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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse der DNA von Süsskartoffeln. Nachdem
Columbus die Süsskartoffel in Spanien eingeführt hatte, verbreitete sie sich nach Afrika, Indien,
Asien und Ozeanien und wurde in diesen Teilen der Erde zu einer wichtigen Feldfrucht. Es ist möglich, dass die Verbreitung der Süsskartoffel ausserhalb Amerikas auf eine beschränkte Anzahl von Genotypen beschränkt war. Im Gegensatz zu dieser Annahme sind jedoch viele verschiedene
Phänotypen (Genotypen) auf der ganzen Welt zu finden, was die Folge des grossen Masses der bei der Süsskartoffel zu findenden Heterozygotität sein könnte. Die Süsskartoffel ist ein auskreuzendes
Hexaploid, und die Variation durch sexuelle Reproduktion und somatische Mutation kann durch vegetative Fortpflanzung behalten werden.
Auf der ganzen Welt gibt es mehrere Keimplasmasammlungen; CIP (Lima) hat mehr als 4000
Zugänge der Süsskartoffel zusammengetragen. Die Aufrechterhaltung der grossen Anzahl von Arten erfordert grosse Bemühungen, was es notwendig macht, das Ausmass der Diversität der Süsskartof- fel-Zugänge zu quantifizieren, um die Reduktion der Anzahl der gelagerten Proben zu ermöglichen und dadurch die Keimplasmakonservierung zu erleichtern.
Während der letzten Jahrzehnte sind mehrere Markersysteme für das Genotypisieren entwickelt worden, die auf die Süsskartoffel angewendet werden konnten, wie RAPD (Jarret et al.,
1992 ; Gichuki et al., SSR (Tautz 1988) und AFLP (Zabeau und Vos 1993, Gichuki et al.). Amplifi- zierter Fragment-Längen-Polymorphismus (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) und einfache Sequenzwiederholungen (Simple Sequence Repeats, SSR) oder Mikrosatelliten sind in letzter Zeit für die Erstellung von Fingerabdrücken und phylogenetische Studien beliebt geworden.
Es ist auch berichtet worden, dass AFLP-Assays eine bessere Reproduzierbarkeit in den
Laboratorien haben als RAPDs (Jones et al., 1997), es wurde jedoch gezeigt, dass AFLP-Stellen innerhalb des Genoms Cluster bilden, wodurch die Konstruktion von Linkage-Maps schwierig wird.
Waugh und seine Mitarbeiter haben ein neues Verfahren entwickelt, den sogenannten sequenzspezifischen amplifizierten Polymorphismus (Sequence-Specific Amplified Polymorphism,
S-SAP) (Waugh et al., 1997). Dieses Verfahren ähnelt dem AFLP, das S-SAP-System produziert jedoch amplifizierte Fragmente, die die Sequenz der langen Terminalwiederholung (Long Terminal
Repeat, LTR) des Retrotransposon an einem Ende und eine mit der Wirts-Restriktionsstelle verbundene flankierende Adaptersequenz am anderen Ende enthalten, wobei sie einzelne Retro- transposon-Einfügungen als Bande auf einem Acrylamidgel für das Sequenzieren zeigen Ellis et al., 1998; Waugh et al., 1997).
Unter Verwendung des ursprünglichen AFLP-Protokolls digerieren Waugh et al. die genomi- sche DNA von Gerste mit zwei Restriktions-Endonukleasen, einem seltenen (Pstl) und einem häufigen (Msel) Schneide-Enzym und adaptieren mit Restriktionsenzymdigestionsstellen- spezifischen Adaptern. Das Verfahren besteht aus zwei aufeinanderfolgenden PCRs (Polymerase Change Reactions). In der ersten wurde die digerierte Templat-DNA voramplifiziert, um Restrik- tionsfragmente der richtigen Grösse und Konfiguration auszuwählen und zusammenzuballen, wobei ein mit den Adaptersequenzen homologer (P und M) Primer verwendet wurde. In der zweiten selektiven PCR-Reaktion wurden Y033P) ATP-markierte Bare-1 ähnliche LTR-Oligonukleotide und P oder M (Pst oder Mse-spezifische Primer mit 1-3 selektiven Nukleotiden) selektive Adapter- primer zugesetzt.
P und M Primer hatten die gleiche Sequenz wie die P und M Primer in der ersten Reaktion, schlossen jedoch ein bis drei zusätzliche selektive Nukleotide am 3'-Ende ein.
Das Touchdown PCR-Protokoll von Vos et al. (1995) wurde genau befolgt.
Ein erheblicher Vorteil des polymorphen Markersystems auf Retrotransposon-Basis liegt in der Tatsache begründet, dass die Klasse 1 Retrotransposons über ein RNA-Zwischenprodukt transpo- nieren, den sie vor dem Wiedereinfügen mittels reverser Transkription in DNA umwandeln, während das elterliche Transposon im Genom fixiert bleibt (siehe Übersicht Boeke 1989 ; 1996). Das bedeutet, dass das eingefügte Transposon seine Position während der Evolution des Genoms nicht ändert, aber jede Einfügung den Polymorphismus und die Grösse des Genoms anhebt. Solo LTR-Sequenzen, die in verschiedenen Genomen zu finden sind, was auf ein ungleichmässiges Crossing-over und/oder intrachromosomale Rekombinationsereignisse hinweist, könnten jedoch eingefügte Retrotransposonsequenzen löschen (Shirasu et al., 2000).
Retrotransposons sind in den Genomen aller Pflanzen vorhanden, angefangen von einzelligen Algen bis zu Angiospermen und Gymnospermen. Sie liegen üblicher Weise in einer grossen Anzahl von Kopien vor (von Hunderten bis Millionen), und zwischen ihnen wurde ein grosses Mass an
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Heterogenität (Aminosäureähnlichkeiten zwischen einzelnen Fragmenten konnten von 5 - 75% variieren) beobachtet (Flavell et al., 1992a Mol Gen). Im Vergleich zur Drosophila copia, Ty1 von
Pilzen oder auch tierischen Retrotransposons zeigen sie in Pflanzen ein erhebliches Ausmass an Sequenzheterogenität und insertionalem Polymorphismus sowohl innerhalb einer als auch zwischen den Arten (Flavell 1992 ; Boeke und Corces 1989).
Die am meisten untersuchte Gruppe von LTR-Retrotransposons ist die Gruppe Ty1-copia, die nach den am besten untersuchten
Elementen in Saccharomyces cervisiae und Drosophila melanogaster benannt ist (Boeke und Corces 1989, Grandbastien 1989, Schmidt 1996). Die LTR-Sequenzen sind als direkte Wieder- holungen an beiden Enden der Retrotransposons positioniert. Verschiedene Retrotransposon- familien haben verschiedene (nicht kreuzhybridisierende) LTR-Sequenzen. Die 5'- und 3'-LTR- Sequenzen sind zum Zeitpunkt der Einfügung ident, sie können sich jedoch durch Mutationen während der Zeit unterscheiden.
Phylogenetische Analysen der Retrotransposonsequenzen zeigen mit einigen signifikanten Ausnahmen, dass das Ausmass der Sequenzdivergenz in Ty1-copia-Retrotransposon-Populationen zwischen irgendeinem Artenpaar im Allgemeinen proportional zum evolutionären Abstand zwischen diesen Arten ist (Flavell, 1992b). Mehrere Autoren haben auch die Hypothese aufgestellt, dass Transpositionen die genetische Variabilität erhöhen könnten, die für den Organismus notwendig ist, um sich an verschiedene Umweltbedingungen anzupassen, und dass sie ein wichtiger Faktor bei der Evolution höherer Pflanzen sein können (McClintock, 1984 ; Schwarz- Sommer und Saedler, 1988 ; Wendel und Wessler, 2000).
Die chromosomale Verteilung der Retrotransposons von der Gruppe Ty1-copia in Pflanzen ist mittels Hybridisierung an Metaphase- Chromosomen in situ untersucht worden und hat gezeigt, dass diese Elemente über die gesamten Euchromatin und Heterochromatin-Regionen aller Chromosome in Pflanzen verteilt sind (Pearce 1996, Schmidt 1996, Heslop-Harrison 1997).
Die Einfügung eines Retrotransposons ist kein beliebiges Ereignis, sondern wird vom Element selbst und von Signalen gesteuert, die vom Wirtsorganismus und äusseren Faktoren abhängen. Es ist bekannt, dass Stresssituationen und Herausforderungen der Umwelt die Expression oder die Transposition mobiler Elemente stimulieren (Mhiri et al. , 1997 ; Grandbastien et al., 1997).
Trotz ihrer grosszügigen Verteilung sind die meisten Retrotransposonsequenzen wegen von Mutationen hervorgerufener fehlerhafter Strukturen inaktiv. Die einzigen aktiven Retrotransposons, von denen bekannt ist, dass sie mobil sind, sind Tto1 Tnt1 und Tnp2 von Tabak und Tos17 von Reis (Grandbastien 1989 ; 1992 ; 1993 ; 1996; Vernhettes 1997 ; Okamoto 2000), Bare-1-Element von Gerste und PDR1 von Erbsen (Pearce et al., 1997 ; Ellis et al., 1998).
Die allgegenwärtige Verteilung, die grosse Anzahl von Kopien und die weite chromosomale Verteilung der Retrotransposons in Pflanzen bieten ein hervorragendes Potential zur Entwicklung eines multiplexen Markersystems auf DNA-Basis.
In letzter Zeit ist von mehreren Markersystemen auf Retrotransposon-Basis berichtet worden.
