AT500370A1 - Verfahren zum diagnostizieren, verhindern und behandeln neurodegenerativer erkrankungen - Google Patents
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Description
1
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung, Prävention und Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen .
Neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer Krankheit (Alzheimer's Disease, AD), sind für die öffentliche Gesundheit von zunehmender Bedeutung. Was AD betrifft, so sind Berichten zufolge bisher etwa 12 Millionen Menschen von dieser Krankheit betroffen. Für das Jahr 2050 schätzt man zwischen 40 und 50 Millionen Patienten. Die Diagnostizierung solcher neurodegenerativer Erkrankungen auf eine entsprechende, verlässliche und sichere Art stellt jedoch noch immer ein großes Problem dar. Abgesehen von neurodegenerativen Prozessen gibt es viele andere mögliche Ursachen für Demenzen bei Patienten, wie Depressionen, Drogenkonsum, Dehydration, Anämie, Syphilis, Virusinfektionen und Vitaminmangel. Eine verlässliche Diagnose - die Voraussetzung für eine wirksame Behandlung - ist daher oft schwierig, wenn nicht unmöglich. Derzeit werden AD-Patienten mittels psychologischer Testmethoden oder (post-mortem) durch morphologische Analyse von Gehirnproben identifiziert. Kriterien für eine wahrscheinliche AD sind z.B. von der National Institute of Neurological Disorders and Stroke and Alzheimer's Disease and Related Disorders Association oder von CERAD definiert.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine einfache und verlässliche Methode zur Diagnostizierung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere von AD, vorzusehen.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren zur Diagnostizierung einer neurodegenerativen Erkrankung erreicht, welches die Schritte umfasst: • die Bereitstellung einer Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebeextrakts eines Individuums, für das eine Diagnose erstellt werden soll, • die Messung der Menge an alpha-Endosulfin in dieser Probe, und • das Vergleichen der gemessenen Menge an alpha-Endosulf in mit einem Bezugswert. Überraschenderweise erwies sich alpha-Endosulfin als hochspezifischer Marker für Zellen von Körperflüssigkeiten von Individuen, die an neurodegenerativen Erkrankungen leiden. Insbesondere bei AD-Patienten sind die alpha-Endosulfin-Mengen fast auf Null reduziert, was alpha-Endosulfin eindeutig als hochselektiven
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Marker für AD identifiziert, dessen Selektivität viel höher ist als die jedes anderen früher berichteten AD-Markers.
Alpha-Endosulfin ist ein endogener Regulator für KATp-Kanäle und hat die Sulfonyl-Harnstoff-artige Fähigkeit, KATP-Kanäle zu hemmen (zu schließen) und dadurch die Insulin-Sekretion in beta-Zellen zu stimulieren. Alpha-Endosulfin wurde mit beta-Endosulfin aus Rinderhirn [1] gereinigt und auch aus Schweinehirn isoliert [2]. Eine cDNA-Teilsequenz von alpha-Endosulfin wurde bestimmt und zeigte eine starke Homologie mit einem zyklischen AMP-regulierten Rinderhirn-Phosphoprotein mit der Bezeichnung ARPP-19, jedoch schienen die beiden Proteine von verschiedenen Genen codiert zu sein [3]. Das humane ENSA-Gen, das für alpha-Endosulfin codiert, ist auf dem Human-Chromosom 14 (14q24.3-q31) ko-lo-kalisiert mit einem Locus für die Empfänglichkeit gegenüber Diabetes Typ 1, genannt IDDM11 [4]. Man nimmt an, dass alpha-Endosulfin ein Protein-Kinase A-abhängiges, phosphoryliertes, intrazelluläres Protein ist, da es keine offensichtliche Signal-Peptid-Sequenz am N-Terminus gibt und es eine cAMP-abhängige Phosphorylierungsstelle im C-Terminus enthält, wie für ARPP-19 beobachtet [5]. Die Gewebsverteilung von alpha-Endosulfin, das in einem breiten Gewebespektrum, einschließlich Muskel und Gehirn, mit geringen Mengen in der Pankreas, exprimiert wird, ähnelt jener des KATp-Kanals und stimmt mit der Fähigkeit von alpha-Endosulfin, die KATP-Kanal-Aktivität zu regulieren, überein [6,7].
