AT500837A1 - Verfahren zur generierung von knorpelbildenden zellen - Google Patents

Description

  Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Generierung von knorpelbildenden Zellen und Knorpelzellen sowie eines Knorpelersatzes.
Die Therapie der degenerativen Gelenkerkrankung, Osteoarthrose, beschränkt sich derzeit auf die Linderung von Schmerzen und Erhaltung der Gelenkfunktion. Mit den zur Verfügung stehenden Substanzen kann weder der Krankheitsfortschritt aufgehalten, noch die Knorpelregeneration gefördert werden. Artikulares Knorpelgewebe, welches an den Enden von in Gelenkverbindung stehenden Knochen gefunden wird und blutgefässloses Gewebe darstellt, weist auch keine natürliche Heilungsmöglichkeit auf.
Während normaler Knorpelgewebe-Ontogenese kondensieren mesenchymale Stammzellen, um Bereiche hoher Dichte zu bilden und eine Reihe von Entwicklungsstufen zu durchlaufen, welche in der reifen Knorpelzelle - den Chondrozyten - enden.

   Das endgültige Hyalinknorpelgewebe enthält nur Knorpelzellen, welche von einer Matrix umgeben sind, die aus Typ-II-Kollagen, sulfatierten Proteoglykanen und zusätzlichen Proteinen zusammengesetzt ist. Diese Matrix, die auch als Interzellularsubstanz bezeichnet wird, ist hydrogen in der Struktur und besteht aus drei morphologisch unterschiedlichen Zonen, die sich in der Kollagen- und Proteoglykan-Verteilung, Kalkablagerung, Ausrichtung der Kollagen-Fibrillen und der Positionierung und Ausrichtung der Knorpelzellen unterscheiden (1, 2, 3) . Diese Eigenschaften bilden die eindeutigen mechanischen und physikalischen Parameter für HyalinKnorpelgewebe .
Zur Therapie von Osteoarthrose, aber auch für Knorpelverletzungen und -Zerstörungen anderer Art, wie z.B.

   Hinblick auf einen Ersatz des Knorpelgewebes durchgeführt ( "Resurfacing", "Tissue Engineering", etc.), doch ist dies oft durch eine mangelhafte Kultivierungsfähigkeit von Knorpelzellen limitiert. Die in der Interzellularsubstanz des Knorpels eingelagerten Chondrozyten dedifferenzieren nämlich unter in vi tro Kulturbedingungen im Laufe der
Kultivierungsdauer. Während primäre Knorpelzellen (PO Kultur) nach ihrer Isolation aus Knorpelgewebe noch knorpelzelltypische Syntheseleistungen, wie die Bildung von Kollagen Typ II, Typ IX und Typ XI, zeigen, verlieren kultivierte Zellen diese typischen Eigenschaften während weiterer Passagen (Pl-PX) in vi tro .
Kultivierte Knorpelzellen befinden sich somit in einem dedifferenzierten Zustand und ähneln morphologisch und physiologisch den Fibroblasten.

   Vor allem bei grösseren Defekten ist jedoch die Vermehrung der autologen Chondrozyten durch Kultivierung und Passagierung für die Herstellung ausreichender Mengen an Transplantationsmaterial aus kleinen Proben notwendig.
Die Dedifferenzierung der Knorpelzellen kann bisher nur durch die Zugabe von zusätzlichen Wachstumsstimulanzien verhindert werden, was die Verwendung dieser Kulturen im in vivo Bereich erschwert, da die Wachstumsstimulanzien mit dem Immunsystem des Empfängerorganismus nachteilig wechselwirken können.

   Durch die bekannten Verfahren ist es des weiteren nicht gewährleistet, dass die Zellen auch nach mehreren Passagen während der Kultivierung ihren natürlichen oder weitestgehend natürlichen Stoffwechsel aufrecht erhalten.
1965 wurde nun festgestellt, dass eine demineralisierte Extraktion der langen Knochen von Rindern eine endochondrale Knochenbildung in Muskeltaschen von Nagetieren induziert (4) . zurückgeführt, die als knochen-morphogenetische Proteine (BMPs, "Bone Morphogenetic Proteins") bezeichnet werden. Wie noch näher ausgeführt werden wird, wurden mittlerweile mehrere Wachstumsfaktoren dieser Art isoliert und aufgrund bedeutsamer Sequenzhomologie als Mitglieder der TGF-ss-Superfamilie von Proteinen klassifiziert (5, 6) .