Purugganan et al. (1995) analysierte Restriktionsstellenpolymorphismus auf einer einge- schränkten Region des Magellan-Retrotransposons und konnte selbst enge verwandte Zea mays- Unterarten unterscheiden. Waugh et al. veröffentlichten 1997 das S-SAP-Verfahren an Gerste und fanden, dass der Grad des Polymorphismus etwa 25% höher liegt als mit AFLP angezeigt wird.
Ellis et al. (1998) amplifizierten Sequenzen zwischen der Polypurinspur des PDR1-Retrotrans- posons und der 3' Taql (häufiges Schneide-Enzym) spezifischen Adaptersequenz, während Pearce et al. (2000) die gleiche S-SAP-Technik mit zwei anderen LTR-Sequenzen von Retrotransposons von Erbsen verwendeten (Tps12 und TPS19), wobei sie jedoch amplifizierte Fragmente zwischen 5'-LTR und einer flankierenden Adapter (Taql)-Sequenz erzeugten. Beide Primer enthielten selektive Nukleotide. Beide Experimente führten zu einem detaillierten Bild der Beziehung zwischen den Arten und innerhalb einer Art der Gattung Pisum. Gong-Xiu Yu und RP Wisa kombinierten AFLP, RAPD und S-SAP-Marker, um auf Basis einer rekombinanten, durch Inzucht erzeugten Population eine gesättigte Karte von diploider Avena herzustellen.
Im Vergleich mit den Ergebnissen von Waugh mit Gerste fanden sie ebenfalls, dass die von S-SAP erzeugten Marker gleichmässiger über das Avena-Genom verteilt waren.
Obwohl Waugh et al. postulierten, dass ihr Ansatz als ein allgemeiner Ansatz verwendet werden könnte, um Informationen über Links an einer Reihe anderer konservierter Sequenzen im
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Genom der Gerste zu erhalten, und dass dieser Ansatz auch auf jede andere Art angewendet werden könnte, stellte sich heraus, dass dieser S-SAP-Ansatz nicht allgemein auf die phylogene- tische Analyse jeglicher Pflanzenarten angewendet werden kann, nicht einmal auf Pflanzenarten, die der Gerste ähnlich sind. Ein Grund dafür liegt darin, dass der Ansatz mit dem Retrotransposon nach Waugh et al. sehr stark von der spezifischen Sequenz des gewählten Retrotransposons sowie auch von der allgemeinen Art des "Transposon" Hüpfens abhängt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Analyse der DNA von Süss- kartoffeln zur Verfügung zu stellen, das die phylogenetische und die Link-Analyse der Süsskartoffel ermöglicht, sowie ein Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung bietet also ein Verfahren zur Analyse der DNA der Süsskartoffel, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Zur-Verfügung-Stellung der DNA einer Süsskartoffel, - Aufbrechen der DNA in DNA-Stücke, - Einführung bekannter Sequenzen an mindestens einem der beiden Enden jedes DNA-
Stückes, - Zur-Verfügung-Stellung von mindestens zwei Primern, einem ersten Primer gemäss der
Formel
N)AGTCCTAACAN1N2NE (I) worin Nx ausgewählt ist aus A, C, G und T ; 0 bis 20 ist; N1 G, T, A oder nicht vorhanden ist; N2 A, C, G oder nicht vorhanden ist; N3 A, G, C oder nicht vorhanden ist ; eine dazu komplementäre Sequenz ; und einem zweiten Primer, der in der Lage ist, an die eingefügte Sequenz zu binden, - Amplifizieren der DNA der DNA-Stücke mit den Primern und - Analyse der amplifizierten DNA.
Überraschender Weise stellte sich heraus, dass mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, das dem von Waugh et al. verwendeten ähnlich ist, zur Analyse der DNA von Süsskartoffeln und zur Erstellung einer phylogenetischen und Link-Analyse verschiedener Süsskartoffel-Individuen von genetisch verschiedenen Süsskartoffelrassen verwendet werden kann. Es stellte sich heraus, dass ein spezifisches Retrotransposon der Süsskartoffel, das Str187 Retrotransposon, für die Analyse und die Unterscheidung ansonsten sogar sehr eng verwandter Süsskartoffel-Individuen äusserst gut geeignet ist und eine klare und deutliche phylogenetische Gruppierung dieser Individuen ermöglicht.
Im Allgemeinen wird mit dem vorliegenden Verfahren ein Primer, der auf die 5'LTR des Str187-Retrotransposons zugeschnitten ist, zusammen mit einem Primer verwendet, der sich 5' zu dieser 5'LTR-Sequenz an einem eingefügten Stück der DNA befindet.
Der Str187 LTR-Primer erwies sich als der am meisten polymorphe aller getesteten Sequen- zen, und es wurde gefunden, dass die einzelnen getesteten Süsskartoffeln eine äusserst hohe Variabilität in der Anzahl der Einfügungen aufweisen. In der Tat weist die schrittweise Erhöhung der Integrationsstellen darauf hin, dass das Str187 Retrotransposon in der jüngsten Vergangenheit aktiv war/ist.
Weiters stellte sich heraus, dass das erfindungsgemässe Verfahren viel verlässlicher und spezifischer ist als andere für diesen Ansatz bei anderen Pflanzengenomen getestete Verfahren, wie RAPD oder AFLP.
Daher ist es möglich, eng verwandte Kartoffelrassen genetisch voneinander zu unterscheiden und sie ihrem spezifischen Ursprung zuzuordnen.
Es gibt eine Reihe von bekannten Verfahren, um DNA physikalisch in Stücke zu zerbrechen.
Die bekanntesten sind statistisches oder definiertes Digerieren mit Restriktions-Endonuklease oder das mechanische Zerbrechen, z. B. durch Beschallung. Gemäss der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, die DNA durch Digestion mit Restriktions-Endonuklease zu brechen, vorzugsweise durch Digestion mit mindestens einem 6 bp Schneide-Enzym, insbesondere EcoRI.
Der erste im erfindungsgemässen Verfahren zu verwendende Primer amplifiziert effizient die 5'LTR von Retrotransposon Str187. Daher umfasst der Primer vorzugsweise in seiner (NX(n-Regin weitere Reste, die zu dieser Region komplementär sind. (Nx)n ist daher vorzugsweise z.B.
TAAGACTAAG oder AGACTAAG oder auch längere Sequenzen von 5'LTR.
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Da 5'LTR-Sequenzen mit 3'LTR-Sequenzen ident oder zumindest sehr ähnlich sind, könnte die Amplifizierung von DNA-Stücken, die 3' LTR-Sequenzen enthalten, negative Auswirkungen auf das erfindungsgemässe Verfahren haben. Daher werden die Primer vorzugsweise derart konstruiert, dass die Amplifizierung von Sequenzen, die 5' von 3'LTR-Sequenzen sind, ausgeschlossen wird, z. B. indem G, T oder A als N1 genommen werden (weil die erste Base 5' des 3'LTR ein G ist).
Solche Primer können auch in einer zweiten Runde der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, z. B. wenn die Multiplizität der Unterschiede ohne eine solche Einschränkung zu hoch ist.
Bevorzugte erste Primer sind daher ausgewählt aus AGACTAAGAGTCCTAACA, AGACTAAGAGTCCTAACAG, AGACTAAGAGTCCTAACAT, AGACTAAGAGTCCTAACAA, AGACTAAGAGTCCTAACAGC, AGACTAAGAGTCCTAACAGA, AGACTAAGAGTCCTAACAGG, AGACTAAGAGTCCTAACATA, AGACTAAGAGTCCTAACATG, AGACTAAGAGTCCTAACATC, AGACTAAGAGTCCTAACAAA, AGACTAAGAGTCCTAACAAG, AGACTAAGAGTCCTAACAAC oder Fragmenten davon, wobei diese Fragmente gegebenenfalls mindestens 10 bp des 3'-Teils dieser Sequenzen umfassen.
Die Einführung bekannter Sequenzen an mindestens einem der beiden Enden jedes DNA- Stücks (vorzugsweise natürlich am 5'-Ende) umfasst vorzugsweise das Schneiden der DNA mit einem Restriktionsenzym, gegebenenfalls unter Herstellung stumpfer Enden (auch abhängig vom Restriktionsenzym), und das Linken eines Adapters an das Ende. Dieser Adapter umfasst 2B eine bekannte Sequenz, wobei der zweite Primer derart konstruiert ist, dass der daran bindet. Anstelle des Herstellens stumpfer Enden, kann natürlich der Adapter mit einem Linker konstruiert werden, der auf diese Restriktionsstelle zugeschnitten ist.
Die Analyse der amplifizierten DNA wird vorzugsweise durch Auftrennen der amplifizierten Nukleinsäuremoleküle an Hand ihrer Grösse durchgeführt, z.B. mittels Gel-Elektrophorese. Solche Systeme können in einer stark automatisierten Form zur Verfügung gestellt werden und können von Robotern durchgeführt werden.
Die Stärke des erfindungsgemässen Verfahrens liegt darin, dass es verwendet werden kann, um die phylogenetische Verwandtschaft jeglicher zwei Süsskartoffel-Individuen mit verschiedenen Genotypen zu definieren. Zur Definition dieser Verwandtschaft wird ein erfindungsgemässes Ver- fahren mit jeder Süsskartoffel mit verschiedenen Genotypen durchgeführt, wodurch ein definiertes Ergebnis im Hinblick auf ihre spezifische Amplifikation erhalten wird (S-SAP-Analyse). Dann kön- nen diese Ergebnisse der Süsskartoffeln mit verschiedenen Genotypen miteinander verglichen werden. Da mit dem erfindungsgemässen Verfahren jede Süsskartoffel in dieser Analyse einen charakteristischen "Fingerabdruck" ergibt, können diese Fingerabdrücke miteinander verglichen werden, und ihre phylogenetische Verwandtschaft kann an Hand des Grades der Ähnlichkeit dieser Fingerabdrücke definiert werden.
