression im Hypokotyl und in den Wurzeln beobachtet wurde (Fig. 5H), was darauf hinweist, dass diese Gene in Regionen mit verschiedenen Zellteilungsmusters   transkriptionell   aktiv sein können.

   Dieser Hinweis wurde durch die unterschiedliche Expression von atSRp30 und atSRp34/SR1 während der Lateralwurzelbil- dung, sowie in Trichomstützzellen bestätigt Überexpression von atSRp30 in transgenen Pflanzen 
Bei Drosophila führte die ektopische Überexpression von SRp55/B52 zu verschiedenen Ab-   normitaten   bei der Entwicklung obwohl die Identität betroffener Transkripte noch immer unbekannt ist (Kraus und Lis 1994). Es war daher von Interesse, die Wirkung der Überexpression von atSRp30 auf die Pflanzenentwicklung und auf die alternativen Spleissmuster einzelner Pflanzentransskripte zu untersuchen. Die verwendeten Konstrukte enthielten entweder ein komplettes Gen (pG30) oder eine cDNA (pC30), die für atSRp30 unter Kontrolle des stark konstitutiven Promotors der 35S RNA von CaMV codiert.

   Der 35S CaMV-Promotor ist stark und konstitutiv in allen untersuchten Pflanzengeweben, was in Kontrollversuchen unter Verwendung von GUS als Reportergen bestätigt wurde. Um die Bedingungen des Regenerations- und Transformationsprozesses in der RNA-Analyse von Transformanten zu regeln, wurden Negativkontrollen entweder mit einer 35SRNA-Promotor-GUS-Kontrolle   (pB1121)   transformiert oder waren Transformanten mit dem gleichen Konstrukt, die jedoch aus unbekannten Gründen keine Überexpression aufwiesen. 



   Die beiden Fusionskonstrukte pG30 und pC30 wurden fur die von Agrobactenum mediierte Transformation von   Arabidopsiswurzeln   verwendet. Vierzig unabhängige, transgene Linien wurden fur jedes Konstrukt regeneriert, acht der mit pG30 transformierten Linien und zwölf der mit pC30 transformierten Linien wurden für die weitere Arbeit verwendet. Einige dieser transgenen Linien wurden für RNA-Blot- und RT-PCR-Analysen verwendet, wie in Fig. 6 A und B dargestellt ist. Überraschenderweise exprimierten alle pG30-Transformanten (Fig. 6A, B, Linien 1 bis 4) hauptsächlich mRNA3, die innerhalb des langen Introns eine alternative 3'-Spleissstelle besitzt (Fig 1 B), aber mRNA1 war in diesen Pflanzen trotzdem noch häufiger als in der Kontrollpflanze (Fig 6A, Spur 10), wie von der RNA-Blotanalyse abgelesen wurde (in Spur 10 in Fig. 6B wurde vier Mal mehr Produkt geladen).

   Obwohl die mRNA1-Werte in beiden Typen von Transformanten ziemlich verschieden sind (Fig. 6A), zeigt die RT-PCR ähnliche Ausbeuten (Fig 6B), weil eine grosse Anzahl von Zyklen verwendet wurde, um alle alternativ gespleissten Produkte zu detektieren. Wie erwartet überexprimierten alle pC30 enthaltenden Transformanten nur mRNA1 (Fig 6A, Spuren 5-9). In beiden Typen von Transformanten waren uberexprimierte mRNAs > 100-fach häufiger als in Pflanzen vom Wildtyp Als pC30-Transformanten mit RT-PCR analysiert wurden, war interessanterweise nur mRNA2 vorhanden, die kryptische 3'- und 5'-Spleissstellen in Intron 10 verwendet (Fig. 6B und 1 B), während eine kleine Menge von mRNA3 in Pflanzen vom Wildtyp erkennbar war Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Überschuss an atSRp30 die Auswahl der 5'-Spleissstelle der endogenen atSRp30 pre-mRNA verändert. 



   In Anbetracht der obigen Ergebnisse war es von Interesse, die Überexpression von atSRp30 auf Proteinebene zu messen. Die gesamten, löslichen Proteinextrake von transgenen Pflanzen wurden durch Western Blotting unter Verwendung von anti-p30 zur Immundetektion analysiert (Fig. 6C) und mit einer Kontrollpflanze (Spur 8, eine transformierte Pflanze ohne Überexpression von atSRp30) und mit einer SR-Proteinzubereitung von Arabidopsis-Suspensionskultur (Spur 1) verglichen. Die SR-Proteinzubereitung hatte das charakteristische Muster von anti-p30 (vgl. 



  Fig. 6C, Spur 1, und Fig. 4A, Spur 2), während auf Grund der geringen Haufigkeit von atSRp30 in Pflanzen im Gesamtproteinextrakt der Kontrollpflanze keine spezifischen Proteine immungefärbt wurden (Fig. 6C, Spur 8). Im Gegensatz dazu war ein spezifisches Proteinband in den pC30Transformanten zu erkennen (Spuren 3-7), das mit einem Proteinband in der SR-Proteinzubereitung mitwanderte (Spur 1).Im Gegensatz dazu wurde im pG30- Transformanten (Spur 2) nur ein schwaches Proteinband festgestellt.

   Diese Ergebnisse stimmen gut mit dem RNA-Expressionsmuster von mRNA1 in beiden Typen von Transformanten überein (Fig. 6A) Es ist interessant, dass die Überexpression von atSRp30 ein immungefärbtes Protein von 38 kD und nicht ein Band ergab, das mit dem häufigeren 43- bis 46-kD-Doublett mitwanderte, das bei der   SR-Proteinzubereitung   zu 

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 sehen war (Fig. 6C, Spur 1). Eine wahrscheinliche Erklärung ist, dass das überexprimierte atSRp30 nur teilweise phosphoryliert ist, was mit unserer Beobachtung zusammenhängen kann, dass selbst vollständige Dephosphorylierung zu einem 38 kD atSRp30-Protein führt, das das mAb104-Phosphoepitop behält (Fig. 4B, Spuren 3-6).

   Allerdings konnte mit keinem der verwende- ten Antikörper in pG30-Transformanten ein kürzeres Proteinprodukt (atSRp30s) der ausserst häufi- gen mRNA3 nachgewiesen werden (siehe auch Fig. 6C, Spur 2). 



