AT501628A1

AT501628A1 - Promotor zur expression von fremdgenen in neuronalen zellen

Info

Publication number: AT501628A1
Application number: AT0063705A
Authority: AT
Inventors: Manfred Dr Windisch; Ulrike Dr Bauer
Original assignee: Jsw Res Forschungslabor Gmbh
Priority date: 2005-04-14
Filing date: 2005-04-14
Publication date: 2006-10-15
Also published as: WO2006108201A1; AT501628B1; AU2006235186A1; CA2604241A1; EP1869178A1

Description

η

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Die Erfindung betrifft einen Promotor zur Expression von Fremdgenen in neuronalen Zellen.

Ein Promotor stellt eine für die Genexpression wichtige regulatorische Startsequenz innerhalb des Genoms eines jeden Organismus dar; er bestimmt ob, wie und in welchem Ausmaß die Transkription eines Gens in Boten-RNA (mRNA) stattfindet. Es gibt «starke“ und „schwache“ Promotoren (d.h. solche, die die Bildung von zahlreichen oder weniger zahlreichen mRNA-Transkripten des Gens bewirken), sowie konstitutive (ständig aktive), induzierbare (d.h. solche, die Transkription in Abhängigkeit von bestimmten Bedingungen steuern) und gewebespezifische Promotoren.

Der neuronenspezifische Thy1-Promotor der Maus wurde bereits mehrfach eingesetzt um transgene Mäuse zu erzeugen, die Fremdgene in ihrem Zentralnervensystem exprimieren. Solche Mausstämme stellen wichtige Instrumente insbesondere zur Erforschung der molekularen Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen sowie zur Entwicklung diesbezüglicher potentieller Therapien dar.

Bei dem mThyl-Promotor handelt es sich um einen atypischen Promotor ohne TATA-Box. Er setzt sich aus zwei identischen Promotor-Nonameren zusammen, denen jeweils ein kurzes nicht translatiertes Exon folgt (Exon 1a und 1b). An Exon 1b schließt sich das Intron A an, welches von dem ersten translatierten Exon (Exon 2) gefolgt wird. Darauf folgen die Exons 3 und 4, jeweils durch ein weiteres Intron voneinander getrennt (Introns B und C). Diese Sequenz (erstes Promotor-Nonamer bis inklusive Exon 4) wird von nicht-translatierten Regionen flankiert (5’- und 3’-UTR), wobei die 3-UTR das Poly-A-Signal beinhaltet. Es wird angenommen, dass die 5’-UTR, die Exons 1a und 1b sowie das Intron A regulatorische Eigenschaften besitzen, die auch für die neuronenspezifische Expression des Promotors verantwortlich sein können (E. Spanopoulou et al., Mol. Cell. Biol. 1988; 8: 3847-3856 and 1991; 11(4): 2216-2228).

Der ursprüngliche mThyl-Promotor zeigte zusätzlich zur neuronalen Expression auch eine Expression im Thymus. Durch die Deletion des Bereiches von Exon 2 bis Exon 4 konnte die Thymusexpression ausgeschaltet werden (H.A. Ingraham and G.A. Evans, Mol. Cell. Biol. 1986; 6(8): 2923-2931; M. Vidal et al., EMBO 1990; 9(3): 833-840).