Die KATP-Kanäle sind große, oktamere Komplexe von zwei strukturell nicht verwandten Typen von Untereinheiten, eine von der nach innen rektifizierenden K+ Kanalfamilie (Kir6.X) und eine regulierende Sulfonyl-Harnstoff-Rezeptor-Untereinheit aus der ATP-Bindungskassetten(ABC)-Transporter-Familie (SUR), die sich mit einer Stöchiometrie von 4:4 zusammenfügen. Kir6.X bildet die Kanal-Pore und besitzt eine intrinsische ATP-Sensibilität [6, 11] , wogegen SUR eine Sensibilität gegenüber KATp-Kanalöffnern verleiht [12]. KATP-Kanäle liegen im Gehirn in hoher Dichte in der Substantia nigra, im Globus pallidus, im Cerebellum und im Cortex vor [13, 14]. Sie liegen auch im Hippocampus vor, und zwar sowohl präsynaptisch als auch postsynaptisch [14] und sind besonders in den moosartigen Fasern, die mit der Glutamat-Freisetzung assoziiert sind [15] . Sie sind gegenüber äußeren Glukose-Konzentrationen empfindlich [16], da sich dadurch das intrazelluläre Maß des ATP/ADP-Verhältnisses ändern könnte, verschließen KATp-Kanäle, was
MAnwriPRcriowT I zu einer zellulären Entpolarisierung, der Erzeugung eines Aktionspotentials, einem Ca2+-Eintritt und einer Insulin-Sekretion in beta-Zellen führt [17] . In Gehirnen könnte die Regulierung der KATP-Kanäle durch Modulatoren (Öffner und Blocker von KATp-Kanälen, wie antidiabetischen Sulfonyl-Harnstoffen) sowie extrazelluläre Glukosemengen die Freisetzung von Neurotransmittern steuern [18, 19]. Im DS-Gehirn sind der gestörte Glucose-Stoffwechsel und die Neurotransmitter-Defizite wohl bekannt und es wurde berichtet, dass eine Erhöhung der zirkulierenden Glucose die Lern- und Gedächtnisprozesse bei einem breiten Spektrum von Individuen, einschließlich gesunder, alter Menschen und Individuen mit schweren kognitiven Pathologien verbessert [20].
Trotz der wichtigen Beziehung zwischen alpha-Endosulfin und den KATp-Kanälen im Gehirn wurden bisher die Beteiligung und die biologische Funktion von alpha-Endosulfin im menschlichen Gehirn mit kognitiven Defekten noch nicht untersucht. Im Laufe der vorliegenden Erfindung wurden die Expressionsmengen des alpha-Endo-sulfin-Proteins in Proben von. Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen untersucht, insbesondere in Gehirnregionen von Patienten mit Down-Syndrom (DS),die die Neurotransmitter-Defizite und den gestörten Glucose-Stoffwechsel zeigen. Insbesondere wurden auch Proben von AD-Patienten im Hinblick auf ihre Expressionsmengen von alpha-Endosulfin-Protein untersucht und mit Kontrollen verglichen. Alle Versuche, die in dieser Hinsicht durchgeführt wurden, ergeben den Beweis für die Beteiligung von alpha-Endosulfin am kognitiven Defekt solcher neurodegenerativer Erkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren vorgesehen, wobei diese neurode-generative Erkrankung Alzheimer-Krankheit ist.
Gemäß einer anderen, bevorzugten Ausführungsform ist die bei der vorliegenden Erfindung zu diagnostizierende neurodegenerative Erkrankung die altersabhängige AD-Typ-Neurodegeneration bei Down Syndrom(DS)-Patienten. Es ist bekannt, dass fast alle DS-Patien-ten von dieser altersabhängigen AD-Typ-Neurodegeneration betroffen sind, wenn sie ein bestimmtes Alter, z.B. über 35 Jahre, erreichen.
Vorzugsweise ist die beim vorliegenden Verfahren zu verwendende Körperflüssigkeit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Liquor cerebrospinalis, Lymphe, insbesondere
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Serum oder Liquor cerebrospinalis. Bei diesen Körperflüssigkeiten ist alpha-Endosulfin unter Verwendung von Verfahren leicht quantifizierbar, die - beispielsweise für andere Proteine - bekannt sind und ohne wesentliche und übermäßige Belastung für den Fachmann für die vorliegende Erfindung adaptiert werden können.
Bevorzugte Gewebeextrakte stammen von Nervengewebe, vorzugsweise von Gehirngewebe, insbesondere Cerebellum und Stirn-Cortex, vom Gewebe peripherer Organe, insbesondere Leber, Herz und Nieren. Im Prinzip sind alle Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakte, die von der neurodegenerativen, zu diagnostizierenden Erkrankung betroffen sind, ein für die vorliegende Erfindung geeignetes Probenmaterial. Bei diesen bevorzugten Gewebeextrakten und Körperflüssigkeiten sind gesenkte alpha-Endosulfin-Mengen leicht und verlässlich detektierbar, und die neurodegenerative Erkrankung kann auf angemessene und effiziente Weise diagnostiziert werden. Das Mittel, mit welchen die Menge des alpha-Endosulf ins gemessen wird, ist nicht von kritischer Bedeutung. Tatsächlich sind im Stand der Technik eine Anzahl hochspezifischer Detektionsmittel für alpha-Endosulfin beschrieben, beispielsweise hochspezifische Antikörper oder Nukleinsäuresonden.