Eine eindrucksvolle Demonstration der Stärke dieses Verfahrens wird im Abschnitt "Beispiele" gegeben.
Vorzugsweise umfasst der Schritt des Vergleichens das Analysieren einer Grössenauftrennung der amplifizierten Nukleinsäuren jeder Süsskartoffelart, Kartoffelrasse, Kartoffeluntergruppe etc.
Daher ist es möglich, zwischen geographischen Regionen und sekundären Verteilungsbereichen der spezifischen Süsskartoffelprobe zu unterscheiden.
Es gibt eine Reihe von Verfahren zum Vergleichen dieser "Fingerabdrücke", und vorzugsweise werden diese Vergleiche mit Hilfe von Computern durchgeführt. Es sind mehrere Computerpro- gramme für eine solche Analyse erhältlich, z. B. Genotyper, Treecon, TFPGA, Arlequin, Geno- grapher, RFLPSCAN etc.
Gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch ein Kit zur Durchführung der erfindungsgemässen Verfahren zur Verfügung gestellt, welches mindestens zwei Primer, wie sie hier definiert sind (ein erster und ein zweiter Primer) und eine Nukleinsäurepolymerase zum Amplifizieren von Nukleinsäure, die durch diese beiden Primer definiert wird, umfasst.
Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemässes Kit weiters auch einen Restriktionsenzym- spezifischen Adapter mit Primer, ein Ligase-Enzym zur Adapterligation, Puffer, Nukleotide, positive oder negative Kontrollen und Mischungen davon.
Gemäss einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Nuklein- säuremolekül, das (a) eine Sequenz gemäss Seq. ID. Nr. 1 oder (b) Sequenzen, die sich um nicht mehr als 1 b/bp pro 20 b/bp von dieser Sequenz unterscheiden oder (c) Sequenzen, die unter
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strengen Bedingungen (z. B. 6 x SSC, 65 C) zur Sequenz gemäss Seq. ID Nr. 1 hybridisieren, oder (d) komplementäre Sequenzen zu solchen Sequenzen gemäss (a), (b) oder (c) umfasst.
Vorzugsweise beträgt die Länge des erfindungsgemässen Nukleinsäuremoleküls zwischen 10 und 500, insbesondere zwischen 12 und 286. Vorzugsweise enthält es die LTR-Region und gegebenenfalls den Polypurin-Anhang gemäss Fig. 1 und 2.
Die vorliegende Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele und Zeichnungen noch detaillierter beschrieben, sie ist jedoch nicht auf diese besonderen Ausführungsformen beschränkt.
Fig. 1 zeigt eine Retrotransposon-Teilsequenz von Ipomoea batatas (3'RNaseH, Polypurinspur und LTR-Teilregion);
Fig. 2 zeigt die Retrotransposonsequenz der Ipomoea batatas und die verwendeten LTR-
Primer ;
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Bandmuster nach der S-SAP-Analyse;
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der S-SAP- und AFLP-Analyse von neun Süsskartoffel-Genotypen;
Fig. 5 zeigt eine S-SAP-Analyse von neun verschiedenen Süsskartoffelquellen;
Fig. 6 zeigt einen regionalen Plan von Ostafrika, der die ursprünglichen Orte zeigt, wo die
Süsskartoffelarten gesammelt wurden ;
Fig. 7 zeigt eine Verteilung der Pflanzen in vier Gruppen mit verschiedenen Einfügungs- nummern ; helle Säulen stellen den Bereich der Einfügungsnummer in einer Gruppe dar, während dunkle Säulen die Anzahl der Varietäten in einer gegebenen Gruppe darstellen;
Fig. 8 zeigt eine Liste von Adaptern und Primern, die für die AFLP-Voramplifikation und selektive PCR verwendet werden;
Fig. 9 zeigt eine phylogenetische Analyse von 173 ostafrikanischen Varietäten durch Cluster- bildung;
Fig. 10 zeigt ein Dendrogramm, basierend auf Nei's (1972) genetischem Distanzverfahren = UPGMA modifiziert vom Nachbarverfahren der PHYLIP-Version 3.5 ;
Fig. 11 zeigt eine angenommene Verteilung der Süsskartoffel in Ostafrika.
BEISPIELE:
Str187-Retrotransposonsequenz wurde gefunden und mit einem bekannten Verfahren geklont (Pearce et al. 1999). Nachdem die Str187-Klone sequenziert worden waren (siehe SEQ. ID. Nr. 1), sind Oligonukleotid-Primersequenzen konstruiert worden, die in der Lage sind, in verschiedenen Verfahren Fingerabdrücke von Süsskartoffelgenomen zu erstellen und diese zu unterscheiden.
Während des Verfahrens, wie es in den vorliegenden Beispielen umrissen ist, werden zwei Arten von Primern verwendet.
Die LTR-Primer oder ersten Primer werden nach der Retrotransposonsequenz konstruiert, gegebenenfalls mit Merkmalen, die die Amplifikation von 3'LTR verhindern. Die anderen Primer oder zweiten Primer können jegliche Sequenz sein, die einen Adapter an die verwendete Restriktionsstelle einschliesslich eine Primerstelle bilden kann. Dieser Adapter-Primer sollte mit den PCR-Parametern des ersten Primers zusammen passen. Beide Primer können am 3'-Ende mit vorzugsweise 1-3 optionalen Nukleotiden verlängert werden. Im Verfahren gemäss den vorliegen- den Beispielen werden die Primer in PCR-Reaktionen mit Süsskartoffel-DNA-Templaten verwendet.
Die Nukleinsäurepolymerase, die in den Reaktionen verwendet wird, ist eine im Handel erhältliche, thermostabile DNA-Polymerase vom thermophilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq-Polyme- rase) oder andere thermostabile Polymerasen.
Die Nukleotid-Triphosphat-Substrate werden verwendet wie in PCR-Protokollen, A Guide to Methods and Applications, M.A. Innis et al., 1989, und den U.S.-Patenten 4,683,195 und 4,683,204 beschrieben. Die Substrate können für eine Vielzahl von Versuchszwecken auf eine Weise modifiziert werden, wie sie dem Fachmann bekannt ist.
Im ersten Schritt (1. ) des vorliegenden Verfahrens wird genomische DNA von Süsskartoffel als Templat-DNA mit sequenzspezifischen Restriktions-Endonukleasen fragmentiert. Es ist möglich, eine, zwei oder auch drei verschiedene Restriktions-Endonukleasen zu verwenden.
Fragmentierte genomische DNA wird mit Restriktionsgrössen-kompatiblen Adaptersequenzen mit speziell konstruierten, Adapter-spezifischen Primerbindungsstellen verbunden.
Es werden eine oder mehrere PCR-Reaktionen mit Adapter-spezifischen und LTR-spezifischen
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Primern durchgeführt. Beide Primer können mit zusätzlichen Nukleotiden verlängert werden, um die Anzahl der amplifizierten Fragmente zu verringern. In der letzten PCR-Reaktion werden die LTR-Primer markiert, so dass das vom LTR-Adapter-Primer amplifizierte PCR-Produkt von den Adapter-Adapter-Primern zu unterscheiden ist.
Eine solche Markierung kann mit jeglichem im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, vorzugsweise durch Markieren mit Isotopen oder Verfahren ohne Isotope, wie Biotinglation, fluoreszierende Farben oder andere Verfahren.
PCR-Produkte können mittels Gel-Elektrophorese mit Agarose oder Acrylamid, händisch oder automatisch aufgetrennt und je nach der Markierung des (LTR) Primers sichtbar gemacht werden.
Ähnliche Verfahren sind von Waugh et al. (1997), Ellis et al. (1998) und Pearce et al. (2000) vorgestellt worden. Die Elektrophorese der amplifizierten genomischen Fragmente mit der gleichen flankierenden LTR-Sequenz trennt die verschiedenen Längen der Fragmente entsprechend ihrer Mobilität auf. Kleinere Fragmente sind mobiler als längere. Es zeigte sich, dass verschiedene Süsskartoffelproben verschiedene Elektrophoresemuster als Folge der Stelle und Anzahl der Retrotransposon-Einfügungen haben. Automatisierte Gel-Elektrophoresesysteme (Sequenzieraus- stattung, Programm Genotyper) können mehr als hundert Fragmente verschiedener Länge verglei- chen, aber es ist natürlich auch möglich, das Ergebnis mit manuellen Verfahren auszuwerten.
Eine Umwandlung dieser Elektrophoresemuster auf eine Matrix von Anwesenheit/Abwesenheit (yes/no) pro Varietät ist mit den oben erwähnten Programmen GENOTYPER oder GENOGRAPHER möglich oder kann natürlich auch händisch erfolgen. Eine Cluster-Analyse dieser Matrix ist unter Verwendung solcher Verfahren wie der Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages (Ungewogenes Paargruppen-Verfahren unter Verwendung arithmetischer Mittel, UPGMA) (Sneath und Sokal, 1973) oder Nachbar-Verbindung (Saitou und Nei, 1987) mit Programmen wie TREECON möglich. Andere Klassifikationsanalysen sind ebenfalls möglich, wie multidimensio- nales Klassifizieren (multidimensional scaling, MDS) oder Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis, PCO) mit Programmen wie SPSS, SYSTAT, STATISTIKA oder SAS.