   Beim Menschen sind zur Zeit 16 Mitglieder der BMP-Familie bekannt, die abhängig von ihrer Struktur in vier Untergruppen unterteilt und fortlaufend nummeriert werden (von BMP-2 bis BMP-15, wobei zusätzlich ein BMP-3B sowie ein BMP-8B existieren) .
Des Weiteren wurde bekannt, dass diese individuellen, rekombinierbar hergestellten Faktoren ferner eine ektopische Knochenbildung im Rattenmodell veranlassen (7, 8). Zusätzlich haben in vitro-Tests gezeigt, dass ein bestimmtes BMP, nämlich BMP-2, als auch TGFss-1 mesenchymale Stammzellen dazu veranlassen, Knorpelgewebe zu bilden (9, 10). Sowohl für BMP-7 als auch BMP-2 wurde - gezeigt, dass sie die Matrixproduktion von Knorpelzellen in vi tro verbessern (11, 12) .

   Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die BMPs nicht nur wichtige Regulatoren der Osteogenese sind, sondern dass sie auch entscheidende Rollen während der chondrogenen Entwicklung in vi tro spielen.
Dennoch sind derzeit auch unter Zuhilfenahme von BMPs keine Kulturtechniken bekannt, die Knorpelzellen aus anderen reifen Gewebszellen in ausreichendem Masse und auf Dauer entstehen lassen. Insbesondere sind keine adulten Zelltypen bekannt, aus denen Knorpelzellen leicht hervorzubringen sind.
Es ist daher das Ziel der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, das es ermöglicht, Knorpelzellen aus bestimmten Gewebstypen zu kultivieren und zu differenzieren, um in weiterer Folge Knorpelersatzgewebe zur Therapie von Knorpelverletzungen und bereitzustellen.
Dieses Ziel wird durch die Merkmale von Anspruch 1 verwirklicht.

   Anspruch 1 sieht dabei ein Verfahren zur Generierung knorpelbildender Zellen und Knorpelzellen vor, bei dem Ligamentfibroblasten in einem Nährmedium unter Anwesenheit von Wachstumsfaktoren kultiviert werden. Es hat sich nämlich herausgestellt, dass Ligamentfibroblasten unter dem Einfluss von Wachstumsfaktoren allgemein und insbesondere der BMPFamilie in Richtung Chondrozyten differenzieren.

   Somit stellen im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens Ligamentfibroblasten eine mögliche Quelle knorpelbildender Zellen für den Wiederaufbau von zerstörtem Knorpelgewebe dar.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird dabei unter dem Begriff "Kultivieren von Zellen" ein, vorzugsweise in vi tro stattfindendes, Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von Zellen in einer geeigneten Umgebung, zum Beispiel unter Zu- und Abfuhr von Stoffwechseledukten und -produkten, verstanden, insbesondere auch eine Vermehrung der Zellen. Eine geeignete Vorgangsweise hierzu wird im folgenden noch genauer beschrieben werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden des weiteren unter "knorpelbildenden Zellen" Vorläuferzellen der Chondrozyten, insbesondere Chondroblasten, verstanden, wobei Chondroblasten und Chondrozyten tierischer oder menschlicher Art sein können.

   Auch wenn der Einsatz gentechnischer Methoden im Sinne einer Veränderung der DNA-Sequenz für das erfindungsgemässe Verfahren zunächst nicht notwendig ist, sind von den Begriffen Chondroblasten und Chondrozyten auch gentechnisch veränderte Knorpelzellen bzw. knorpelbildende Zellen umfasst. beschriebene Molekülfamilie, die knochenformbildende Proteine umfasst. Mitglieder der BMP-Familie sind als jene definiert, die im reifen Abschnitt des Moleküls sieben Cysteinreste aufweisen, zumindest 65% Homologie mit anderen bekannten BMPSequenzen im reifen Bereich besitzen und um den gleichen Rezeptor konkurrieren. Ausserdem scheinen sie alle als grösserer Vorläufer kodiert zu sein, der am N-terminalen Ende ein Signalpeptid, weiters ein langes Prosegment ("LatencyAssociated Polypeptide") und ein je nach Typ des Wachstumsfaktors verschieden langes C-terminales Polypeptid besitzt.