Vorzugsweise wird die Menge des alpha-Endosulfins durch Immundetektion mit alpha-Endosulfin-spezifischen Antikörpern gemessen, die mittels aller auf dem Gebiet als poly- oder monoklonale Antikörper bekannter Methoden erzeugt werden können.
Bei einer alternativ bevorzugten Ausführungsform wird die Menge des alpha-Endosulfins durch Messen der Menge der mRNA von alpha-Endosulfin mit einer Nukleinsäuresonde, die für alpha-Endosulf in spezifisch ist, gemessen, insbesondere mit Nukleinsäuremolekülen, die spezifisch an die für alpha-Endosulfin einzigartige Region binden. Vorzugsweise werden auf PCR basierende Verfahren zur Identifizierung solcher mRNA-Mengen von alpha-Endosulf in verwendet.
Obwohl das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine rasche, einfache und verlässliche Diagnose der neurodegenerativen Erkrankung erlaubt, kann die Menge des alpha-Endosulfins vorzugsweise in mehr als einer Körperflüssigkeit oder mehr als einem Gewebeextrakt gemessen werden. Dies ermöglicht eine noch verlässlichere Charakterisierung des Zustands des Individuums, insbesondere in einem frühen Stadium der neurodegenerativen Erkrankung. Demgemäß kann die neurodegenerative Erkrankung in
i NACHGEREICHT I 5 einem sehr frühen Stadium diagnostiziert werden, was einen frühen Beginn therapeutischer Maßnahmen, insbesondere für AD-Patienten, ermöglicht.
Vorzugsweise ist dieser Bezugswert der Wert eines gesunden Individuums, das nicht an dieser neurodegenerativen Erkrankung leidet, wobei der Bezugswert in der entsprechenden Körperflüssigkeit oder im betreffenden Gewebeextrakt gegebenenfalls mit der selben Messmethode gemessen wird. Mit einem solchen Bezugswert wird sowohl ein systematischer Fehler in Bezug auf differierende alpha-Endosulfin-Gehalte in verschiedenen Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten wie auch eine Abhängigkeit von absoluten Werten vermieden. Da alle verschiedenen Detektionsmethoden systematische Abweichungen vom absoluten ("realen") Wert der.alpha-Endosulfin-Menge zeigen können, sind solche Abweichungen für eine relative, gemeinsame Analyse der Probe des Patienten gemeinsam mit dem Kontrollwert mittels der selben Detektionsmethode, die vorzugweise zur selben Zeit mit dem selben Reagens oder Reagens-Lots durchgeführt wurde, nicht wichtig. Daher wird der Referenzwert vorzugsweise parallel zur Messung der Probe, für die eine Diagnose erstellt werden soll, gemessen.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Set zur Detektion von alpha-Endosulfin vorgesehen, welches umfasst: • Mittel zur Messung von alpha-Endosulf in, • eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebeextrakts eines Individuums, von dem eine Diagnose erstellt werden soll, und • einen alpha-Endosulfin-Bezugswert.
Vorzugsweise sind die Mittel zur Messung von alpha-Endosul-fin ausgewählt aus alpha-Endosulfin-Antikörpern und alpha-Endosulf in-spezifischen Nukleinsäuren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Sets ist der Bezugswert eine Probe, die von einem Normalplasma-Pool stammt, vorzugsweise in lyophilisierter Form. Bei einem solchen Bezug sind Abweichungen vom normalen, physiologischen Wert, die bei individuellen Proben selbst von gesunden Personen auftreten können, durch die hohe Anzahl individueller Proben, die in einem solchen Pool enthalten sind, ausgeglichen.
Alternativ zu einer solchen Pool-Probe oder in Kombination mit dieser kann ein Referenzwert vorzugsweise vorgesehen werden, [nachgereicht - 6 - - 6 - * · • · • fl • · • · • · der aus einer Reihe von alpha-Endosulfin-Lösungen mit verschiedenen alpha-Endosulfin-Konzentrationen besteht. Eine solche Reihe von alpha-Endosulfin-Konzentrationen kann entweder durch Verwendung einer gereinigten alpha-Endosulfin-Präparation vorgesehen werden, oder durch Verdünnen oder Konzentrieren einer gegebenen Körperflüssigkeit oder eines Gewebeextrakts für einen Referenzwert .