Weiters ist es möglich, für die Analyse des geographischen Ursprungs der getesteten Süsskartoffelprobe die Anzahl der Retrotransposon-Einfügungen in die verwandten Genotypen zu vergleichen. Pflanzen, die im gleichen Gebiet wachsen, sind den gleichen Stressauswirkungen ausgesetzt, die unter anderem Retrotransposonaktivierung und weitere neue Einfügungen auslösen können.
Beispiel 1:
Süsskartoffelquellen und DNA-Reinigung
Für alle Analysen wurden lyophilisierte Blattproben verwendet. 67 Landrassen wurden von Genbanken des Institutes für Landwirtschaftliche Forschung in Kenia (Kenya Agricultural Research Institute) an der Universität Nairobi, Field Station, Kabete erhalten, und 59 Landrassen wurden vom Nationalen Institut für landwirtschaftliche Forschung in Uganda (Ugandan National Agricultural Research Institute) in Namulongeand erhalten. 44 Landrassen wurden vom Institut für landwirt- schaftliche Forschung in Tansania (Tanzania Agricultural Research Institute) in Tengeru erhalten.
Einzelne Pathogen-getestete Klone aus Kolumbien, Peru, Mexiko, Brasilien und Papua Neuguinea wurden von der Keimplasmasammlung des Internationalen Kartoffelzentrums (International Potato Centre) in Kabete, Kenia, erhalten. Aus dieser Gesamtprobe wurden 9 Genotypen aus verschiede- nen Ländern für die Primer-Vergleiche und für den Vergleich des S-SAP-Systems mit anderen molekularen Markern (AFLPs und RAPDs) ausgewählt. Die Details dieser Genotypen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
EMI6.1
<tb> Varietät <SEP> Andere <SEP> Namen <SEP> und <SEP> Ursprungsland <SEP> Art <SEP> des
<tb>
<tb> Codes <SEP> Genotyps
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> Mafuta <SEP> Kenia <SEP> Landrace
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> Simama <SEP> Kemb <SEP> 10, <SEP> CIP <SEP> 440169 <SEP> Kenia <SEP> Landrace
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> Kyebandula <SEP> EAI <SEP> 56702 <SEP> Uganda <SEP> Landrace
<tb>
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EMI7.1
<tb> Varietät <SEP> Andere <SEP> Namen <SEP> und <SEP> Ursprungsland <SEP> Art <SEP> des
<tb>
<tb> Codes <SEP> Genotyps
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> Wagabolige <SEP> CIP <SEP> 440167 <SEP> Uganda <SEP> Landrace
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> Camote <SEP> Amarillo <SEP> CIP <SEP> 400014 <SEP> Kolumbien <SEP> Landrace
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> Santo <SEP> Amaro <SEP> CIP <SEP> 400011 <SEP> Brasilien <SEP> Landrace
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7
<SEP> Nr. <SEP> 221 <SEP> CIP <SEP> 400009 <SEP> Mexiko <SEP> Landrace
<tb>
<tb>
<tb> Japonese <SEP> CIP <SEP> 420009 <SEP> Peru <SEP> Landrace
<tb>
<tb> 8 <SEP> Tresmesino
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> Naveto <SEP> CIP <SEP> 440131 <SEP> Papua <SEP> Neuguinea <SEP> Landrace
<tb>
Namen, Ursprungsland und Art des Genotyps der neun ausgewählten Arten, die für das Testen der Primerkombinationen und für das Vergleichen der S-SAP molekularen Marker mit RAPD- und AFLP-Markern verwendet wurden.
Alle Keimplasmen von KARI (Kenya Agricultural Research Institute) und CIP (International Potato Centre) wurden aus Feldsammlungen zusammengestellt. Für die meisten Keimplasmen aus Uganda und Tansania wurden Rankenabschnitte aus der Feldsammlung als Proben genommen und in Töpfe in einem Gewächshaus gepflanzt. Vier Wochen später wurden junge Blätter als Proben zum Gefriertrocknen genommen. In allen Fällen wurden 5-7 sehr junge Blätter von stark wachsenden Pflanzen geschnitten und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht. Die gefriergetrock- neten Blätter wurden bei 4 C gelagert, bis die DNA isoliert wurde. Etwa 20 mg gefriergetrocknetes Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff wurde in einer Kugelmühle 5 Minuten lang zerrieben. Die Gesamt-DNA wurde isoliert und mit einem "Dneasy plant minikit" (Qiagen) nach dem Original- protokoll gereinigt.
Nach der Extraktion wurden 4 1 von 10 mg/mi RNase A zugesetzt, und die Probe wurde 1 Stunde lang bei 37 C inkubiert. Die DNA wurde mit einem "TKO 100" Minifluori- meter (Hoefer Scientific Instruments) quantifiziert, und die Qualität wurde auf 0,8% Agarosegel bestimmt, das mit 0/5 g/ 1 Ethidiumbromid in einem 1 x TBE-Puffer gefärbt war.
PCR-Amplifikation von Ty1-copia Retrostransposon LTRs
Msel oder EcoRI Restriktionsenzym-digerierte genomische DNA wurde mit degenerierten RNaseH Gen-spezifisch und Enzymschnittstellen-spezifisch flankierten PCR-Primern amplifiziert, wie von Pearce et al. 1999 beschrieben wurde. Die Auftrennung der biotinylierten ersten PCR- Produkte erfolgte auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Dynabeads-Partikeln.
5'-biotinylierter RNaseH-Primer : 5'MGNACNAARCAYATHGA
Getesteter RNaseH-Primer: 5'GCNGAYATNYTNACNAA
N : A, G, T oder C
M: A oder C
Y: C oder T
H : A, C oder T
Die degenerierten RNaseH-Primer sind ein freundliches Geschenk des Labors von AJ Flavell (Institut für Biochemie, Universität Dundee) und wurden durch Sequenzhomologien von bekannten RNaseH-Genen retrotransposonalen Ursprungs konstruiert. Die amplifizierten Fragmente wurden in Topo 4 TA Klonierungsvektor geklont (TOPO TA Cloning Kit, Clontech K4575-01) und sequenziert.
Identifikation von LTR-Sequenzen von Süsskartoffel-Transposons vom Typ Ty1-copia:
Etwa 100 Klone mit verschiedenen Graden der Homologie mit Ty1-copia RNaseH-Gen wurden identifiziert, aber nur drei (Str6, Str85 und Str187) wiesen das charakteristische RNaseH-Gen, Stopkodon, Polypurinspur und mögliche 3'LTR-Sequenzelemente auf (Fig. 2). Die Str6- und
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Str187-Sequenzen erwiesen sich als homolog mit den Ty1-copia-Retrotransposons. Der Str85- Klon wurde trotz der copiahomologen Primerstelle in der RNaseH-ähnlichen Sequenz und der Polypurinspurregion mit der Blast-Suche nicht als Retrotransposonsequenz vom copia-Typ erkannt. Die putative inverse Wiederholungsregion (IR) der LTR-Region ist bei den drei Süsskartof- felsequenzen verschieden, nur das Str187-Klon enthält die charakteristischen TGTT-Sequenzen.
Obwohl mit geringeren Frequenzen andere IR-Sequenzen vorkommen (Picea abies Tpa8 TAGTT), wird angenommen, dass dies bereits eine Mutation ist. Weiters wurde in der putativen LTR-Region des Str6-Klons nach der TATT inversen Wiederholungssequenz eine 34 bp lange direkte Wieder- holung erkannt, die einen weiteren Beweis für die aussergewöhnlich hohe Mutationsrate in der Süsskartoffel-Retrotransposonpopulation lieferte. Der Ausgangspunkt der 3'LTR-Sequenzen für den Rest der sequenzierten Klone konnte nicht bestimmt werden, da sie keine erkennbare Polypurin- Spur nach dem RNaseH-Gen-Stopkodon enthielten.
In vielen Fällen war die Sequenz von der Msel-Restriktionsschnittstelle unterbrochen ; bei Verwendung des seltenen Schneide-Enzyms EcoRI zum Fragmentieren der genomischen DNA wurden zwar längere Klone erhalten, die Identifikation der LTR-Sequenz war jedoch nicht weiter möglich.
Die in den Str6- und Str187-Klonen gefundene LTR-Sequenz erwies sich in der S-SAP-Analyse als funktionierend, während Str85 kein amplifiziertes polymorphes Bandmuster ergab. Fig. 2 zeigt die Liste der LTR- und Eco-Adapter-Primer, die in S-SAP-Reaktionen getestet wurden.
Diskussion
PCR-Amplifikation der Ty1-copia Retrotransposon-LTRs
DNA-Sequenzen der Süsskartoffel wurden mit degenerierten Oligonukleotidprimern, die konser- vierten Domänen des Ty1-copia Retrotransposon RNaseH-Genfragments und flankierten Adapter- primern entsprechen, isoliert. Die amplifizierten Klone wurden geklont, wie in "Verfahren" beschrie- ben ist. 2-300 beliebige Klone wurden sequenziert, aber es wurden nur drei Klone mit erkennbaren LTR-Sequenzen gefunden. In diesen drei Klonen konnten das Stop-Kodon der RNaseH-Gene, die charakteristischen Polypurinspuren und die putativen 3'LTR-Regionen erkannt werden.
Jede Retrotransposonklasse hat eine unterschiedliche LTR-Region, die in der Klasse homolog ist, jedoch nicht zwischen den Klassen.