   Phänotypänderungen bei Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren 
Die Überexpression von atSRp30 führte zu starken Phänotypen mit pleiotropen Veränderungen sowohl in der Morphologie als auch bei der Entwicklung der transgenen Pflanzen. Zwischen Pflan- zen, die mit pG30- und pC30-Konstrukten transformiert waren, wurden keine signifikanten Unter- schiede festgestellt, obwohl die Werte von atSRp30-Protein verschieden waren (Fig. 6C, vgl. Spur   2 und Spuren 3 bis 7). Die Beobachtungen waren in T ? folgenden Generationen unabhängiger   transgener Linien reproduzierbar und cosegregierten mit der antibiotischen Resistenz zusammen. 



  Bei transgenen Pflanzen war der Übergang vom Wachstums- zum Blühstadium unter Kurztagbe- dingungen stark verspätet. Die Zeit vom Keimen bis zur Bildung der ersten reifen Schote betrug 65-78 Tage bei überexprimierenden Pflanzen im Vergleich zu 42-47 Tagen bei Kontrollpflanzen, die unter den gleichen Bedingungen gezogen wurden. Ausserdem zeigten ausgewachsene Pflan- zen eine reduzierte apikale Dominanz, was zu einem "buschigen" Phanotyps mit erhöhter Anzahl sekundärer Infloreszenzen und verkürzter primärer Infloreszenz führte (Fig. 7C). Das Züchten der transgenen Pflanzen unter Langtagbedingungen führte zu einer teilweisen Rückkehr zu einem normalen Phänotyp. Trotz der teilweisen Wiedererlangung der apikalen Dominanz blieben jedoch der Übergang zum Blühen und die Zeit bis zum Altern verspätet.

   Unter Langtagbedingungen be- gann die Mehrheit der Pflanzen von überexprimierenden Linien zwischen 35 und 39 Tagen nach dem Keimen zu blühen, während Kontrollpflanzen zwischen Tag 25 und Tag 28 blühten. Die ersten Infloreszenzen waren sehr kurz und nicht grösser als 0,5 bis 1 cm, als sich die erste Blüte öffnete. 



  Die Blüten bei transgenen Pflanzen waren etwa 30% grösser als bei Kontrollpflanzen (4 bzw. 



  3 mm). Transgene Pflanzen hatten auch grössere Rosettenblätter (Fig. 7A, vgl. Wildtyp in B), wobei die Trichome hauptsächlich vier bis fünf 5 Zweige hatten, im Gegensatz zu den Blättern beim Wildtyp, die hauptsächlich dreizweigige Trichome aufwiesen. In stark überexprimierenden Linien produzierte die primäre Infloreszenz zahlreiche sekundäre Zweige mit vegetativem, rosetten arti- gem Aussehen. Diese Zweige entwickelten 7 bis 15 vegetativartige Blätter und bildeten schliesslich Infloreszenzen.

   Unter Langtagbedingungen war die zum Zeitpunkt der Blüte bestimmte Anzahl der Rosettenblätter bei transgenen Pflanzen etwas geringer als beim Wildtyp (durchschnittlich 12 bzw 16 Blätter) Unabhängige transgene Linien, die atSRp30 überexprimieren, zeigten in verschiede- nem Ausmass die beschriebenen Charaktenstika mit den grössten Auswirkungen auf die Zeit für den Übergang von der vegetativen zur reproduktiven Phase. 



     Uberexprimiertes   atSRp30 moduliert alternatives Spleissen in vivo 
Der Einfluss der Uberexpression von atSRp30 auf sein eigenes alternatives Spleissmuster und die grosse Homologie von atSRp30 mit dem menschlichen alternativen Spleissfaktor SF2/ASF wiesen darauf hin, dass dieses Protein ein Modulator des pflanzlichen Spleissens sein konnte. 



  Diese Annahme kann in vitro nicht überprüft werden, da keine pflanzlichen Spleissextrakte zur Verfugung stehen. Daher verwendeten wir Gesamt-RNA-Präparationen von pG30-Transformanten (niedrigeres Niveau der atSRp30-Uberexpression) und pC30-Transformanten (höheres Niveau der atSRp30-Überexpression) für die RT-PCR-Analyse mehrerer Pflanzenintrons, von denen bekannt ist, dass sie unter Wildtyp-Bedingungen alternativ prozessiert werden. 



   Unter mehreren getesteten Genen, wie FCA (Macknight et al. 1997), Rubiscoaktivase (Werne- ke et al. 1989), Agamous (Yanofsky et al. 1990) und LSD1 (Dietrich et al. 1997) wurden bei Pflan- zen, die atSRp30 überexprimieren, keine Veränderungen der Spleissmuster festgestellt. Es wurde jedoch gefunden, dass das pre-mRNA-Spleissen dreier Pflanzengene von der Überexpression be- troffen wird, wie im folgenden ausgeführt ist. 



   Der Spleissfaktor atSRp31 gehort zu einer neuen Familie von pflanzlichen RS-Proteinen und 

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 besitzt ein alternativ gespleisstes zweites Intron (792 Nukleotide) (Lopato et al. 1996b). Beim Wildtyp der Pflanze wurden bei diesem Intron entweder eine kryptische 3'-Spleissstelle oder die beiden alternativen 3'- und 5'-Spleissstellen verwendet (Fig. 8A), während in Kontrolllinien (Spur 1) und pG30-transformierten Linien (Spuren 2 bis 5) die letztere Form vorherrschend war.

   Im Gegensatz dazu exprimierten pC30-Linien (Spuren 6-10) hauptsächlich die Form der alternativen 3'-Spleissstelle, obwohl ihre Haufigkeit variabel war (in den Spuren 6 und 7 ist diese Form nur auf dem Originalfoto zu erkennen) Diese Transknpte sind wahrscheinlich einem nonsens-vermittelten Abbau ausgesetzt und codieren möglicherweise für das gleiche   Rumpfprotein  
Ein weiteres, gut beschriebenes alternatives Spleissereignis findet im Fall des U1-70K-Gens von Arabidopsis statt, wobei Transknpte, die das Intron 6 behalten, in den meisten Geweben (ausser in den Wurzeln) haufiger sind als das richtig gespleisste Transkript (Golovkin and Reddy
1996). Die Ergebnisse der RT-PCR von Kontrollpflanzen (Fig. 8B, Spuren 1,9, 10) bestätigen diese Beobachtung.

   In beiden atSRp30-Transformanten, entweder in den niedriger exprimierenden pG30-Linien (Spuren 2 und 3) oder den höher exprimierenden   pC30-Lmien   (Spuren 4 bis 8) wurden die meisten Transknpte korrekt gespleisst, und es wurde nur ein geringes Ausmass an Zurückhalten der Introns beobachtet. Dieses regulatorische Ereignis könnte möglicherweise das Niveau des aktiven Proteins beeinflussen. 