Als Referenzwert kann auch eine Probe einer Person verwendet werden, von welcher bekannt ist, dass sie an einer neurodegene-rativen Erkrankung, insbesondere AD, leidet. Vorzugsweise kann eine Reihe von Proben mit verschiedenen alpha-Endosulfin-Konzen-trationen auf Grund verschiedener Stufen oder Stadien der entsprechenden Krankheit vorgesehen werden, insbesondere eine Reihe verschiedener Stadien von AD.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von alpha-Endosulfin zur Herstellung eines Diagnosemittels für neu-rodegenerative Erkrankungen, insbesondere für AD.
Da alpha-Endosulfin als verlässlicher Marker für neurodege-nerative Erkrankungen etabliert wurde und da man weiß, dass dieses Protein die physiologische Rolle eines endogenen Regulators für KATP-Kanäle hat, sieht die vorliegende Erfindung auch effiziente therapeutische Mittel zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere AD, vor: Da alpha-Endosulfin bei solchen Patienten fast vollständig fehlt, umfasst eine Therapie für diese Krankheiten die aktive Gabe von alpha-Endosulfin an solche Patienten. Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem anderen Aspekt die Verwendung von alpha-Endosulfin für die Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung neurodege-nerativer Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung von AD.
Mit der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Präparation zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere AD, vorgesehen, welche alpha-Endosulfin und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Eine andere Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung eines Nukleinsäure-Vektors, der für alpha-Endosulfin codiert, für eine Gen-Therapie eines Patienten, der durch reduzierte oder fehlende Mengen an alpha-Endosulfin beeinträchtigt ist.
Alpha-Endosulfin, das die Sulfonyl-Harnstoff-ähnliche Fähigkeit zur Blockierung der KATp-Kanäle besitzt, wird im Gehirn
I NACHGEREICHT I exprimiert, und die Gewebsverteilung von alpha-Endosulfin ähnelt der der Κλτρ-Kanäle. Die KATP-Kanäle werden durch Kalium-Kanalöff-ner, wie Diazoxid, Cromakalim, Pinacidil, Nicorandil oder Apri-kalim [21-23] aktiviert und durch die antidiabetischen Sulfonylharnstoffe (oder Blocker), wie Tolbutamid, Glibenclamid und Glipizid inhibiert [24]. Obwohl Öffner und Blocker ihre jeweiligen Wirkungen deutlich dadurch ausüben, dass sie mit verschiedenen Typen von Rezeptorstellen assoziiert sind, gibt es eine ausgezeichnete Korrelation für eine Reihe von Sulfonylharnstoffen zwischen ihrer Effizienz zur KATP-Kanal-Blockierung und Bindung an ihren Arzneistoffrezeptor [25]. Kürzlich wurde berichtet, dass diese Modulatoren der KAtp-Kanal-Aktivität bei der Freisetzung von Neurotransmittern eine Rolle spielen. Es wurde gezeigt, dass Tolbutamid und Glibenclamid die Acetylcholin-Freisetzung aus cholinergischen Striatum-Interneuronen durch eine Blockade der KATP-Kanal-Aktivität stimulieren [26] . Die Blockade der KATP-Kanäle durch Glibenclamid schien auch die Freisetzung von gamma-Aminobuttersäure (gamma-aminobutyric acid, GABA) auf GABAergischen Interneuronen auszulösen, was wiederum serotoninergische Neuronen hemmt [27] . Von Sulfonylharnstoffen ist auch berichtet, dass sie GABA-synaptische Potentiale bei Ratten-Mittelhirn-Dopamin-Neuronen verbessert [28] . im Gegensatz dazu verbesserte Diazoxid die exzitatorischen glutama-tergischen Ströme und verringerte GABAergische Ströme bei Neuronen des Hippocampus [29]. Es zeigte sich, dass Cromakalim den Glutamat-induzierten neuronalen Tod bei Hippocampus-Neuronen verhindert, aber diese Wirkung wurde durch Glibenclamid ausgeschaltet [30] .
Die KATP-Kanäle konnten auch durch die Konzentration intrazellulärer ATP, die im Wesentlichen durch den Glucose-Stoffwechsel gesteuert wird, reguliert werden. Die Konzentrationen zirkulierender Glucose regulieren viele Gehirnfunktionen, einschließlich Lernen und Gedächtnis [31]. Umfassende Beweise wiesen darauf hin, dass relativ geringe Steigerungen der zirkulierenden Glucose-Konzentrationen die Lern- und Gedächtnis-Prozesse bei gesunden, alten Menschen und Individuen mit schweren kognitiven Pathologien, wie DS und AD, verbessern [20] . In mehreren Studien wurde von den gestörten Stoffwechselfunktionen im DS-Gehirn berichtet. Ältere, an Demenz leidende Erwachsene mit DS zeigten niedrigere Raten als die normalen Raten des absoluten Glucose-
[ NACHGEREICHT I 8
Stoffwechsels in Schläfen- und Scheitelbein-assoziierten neocor-tikalen Bereichen unter Verwendung von Positronen-Emissions-To-mographie (PET) mit [18F]-Fluordesoxyglucose, einem wohletablierten Verfahren zur Messung regionaler zerebraler Glucose-Stoffwechsel-Raten [32] . Obwohl bei älteren Erwachsenen mit DS ohne kognitive Störung der regionale zerebrale Glucose-Stoffwechsel viele Jahre lang innerhalb des normalen Bereichs bleibt, zeigten wiederholte Messungen im Laufe der Zeit und nach dem Einsetzen einer Demenz eine progressive Abnahme des Glucose-Stoffwechsels.