Die Tatsache, dass nur zwei arbeitende LTR-Regionen unter mehreren Hundert sequenzierten Klonen gefunden wurden, lässt vermuten, dass bei der Süsskartoffel die Mutationsrate der Retro- transposons sehr hoch ist, und auch dass nur wenige Klassen von Retrotransposonklassen existie- ren. Sonst muss bedacht werden, dass die Süsskartoffel hauptsächlich vegetativ vermehrt wird, was bedeutet, dass die Einfügung eines Retrotransposons in die vegetativen Zellen eine längere "Lebensdauer" und weiters eine grössere Chance für Mutationen hat. Es ist bekannt, dass verschie- dene biotische und abiotische Stressereignisse die Mobilität des Retrotransposon auslösen können (Mhiri et al., 1997 ; Grandbastien et al., 1997).
Pflanzengenome haben jedoch Mechanismen entwickelt, um die unkontrollierte Retrotransposonexpansion zu unterdrücken, wie die DNA-Methy- lierung (Liu und Wendel, 2000), schädliche Mutationen (Nuzhdin, 1999; Heslop-Harrison et al., 1997), ungleiches Crossing-over und/oder intrachromosomale Rekombination zwischen LTRs (Shirasu et al., 2000).
Die hohe Variabilität der Str187 Retrotransposon-Einfügung zwischen verschiedenen Süsskar- toffelklonen spielt auf die Mobilität dieser Retrotransposons an.
Nach anfänglichen Experimenten wurden die Str187 Retrotransposon LTR-Sequenzen verwen- det, um S-SAP-Primer zu konstruieren. Bei Erhöhung der Anzahl der selektiven Nukleotide auf den Adapter oder LTR-Primern wurde die Anzahl der nachgewiesenen Einfügungen reduziert, wie zu erwarten war. Die Reduktion war jedoch wesentlich effektiver (4-5 Mal pro Nukleotid), wenn selektivere Nukleotide am LTR-Primer erhöht wurden. Das beste Ergebnis wurde mit nur einer Nukleotiderweiterung am LTR-Primer erzielt, es muss jedoch bedacht werden, dass nur ein 6 bp Schneide-Enzym verwendet wurde, um die genomische DNA zu fragmentieren. Waugh et al. fragmentierten die genomische DNA von Gerste mit einem 6 und einem 4 bp Schneide-Enzym gemäss dem Anzahl der amplifizierten Fragmente auf eine bewertbare Menge reduzieren, indem sie die Anzahl der selektiven Nukleotide erhöhten.
Ausserdem verwendeten sie das selektive Nukleotid am LTR-Primer nicht und amplifizierten daher nicht nur die pflanzenspezifische
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genomische DNA, sondern möglicher Weise auch die internen Retrotransposon-Sequenzen.
S-SAP-Verfahren
Das Verfahren von Waugh et al. (1997) wurde mit einigen Modifikationen auf die Süsskartoffel angewendet.
Genomische DNA wurde nur mit einem hinten schneidenden Enzym (EcoRI) digeriert und mit spezifischem Adapter in einer Reaktion verbunden. Es wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt.
Die erste, vorselektierende PCR-Amplifikation erfolgte mit Dynazyme Taq Polymerase in 50 1 Reaktionen während 30 Zyklen auf 52 C Annealingtemperatur. Es wurden LTR-spezifische Primer ohne jegliche Verlängerung und der E01-Adapter-Primer (Tabelle 2) verwendet.
Tabelle 2
EMI9.1
<tb> LTR- <SEP> Primer
<tb>
<tb> Str18710 <SEP> 5-AGACTAAGAGTCCTAACA-3
<tb>
<tb> Str187/G <SEP> 5'-AGACTAAGAGTCCTAACAG-3'
<tb>
<tb> Adaptor-Primer
<tb>
<tb> E01 <SEP> 5-GACTGCGTACCAATTCA-3
<tb>
Str187-Primer verwendet in S-SAP-Analyse
Erste Reaktion : Zweite Reaktion : Die zweite, selektive PCR-Amplifikation erfolgte mit Quiagen Hot Taq DNA-Polymerase in 25 pl Reaktionen. Touchdown von 70 C (-O,7 C/Zyklus) auf 55 C, dann weitere 20 Zyklen bei 55 C Annealingtemperatur. Mit selektivem Nukleotid wurde der erweiterte FAM-markierte Transposon- Primer (Str187G) mit dem E01-Adapter-Primer kombiniert (Tabelle 2). Die Reaktionen wurden auf Acrylamidgel geladen und auf einem ABI 373 automatischen Sequenzierer aufgetrennt.
Adaptierung des S-SAP-Verfahrens auf die Süsskartoffel
Im ursprünglichen S-SAP-Protokoll (Waugh et al.) wird die genomische DNA mit zwei Enzymen geschnitten, wie es bei AFLPs üblich ist, einem seltenen Schneider und einem häufigen Schneider (Vos et al.). Bei der Adaptierung der S-SAP-Technik auf die Süsskartoffel verbesserte jedoch das Digerieren der genomischen DNA mit nur einem seltenen Schneide-Enzym anstatt mit zweien die Anzahl und die Länge der polymorphen Bande. Eine weitere Verbesserung wurde erreicht, indem die adaptierte DNA mit dem Adapter und nicht markierten LTR-Primern voramplifiziert wurde. Die zweite spezifische Amplifikation wurde mit dem Adapter-Primer und dem durch selektive Nukleoti- de erweiterten LTR-spezifischen Primer durchgeführt. Diese Modifikationen ergaben eine grosse Anzahl von amplifizierten Produkten, sowohl polymorphen als auch monomorphen.
In vorbereiten- den Versuchen wurden die drei LTR-Primer der Süsskartoffel in einer S-SAP-Analyse getestet, und Str187 wies den höchsten Grad an Polymorphismus auf. Der Str6-Primer produzierte eine mode- rate Anzahl von polymorphen Mustern, mit Str85 wurden jedoch keine Amplifikationsprodukte erhalten.
Die folgenden Experimente wurden mit den Str187 LTR-Primern durchgeführt.
Neun Süsskartoffelarten aus Afrika, Süd- und Zentralamerika und Papua Neuguinea wurden ausgewählt und mit den verschiedenen LTR/Adapter-Primer-Kombinationen getestet. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse dieser Vergleiche.
Tabelle 3
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EMI10.1
<tb> E441187GC <SEP> E011187GC <SEP> E44/187G <SEP> E011187G
<tb>
<tb> Freq. <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> %
<tb>
<tb> 1 <SEP> 25 <SEP> 64 <SEP> 32 <SEP> 63 <SEP> 79 <SEP> 46 <SEP> 86 <SEP> 33
<tb>
<tb> 2 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 40 <SEP> 23 <SEP> 51 <SEP> 20
<tb>
<tb> 3 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 14 <SEP> 41 <SEP> 16
<tb>
<tb> 4 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 11 <SEP> 6 <SEP> 28 <SEP> 11
<tb>
<tb> 5 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 19 <SEP> 7
<tb>
<tb> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 7 <SEP> 3
<tb>
<tb> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 5 <SEP>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1
<SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
<tb> Ins. <SEP> 39 <SEP> 51 <SEP> 173 <SEP> 260
<tb>
Tabelle 3 : Vergleich der verschiedenen Primer-Kombinationen in der S-SAP-Analyse von neun Süsskartoffelarten. Frequenzen (Freq. ) bedeutet, dass das getestete Str187-Retrotransposon eine
Einfügung in ein, zwei oder alle neun Genome aufweist. Die Spalte N' stellt die Gesamtzahl der
Einfügungen dar, die in den neun Genomen ein, zwei oder neun Mal vorkommen.
Die Daten sind auch in Prozent angegeben. In der Zeile Einfügungen (Ins.) ist die Gesamtzahl der Einfügungen angegeben, die mit dem gegebenen Primerpaar amplifiziert wurde.
Der E44 Adapter-Primer in Kombination mit den Str187GC- oder G-Primern ergab 36 bzw. 173 polymorphe Bande, die einzelne Retrotransposon-Einfügungen darstellen. Eine Reduktion der Anzahl der selektiven Nukleotide am LTR-Primer erhöht signifikant die Anzahl der amplifizierten Einfügungen.
Die gleiche Relation wurde bei den Primern E01/187GC und E01/187G beobachtet. Bei Reduktion der selektiven Nukleotide um eines stieg die Anzahl der amplifizierten Einfügungen von 51 auf 261.
Die Anzahl der selektiven Nukleotide am Adapter-spezifischen Primer hat nur eine geringe Auswirkung auf die Amplifikation der Einfügung.
In Tabelle 3 sind die Frequenzen der Einfügungen dargestellt, die von nur einem, zwei oder auch allen neun Pflanzengenomen amplifiziert wurden. Es ist erkennbar, dass der Polymorphismus sehr hoch ist ; Prozentsatz der monomorphen Bande im Vergleich zur Gesamtzahl der Einfü- gungen beträgt nur 1-2%. Die Anzahl der einzigen Einfügungen - die nur von einem einzigen Pflanzengenom amplifiziert sind - ist jedoch sehr hoch : der gesamten Einfügungen.
Eine phylogenetische Analyse der neun Süsskartoffelarten mit den Primerkombinationen E01Str187/G und E44-Str187/G ist in Fig. 5 dargestellt. Beide Primerkombinationen unterscheiden die südamerikanischen Arten von den afrikanischen. Die Klone aus Mexiko und Papua Neuguinea wurden mit den afrikanischen Typen in Verbindung gebracht. Mit den beiden anderen Primerkombinationen, wo der LTR-Primer mit zwei Nukleotiden erweitert ist, wurden die südamerikanischen und afrikanischen Arten voneinander nicht unterschieden (Daten nicht angegeben).