   Der interessanteste Fall der Modulierung des alternativen Spleissens wurde im Fall des langen Introns (Intron 11) von GatSRp34 gefunden, eines engen Homologen von GatSRp30 (Fig. 9). Bei Pflanzen vom Wildtyp (Fig. 9, Spur 1) wird ein Teil dieses Introns alternativ gespleisst, um mRNA5 zu erzeugen. Bei pG30-Transformanten (Spuren 2 bis 5) war mRNA3 die hauptsächliche, alternativ gespleisste Form, während die Werte von mRNA1 unverändert schienen. Wenn atSRp30 stark überexprimiert wurde, wurde die alternativ gespleisste mRNA3 überraschenderweise zum Haupttranskript, während die Menge mRNA1 erheblich abnahm. Wenn man annimmt, dass kürzere PCR-Produkte möglicherweise überrepräsentiert sind, kann die Reduktion von mRNA1 sogar noch drastischer sein.

   Diese Annahme wurde durch die Immunblot- Analyse der Gesamtproteinextrakte bestätigt : atSRp34/SR1 wurde in Kontrollpflanzen (Fig 9B, Spur 3) und in einem pG30-Transformanten (Spur 5) nachgewiesen, nicht jedoch in einem pC30-Transformanten (Spur 4). Es wurde jedoch in diesem Fall ein kleineres, spezifisches Proteinband (atSRp34s, 38 kD) sichtbar, was darauf hinweist, dass das Proteinprodukt von mRNA3 in diesem Transformanten dominierend ist. 



  Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Überexpression von atSRp30 die Genexpression seines engen Homologen atSRp34/SR1 stark beeinflusst. 



   DISKUSSION atSRp30 ist ein Mitglied der SR-Proteinfamilie 
Zusätzlich zu ihren charakteristischen Domänen, die ein oder zwei RRMs und eine Carboxyterminale RS-Domäne mit multiplen SR-Dipeptiden einschliessen, besitzen SR-Proteine (ein) Phosphoepitop (e), das die von mAb104 erkannt wird/werden, und sie sind in Gegenwart millimolarer Konzentrationen von Magnesiumsalzen löslich Der Antikörper zu atSRp30 erkannte ein komplexes Banden muster im Mg-Niederschlag, während in den Gesamtproteinfraktionen kein spezifisches Band festgestellt werden konnte. Die Tatsache, dass atSRp30 in rohen Lysaten nicht nachgewiesen werden konnte, spiegelt die geringe Häufigkeit des Proteins und/oder die eingeschränkte Sensibilität des Antikörpers wider. Als atSRp30 jedoch überexprimiert wurde, wies der Antikörper ein spezifisches Protein mit einer offensichtlichen Mobilität von 40 kD nach.

   Im Gegensatz dazu konnte atSRp34/SR von anti-p34 in Gesamtproteinfraktionen nachgewiesen werden. Unsere Daten aus dem Immunblot bestätigen, dass atSRp30 ein echtes SR-Protein ist, da es in SR-Proteinpraparationen vorhanden ist und mit mAb104 korrespondierende immungefärbte Bande aufweist. Da jedoch keine vollständige Dephosphorylierung erreicht werden konnte, wissen wir nicht, wie viele dieser Proteine modifizierte Formen von atSRp30 oder eng verwandten Proteinen darstellen. 



   Ist die Expression von atSRp30 selbstregulierend? 
Als atSRp30 pre-mRNA überexprimiert wurde, war mRNA3, die durch die Verwendung einer alternativen 3'-Spleissstelle im zehnten Intron erzeugt wird, das hauptsächlich nachgewiesene 

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Transknpt, während der Wert von mRNA1 nur mässig erhöht war (Fig. 6). Es gibt mehrere mögliche 
Erklärungen fur dieses Phänomen. Erstens kann ein einschränkender Spleissfaktor vorhanden sein, der aufgrund der Überexpression des atSRp30-Gens austitriert wird. Ein solcher Faktor würde für das zehnte Intron spezifisch sein müssen, da alle anderen Introns in atSRp30 ordentlich gespleisst werden.

   Zweitens können mRNA3 und mRNA1 grösstenteils in verschiedenen Zellen über zellty- penspezifisches alternatives Spleissen synthetisiert werden Da der in den Uberexpressionsversu- chen verwendete konstitutive 35S-CaMV-Promotor in den meisten Geweben aktiv ist, kann die grosse Menge mRNA3 eine unpassende Expression in Zelltypen widerspiegeln, in denen ein für die richtige Prozessierung des zehnten Introns erforderlicher Faktor fehlt. Um diese Frage zu klaren, werden Experimente notwendig sein, die darauf abzielen, jene Zellen festzustellen, in denen das alternative Spleissereignis stattfindet. 



   Die Tatsache, dass das Verhältnis von mRNA3 zu mRNA1 bei allen Transformanten, die 
GatSRp30 (Fig. 6A) überexpnmieren, konstant ist, stimmt mit einem möglichen selbstregulierenden 
Mechanismus überein, der atSRp30 involviert. Überproduziertes atSRp30-Protein kann das alter- native Spleissereignis stimulieren und so seine eigene Expression nach unten regulieren, was, wie gezeigt worden ist, bei mehreren tierischen Spleissfaktoren der Fall ist, wie Sxl (Bell et al. 1991), tra (Mattox und Baker 1991) und SWAP (Zachar et al. 1987) von Drosophila sowie SRp20 (Jumaa and 
Nielsen 1997) von der Maus. In Übereinstimmung mit diesem Modell konnten wir kein Proteinpro- dukt von mRNA3 (atSRp30s) finden.

   Wir erhielten Beweise für einen Einfluss von atSRp30 auf das alternative Spleissen von Transkripten vom endogenen Gen in Pflanzen, die die atSRp30 cDNA (Fig. 6B, Spuren 5 bis 9) überexprimieren, was zu einer bevorzugten Verwendung einer alternati- ven 5'-Spleissstelle führte. Die Überexpression von atSRp30 könnte eine unterschiedliche Auswir- kung auf die grosse Menge exogener pre-mRNA haben, die in Zellen vorhanden ist, wo dieses 
Protein normalerweise nicht exprimiert wird, was zu einer bevorzugten Verwendung einer alternati- ven 3'-Spleiss stelle führt (Fig. 6A, B, Spuren 1 bis 4). Leider kann diese Hypothese nicht in vitro überprüft werden, da keine pflanzlichen Spleissextrakte verfügbar sind. Zukünftige Experimente sollten sich damit beschäftigen, ob atSRp30 tatsächlich seine eigene Produktion selbst regulieren kann. 