Auf der Grundlage dieser Studien konnte der der Glucose-Wirkung auf das Gedächtnis zu Grunde liegende Mechanismus mit der Freisetzung von Neurotransmittern über IW-Kanäle in Beziehung gebracht werden.. Sowohl die lokale als auch die systemische Glucose-Verfügbarkeit konnte die Nigra-GABA-Freisetzung über eine Wirkung auf KATP-Kanäle beeinflussen, und eine Hemmung der GABA-Freisetzung könnte zum Teil die Hyperexzitabilität, die mit der Hypoglykämie verbunden ist, vermitteln [33].
Bei DS wurden mehrere Neurotransmitter-Defizite untersucht. Es wurde beobachtet, dass die cholinergischen Defizite bei DS eine signifikante Verringerung der Aktivität des spezifischen cholinergischen Marker-Enzyms [34-36], Cholin-Acetyltransferase, das die Synthese von Acetylcholin katalysiert, zeigen. Bei muriner Trisomie 16 (TS16), die als Modell für das humane Trisomie-21-Gehirn angesehen wird, war die Gehirn-Cholinacetyltransferase-Aktivität auf 67% der Kontrolle reduziert, und die gleichbleibende Cholin-Aufnahme war auf 35% reduziert [37] . GABA war im Hippocampus und in der Schläfen-Cortex bei DS-Patienten mit neo-cortikalen neurofibrillären Verflechtungen reduziert, und diese Ergebnisse stimmen mit den Verlusten GABAergischer Neuronen überein [38]. Substantielle Defizite an Noradrenalin, 5-Hydroxy-tryptamin und 5-Hydroxyindolessigsäure wurden im Hippocampus, in der Schläfen- und Stirn-Cortex von DS-Patienten beobachtet [39]. Obwohl diese Neurotransmitter-Defizite von der Schädigung der cholinergischen, noradrenergischen und Serotonin-Neurotransmit-ter-Systeme, die bei DS beobachtet wurden [40], herrühren könnten, konnte die neurobiologische Funktion endogener Regulatoren bei der Steuerung der Neurotransmitter-Freisetzung auf dem Weg über Ionen-Kanäle nicht ausgeschlossen werden.
Da alpha-Endosulfin-Protein bei Individuen mit neurodegene-
ΜΔΛυ^ιτηπΛί ι-t- I rativen Erkrankungen extrem verringert oder nicht vorhanden ist, insbesondere in der Stirn-Cortex und im Cerebellum von Patienten mit AD und DS, stellt es für solche Krankheiten einen sehr selektiven Marker dar. Eine neurodegenerative Erkrankung wird mit dem vorliegenden Verfahren identifiziert, beispielsweise, wenn eine Probe 50 oder weniger %, insbesondere 10% oder weniger, mehr bevorzugt 5% oder weniger, insbesondere etwa 1% oder weniger, alpha-Endosulfin im Vergleich zu einem normalen physiologischen Wert im selben Gewebeextrakt oder in derselben Körperflüssigkeit aufweist.
In der DS-Gruppe wurde auch ein gestörter Glucose-Stoffwechsel beobachtet, indem die signifikant verringerte Aktivität von Phosphoglucose-Isomerase in früheren Arbeiten aufgezeigt wurde [41]. Solch ein verringertes alpha-Endosulfin könnte die Neurotransmitter-Freisetzung hemmen, die sich aus der kontinuierlichen Öffnung von KATP-Kanälen bei DS zusammen mit dem gestörten Glucose-Stoffwechsel ergibt.
Gemäß einer alternativen therapeutischen Strategie, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird, werden Substanzen, die KATp-Kanäle schließen können, zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation für die Behandlung neurodegenerati-ver Erkrankungen, insbesondere AD, verwendet. Da die KATp-Kanäle physiologisch durch alpha-Endosulfin geschlossen werden und das Fehlen oder gesenkte Werte von alpha-Endosulfin zu einer verstärkten (unkontrollierten) Öffnung (Aktivität) dieser Kanäle führen, ist ein derartiges Fehlen oder gesenkte Werte von alpha-Endosulfin durch die Bereitstellung alternativer Verschlussmittel für diese KATp-Kanäle kompensierbar.