   Letzteres stellt nach enzymatischer Abspaltung die aktive Sequenz der aktiven Form des Wachstumsfaktors dar. Bezugnahmen auf ein BMP bzw. einen BMP-Wachstumsfaktor sind als Bezugnahme auf jede der derzeitig identifizierten Formen, d.h. jene, die in Fig. 1 gegeben sind, auf latente Versionen davon, sowie auf BMP-Spezien, die in Zukunft identifiziert werden, zu verstehen, einschliesslich Polypeptiden, die aus der Sequenz jedes bekannten BMP abgeleitet sind und eine Homologie von zumindest 75% mit der Sequenz aufweisen.
Es ist dabei durchaus möglich, dass die erfindungsgemäss verwendeten BMP-Wachstumsfaktoren miteinander zusammenwirken oder möglicherweise synergistisch wirken. Das erfindungsgemässe Verfahren kann daher nicht nur einen dieser BMPWachstumsfaktoren umfassen, sondern auch Kombinationen mehrerer Proteine der BMP-Familie.

   Solche Kombinationen können einzelne getrennte Proteinmoleküle oder Heteromoleküle umfassen, wie Heterodimere, die durch Teile der jeweiligen Proteine gebildet werden. Ein erfindungsgemässes Verfahren kann beispielsweise ein BMP-Protein oder einen Teil davon umfassen, das/der mit einem Teil eines anderen - BMP-Proteins verbunden ist, wobei ein Hetero olekül gebildet wird. verwendeten BMP-Proteine auch Faktoren, die von Sequenzen codiert werden, die entweder von Natur aus Modifikationen (z.B. Allel-Variationen in der Nukleotidsequenz, die zu Aminosäure-Veränderungen im Polypeptid führen können) aufweisen, oder gezielt verändert wurden. Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst ebenso synthetische Polypeptide, bei denen zusammenhängende Sequenzen des aktiven Segments der in Fig. 1 gegebenen BMP-Proteine ganz oder teilweise wiederholt sind.

   Aufgrund der gleichen primären, sekundären und tertiären Struktur- und Konformationsmerkmale wie andere erfindungsgemäss verwendeten BMP-Proteine können diese Sequenzen auch die gleichen biologischen Knorpel-Wachstumsfaktor-Eigenschaften wie diese besitzen. Daher könnten sie im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens als biologisch aktive Ersatzmittel für natürlich vorkommende BMP-Proteine eingesetzt werden.
Wie noch näher ausgeführt werden wird, kann es sich bei den Wachstumsfaktoren der BMP-Familie gemäss Anspruch 2 um CDMP-1, CDMP-2, BMP-6 und OP-1 handeln.

   Es ist jedoch denkbar, auch andere Kombinationen an Wachstumsfaktoren der BMP-Familie oder anderer Familien wie beispielsweise der IGF-Familie (Insuline Like Growth Factor) oder der FGF-Familie (Fibroblast Like Growth Factor) wie in den Ansprüchen 3 und 4 angeführt, heranzuziehen.
Gemäss Anspruch 5 werden die Wachstumsfaktoren bei einer Konzentration von lOOng/ml zugesetzt, wobei sich je nach verwendeten Wachstumsfaktoren bzw.

   Kombination an Wachstumsfaktoren auch davon abweichende Konzentrationen als optimal erweisen können.
Bei Vorliegen der Ligamentfibroblasten als Monolayer-Kulturen hat sich gemäss Anspruch 6 ein Zusetzen der Wachstumsfaktoren als vorteilhaft erwiesen.
Liegen die Ligamentfibroblasten als Mikromasse-Kulturen vor, so erweist sich gemäss Anspruch 7 das Zusetzen der Wachstumsfaktoren über einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen, vorzugsweise 10 Tagen, als vorteilhaft.
Gemäss Anspruch 8 wird das Nährmedium mit den Wachstumsfaktoren mindestens jeden zweiten Tag erneuert.
Anspruch 9 bezieht sich schliesslich auf einen Knorpelersatz, der gemäss des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hergestellt wurde.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden anhand der beiliegenden Figuren näher erläutert.

   Es zeigen dabei
Fig. 1 eine Tabelle mit den derzeit bekannten Mitgliedern der BMP-Familie,
Fig. 2 Versuchsresultate des Anmelders zur fehlenden Ansprechbarkeit von Hautfibroblasten auf CDMP-1, -2, OP-1 und BMP-6, wobei die Bestimmung mittels der [<35>S] SulfatInkorporationsmethode erfolgte (BM=basales Medium, also unstimulierte Kontrolle; Konzentration der Wachstumsfaktoren lOOng/ l; Inkubationszeit 5 Tage; Werte dargestellt als counts per minute/[mu]g Protein; Balken repräsentieren Mittelwert und Standardabweichung) ,
Fig. 3 Versuchsresultate des Anmelders zur Stimulierung der Synthese von Matrix-Makromolekülen in Ligamentfibroblasten durch Zusatz von CDMP-1, -2, OP-1 und BMP-6, wobei die Bestimmung mittels [<35>S] Sulfat-Inkorporationsmethode erfolgte (BM=basales Medium, also unstimulierte Kontrolle; Konzentration der Wachstumsfaktoren lOOng/ml; Inkubationszeit 5 Tage;