AFLP-Analyse
Die AFLP-Methodik war im Wesentlichen so, wie sie von Vos et al. (1995) beschrieben wurde, sie wurde jedoch mit Fluoreszenz-Markierung und Sequenzerlauf des Gels auf die Süsskartoffel angepasst. Zwei Restriktionsenzyme, Msel und EcoRI, wurden verwendet, um die genomische DNA zu fragmentieren. Die Restriktionsdigerierte DNA wurde dann an zwei verschiedene synthetisierte, doppelsträngige Oligonukleotide gebunden, die aus einem kurzen DNA-Strang und der Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym bestanden (Tabelle 4). Die Voramplifikation erfolgte unter Verwendung der Primer E01 und M01. Eine Annealingtemperatur von 60 C wurde für 45 Zyklen verwendet.
Die selektive Amplifikation der PCR-Produkte der Voramplifikation erfolgte mit Primern, die mit den Primern der Voramplifikation ident waren, jedoch mit 2 zusätzlichen selektiven
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Nukleotiden an ihren 3'-Enden (Tabelle 4).
Liste der Adapter und Primer, die für die AFLP-Voramplifikation und selektive PCR verwendet wurden :
Tabelle 4
EMI11.1
<tb> EcoRI-Adapter <SEP> Nukleotidsequenz
<tb>
<tb>
<tb> EcoA1 <SEP> 5-CTC <SEP> GTA <SEP> GAC <SEP> TGG <SEP> GTA <SEP> CC-3 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> EcoA2 <SEP> 5-AAT <SEP> TGG <SEP> TAC <SEP> GCA <SEP> GTC-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Voramplifikations-Primer
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> E01 <SEP> 5-GAC <SEP> TGC <SEP> GTA <SEP> CCA <SEP> ATT <SEP> CA-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Selektive <SEP> PCR-Primer
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> E33 <SEP> 5-GAC <SEP> TGC <SEP> GTA <SEP> CCA <SEP> ATT <SEP> CAA <SEP> G-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> E36 <SEP> 5-GAC <SEP> TGC <SEP> GTA <SEP> CCA <SEP> ATT <SEP> CAC <SEP> T-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mse1 <SEP> - <SEP> Adapter
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MseA1 <SEP> 5-GAC <SEP> GAT <SEP> GAG <SEP> TCC <SEP> TGA <SEP>
G-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MseA2 <SEP> 5-TAC <SEP> TCA <SEP> GGA <SEP> CTC <SEP> AT-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Voramplifikations-Primer
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M01 <SEP> 5-GAT <SEP> GAG <SEP> TCC <SEP> TGA <SEP> GTA <SEP> AA-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Selektive <SEP> PCR-Primer
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M38 <SEP> 5-GAT <SEP> GAG <SEP> TCC <SEP> TGA <SEP> GTA <SEP> AAC <SEP> T-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M40 <SEP> 5-GAT <SEP> GAG <SEP> TCC <SEP> TGA <SEP> GTA <SEP> AAG <SEP> C-3
<tb>
EcoRI-selektive Primer wurden ABI-FAM Fluoreszenz-markiert, um das Auftreten von "Doublets" auf den Gelen auf Grund der ungleichen Mobilität der beiden Stränge der amplifizierten Fragmente zu vermeiden (Vos et al., 1995). Die Proben wurden auf ein 6% Polyacrylamid denaturierendes Gel geladen und mit einem ABI Prisma 373-Sequenzer 10 Stunden lang laufen gelassen.
Das Gel wurde gescannt, und es wurden Proben gezogen, wobei das Programm GENESCAN 3. 1 verwendet wurde. Die PCR-Produkte der selektiven Amplifikation wurden sichtbar gemacht. Ein interner Grössenstandard wurde in die Probe eingearbeitet. Die sichtbar gemachten Peaks, die die Position der amplifizierten Fragmente anzeigen, wurden mit dem Programm GENOTYPER 2. 5 analysiert, um ein 0/1 (Abwesenheit/Anwesenheit) Fragment durch eine Probenmatrix zu entwickeln. Die Peak-Filterbedingungen wurden derart eingestellt, dass nur die Peaks mit einer massstabgerechten Höhe von mindestens 30 inkludiert wurden. Die Selektion der Kategorien erfolgte wie oben für das S-SAP-Verfahren beschrieben. Informative Produkte fallen typischer Weise in den Bereich von 50-450 bp (Sharbel, 1999). Nur die Kategorien zwischen 50-400 bp wurden für die Datenanalyse verwendet.
RAPD-Analyse
RAPD-Amplifikationen wurden durchgeführt, wie sie von Williams et al. (1991) beschrieben wurden, jedoch mit einigen Modifikationen, wie sie in Gichuki et al. (2001) beschrieben sind.
Gel und Datenanalyse
Die Daten wurden mit dem Programm Genotyper 2. 5 analysiert. Peaks, die einer amplifizierten Retrotransposon-Einfügung entsprechen, wurden in Kategorien eingeteilt. Die Toleranz einer Kate- gorie wurde derart gewählt, dass sie 0,25-0,5 bp betrug, was bedeutet, dass zwei Fragmente, wenn sie eine grössere Differenz als 0,5 oder 1 bp aufweisen, als zwei verschiedene Kategorien genommen wurden. Daten, die Einfügungen in bp darstellen, wurden mit dem Programm Geno-
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typer in eine Matrix der Anwesenheit/Abwesenheit (1/0) der Einfügung pro Art umgewandelt, um sie in anderen phylogenetischen Programmen, wie Treecon, zu verwenden.
Vergleich von RAPD, AFLP und S-SAP
Die S-SAP-Analyse auf Basis des Ty1-copia Transposons ist ein dominantes Markersystem, das ein Mehrfachbandmuster ergibt. Jedes individuelle Band dieses Musters stellt eine einzigartige Retrotransposon-Integrationsstelle dar (Fig. 3). Das Ziel bestand darin, zu testen, ob ein Genotypi- sierungssystem auf Basis der konsekutiven Integration von Retrotransponson-Elementen zu einer ähnlichen genetischen Verwandtschaft der Zugänge führt wie jene, die unter Verwendung von RAPDs und AFLPs erzeugt wurden, die auf den Veränderungen der DNA-Sequenz basieren.
Daher wurden neun Genotypen der Süsskartoffel, die verschiedene geographische Regionen darstellen, die bereits mittels RAPD-Analyse identifiziert wurden, mittels AFLP- bzw. S-SAP- Techniken analysiert (Tabelle 1).
Die Bandmuster wurden mit UPGMA-Dendogrammen verglichen, wobei die genetische Distanz von Nei, 1979, verwendet wurde (Fig. 4).
Tabelle 5
EMI12.1
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> Gesamtzahl <SEP> Gesamtzahl <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Durchschnitt- <SEP> % <SEP> polymor-
<tb>
<tb>
<tb> analysierten <SEP> der <SEP> Assays <SEP> der <SEP> Amplifi- <SEP> polymorphen <SEP> liche <SEP> Anzahl <SEP> phe <SEP> Loci
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Genotypen <SEP> kations- <SEP> Produkte <SEP> der <SEP> Produkte
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> produkte <SEP> pro <SEP> Assay
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> RAPD <SEP> 9 <SEP> 12 <SEP> 74* <SEP> 65 <SEP> 6 <SEP> 87,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> AFLP <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 228 <SEP> 179 <SEP> 114 <SEP> 78,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S-SAP <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 260 <SEP> 254 <SEP> 260 <SEP> 97,7
<tb>
Zusammenfassung jeder Art der durchgeführten Analyse
Gesamtzahl der pro Art der Analyse erhaltenen Amplifikationsprodukte, Zahl derer, die polymorph waren,
durchschnittliche Anzahl der Produkte pro Assay (Primer oder Primer-Produkt) und Gesamtprozentsatz polymorpher Loci.
*Nur deutliche Bande, die Polymorphismus aufwiesen, wurden für die RAPDs ausgewertet.
Tabelle 5 zeigt die Details der drei Analyseverfahren. Der Prozentsatz der polymorphen Loci war bei der S-SAP-Analyse am grössten (97,7%), wo 260 Einfügungen mit nur einen Primer-Paar amplifiziert wurden. Im Gersten-Genom wurde mit S-SAP auf Retrotransposon-Basis eine Steigerung von 25-30% in der Polymorphismusrate im Vergleich mit Standard-AFLP beobachtet (Kumar, 1996 ; Waugh et al., 1997 ; Gong-Xin Yu und R. P. Wise, 2000). Im vorliegenden Fall ist dieses Verhältnis geringer, 19% im Vergleich zum AFLP-Verfahren. Obwohl RAPDs einen hohen Grad an Polymorphismus zeigten, wurden nur deutliche Bandmuster einbezogen, die in einer früheren Studie von 74 Genotypen Polymorphismus zeigten (Gichuki et al., 2001 in Papier). Daher wird der Polymorphismus der RAPD-Analyse überbewertet und ist daher nicht mit den AFLP- und S-SAPDaten vergleichbar (Tabelle 5).
Der bei den drei Verfahren beobachtete hohe Polymorphismus kann durch die vegetative Vermehrung der Süsskartoffel bedingt sein.