Vorzugsweise werden zum Schließen oder zur Blockierung der KATp-Kanäle antidiabetische Sulfonylharnstoffe verwendet, insbesondere Tolbutamid, Glibenclamid und Glipizid. Diese Substanzen wurden als Pharmazeutika bereits verwendet, doch für ganz andere Indikationen. Die Möglichkeit, diese Substanzen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zu verwenden, insbesondere ihre Verwendung bei der Behandlung von AD, wird durch die vorliegende Erfindung direkt ermöglicht, ist jedoch angesichts des Standes der Technik, in welchem die spezifische Rolle von alpha-Endosulfin oder den KATP-Kanälen bei neurodegenerativen Erkrankungen überhaupt nicht angesprochen wurde, völlig überraschend. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur
NACHGEREICHT 10
Behandlung eines Patienten, der an einer neurodegenerativen Erkrankung, insbesondere AD, leidet, durch Verabreichung einer wirksamen Menge von alpha-Endosulfin an diesen Patienten. Wenn alpha-Endosulfin dem Patienten in einem frühen Stadium der Krankheit verabreicht wird, können schwere Komplikationen, die in späteren Stadien einer solchen Erkrankung entwickelt werden, verhindert oder hinausgezögert werden.
Die vorliegende Erfindung ist in den Beispielen und Zeichnungsfiguren weiters beschrieben, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt Western Blots mit den alpha-Endosulfin-Expres-sionsmengen in der Stirn-Cortex (A) und im Cerebellum (B) von Patienten mit AD und von Kontrollen (denaturierte Gehirn-Proteine (10 pg) wurden auf SDS-PAGE getrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert, mit gereinigten Kaninchen-polyklonalen IgGs gegen alpha-Endosulfin nachgewiesen und mit Chemilumineszenz-Reagentien entwickelt);
Fig. 2 zeigt einen Immunoblot für alpha-Endosulfin in der Stirn-Cortex (A) und im Cerebellum (B) von Patienten mit DS und von Kontrollen (denaturierte Gehirn-Proteine (10 pg) wurden aufgetragen, auf einem homogenen 12,5% Gel getrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert; die Membran wurde mit Kaninchen-Anti-seren gegen alpha-Endosulfin inkubiert; immunreaktives alpha-Endosulfin wurde in 19 kDa unter Verwendung von Chemilumineszenz-Reagentien nachgewiesen);
Fig. 3 zeigt eine Sequenz-Ausrichtung von alpha-Endosulfin, beta-Endosulfin und ARPP-19.
Beispiele : 1.: Alpha-Endosulfin-Bestimmung bei AD-Patienten
Menschliche Gehirnproben, die von einer Autopsie stammten, wurden von der MRC London Brain Bank for Neurodegenerative Diseases, Institute for Psychiatry, erhalten. Die AD-Patienten erfüllten die Kriterien des National Institute of Neurological Disorders and Stroke and Alzheimer's Disease and Related Disorders Association für eine wahrscheinliche AD. Die neuropatholo-gische Diagnose der "definitiven AD" wurde unter Verwendung der CERAD-Kriterien bestätigt. Normalgehirne, die von Individuen, die keine neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen erlitten hatten, stammten, wurden als Kontrollen verwendet. Zwei Gehirn-
NACHGEREICHT 11 regionen (Stirn-Cortex und Cerebellum) von Patienten mit AD und Kontrollen wurden verwendet (vgl. Tabelle 1). Die Haupttodesursache war Bronchopneumonie bei AD und eine Herzerkrankung bei den Kontrollen. Die alpha-Endosulfin-Protein-Expressionsmengen wurden durch Western Blot mit spezifischen Antikörpern für alpha-Endo-sulfin gezeigt (vgl. Fig. 1) [Hinweis auf Antikörper]. Im Vergleich zu Kontrollen wurde alpha-Endosulfin (19 kDa) in der Stirn-Cortex und im Cerebellum von Patienten mit AD, überhaupt oder fast nicht nachgewiesen.
Tabelle 1. Autopsie-Daten, die bei dieser Studie verwendet wurden .Autopsie-Intervall (Stunden) 37,30 ± 18,39 29,43 ± 30,07 38,89 ± 18,77 31,80 ± 28,34
Alter (Jahre) 62,60 ± 8,02 60,71 ± 9,48 63,11 ± 8,33 60,80 ± 8,42
Geschlecht (männl./weibl.)