   Werte dargestellt als counts per minute/[mu]g Protein; p<0.01 vs. BM) ,
Fig. 4 Versuchsresultate des Anmelders zur Auf-Regulierung der Knorpelmarker Aggrecan und Typ II-Kollagen in Ligamentfibroblasten in Monolayer-Kulturen nach Stimulation mit CDMP-1, -2, OP-1 und BMP-6, wobei die Bestimmung unter Verwendung der RT-PCR ("Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction") -Methodik erfolgte (Konzentration der Wachstumsfaktoren lOOng/ml; die Säulendiagramme zeigen die Ergebnisse nach Normalisierung auf Actin) , und
Fig. 5 histologische Schnitte von Ligamentfibroblasten in Mikromasse-Kulturen nach 10-tägiger Stimulation mit BMPs (hier BMP-6 bei 100 ng/ml; Kontrolle: unstimulierte Kultur; Gewebefärbung mit Toluidinblau) .
Der Pionierarbeit von Urist 1965 ist die Erforschung und Identifizierung der BMPs zu verdanken (4) .

   Wie bereits erwähnt wurde, konnte in seiner Arbeit gezeigt werden, dass demineralisierter Knochenextrakt eine de novo Knochenbildung in Muskeltaschen von Nagetieren bewirkt. Der Name BMP wurde erstmals 1988 im Rahmen der Isolation dreier Proteine aus demineralisierten bovinen Knochenpräparationen genannt, die im Tierexperiment ektopische Knorpel- und Knochenbildung induzierten. Heute weiss man, dass der Begriff "Bone Morphogenetic Protein" die Funktionen dieser Wachstumsfaktoren nur sehr einseitig beschreibt. BMPs sind an der Entwicklung von beinahe allen Organen und Geweben, wie Herz, Lunge, Niere, Gastrointestinaltrakt und der Zähne beteiligt und regulieren als multifunktionelle Morphogene differenzierte biologische Prozesse wie Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Apoptose.

   Des weiteren spielen BMPs eine massgebliche Rolle während der embryonalen Skelett- und Extremitätenentwicklung. bekannt, die abhängig von ihrer Struktur in vier Untergruppen geteilt und fortlaufend nummeriert werden (Fig. 1) . Die BMPFamilie ist dabei Mitglied der TGF-ss-Familie, die somit auch als "TGF-ss-Superfamilie" bezeichnet wird.
Die TGF-ss-Familie ist eine Gruppe von strukturell verwandten Wachstumsfaktoren, die neben BMPs Activine und Inhibine, TGF-sss, Müllerian Inhibiting Substance (MIS) und Glial Cell Line-derived Neutrophic Factor (GDNF) vereint. Die Wachstumsfaktoren der TGF-ss-Familie werden als grosse Vorläuferproteine synthetisiert.

   Wie bereits erwähnt wurde, besitzen sie am N-terminalen Ende ein Signalpeptid, weiters ein langes Prosegment, auch "Latency-Associated Polypeptide" genannt, und ein von Wachstumsfaktor zu Wachstumsfaktor verschieden langes C-terminales Polypeptid. Dieses Segment, das bei TGF-ss, dem strukturellen "Prototypen" der TGF-ss Familie, aus 112 Aminosäuren besteht, ist nach enzymatischer Abspaltung vom Pre-Pro-TGF-ss-Protein die aktive Form des Wachstumsfaktors .
Dieses aktive Polypeptid ist ein hydrophobes, Disulfid-verbundenes Dimer. Unter den 112 Aminosäuren befinden sich neun Cysteine, die alle paarweise intramolekulare Disulfidbrücken bilden, mit der Ausnahme einer intermolekularen Cysteinbrücke, die für die Dimerisation verantwortlich ist.
Hinsichtlich Aufbau und Struktur weisen die BMPs grosse Ähnlichkeiten zu den oben beschriebenen TGF-ss auf.