Alle drei verschiedenen Genotypisierungsverfahren identifizierten deutlich die beiden südamerikanischen Klone Zapallo (Peru)/ und Camote Amarillo (Kolumbien) als eine getrennte Gruppe (siehe Fig. 4). Die vier afrikanischen Klone wurden ebenfalls als eine andere Gruppe identifiziert.
Der mexikanische Klon, Nr. 221, und der aus Papua Neuguinea, Naveto, waren in allen drei Fällen mit den afrikanischen Klonen verwandt. Der brasilianische Klon, Santo Amaro, war sowohl im S-SAP als auch im RAPD mit den südamerikanischen Klonen und in der AFLP-Analyse mit den afrikanischen Klonen verwandt.
Die wichtigen Faktoren in der Auswahl eines genetischen Markers schliessen die Entwicklungszeit und-Kosten, Kapitalauslagen, Menge und Qualität der erforderlichen DNA, Vorwissen über die
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DNA-Sequenz, erforderliches technisches Wissen, Robustheit, Informationsgehalt, Genomab- deckung und Reproduzierbarkeit ein (Vos et al., 1995; Milbourne et al., 1997; Milbourne et al.,
1998 ; Powell et al. , 1996). Die S-SAP-Marker erfordern höhere anfängliche Entwicklungskosten als RAPDs und AFLPs, da es notwendig ist, die LTR-Wiederholungssequenz des Retrotranspo- sons zu isolieren.
Andererseits sind die Kosten der Adaptierung der LTR-Sequenz für spezifische Genome mit jenen von AFLPs vergleichbar S-SAP erwies sich als besser als RAPD und AFLP im
Hinblick auf die Anzahl der dargestellten Amplifikationsprodukte und die Anzahl der polymorphen
Loci (Tabelle 5). Um die beliebigen 12 RAPD-Primer auszuwählen, wurden mehr als 100 Primer gescreent, und nur etwa die Hälfte produzierte irgendwelche Amplifikationsprodukte. In Anbetracht der Tatsache, dass 12 RAPD-Assays und 2 AFLP-Assays erforderlich waren, um etwa das gleiche Analyseniveau zu erreichen, ist klar ersichtlich, dass, pro Assay gerechnet, das S-SAP-Verfahren bei vergleichbaren Kosten das schnellste der drei Verfahren für die genetische Analyse und Charakterisierung der Süsskartoffel sein kann.
Im Vergleich zu fluoreszierenden AFLPs wurde gefunden, dass die S-SAP-Peaks deutlicher waren. Obwohl sowohl die AFLP- als auch die S-SAP-Marker dominant sind, weist der hohe Multiplexanteil der S-SAPs darauf hin, dass sie informativer sind. AFLP- und RAPD-Marker zielen auf beliebige Regionen des Genoms ab. Es sind jedoch von einigen Autoren gewisse Bedenken bezüglich der zentrometrischen Clusterbildung der AFLP-Marker geäussert worden, insbesondere für Linkage-Studien. Die meisten AFLP-Primer scheinen auf die AT-reiche zentromere Region des Chromosoms zu zielen. Das Ty1-copia Retrotransposon ist im Genom weit verbreitet (Pearce, 1996 ; Schmidt, 1996; Heslop-Harrison, 1997). Dies würde bedeuten, dass die Ty1-copia LTR S-SAP-Marker ebenfalls weit verbreitet sind, da sie am Retrotransposon verankert sind.
Die Repro- duzierbarkeit eines Markersystems ist ziemlich wichtig, insbesondere für die Charakterisierung und die Kartierung von Keimplasma und dort, wo Ergebnisse zwischen verschiedenen Laboratorien und Wissenschaftlern ausgetauscht werden müssen. Es ist gezeigt worden, dass die AFLPs besser reproduzierbar sind als RAPDs (Jones et al., 1995). Die Sequenz-spezifische Natur der S-SAP-Analyse kann diese Reproduzierbarkeit verbessern. Vorläufige Ergebnisse weisen auf ein grosses Ausmass an Reproduzierbarkeit unter Verwendung verschiedener PCR-Ausstattungen hin (Daten nicht angegeben). In Anbetracht aller dieser Faktoren ist offensichtlich, dass das Ty1-copia S-SAP-Markersystem ein wirksames Verfahren zur genetischen Analyse bei Süsskartoffeln ist.
Die Nützlichkeit des Retrotransposon S-SAP-Markers ist bereits bei Gerste (Waugh et al., 1997) und bei Erbsen (Elliot et al.) gezeigt worden.
Beispiel 1'
Analyse der ostafrikanischen Klone
172 ostafrikanische Zugänge aus Uganda, Tansania und Kenia wurden mit Hilfe der E01¯187G-Primerkombination in der S-SAP-Analyse analysiert. Diese Primerkombination ergab die grösste Anzahl polymorpher Bande. Die PCR-Amplifikation und die Analyse der Fragmente an Hand ihrer Grösse erfolgten, wie in "Materialien und Verfahren" beschrieben.
Aus verschiedenen Gebieten Ostafrikas wurden insgesamt 61 Arten aus Kenia, 44 aus Tansa- nia und 61 aus Uganda ausgewählt. Die Arten aus Kenia stammten vom Zentralen und Westlichen Hochland und der Region Nyanza im Becken des Viktoriasees. Aus Tansania kamen die Arten aus drei Gebieten, der Ostküste, dem Nördlichen Zentralen Hochland und dem Seengebiet. Die Arten aus Uganda teilten sich in jene Gruppen, die aus dem Nordosten Ugandas kamen, und den Rest, der aus Zentral- und Westuganda stammte. Die geographischen Regionen der Herkunft sind in Fig. 6 dargestellt.
In der S-SAP-Analyse aller Proben wurden 242 Einfügungen in der Kategorie des Str187 Retrotransposons gefunden. Fig. 7 zeigt alle diese Arten in einem Dendogramm basierend auf der UPGMA-Analyse. Um die Analyse zu vereinfachen, wurden die Proben gemäss dem geographi- schen Ursprung oder als Mitglied einer gegebenen monophyletischen Gruppe, festgestellt mit Hilfe der Treecon UPGMA-Analyse, verglichen. Die 172 Arten wurden zu erst nach geographischer Herkunft geordnet und zu dem gegebenen Landesteil zusammengefasst, dann wurde das Ergebnis der Analyse kategorisiert und ein phylogenetischer Baum erstellt (siehe Fig. 10).
Der phylogenetische Baum zeigt die Trennung der ostafrikanischen Quellen. Ost- und Nord-
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tansania sind vom Seenteil Tansanias getrennt, der eng mit den Proben aus Zentral- und Westuganda verwandt ist. Diese Ergebnisse entsprechen der geographischen Lage. Interessanter Weise wurden die Proben aus Nordostuganda näher zu Kenia als zu den Arten aus Zentral- und Westuganda zugeordnet, was jedoch in Anbetracht der geographischen Lage auch durchaus möglich ist. Obwohl die Proben aus Zentralkenia zusammen mit den anderen kenianischen Arten eine Gruppe auf dem phylogenetischen Baum bildeten, sind sie vom westlichen und vom NyanzaTeil des Landes getrennt.
Die Ergebnisse korrelieren mit der geographischen Lage.
Sekundäre Verbreitung der Retrotransposon-Einfügungen
Nach dem Vergleich der 172 getesteten Arten miteinander mit Hilfe der UPGMA-Clusteranalyse wurden 10 Untergruppen identifiziert. Die Untergruppen sind in Tabelle 6 aufgelistet.
Tabelle 6 : Gruppen auf Basis der phylogenetischen Analyse
EMI14.1
<tb> Gr. <SEP> 1 <SEP> Gr.2 <SEP> Gr. <SEP> 3. <SEP> Gr. <SEP> 4 <SEP> Gr5 <SEP> Gr6 <SEP> Gr7 <SEP> Gr8 <SEP> Gr9 <SEP> Gr.10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KWA104 <SEP> KWA100 <SEP> UB101 <SEP> KNB22 <SEP> KNB2 <SEP> TEB158 <SEP> KWB1 <SEP> KNA28 <SEP> KCA113 <SEP> TEB148
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> KWA108 <SEP> KCA103 <SEP> UB102 <SEP> KNB23 <SEP> KNB16 <SEP> TEB161 <SEP> KNB10 <SEP> TLB122 <SEP> KWA102 <SEP> TLB117
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KCA117 <SEP> KCA105 <SEP> UB103 <SEP> KNB24 <SEP> KWB21 <SEP> TEB165 <SEP> KNB11 <SEP> TLB123 <SEP> KCA19 <SEP> UNC25
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<tb>
<tb>
<tb> KWA119 <SEP> KCA110 <SEP> UB104 <SEP> KWB18 <SEP> KNB25 <SEP> TEB166 <SEP> KWB12 <SEP> TEB125 <SEP> UA22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KNA121 <SEP> KNA120 <SEP> UB106 <SEP> UNC11 <SEP> KWB46 <SEP> TEB169
<SEP> KNB13 <SEP> TEB126 <SEP> UA4
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> KNA134 <SEP> KCA36 <SEP> UB109 <SEP> KNB47 <SEP> TEB152 <SEP> KNB26 <SEP> TEB128 <SEP> UNC4
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<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
<tb> Gr. <SEP> 1 <SEP> Gr <SEP> 2 <SEP> Gr <SEP> 3 <SEP> Gr. <SEP> 4 <SEP> Gr <SEP> 5 <SEP> Gr <SEP> 6 <SEP> Gr.