Stirn-Cortex Kontrolle 7:3 DS 3:4
Cerebellum Kontrolle 6:3 DS 6:4
Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Nützlichkeit von alpha-Endosulfin als diagnostischen Marker und als Ziel für eine Arzneistof f-Therapie bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie AD. 2.: Alpha-Endosulfin bei DS-Patienten
Materialien und Methoden:
Gehirnproben: Menschliche Gehirnproben, die aus einer Autopsie stammten, wurden von der MRC London Brain Bank for Neurode-generative Diseases, Institute of Psychiatry, erhalten. Alle DS-Patienten wurden karyotypisiert und hatten Trisomie 21. Eine formal-kognitive Beurteilung der Demenz bei DS wurde nicht durchgeführt. Bei allen DS-Gehirnen gab es reichliche und umfassende beta-Amyloid-Ablagerungen, Neurofibrillen-Verflechtungen und Neuriten-Plaques, und sie wiesen AD-Neuropathologien auf. Normale Gehirne, die von Individuen stammten, welche keine neurologische oder psychiatrische Krankheit erlitten hatten, wurden als Kontrollen verwendet. Zwei Gehirn-Regionen (Stirn-Cortex und Cerebellum, die bei DS regelmäßig beeinträchtigt sind) von Patienten mit DS und von Kontrollen wurden für die Untersuchungen auf Protein-Ebene verwendet (Tabelle 2). Die Haupttodesursache bei DS war Bronchopneumonie, und bei den Kontrollen eine Herzkrankheit. Koronal-Schnitte wurden sofort gefroren und bis zur
NACHGEREICHT 12
Verwendung bei -70°C gelagert.
Tabelle 2. Autopsie-Daten, die bei dieser Studie verwendet wurden
Geschlecht Alter (Jahre) (männl. /weibl.)
Stirn-Cortex Cerebellum
Kontrolle 7:3 DS 6:2 Kontrolle 6:3 DS 4:2 62,60 ± 8,02 55,88 ± 7,97 63,11 ± 8,33 55,83 ± 9,37
Autopsie-Intervall (Stunden) 37,30 ± 18,39 32,38 ± 20,70 38,89 ± 18,77 28,00 ± 23,21
Probenherstellung: Gehirngewebe wurden in Homogenat-Puffer bestehend aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05% (V/V) Tween 20, 4% CHAPS, 1 mM EDTA und einer Mischung aus Protease-Inhibitoren, 1 mM PMSF und 1 mg/ml jeweils von Pepstatin A, Chy-mostatin, Leupeptin und Antipain suspendiert. Die Suspension wurde in einem Potter-Elvehjem-Homogenisator bei 4°C homogenisiert und bei lO.OOOxg 10 min lang zentrifugiert. Mit dem BCA-Protein-Testset (Pierce, USA) wurde die Protein-Konzentration im Überstand bestimmt.
Immunoblots: Gehirnproben (10 mg) wurden mit demselben Volumen Proben-Puffer (125,5 mM Tris, 70 mM SDS, 0,001% Bromphenolblau, 20% Glycerin, 2% 2~Mercaptoethanol, pH 6,8) gemischt, bei 95°C 15 min lang inkubiert und auf 12,5% ExcelGel, ein homogenes SDS-Gel (Amersham Pharmacia Biotech, Schweden), geladen. Die Elektrophorese erfolgte mit einem Multiphor II Electrophoresis System (Amersham Pharmacia Biotech, Schweden). Auf dem Gel separierte Proteine wurden auf eine PVDF-Membran (Millipore, Bedford, USA) übertragen, und die Membran wurde in Blockierungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 1% Mager-Trockenmilch) blockiert. Die Membran wurde 4 h lang bei Raumtemperatur mit 1:2000 verdünnten, gereinigten polyklonalen Kanin-chen-IgGs für alpha-Endosulfin inkubiert. Nach dreimaligem 15 min langem Waschen mit Blockierungspuffer wurden die Membranen mit einer 1:1000-Verdünnung des sekundären Antikörpers, anti-Kanin-chen-IgG(H+L), an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt (Southern Biotechnology Associates, Inc., Alabama, USA) als Sonde 1 h lang untersucht. Die Membran wurde dreimal 15 min lang gewaschen und mit dem Western Blot-Chemilumineszenz-Reagens (NENä Life Science Products, Inc., USA) entwickelt. _
NACHGEREICHT 13
Ergebnisse: Die Immunoblot-Analyse zeigte, dass das 19-kDa alpha-Endosulfin-Protein sowohl in der Stirn-Cortex als auch im Cerebellum von Patienten mit DS im Vergleich zu den Kontrollen extrem verringert oder nicht vorhanden war. Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde alpha-Endosulfin in der Stirn-Cortex von männlichen DS-Patienten und im Cerebellum von weiblichen DS-Patienten absolut oder fast nicht nachgewiesen. In der Stirn-Cortex von weiblichen DS-Patienten und im Cerebellum von männlichen DS-Patienten wurde alpha-Endosulfin in einer von beiden Proben schwach nachgewiesen, hatte jedoch im Vergleich zu den Kontrollen eine sehr geringe Dichte.