   Überexpression von atSRp30 beeinflusst die Auswahl der Spleissstelle bei mehren pflanzlichen pre-mRNAs und führt zu Veränderungen in der Pflanzenentwicklung 
Zahlreiche Versuche in vitro und in vivo haben gezeigt, dass menschliches SF2/ASF in die Auswahl von 5'-Spleissstellen involviert ist, indem es kooperativ an diese Stelle (Zuo und Manley 1994) und an U1 snRNP (Kohtz et al. 1994 ; Jamison et al. 1995 ; Zahler und Roth 1995) bindet. 



  Wie andere SR-Proteine beeinflusst SF2/ASF weiters teilweise die Auswahl der Spleissstelle, indem es an Verstärkersequenzen bindet, die in intronischen oder exonischen Regionen häufig vorhan- den sind. Durch das Binden an diese Elemente aktiviert das Protein das Spleissen durch Rekrutie- ren des   Spleissmechanismus   an eine benachbarte Spleissstelle mit Hilfe von Protein-Protein- Wechselwirkungen (Wu und Maniatis 1993; Amrein et al. 1994 ; Zuo und Manley 1994).   Arabi-   dopsis atSRp30 war aufgrund seiner Ähnlichkeit mit menschlichem SF2/ASF und seinem besonde- ren Expressionsmuster ein guter Kandidat für einen Spleissmodulator.

   Die Fähigkeit, atSRp30 in ganzen Pflanzen stabil zu überexprimieren, die gangbar blieb, ermöglichte es uns, zum erst Mal die Auswirkungen erhöhter SR-Proteinwerte auf das alternative Spleissen spezifischer endogener Transknpte festzustellen. Es waren einige, jedoch nicht alle getesteten endogenen Transknpte betroffen Bei atSRp30 pre-mRNA selbst und tSRp34/SR1 pre-mRNA wurden intronische alternati- ve 5'-Spleissstellen aktiviert, während bei atSRp31 und U1 70K pre-mRNAs die Verwendung der normalen Spleissstellen allgemein erhöht, jedoch variabel war. Wir haben keine Erklärung für diese Variabilität bei einzelnen Transformanten (siehe Fig. 8), da die atASp30 Proteinwerte bei mehreren pC30-Transformanten ähnlich waren (Fig. 6C).

   Die deutlichste Auswirkung der Überexpression von atSRp30 betraf das Spleissmuster des engen Homologen atSRp34/SR1, bei welchem die bevor- zugte Verwendung der alternativen 5'-Spleissstelle hauptsachlich zu einer mRNA-Rumpf-lsoform, atSRp34s, und zu so gut wie keinem   atSRp34/SR1-Protein   führte. Obwohl wir bis jetzt keine Infor- mationen über die Aktivität des kleineren atSRp34s haben, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die normale Expression von atSRp30-Protein in den gleichen Zellen, die atSRp34/SR1 trans- 

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 kribieren, für die Synthese von authentischem atSRp34/SR1-Protem wichtig ist. Diese regulatorische Schleife könnte die unterschiedlichen Expressionsmuster beider Faktoren in Wurzelgewebe und jungen Setzlingen erklären.

   Es muss jedoch noch ermittelt werden, ob es einen reziproken
Effekt der Überexpression von atSRp34/SR1 auf das alternative Spleissen von atSRp30 pre-mRNA gibt. 



   Pflanzen, die atSRp30 überexprimieren, zeigten konstitutiv und ubiquitär interessante Verände- rungen in der Morphologie sowie in mehreren Aspekten ihrer Entwicklung Obwohl einige Details noch genauer untersucht werden müssen, können viele Unterschiede durch Veränderungen in den
Phasenübergängen und in der Definition der Schicksale der Zellen erklärt werden. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass atSRp30 die Expression anderer Gene drastisch verandern kann, indem es ihre Spleissmuster beeinflusst. Da das Expressionsmuster von atSRp30 normalerweise sehr gewebespezifisch ist, könnten einige der beobachteten Auswirkungen der Überexpression einfach durch seine Expression in ungeeigneten Geweben verursacht worden sein, wo es die Expression von Genen beeinflusst, die nicht die natürlichen Ziele dieses Spleissfaktors sind.

   Ausserdem kann der beobachtete Rückgang der Expression des Spleissfaktors atSRp34 beim Überexprimieren von atSRp30 seinerseits die Expression anderer Gene beeinflussen, was zu den beobachteten Veränderungen des Phanotyps führt Die Veränderungen bei der Trichomentwicklung, die zu zusätzlichen Verzweigungen führen können, kann andererseits die Überexpression von atSRp30 in der Stützzelle des Trichoms widerspiegeln, die eine normale Stelle fur die Expression von atSRp30 ist. Da her kann es sich bei atSRp30 um eine Determinante der Trichomentwicklung handeln.

   Es bleibt ein kntisches Ziel, die natürlichen Regulierungsziele von atSRp30 zu finden, um die beobachteten Veränderungen des Phänotyps zu erklären, sowie um unser Verständnis der Entwicklungswege bei Pflanzen zu erweitern 
Zwei SF2/ASF-ähnliche Faktoren bei Arabidopsis 
Die Immunblot-Analyse mit mAb104 wies vorher darauf hin, dass die Komplexität der SRProteinfamilie bei Tieren grosser ist als bei Pflanzen (Lopato et al 1996a), da mehrere Proteine mit grösserer Molekülmasse in SR-Präparationen von Säugetieren, jedoch nicht von Pflanzen, identifiziert worden sind. Die Existenz von zwei SF2/ASF-ähnlichen Faktoren in Arabidopsis kann das Fehlen von Orthologen anderer Mitglieder der SR-Proteinfamile kompensieren. Die ähnliche Genstruktur von atSRp30 und atSRp34/SR1 ist ein Hinweis für ein fruheres Genverdoppelungsereignis. 



  Es ist interessant, dass das vorletzte lange Intron in beiden Genen erhalten ist und in die alternativen Spleissereignisse involviert ist. Aus der Northern Blot-Analyse von RNAs verschiedener Pflanzenorgane ist zu schliessen, dass das Verhältnis der verschiedenen   SR-Protem-mRNAs   ziemlich variabel ist und möglicherweise in der Häufigkeit der resultierenden Proteine widergespiegelt wird. 