<SEP> 7 <SEP> Gr <SEP> 8 <SEP> Gr <SEP> 9 <SEP> Gr.10
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Diese Art der Analyse zeigt ähnliche Ergebnisse, jedoch sind nicht nur zwischen verschiedenen Landesteilen, sondern auch innerhalb dieser Landesteile Divergenzen zu beobachten. Die Details sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7: Verbreitung der Arten in den Cluster-Gruppen
EMI15.2
<tb> Gruppen <SEP> Prozentsatz <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> möglichen
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<tb> Einfügungsstellen
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<tb> Zentralkenia <SEP> 1 <SEP> 43% <SEP> 203
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<tb> 2 <SEP> 36% <SEP> 164 <SEP>
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<tb>
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<tb> Westkenia <SEP> 7 <SEP> 25% <SEP> 162
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<tb> 1 <SEP> 18% <SEP> 203 <SEP>
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<tb> Nyanza <SEP> 7 <SEP> 48% <SEP> 162
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<tb> Zentral- <SEP> und <SEP> 3 <SEP> 84% <SEP> 161
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<tb> Westuganda
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<tb> Ost- <SEP> und <SEP> Nord- <SEP> 1 <SEP> 30% <SEP> 203
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<tb> ostuganda <SEP> 2 <SEP> 14% <SEP> 164
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<tb> 7 <SEP> 39% <SEP> 162 <SEP>
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<tb> Tansania-See <SEP> 3 <SEP> 60% <SEP> 161
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<tb> 8 <SEP> 30%
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<tb> Tansania-Nord <SEP> 3 <SEP> 100%
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Die kenianischen Arten befinden sich hauptsächlich in Gruppe 1,2 und 7 zusammen mit den Arten aus Nordostuganda. Zum Beispiel befinden sich 43% der Klone aus Zentralkenia in Gruppe 1 und 33% in Gruppe 2. Ebenso sind die Klone aus Nyanza hauptsächlich in Gruppe 7 verteilt, wobei ein geringerer Prozentsatz auch in Gruppe 1 und 2 vorhanden ist. Die Proben aus Westkenia weisen die grösste Diversität auf; der grösste Anteil befindet sich mit 23% in Gruppe 7, sie sind jedoch auch in Gruppe 1, 2 und 5 zu finden.
Die Klone aus Nordostuganda weisen Ähnlichkeit mit den kenianischen auf, sie sind mit 39%, 30% bzw. 14% in Gruppe 7,1 und 2 eingeteilt. Viel stärker konserviert sind die Klone aus Zentral- und Westuganda, von denen 84% zusammen mit den 3 Arten aus Nordtansania und 60% der Proben aus dem tansanischen Seengebiet zu Gruppe 3 gehören. Weitere 30% der Arten aus dem tansanischen Seengebiet befinden sich zusammen mit den 66% der osttansanischen Proben in Gruppe 8. Der Rest von 28% der Arten aus Osttansania wurde in Gruppe 6 eingeteilt.
Bei der Analyse der Anzahl der Einfügungen in den verschiedenen Gruppen wurde eine wachsende Anzahl von möglichen Einfügungsstellen vom Küstenland Tansanias (Osten) nach Zentralkenia gefunden. Die höchstmögliche Anzahl von Einfügungen wurde in Gruppe 1 gefunden (203). Etwa 16% der untersuchten Klone wurden in dieser Gruppe gefunden, wobei die Proben aus Zentralkenia am stärksten repräsentiert waren (43%). In den Gruppen 2,3, 7 und 9 betrug die
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Anzahl der möglichen Einfügungsstellen 164,161, 162 und etwa 60-90 mögliche Einfügungs- stellen, und die dominierendsten sind die Proben aus Osttansania in den Gruppen 6 und 8 (siehe Tabelle 7 und Fig. 9). Tabelle 7 zeigt nur die charakteristischesten beiden Gruppen (6,7), da die anderen (4,5 und 10) entweder zu klein oder zu verschieden sind (siehe auch Tabelle 6).
Wie bereits erwähnt, transponieren Retrotransposons über ein RNA-Zwischenprodukt, was bedeutet, dass die elterliche Einfügung im Genom fixiert bleibt. Daher muss jede weitere Einfügung später passiert sein, was eine Veränderung im Genom in jüngster Zeit bedeutet. Dieser Theorie folgend kann die Verteilung eines Retrotransposons in der geographischen Verbreitung verfolgt werden. In diesem Fall ist es möglich, die Verbreitung des Str187 Retrotransposons in Zeit und Raum zu verfolgen. Es wird angenommen, dass dort, wo die Anzahl der Einfügungen des gegebe- nen Retrotransposons geringer ist, der Ausgangspunkt seiner Verbreitung in einem gegebenen Gebiet liegt.
Nach dieser Theorie und basierend auf den Ergebnissen über die ansteigende Anzahl von Einfügungen wird die Theorie aufgestellt, dass die Süsskartoffel in Ostafrika zu erst in Osttan- sania vorkam (Einfügungen 80-90) und sich weiter in das Seengebiet, nach Nordtansania, Zentral- und Westuganda (Einfügungen 161),Ost- und Nordostuganda und Kenia (Fig. 11) ausbreitete, bis sie zum Viktoriasee kam. In Kenia und Nordostuganda wurden drei Verbreitungsgebiete mit verschiedenen Einfügungsraten gefunden. Arten aus Zentral- und Westkenia sowie aus dem Nyanza-Gebiet von Kenia finden sich in den Gruppen 1,2 oder 7 zusammen mit den Klonen aus Nordostuganda, wo die Anzahl der Retrotransposon-Einfügungen 203,164 bzw. 162 beträgt (siehe Tabelle 7).
Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass in Kenia ein Teil der Arten verschie- denen biotischen und abiotischen Wirkungen ausgesetzt war, die die Retrotransposon-Expression auslösen konnten, was zu neuen Einfügungen führte.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Süsskartoffel in Afrika erst vor 500 Jahren eingeführt worden ist und während dieser Zeit die Einfügung von Retrotransposons in den afrikanischen Quellen um das 2-3-Fache steigen konnte, kann angenommen werden, dass das Str187-Retrotran- sposon noch immer ein mobiles Retrotransposon ist.
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SEQUENZPROTOKOLL < 110 > österreichisches Forschungszentrum Seibersdorf Ges.m.H.
< 120 > Süsskartoffel < 130 > Süsskartoffel < 140 > < 141 > < 160 > 35 < 170 > Patente Ver. 2.1 < 210 > < 211 > 195 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:RnaseH < 400 > 1 gaggggaagt gttaggactc ttagtctaga ctacttctag tattactata cttctacata 60 ttgtatttat atttctcctg tgtaattgtg tacgactgat atacagaatt attcaatcct 120 aatcaatgtc atagcaacat agaactcaag aaagaaatga gcggagaggt aatgaggttt 180
<Desc/Clms Page number 19>
tactcaggac tcatc 195 < 210 > 2 < 211 > 10 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 2 taagactaag 10 < 210 > 3 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
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<Desc/Clms Page number 20>
< 210 > 7 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
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< 210 > 12 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 12 agactaagag tcctaacatc 20 < 210 > 13 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 13 agactaagag tcctaacaaa 20 < 210 > 14 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 14 agactaagag tcctaacaag 20 < 210 > 15 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
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Primer < 400 > 19 ctcgtagact gggtacc 17 < 210 > 20 < 211 > 15 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Pnmer < 400 > 20 aattggtacg cagtc 15 < 210 > 21 < 211 > 19 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 21 gactgcgtac caattcaag 15
<Desc/Clms Page number 23>
< 210 > 22 < 211 > 19 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 22 gactgcgtac caattcact 19 < 210 > 23 < 211 > 16 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Primer < 400 > 23 gacgatgagt cctgag 16 < 210 > 24 < 211 > 14 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz :Primer < 400 > 24 tactcaggac tcat 14 < 210 > 25 < 211 > 17 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 25 gatgagtcct gagtaaa 17 < 210 > 26 < 211 > 19 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 26 gatgagtcct gagtaaact 19
<Desc/Clms Page number 24>
< 210 > 27 < 211 > 19 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Primer < 400 > 27 gatgagtcct gagtaaagc 19 < 210 > 28 < 211 > 28 < 212 > PRT < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz :RnaseH < 400 > 28 Ala Asp Met Phe Thr Lys Ala Leu Pro Thr Pro Arg Phe Thr Phe Leu
1 5 10 15 Arg Asp Lys Leu Gln Val Thr Ala Leu Pro Cys Ala
20 25 < 210 > 29 < 211 > 29 < 212 > PRT < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:RnaseH < 400 > 29 Ala Asp lle Phe Thr Lys Ala Leu Gly Gin Arg Gin Leu Gin Tyr Phe 1 5 10 15 lle Arg Lys Leu Gly lle Arg Asp Leu His Ala Pro Thr
20 25 < 210 > 30 < 211 > 26 < 212 > PRT < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
RnaseH < 400 > 30 Ala Asp lle Phe Thr Lys Pro Leu Ala Ala Arg Phe Ala Phe Leu Arg
1 5 10 15 Asp Lys Leu Gin Val Val Pro Pro Cys Ala
20 25
<Desc/Clms Page number 25>
< 210 > 31 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:RnaseH < 400 > 31 gagggggagt attagagtat taggactct < 210 > 32 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:RnaseH < 400 > 32 gagggggggt aatagcagta atatcatat < 210 > 33 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:RnaseH < 400 > 33 290 gaggggaagt gttaggactc ttagtctag < 210 > 34 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Primer < 400 > 34 18 agactaagag tcctaaca < 210 > 35 < 211 > 19 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 35 19 gactgcgtac caattcatc