Die vorliegenden Ergebnisse legen daher die biologische Rolle von alpha-Endosulfin im Gehirn sehr deutlich nahe. Sie zeigen, dass alpha-Endosulfin ein sehr nützlicher endogener Marker für Neurotransmitter-Defizite, die mit KATP-Kanälen bei neu-rodegenerativen Erkrankungen mit kognitiven Defekten verbunden sind, ist.
NACHGEREICHT 14
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NACHGEREICHT
Claims (19)
- - 18 - • · · · · · ' • · · · ♦ · •«· · ♦ · ·· w* . · * · · • * ««*···«·· t Patentansprüche 1. Verfahren zur Diagnostizierung einer neurodegenerativen Erkrankung, welches die Schritte umfasst: • die Bereitstellung einer Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebeextrakts eines Individuums, für das eine Diagnose erstellt werden soll, • die Messung der Menge an alpha-Endosulfin in dieser Probe, und • das Vergleichen der gemessenen Menge an alpha-Endosulfin mit einem Bezugswert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neurodegenerative Erkrankung Alzheimer-Krankheit (Alzheimer's Disease, AD) ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neurodegenerative Erkrankung die altersabhängige Neurodegeneration vom AD-Typ bei Down-Syndrom(DS)-Patienten ist.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Liquor cerebrospinalis, Lymphe, insbesondere Serum oder Liquor cerebrospinalis.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gewebeextrakt von Nervengewebe, vorzugsweise von Gehirngewebe, insbesondere Cerebellum und Stirn-Cortex, vom Gewebe peripherer Organe, insbesondere Leber, Herz und Nieren stammt.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an alpha-Endosulfin durch Immundetektion mit alpha-Endosulfin-spezifischen Antikörpern gemessen wird.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an alpha-Endosulfin durch Messen der Menge der m-RNA von alpha-Endosulfin mit einer Nukleinsäuresonde, die für alpha-Endosulfin spezifisch ist, gemessen wird.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an alpha-Endosulfin in mehr als einer I MAm-mpRpiriWT I 19 Körperflüssigkeit oder in mehr als einem Gewebeextrakt gemessen wird.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Bezugswert der Wert eines gesunden Individuums ist, das nicht von der neurodegenerativen Erkrankung betroffen ist, wobei der Bezugswert in der entsprechenden Körperflüssigkeit oder im entsprechenden Gewebeextrakt gemessen wird, gegebenenfalls mit derselben Meßmethode.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Bezugswert parallel zur Messung der Probe, für die eine Diagnose erstellt werden soll, gemessen wird.
- 11. Set zur Detektion von alpha-Endosulfin, umfassend • Mittel zum Messen von alpha-Endosulfin, • eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebeextrakts aus dem Individuum, für das eine Diagnose erstellt werden soll, • einen alpha-Endosulfin-Bezugswert.
- 12. Set nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Messen von alpha-Endosulfin ausgewählt sind aus alpha-Endosulf in-Antikörpern und alpha-Endosulfin-spezifischen Nukleinsäuren.
- 13. Set nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Bezugswert eine von einem Normalplasma-Pool stammende Probe, vorzugsweise in lyophilisierter Form, ist.
- 14. Set nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Bezugswert eine Reihe von alpha-Endosulfin-Lösungen mit verschiedenen alpha-Endosulfin-Konzentrationen ist.
- 15. Verwendung von alpha-Endosulfin für die Herstellung eines Diagnostikums für neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere für AD.
- 16. Verwendung von alpha-Endosulfin für die Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung von AD. N.IAf'LiriCDCir'LJ-r I - 20 - - 20 - • · • · ♦ ·• · · ··*··*»·· · ♦ · • · • · · · • · « t
- 17. Pharmazeutische Präparation zur Behandlung neurodegenera-tiver Erkrankungen, insbesondere AD, dadurch gekennzeichnet, dass sie alpha-Endosulfin und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
- 18. Verwendung einer KATP-Kanal-blockierenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung neu-rodegenerativer Erkrankungen, insbesondere AD.
- 19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die KATP-Kanal-blockierende Substanz ein antidiabetischer Sulfonylharnstoff, vorzugsweise Tolbutamid, Glibenclamid oder Glipi-zid, ist. DA/fm NACHGEREICHT
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| Virsolvy-Vergine A. et al:"Endosulfine, endogenous Ligand for the sulphonylurea receptor: isolation from porcine brain and partial structural determination of the alpha form" …Diabetologia. 1996 Feb;39(2):135-41. …[C.A. 124(21)1996:283593i] …*abstract* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AT500370B1 (de) | 2006-03-15 |
| AT500370B8 (de) | 2007-02-15 |
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