  Bei beiden Genen führt das alternative Spleissereignis zu vorhergesagten Proteinen mit einer RSRumpf-Region und einigen neuen, zusätzlichen Carboxy-terminalen Aminosäuren. Während ein kürzeres Protein von atSRp34/SR1 bei atSRp30 überexprimierenden Pflanzen deutlich erkennbar war, beobachteten wir bei diesen Pflanzen nie atSRp30s, obwohl die entsprechende alternativ gespleisste mRNA in grosser Menge vorhanden ist. Die Expression von atSRp30s cDNA in Escherichia coli ergab stabiles Protein (Daten nicht angegeben).

   Daher wird entweder mRNA3 nicht effizient übersetzt, oder sie wird über einen vorzeitigen, von einem Nonsense-Kodon mediierten Abbauweg abgebaut, oder atSRp30s wird bevorzugt von einem der pflanzlichen Protemabbausysteme erkannt
Eine Vergleichsanalyse von atSRp30 mit allen bekannten pflanzlichen und tierischen SRProteinen ergab, dass es ein Paralog von atSRp34/SR1 ist und dass beide Arabidopsis-Proteine dem menschlichen SF2/ASF am nächsten sind Der grösste strukturelle Unterschied besteht darin, dass atSRp30 keine G-reiche Region zwischen den beiden RRMs hat, was die Flexibilität und möglicherweise die Spezifität der RNA-bindenden Region beeinflussen kann.

   Die Annahme, dass die beiden Proteine unterschiedliche Aktivität haben könnten, wird von der Beobachtung erhärtet, dass ihre Expressionsmuster in vielen Fällen ziemlich verschieden sind, wie in Fig. 5 dargestellt ist Im Allgemeinen ist die Expression von atSRp30 mehr auf spezialisierte Zelltypen und Gewebe beschränkt, wie Trichome, Keimblätter oder laterale Wurzelanlagen, was darauf hinweist, dass dieses Protein bei der Initiierung der Organbildung eine besondere Rolle spielt, wahrend atSRp34/SR1 in 

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 Meristemgewebe stärker exprimiert wird. Weiters weisen unsere immunologischen und Sequenz- daten darauf hin, dass atSRp34/SR1 hSF2/ASF ähnlicher ist als atSRp30.

   In ihrer Gesamtheit wei- sen diese Daten darauf hin, dass atSRp34/SR1 ein allgemeinerer Spleissfaktor ist, ähnlich wie hSF2/ASF, während atSRp30 speziellere Funktionen haben könnte und möglicherweise als ein regulierender Spleissfaktor fungiert, der das alternative Spleissen und die Genexpression in spezifi- schen Zelltypen moduliert. atSRp30-Protein aus Tomate (Lycopersicon esculentum) 
Aus den GenBank-Eintragen   AI482838.1   (EST242161), BE353486. 1 (EST353683), BE461419. 1 (EST412838), 
BE433884. 1 (EST404962), BE460305. 1 (EST411640), BE463264.1 (EST354487),   AW224111 1 (EST300922), AW223522. 1 (EST300333), BE433888.1 (EST404966),     AI896966.1   (EST266409), A14910201 (EST241729) wurde eine Consensus-Sequenz zusammengestellt (Fig. 10A) und diese translatiert (Fig.

   10B) Dies ergab ein Protein mit einer Länge von 285 Aminosäuren und einem errechneten Molekular- gewicht von 32.731. 



   Dieses Protein wurde nunmehr mit den beiden Spleissfaktoren aus Arabidopsis thaliana vergli- chen, nämlich mit dem atSRp30-Molekül (Fig. 10C und 10D) sowie mit dem ASF/SF2-Homologen aus Arabidopsis thaliana (atSRp34; Fig. 10E). Mit atSRp30 ergab sich ein Alignment auf einer Län- ge von 268 bzw. 256 Aminosäuren, wobei 187/264 bzw. 180/252 identisch und 209/264 bzw. 



  203/252 positiv waren. Für atSRp34 ergab das Alignment eine Länge von 303 Aminosäuren, jedoch lediglich 187/302 (61 %) identische und 212/302 (69 %) positive Aminosäuren. 



   Daraus ergibt sich, dass die Proteinsequenz, die aus Lycopersicon esculentum cDNA-Klonen generiert worden ist, eine höhere Homologie zum   Splicing-Modulatur   atSRp30 aus Arabidopsis thaliana aufweist als zu atSRp34, wobei insbesondere die Glycin-reiche Verbindungsregion, die charakteristisch für atSRp34 ist, in der vorliegenden Tomatensequenz ebenso abwesend ist wie in der atSRp30-Sequenz aus Arabidopsis. Auch dies belegt die engere Verwandtschaft der Sequenz aus Tomate zu atSRp30. 



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   SEQUENZPROTOKOLL < 110 > ìsterreichisches Forschungszentrum Seibersdorf Ges 
Barta, Andrea 
Lopato, Sergyi 
Kalyna, Maria 
Dorner, Silke < 120 > Splei faktor < 130 > splei faktor < 140 >   PCT/ATOO/00100   < 141 > 2000-04-20 < 150 > A 727/99 < 151 > 1999-04-23 < 160 > 22 < 170 >   Patentin Ver. 2.1   < 210 > 1 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen   Sequenz:Pnmer   < 400 > 1 aaatgagctc aaatgtatat gtatggaaaa acc 33 < 210 > 2 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen   Sequenz:Pnmer   

 <Desc/Clms Page number 23> 

 < 400 > 2 aatgagctcg aaacgatatc ttcaaaaaaa aac < 210 > 3 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:

  Primer < 400 > 3 aaactggatc cagaacaatc taacgctttc tcg < 210 > 4 < 211 > 31 < 212 > DNA < 213 > Kunstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz :   Primer   < 400 > 4 atataggatc ctcaaccaga uaucacaggt g < 210 > 5 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz Primer < 400 > 5 aaatatctag agatctcaaa tcgacgacc < 210 > 6 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Pnmer < 400 > 6 atataggatc ccattttacc tcgatggac < 210 > 7 < 211 > 28 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kunstlichen Sequenz:Primer 

 <Desc/Clms Page number 24> 

 < 400 > 7 aatgagctct gtgtcacctg ctagatcc < 210 > 8 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:

  Primer < 400 > 8 atataggatc cagatatcac aggtgaaac < 210 > 9 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Primer < 400 > 9 ataggatcca ggagcagaag tcccaaggca aag < 210 > 10 < 211 > 32 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Pnmer < 400 > 10 aaagtcgaca gaaggtagag gagatcttga tc < 210 > 11 < 211 > 31 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen   Sequenz:Pnmer   < 400 > 11 aaactaagct tggtatcttc ttccctgcaa g < 210 > 12 < 211 > 37 < 212 > DNA < 213 > Kunstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen   Sequenz:

  Primer   

 <Desc/Clms Page number 25> 

 < 400 > 12 aaacctaggc ggctactcag ctgatacctc agagcag < 210 > 13 < 211 > 34 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Primer < 400 > 13 aaactaagct taaatattga accggcctcg gttc < 210 > 14 < 211 > 37 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:

   Primer < 400 > 14 aaactggatc ctcttcctgt tggtcgtcga cgatttg < 210 > 15 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Primer < 400 > 15 aaactggatc ctcttccttt atcaaatcc < 210 > 16 < 211 > 30 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Primer < 400 > 16 atataccatg ggtagccgat ggaatcgtac < 210 > 17 < 211 > 24 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:Primer 

 <Desc/Clms Page number 26> 

 < 400 > 17 atataccatg ggcagtcgtt cgag 24 < 210 > 18 < 211 > 4044 < 212 > DNA < 213 > Unbekannt < 220 > < 223 > Beschreibung des unbekannten Organismus:

  Genom atSRp30 < 400 > 18 agacaaagat gcttacttct taaacatgtt cgaggtttat tgaaaatgat caccagcttc 60 taactatggt atcttcttcc ctgcaagcga acagtggaag atgattgata acggaaatat 120 cggaacatca ctcaacaaac caaaaatttg gacatcatat cgcaacaaat tcaataggaa 180 aaatactgaa attccaaaac agaaaaacca aacggaacag agcaggaact cacggactga 240 gagagaccgt ggacggtgtc acggcggaaa atggtcttgg acggagttac taatcggcga 300 attgagattt gagaggtggt agtagaggaa ccgagagaat gtttctctca aaaaaatccc 360 caagtgtttc cgatctagtg tctcttttgt ccaaaaacga cagtgtttag gaaacctagg 420 agaatgaatg acccgatggt ccgaatccga ttcgaaattg gttcgaattg taataactaa 480 catacaatat tccggtttga atgataagaa aaaacacatt cgatccggtt agaacaatat 540 attaacaggc ccattaaaac atatgggccg atcttgatca actgggctat tcatcgttga 600 tacatgcggc cgcacaggat taaaatccag ttccgtttta taaaaggata ctagtttcca 660 aacgaacggt ggttgtctcc tttccagaac aatctaacgc tttctcgaac atcttcttct 720 tcttctttct cgaaattatt 

  tttccagtaa tcaatttctt ctcttctaga tttttacagg 780 aactaatttt ctgctctgag gtatcagatg agtagccgat ggaatcgtac gatctacgtt 840 gggaatttgc ctggagatat tcgcaagtgt gaggttgaag atctcttcta caaggtttga 900 aaatttcctc ttttctctcg ataaaaattg aattcattat gactagtttg ggttcataaa 960 tttgcaattc tgtcttgctg agacaattta aatcgactct tatgtatatt tgtttcagta 1020 tggaccaatt gtggacattg atttgaagat tccaccgaga cctcctggtt atgcctttgt 1080 cgaggtatat tgatcaagta caaatttgtt tttttcttct tcttgtaata gtataggcta 1140 atgactaaga tagtttgtta ttggtggcag tttgaagatc ctcgtgatgc agacgatgca 1200 atttatggac gtgatggtta tgattttgat gggtgtcgac ttcgggttag taaacgcatg 1260 atgaaagcta gcttaatttt ctgtaatttc ttgtaaaggt gttatctttg tgtgatgttt 1320 ttaggttgag attgcacatg gtggtcgtag attttcacca tcagttgata ggtacagcag 1380 cagctacagt gcgagccgtg caccttcaag acgctctgac taccgcggtt tgtagagtct 1440 tctcgattgt gttatttggt gttgtgtaaa attttatatt tgaaaactca tttttactac 

  1500 ctaaacatgt agtgcttgtg accggattac cgccttctgc ttcgtggcag gaccttaagg 1560 taagggacac tatatagtct ttttctctga atgttggttc tctatatcat gttttggatt 1620 tatctctttt ctgaaatgat gttatttgct atttacgggt gattaggatc acatgcgcaa 1680 agctggagat gtctgcttct ctgaagtttt ccctgaccgt aaaggtgagt tgacattcga 1740 tagtttggat aagctttttg attgatgtgt tagtaaatta gtctttgtga aggagaatag 1800 gtgttaagca tctgaactgc taaactcaca ttcagtattt ctttgtaggc atgtctgggg 1860 ttgtggatta tagcaactat gatgatatga agtacgcagt aagttttata tctttgcaac 1920 gcaaatgttc ctggacttat gccttagact gcttttgttt catagtatac cgagctgaat 1980 ttatcttcct ggaggccagt gttggatctt tgatgttccc ttaaaatttt tgatgtgaca 2040 gataaggaaa cttgatgcca ctgaatttcg aaatgctttc tctagtgctt atatacgggt 2100 atgttgtatt gctttctttg attttgttaa gcataagtgg atatggagtc atctctgaat 2160 ttactgttca ggtgagggaa tatgagtcga ggagtgtgag tcgaagccca gatgattcta 2220 aaagctatag aagcaggagt cggagccgtg 

  gtccaagctg tagctatagt agcaagagca 2280 ggaggtcttt tttttttttt ttttttcata aacctaagac atataaggga tttttattgt 2340 aacttattta tgaaattaac tgacttctaa atgcaatgca gtgtgtcacc tgctagatcc 2400 atttccccgc gttcacggcc ccttagtcgt tctcgctcgc tatacagctc tgtctcaagg 2460 tatgagtgtt agatttgtat cattattata tatgtagtta ccccttcatg gatcacttgt 2520 