   Sie sind, wie TGF-ss, Dimere, unterscheiden sich aber strukturell durch die Anzahl der Aminosäuren des aktiven Segmentes (139 bei BMP6 und OP-1 oder 116 bei BMP-4) und sieben statt neun Cystein Bausteinen. CDMPs ("Cartilage derived Morphogenetic Proteins"), die humanen Homologe der Growth/differentiation factors ( DF) bei Mäusen, dar. Wie auch die anderen Mitglieder dieser Familie besitzen CDMPs sieben Cysteine, die über Disulfidbrücken intra- und intermolekulare Verbindungen bilden. Sie stehen in engem Verwandtschaftsverhältnis zu BMPs, teilen aber nicht das breite Spektrum an Zielgewebe mit ihnen. CDMPs sind in der Gruppe der BMPs die knorpelspezifischen Wachstumsfaktoren. CDMP-1 vermag ektopes Knorpelwachsturn durch Implantation in Muskelgewebe zu vermitteln.

   Der Einfluss von CDMPs auf die Knochenentwicklung ist zwar nachgewiesen, aber weniger stark ausgeprägt als bei BMPs. CDMP-1 und CDMP-2 werden während der embryonalen Entwicklung vermehrt von mesenchymalen Knorpelvorläuferzellen des Extremitätenskeletts, in den Knorpelanlagen 'der langen Röhrenknochen und von jenen Zellen, die in weiterer Folge den Gelenksspalt bilden, exprimiert. In axialen Skelettanteilen, wie Wirbelsäule oder Rippen, konnten CDMPs nicht nachgewiesen werden. Die physiologische Funktion der CDMPs/GDFs wurde anhand von Skelettfehlbildungen erforscht. Bei Mäusen führt eine Null-Mutation von GDF-5 zu verringerter Extremitätenlänge (Brachipodismus) . Mutationen des CDMP-1 Genes wurden bei Patienten mit Chondrodysplasie vom Typ Hunter-Thompson bzw. Grebe beschrieben.

   Diese Krankheit ist durch verkürzte Extremitäten, veränderte Zahl und Form von Extremitätenknochen, aber keiner Mitbeteiligung der axialen Skelettanteile, gekennzeichnet. Besonders betroffen sind die distalen Extremitätenanteile, und auch das Fehlen von peripheren Phalangealgelenken ist eine häufige Manifestation der Krankheit. Diese genetischen Studien beweisen, dass CDMP-1 eine bedeutende Funktion bei der Anlage und Entwicklung der Extremitätenstrukturen einnimmt.
Die primäre Rolle von CDMP-2 ist nicht bekannt. Neben der Beteiligung an der Skelettentwicklung wurde CDMP-2 in grossen mögliche Stabilisierung des Knorpelphänotyps schliessen.
Über die Funktion von CDMPs ausserhalb des Skelettsystems existieren nur wenige Berichte.

   Eine Arbeit beschreibt trophische und protektive Wirkung auf dopaminerge Neurone des Mesencephalons, eine Wirkung, die auch bei anderen Mitgliedern der TGF-ss-Familie nachgewiesen ist.
Der molekulare Mechanismus für Knorpelgewebe- und Knochenbildung wurde teilweise entschlüsselt. Sowohl die BMP als auch die TGF-ss-Moleküle verbinden sich mit Rezeptoren (die BMP/TGF-ss-Rezeptoren) der Zelloberfläche, welche eine Kaskade von Signalen zu dem Zellkern initiieren, welcher Zellvermehrung, Differenzierung in Knorpelgewebe und/oder Differenzierung zu Knochen fördert.
Die Erfahrungen zur Rolle der BMPs bei Knorpelbildung in vivo liessen somit auf einen Einsatz zur Bildung von Knorpelzellen in vi tro hoffen. Dennoch scheiterten bislang alle Versuche, unter Zuhilfenahme von BMPs Knorpelzellen aus anderen Gewebszellen in ausreichendem Masse und auf Dauer zu kultivieren.

   Insbesondere sind keine adulten Zelltypen bekannt, aus denen Knorpelzellen leicht hervorzubringen sind.
Erfindungsgemäss wird dieses Problem mithilfe von Ligamentfibroblasten gelöst. Hierzu werden Ligamentfibroblasten zunächst gemäss gängiger Techniken, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind, isoliert. Eine Beschreibung der Isolierung von Ligamentfibroblasten ist etwa in (13) gegeben. Dazu wurden drei Zentimeter lange Stücke intraartikulärer Ligamente der Metacarpophalangealgelenke von Kälbern unter sterilen Bedingungen gewonnen, unter Aussparung der Ligament-Knochen-Verbindungen. Selbstverständlich ist auch der Einsatz von humanen Ligamentfibroblasten denkbar. Die Bänder wurden in sterilem Medium, eine 1:1 Mixtur von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 25mM Hepes + 4500 mg/1 Glucose + Pyridoxine, ohne Sodium-Pyruvate; z.B.

   Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) und Ham's F12 (Ham's F-12 + L-Glutamine; z.B. Life Technologies), welches 10% (v/v) FBS (Fetal Bovine Serum; z.B. PAA Laboratories, Linz, Austria) und Antibiotika/Antimykotika (100 U/ml Penicillin G, 10O mg/ml Streptomycin, und 0.25[mu]g/ml Amphotericin B; z.B. Life Technologies) beinhaltet, inkubiert. Die Ligamente wurden in kleinste Stücke geschnitten (2-3 mm<2>) und als Explant-Kulturen in Kulturflaschen (z.B. T175, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) bis zur Subconfluenz gezüchtet. Danach wurden die Fibroblasten unter Verwendung von 6ml/Flasche Trypsine-EDTA Lösung (z.B. Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) vom Flaschenboden abgelöst.

   Ein Aliquot von lO[mu]l der Zellsuspension wurde zur Viabilitätsprüfung und Zellzahlerhebung mit lO[mu]l Trypanblau gefärbt und lichtmikroskopisch evaluiert.
Die Fibroblasten wurden in 24 multiwell-plates (z.B. Costar, Cambridge, MA, U.S.A.) als Monolayer-Kulturen in Quadrupliketts bei einer Dichte von 1 x 10<5>Zellen/well im oben beschriebenen Nährmedium gezüchtet. Bei 90%iger Konfluenz der Ligamentfibroblastenkulturen wurde das bestehende Medium auf ein chemisch definiertes serumfreies basales Medium (BM) umgestellt (14) . Über einen Zeitraum von 5 Tagen wurden Wachstumsfaktoren der BMP-Familie (GDF-5, GDF-6, BMP6, OP-1; R&D Systems Inc. Minneapolis, U.S.A.) bei einer optimalen Konzentration von 100 ng/ml zugesetzt. Nährmedium und Wachstumsfaktoren wurden jeden 2. Tag erneuert.
Alternativ wurden Mikromasse-Kulturen angelegt (15) .

   Hierzu wurde eine Zellsuspension mit 2 x 10<7>Zellen/ml bereitet und davon 20-[mu]l Tröpfchen in individuelle "weils" einer 24 Stunden ohne Medium belassen, um am Boden der Kulturplatte anzuhaften. Danach wurde 1 ml serumfreies BM hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt und BMPWachstumsfaktoren (100 ng/ml) wurden hinzugefügt. Die Kulturen wurden über 10 Tage inkubiert. Nährmedium und Wachstumsfaktoren wurden jeden 2. Tag erneuert. Alle Zellkulturen wurden bei 37 [deg.]C, 5% C02und 95% relativer Feuchtigkeit kultiviert.

   Die Evaluierung der chondrogenen Differenzierung erfolgte mittels Standardtechniken und Standardprotokollen, wie sie dem Fachmann hinlänglich bekannt sind.
In Fig. 2 sind Versuchsresultate des Anmelders dargestellt, die die fehlende Ansprechbarkeit von Hautfibroblasten auf CDMP-1, -2, OP-1 und BMP-6 zeigen, wobei die Bestimmung mittels der [<35>S] Sulfat-Inkorporationsmethode erfolgte (BM= basales Medium, also unstimulierte Kontrolle; Konzentration der Wachstumsfaktoren lOOng/ml; Inkubationszeit 5 Tage; Werte dargestellt als counts per minute/[mu]g Protein; Balken repräsentieren Mittelwert und Standardabweichung) .

   Die fehlende Synthese sulfatierter Proteoglykane, ein wesentliches Merkmal von Knorpelgewebe, zeigt die mangelnde Differenzierbarkeit dieser Fibroblastenart .
Hingegen konnte bei Zusatz von CDMP-1, -2, OP-1 und BMP-6 zu Ligamentfibroblasten eine Stimulierung der Synthese von Matrix-Makromolekülen nachgewiesen werden, wie Fig. 3 zeigt. Die Bestimmung erfolgte wiederum mittels [<35>S] SulfatInkorporationsmethode (BM= basales Medium, also unstimulierte Kontrolle; Konzentration der Wachstumsfaktoren lOOng/ml; Inkubationszeit 5 Tage; Werte dargestellt als counts per minute/[mu]g Protein; Balken repräsentieren Mittelwert und Standardabweichung bei p<0.01 vs BM) .