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 tcttgcatag tgaactcctt actagcttta ttacttacaa ctaagcacct tttgttgctt 2580 ccgtacacag ttgaatttgt ttgagtcttt tttccctcat agtggactag tctattgtca 2640 cttgattttc ttcctttgtt gatgttttct atgtcatgca aactccaata tgggtaaagg 2700 ttacctcctt gtttgggatt accagagttc cttttcattt cttacacgtg aatgtgtttg 2760 ttttttatgt tttgagttct tgacagagat gctcccatca tatttagtcc ttttcctttc 2820 tctttgtgtc gttctcttct ggatgtttcc ttctgataaa gctttacttc ttaacttttt 2880 tccagcgacg gtgaatttat tacgtatcaa cctcaatatc cgacctataa tttaaagaac 2940 acttagctag atgttcactt ttgaaaattt 

  atttctatcg gaagggggca gatgatttct 3000 gaggcatgtc ctcgatcatt taccgtgatt acaattgtat tgcgttgttt gtttctagat 3060 ctggctcact gctacgagct ggggattgga tctagatggg tcatctagat ggattcttgg 3120 actggattta caaagctgga ttagcatgaa ctgaacttct gttttacggt ctggtctggt 3180 ctggtactcc gcgcgtatca gctgtaggat ctgatcgcaa agttttggac tatgattact 3240 ctgattcctc aatatattta tctttttgac aatagtggat tctgtgttga gttcttttct 3300 aggacagcat ttaagctccc gggactagat gggagatggt cagtaaattt ctttgttatg 3360 ccacacttac atggggtttt tcggtcttgc tgcaggtccc aatcaagatc aaaatcaaga 3420 tcaagatcaa gatcgaattc tccagtttca cctgtggtaa gtctaaaagc tgaaccttct 3480 ttaattcaca atccatgtgt ttgtttaaat acctgctcac tttggttgtt cttcaatcaa 3540 caccaactta acgaaatcat gagacagact ataaaatttg aagagtctgt agaacgacta 3600 ggtctcacca acctctgtgt gcactaaaaa tcgcctctcc aagtgtttca gcaacataat 3660 ctacctctgt catgtgttat catttcttct tctcttaacg gtattacata ttatgttttg 3720 

  caggtgatat ctggttgaaa atgaaaactg gccactggct gtacccgaat cgtctcaagc 3780 ttctcaggct ccactgctaa tagaatttga ttccgatttg ggattattat actggtcttc 3840 ttgtatggga cgaccaatat gtctttctag ttttagttgt gaacctggaa ttggtctgtt 3900 attgtgtcat taaaaagccg gaaactctgt ctcggctgca taataaagtt catcagacat 3960 tgtgttgggt gtggtgaggt ttttccatac atatacattt acattacaac tactggtgtc 4020 ttttatgatt atcttaaact aaac 4044 < 210 > 19 < 211 > 279 < 212 > PRT < 213 > Unbekannt < 220 > < 223 > Beschreibung des unbekannten Organismus:

  Genom atSRp30 < 400 > 19 Met Ser Ser Arg Trp Asn Arg Thr lle Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly   1 5 10 15   Asp lle Arg Lys Cys Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Pro
20 25 30 lle Val Asp lle Asp Leu Lys lle Pro Pro Arg Pro Pro Gly Tyr Ala
35 40 45 Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Ala Asp Asp Ala lle Tyr Gly
50 55 60 Arg Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Gly Cys Arg Leu Arg Val Glu lle Ala 65 70 75 80 His Gly Gly Arg Arg Phe Ser Pro Ser Val Asp Arg Tyr Ser Ser Ser
85 90 95 

 <Desc/Clms Page number 28> 

 Tyr Ser Ala Ser Arg Ala Pro Ser Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Val Leu 
100 105 110 Val Thr Gly Leu Pro Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu Lys Asp His 
115 120 125 Met Arg Lys Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Glu Val Phe Pro Asp Arg 
130 135 140 Lys Gly Met Ser Gly Val Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Asp Asp Met Lys 145 150 155 160 Tyr Ala lle Arg Lys Leu Asp Ala Thr Glu Phe Arg Asn Ala Phe 

  Ser 
165 170 175 Ser Ala Tyr lle Arg Val Arg Glu Tyr Glu Ser Arg Ser Val Ser Arg 
180 185 190 Ser Pro Asp Asp Ser Lys Ser Tyr Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Gly 
195 200 205 Pro Ser Cys Ser Tyr Ser Ser Lys Ser Arg Ser Val Ser Pro Ala Arg 
210 215 220 Ser lle Ser Pro Arg Ser Arg Pro Leu Ser Arg Ser Arg Ser Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ser Val Ser Arg Ser Gly Ser Leu Leu Arg Ala Gly Asp Trp lle 
245 250 255 Ser Gln Ser Arg Ser Lys Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Asn Ser Pro 
260 265 270 Val Ser Pro Val lle Ser Gly 
275 < 210 > 20 < 211 > 1132 < 212 > DNA < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz.

   atSRp34/SR1 < 400 > 20 aggagcagaa gtcccaaggc aaagtcttca cgtaggtccc ctgcaaaatc tacatcaaga 60 tctcctggcc cccgctcgaa gtcaaggtca ccgtctccaa gaaggtaatg atttgattcc 120 ttttcagaat gcaccaggca acattactta gtcggtagat tttcctgtga agtttatgaa 180 aatctgatta gaaaagtcat tgttgatgct caaagttctt gttgattgag catatactgg 240 ttttttgttg acacctgctg tttgctcgtc attattgtcc cttcttactc catccttata 300 tttagatgct tagccctttt ctggttaaga tttgcgagat tggccttaca tttttagcat 360 ttttaaatat gctcttttct ttcctgagaa gaaaatggtt ttgtttcata gatatggatt 420 tacatacgac tagaaaatgg aaattaatat ctggatggaa attgattgtt gacaagtgtt 480 tcgtctaaga ggtatgggaa actttggaat agagactttg cttttcgtgg cttcctgata 540 tagtattcac taatttacat tgctgctaga tggataacag tggagacatt ggatcacttg 600 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 gatcacaata ttatatcggg atttctgtaa aactatattg gctcgatgga ttgacaatat 660 ggaatctggg ctctcttggg acgtacgtgg ctcatttggc aacacaagtt tttttcgcca 