   Die Präsenz von biochemische Charakteristik von Knorpelgewebe und reflektiert die Differenzierung von Ligamentfibroblasten in Richtung Chondrozyten .
Fig. 4 zeigt des weiteren Versuchsresultate des Anmelders zur Auf-Regulierung der Knorpelmarker Aggrecan und Typ II-Kollagen in Ligamentfibroblasten in Monolayer-Kulturen nach Stimulation mit CDMP-1, -2, OP-1 und BMP-6, wobei die Bestimmung unter Verwendung der RT-PCR Methodik erfolgte (Konzentration der Wachstumsfaktoren lOOng/ml; die Säulendiagramme zeigen die Ergebnisse nach Normalisierung auf Actin) .

   Die Auf-Regulierung des Knorpelmarkers Aggrecan, sowie die gleichzeitige Expression von Typ II-Kollagen dient als zuverlässiger Marker eines reifen chondrogenen Phänotyps.
In Fig. 5 sind histologische Schnitte von Ligamentfibroblasten in Mikromasse-Kulturen nach 10-tägiger Stimulation mit BMPs gezeigt (hier BMP-6 bei 100 ng/ml; Kontrolle: unstimulierte Kultur; Gewebefärbung mit Toluidinblau) .

   Die knorpelspezifische Metachromasie der stimulieren Kultur im Vergleich zur unstimulierten ist wiederum ein deutlicher Hinweis für die chondrogene Differenzierung der Ligamentfibroblasten .
Selbstverständlich ist es denkbar, im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens zusätzlich zu BMP-Wachstumsfaktoren andere Agenzien zuzusetzen, einschliesslich Wachstumsfaktoren wie dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) , Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) , transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-[alpha] und TGF-ss) und insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) .
Es ist auch denkbar BMP-Wachstumsfaktoren durch andere Wachstumsfaktoren zu ersetzen, wie beispielsweise jene der IGF-Familie (Insuline Like Growth Factor) oder der FGF-Familie Wachstumsfaktoren dieser Familien haben gezeigt, dass ähnliche Ergebnisse wie beim Einsatz der BMP Familie zu erwarten sind,

   so dass der Schwerpunkt der Erfindung in der Auswahl des Basismaterials, nämlich der Ligamentfibroplasten, zu sehen ist, die in Kombination mit Wachstumsfaktoren jeder Art, zur Bildung von knorpelbildenden Zellen oder Knorpelzellen führt.
Die Kultivierung knorpelbildender Zellen bzw. Knorpelzellen könnte auch in einer geeigneten, dreidimensionalen Biomatrix wie etwa Schwämme, Schäume oder andere Stützgewebe, erfolgen, um eine Oberfläche für das Wachstum eines Knorpelersatzes zur Verfügung zu stellen. Solche Matrizen können aus Materialien gebildet werden, die derzeit für andere medizinische Implantat-Anwendungen verwendet werden. Die Wahl des Biomatrix-Materials basiert auf der biologischen Verträglichkeit, der biologischen Abbaubarkeit, den mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Erscheinungsbild und den Grenzflächen-Eigenschaften.

   Eine geeignete Formulierung wird durch die spezifische Anwendung des erfindungsgemässen Knorpelersatzes festgelegt. Potentielle Biomatrizen lassen sich biologisch abbauen und sind chemisch definiert, wie Hydroxyapatit, Polymilchsäure und Polyanhydride. Andere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizen bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrix-Bestandteilen.
Im Zuge der Kultivierung knorpelbildender Zellen bzw. Knorpelzellen kann vorteilhafterweise auch der Stoffwechsel der Knorpelzellen in vi tro untersucht werden, bevor die Knorpelzellen in vivo eingesetzt werden. Die Überprüfung kann zum Beispiel die Messung von Stoffwechselleistungen ebenso wie eine morphologische oder Funktionsüberprüfung sein.

   Während der Phase des Kultivierens der Zellen kann bereits die diese Art und Weise kann ein transplantierbarer Knorpelersatz, etwa ein Gelenkknorpelersatz, gewonnen werden.
Der Knorpelersatz kommt im Anwendungsfall in Kulturgefässen in den Operationssaal und kann dann durch den Mediziner durch mechanische Bearbeitung, zum Beispiel mit einem Messer, in Grösse, Dicke und Form dem Defekt angepasst werden. Anschliessend wird der Knorpelersatz, zum Beispiel mittels Gewebekleber, insbesondere Fibrinkleber, in dem Defekt fixiert. Nach wenigen Minuten ist der Knorpelersatz im Defekt fest verankert. Die Operation kann auch arthroskopisch durchgeführt werden, da der Knorpelersatz flexibel ist.

   Auf diese Weise kann zum Beispiel in vi tro gezüchteter Knorpelersatz in osteoarthrotische Gelenke injiziert worden, um die beschädigten Bereiche wieder aufzufüllen und die mit Knorpeldegeneration verbundenen Defekte in dem betroffenen Gelenk mithilfe der von Ligamentfibroblasten abgeleiteten Matrix zu reparieren. 
: Archer et al., i. Anat. 189 (1) : 23-35, 1996 : Morrison et al., J. Anat. 189(1): 9-22, 1996 : Mow et al., Biomaterials 13(2): 67-97, 1992 : Urist Science 150: 893-B99, 1965 : Wozney, et al., Science 242: 1528-34, 1988 : Wang et al., Proc. Nat . Acad. Sei. 87: 2220-2224, 1990 : Luyten et al., J. Biol._Chem. 264: 13377-80, 1989 : Celeste et al., Proc. Nat. Acad. Sci._87: 9843-50, 1990 : Denker, et al., Differentiation 59(1): 25-34, 1995 : Denker et al . , 41st Ann. Orthop. Res. Society_465: 1995 1: Flechtenmacher J.

   Arthritis Rheum. 39(11): 1896-904, 1996 : Sailor et al., i. Orthop. Res. 14: 937-945, 1996 : Nagineni, J Orthop Res 1992 : Erlacher, J Bone Miner Res 1998 : Chen et al., Biochem Biophys Res Commun 1993

Claims (8)

1. Verfahren zur Generierung von knorpelbildenden Zellen und Knorpelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Ligamentfibroblasten in einem Nährmedium unter Anwesenheit von Wachstumsfaktoren, die aus der Gruppe bestehend aus der BMP-Familie, der IGF-Familie (Insuline Like Growth Factor) und der FGF-Familie (Fibroblast Like Growth Factor) ausgewählt sind, kultiviert werden.

1. Verfahren zur Generierung von knorpelbildenden Zellen und Knorpelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass

Ligamentfibroblasten in einem Nährmedium unter Anwesenheit von Wachstumsfaktoren kultiviert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren aus der BMP-Familie ausgewählt sind und es sich insbesondere um CDMP-1, CDMP-2, BMP-6 und 0P1 handelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren aus der BMP-Familie ausgewählt sind und es sich insbesondere um CDMP-1, CDMP-2, BMP-6 und OP-1 handelt .

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren in einer Endkonzentration von lOOng/ml zugesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren aus der IGF-Familie (Insuline Like Growth Factor) ausgewählt sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Ligamentfibroblasten als Monolayer-Kulturen vorliegen und das Zusetzen der Wachstumsfaktoren über einen Zeitraum von 4 bis 6 Tagen, vorzugsweise 5 Tagen, erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren aus der FGF-Familie (Fibroblast Like Growth Factor) ausgewählt sind. -

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ligamentfibroblasten als Mikromasse-Kulturen vorliegen und das Zusetzen der Wachstumsfaktoren über einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen, vorzugsweise 10 Tagen, erfolgt.

NACHGEREIC! !T

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren bei einer Konzentration von lOOng/ml zugesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Nährmedium und Wachstumsfaktoren mindestens jeden zweiten Tag erneuert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ligamentfibroblasten als Monolayer-Kulturen vorliegen und das Zusetzen der Wachstumsfaktoren über einen Zeitraum von 4 bis 6 Tagen, vorzugsweise 5 Tagen, erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ligamentfibroblasten als Mikromasse-Kulturen vorliegen und das Zusetzen der Wachstumsfaktoren über einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen, vorzugsweise 10 Tagen, erfolgt. gekennzeichnet, dass Nährmedium und Wachstumsfaktoren mindestens jeden zweiten Tag erneuert werden.

Knorpelersatz, der gemäss des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt wurde.

08. April 2004

P <EMI ID=19.1>

620/2004 E/F/39196

Dr. Bobacz Klaus neue Patentansprüche

P A T E N T A N S P R Ü C H E

7. Knorpelersatz, der gemäss des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hergestellt wurde.

Wien, am fj

8. A ril 2005 <EMI ID=21.1>

NACHGEREICHT