  720 catggcttat aaaacctctg tcctatcacc tatgttttaa ctaagtagca gaatagtttg 780 gtttatgttc ctttttttta tttgttgcaa cttcttaatc tctgtgagat agaaggagag 840 gctccaggac cttgctgaac agtataaaac acaacatgtt tggatttttg aatctgagtt 900 tcttttcttg gacttttgca gatcgcgttc aagatcaaga tctcctctac cttctgtgag 960 taacaagatc caacttgtga cccctctttt attttgacat aatcttctgt tttacattgt 1020 tcgttatctt aatagctttt ctgtatcaca ggttcagaag gaaggaagca agagccctag 1080 caagccaagt ccagccaaga gtcctatcca cactaggagt ccatcgaggt aa 1132 < 210 > 21 < 211 > 78 < 212 > PRT < 213 > KÜnstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der kÜnstlichen Sequenz:

  atSRp34/SR1 < 400 > 21 Arg Ser Arg Ser Pro Lys Ala Lys Ser Ser Arg Arg Ser Pro Ala Lys
1 5 10 15 Ser Thr Ser Arg Ser Pro Gly Pro Arg Ser Lys Ser Arg Ser Pro Ser
20 25 30 Pro Arg Arg Tyr Gly Phe Thr Tyr Asp Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser
35 40 45 Pro Leu Pro Ser Val Gln Lys Glu Gly Ser Lys Ser Pro Ser Lys Pro
50 55 60 Ser Pro Ala Lys Ser Pro lle His Thr Arg Ser Pro Ser Arg
65 70 75 < 210 > 22 < 211 > 248 < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 400 > 22 Met Ser Gly Gly Gly Val lle Arg Gly Pro Ala Gly Asn Asn Asp Cys   1 5 10 15   Arg lle Tyr Val Gly Asn Leu Pro Pro Asp lle Arg Thr Lys Asp lle
20 25 30 Glu Asp Val Phe Tyr Lys Tyr Gly Ala lle Arg Asp lle Asp Leu Lys
35 40 45 Asn Arg Arg Gly Gly Pro Pro Phe Ala Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro
50 55 60 Arg Asp Ala Glu Asp Ala Val Tyr Gly Arg Asp Gly Tyr Asp Tyr Asp
65 70 75 80 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 Gly Tyr Arg Leu Arg 

  Val Glu Phe Pro Arg Ser Gly Arg Gly Thr Gly 
85 90 95 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Arg Tyr 
100 105 110 Gly Pro Pro Ser Arg Arg Ser Glu Asn Arg Val Val Val Ser Gly Leu 
115 120 125 Pro Pro Ser Gly Ser Trp Gin Asp Leu Lys Asp His Met Arg Glu Ala 
130 135 140 Gly Asp Val Cys Tyr Ala Asp Val Tyr Arg Asp Gly Thr Gly Val Val 145 150 155 160 Glu Phe Val Arg Lys Glu Asp Met Thr Tyr Ala Val Arg Lys Leu Asp 
165 170 175 Asn Thr Lys Phe Arg Ser His Glu Gly Glu Thr Ala Tyr lle Arg Val 
180 185 190 Lys Val Asp Gly Pro Arg Ser Pro Ser Tyr Gly Arg Ser Arg Ser Arg 
195 200 205 Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Asn Ser Arg Ser Arg 
210 215 220 Ser Tyr Ser Pro Arg Arg Ser Arg Gly Ser Pro Arg Tyr Ser Pro Arg 225 230 235 240 His Ser Arg Ser Arg Ser Arg Thr 
245 
PATENTANSPRÜCHE: 1.

   Protein mit einer atSRp30-Spleissfaktor-Aktivität in Pflanzen, welches bei Überexpression zu einer trunkierten mRNA-Isoform eines atSRp34/SR1-Protein führt, wobei das Protein mit atSRp30-Spleissfaktor-Aktivität - die Aminosäuresequenz des Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 aufweist, oder - zumindest 90 % Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des 
Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 aufweist, oder - das dem in Seq.ID.No. 19 entsprechende Protein aus einer anderen Pflanze als Arabi- dopsis thaliana entspricht.

Claims (1)

1. 2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 4, 7 bis 19, 22 bis 72, 74 bis 85, 96 bis 141,149 bis 153,156 bis 172, wobei Amino- säure 168 variabel, jedoch nicht Asp oder Asn ist, des Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 auf- weist 3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäurese- quenz enthält, die zumindest 95 % Identität mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 aufweist.

   4 Protein nach einem der Anspruche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Amino- sauresequenz enthält, die zumindest 98 % Identitat mit der Sequenz der Aminosäuren 1 <Desc/Clms Page number 31> bis 85 und 96 bis 222 des Proteins gemäss Seq.ID.No. 19 aufweist.

   5. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, dass es - eine Nukleinsäuresequenz gemäss Seq.ID.No. 18 umfasst oder - eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert oder - eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die unter stringenten Bedingungen an das Nuk- leinsäuremolekül gemass Seq ID.No. 18 bindet und für ein in Pflanzen aktives Spleiss- protein kodiert oder dazu komplementär ist.

   6. Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5 umfasst.

   7 System, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, und eine Nukleinsäure, die - für das atSRp34/SR1-Protein aus Arabidopsis thaliana oder - für das dem in Seq.ID.No. 20 entsprechende Protein aus einer anderen Pflanze als Ara- bidopsis thaliana kodiert, wobei mindestens eine der Nukleinsäuren unter Kontrolle eines nicht natürlicher- weise mit diesen Nukleinsäuren verbundenen Promotors steht.

   8. System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass beide Nukleinsäuren von Promo- toren kontrolliert werden, die nicht natürlicherweise mit diesen Nukleinsäuren verbunden sind.

   9. System nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Pro- motoren, unter deren Kontrolle die Nukleinsäuren stehen, ein induzierbarer Promotor ist.

   10. System nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäu- re, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, unter Kontrolle eines Promotors steht, der eine Überexpression dieses Proteins bewirkt.

   11 System nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklein- säure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, unter Kontrolle eines Promotors steht, der unter definierten Bedingungen die Expression dieses Proteins unter- bindet und unter definierten anderen Bedingungen die Expression dieses Proteins ermög- licht.

   12. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 expnmiert.

   13. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäu- remolekül nach Anspruch 5 oder einen Vektor nach Anspruch 6 umfasst.

   14. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein System nach einem der Ansprüche 7 bis 11umfasst.

   15. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Nukleinsäure nach Anspruch 5, eines Vektors nach Anspruch 6 oder eines Systems nach einem der Ansprü- che 7 bis 11 zur Veränderung der Spleisseigenschaften einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze.

   16. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Nukleinsäure nach Anspruch 5, eines Vektors nach Anspruch 6 oder eines Systems nach einem der Ansprü- che 7 bis 11zur Veränderung des Entwicklungsverhaltens einer Pflanze.

   17. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Nukleinsäure nach Anspruch 5, eines Vektors nach Anspruch 6 oder eines Systems nach einem der Anspru- che 7 bis 11 zur Verzögerung des Blütenansatzes von Pflanzen.

   18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Verzögerung des Blü- tenansatzes gegenüber dem Wildtyp zumindest 15 %, vorzugsweise zumindest 25 % ausmacht.

   HIEZU 11 BLATT ZEICHNUNGEN