Der mThyl-Promotor mit Deletion von Exon 2-4 wurde und wird zur Steuerung der Transgen-Expression bei der Generierung transgener Tiere verwendet, um das entsprechende Transgen spezifisch in den Neuronen zu exprimieren. So weisen beispielsweise transgene Mäuse, die ein bei einer seltenen erblichen Form der Parkinson’schen Krankheit gefundenes mutiertes alpha-Synuklein-Protein unter mThyl-Promotor-Kontrolle exprimieren, ähnliche Symptomatik auf wie die entsprechenden Patienten (H. van der Putten et al., J Neurosci. 2000; 20(16): 6021-9; B. Sommer et al., Exp Gemntol. 2000; 35(9-10): 1389-403). Ähnliche murine Tiermodelle existieren für bestimmte menschliche Tauopathien, bei denen mutierte Formen des mit den Mikrotubuli assoziierten Proteins Tau gefunden werden (J. Gotz et al., J Biol Chem. 2001; 276(1): 529-34). Sehr verbreitet eingesetzt werden Tiermodelle der Alzheimer’schen Krankheit, in denen Amyloid Precursor Protein (APP, das Vorläuferprotein des Beta-Amyloids, welches in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten die sogenannten Plaques bildet) unter Thy1-Kontrolle exprimiert bzw. überexprimiert werden. Dabei kann sowohl normales Amyloid (E. Masliah und E. Rockenstein, J Neural Transm Suppl. 2000; 59: 175-83) als auch mutiertes Amyloid aus bekannten erblichen Formen der Alzheimer-Demenz (J. Davis et al., J Biol Chem. 2004; 279(19): 20296-306) gebildet werden. • 9 • · 2

Jedoch hat der Thy1-Promotor entscheidende Nachteile. Die erhebliche Größe des Thy1-Promotors macht ihn für gentechnische Arbeiten, insbesondere für den Einbau größerer Genkonstrukte, schwer handhabbar.

Angesichts der Tatsache, dass die für die Generierung transgener Tiere ebenfalls verwendbaren viralen Vektoren nur begrenzte Mengen an Fremd-DNA aufnehmen können, schränkt die Promotorgröße die Größe des zu übertragenden Gens erheblich ein. Ferner ist der Thy1-Promotor oft nicht stark genug, um in den transgenen Tieren eine Expression des Fremdgens im wünschenswerten Ausmaß zu bewirken.

Es stellte sich daher die erfindungsgemäße Aufgabe, die bekannte mThyl-Promotorstruktur so zu modifizieren, dass a) die Promotorgröße derart verkleinert wird, dass seine Verwendung für gentechnische Arbeiten erleichtert und die Übertragung größerer Fremdgene bzw. Genfragmente mit stabilen Vektoren ermöglicht wird, b) die Expression dieser Fremd-DNA in den so erzeugten transgenen Mäusen signifikant erhöht wird und c) die Expression des von dem Promotor zu kontrollierenden Transgens neuronenspezifisch erfolgt.

Es stellte sich nunmehr heraus, dass die oben beschriebene Aufgabe durch die Konstruktion eines gentechnisch veränderten Promotors gelöst werden kann, der nur bestimmte (ursprüngliche oder geringfügig veränderte) Teilsequenzen des mThyt-Promotors in Kombination mit anderen regulatorischen Elementen enthält.

Die Erfindung selbst ist durch die anspruchsgemäßen Merkmale gekennzeichnet.

Ausgehend von der mThyl-Expressionskassette (Moechars et al. 1996, EMBO J. 15(6), 1265-74), welche eine ursprüngliche Größe von ca. 8.2 kb hat und die anstelle der mThyl Exons 2 bis 4 einen Xho I - Linker enthält, wurden mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen größere Deletionen gesetzt und anschließend kleinere Insertionen vorgenommen, sodass am Ende eine nur 1.6 kb große Promotorkassette entstand.

Im ersten Schritt wurde die mThyl-Expressionskassette mit Sma I gespalten und damit der am 5’-Ende an die mThyl 5-UTR angrenzende Bereich entfernt. Das entstandene Konstrukt, in welches 3’-terminal vom mThyl Intron A das eGFP Reportergen (kodiert für ein Green Fluorescent Protein, das für die Maus harmlos ist und als fluoreszenzmikroskopischer Marker dient) integriert wurde, wurde mittels Transfektion in zwei neuronale Zelllinien (SH-SY5Y und Neuro-2A) auf Promotoraktivität (eGFP-Expression) hin untersucht.

In einem zweiten Schritt wurde die Sequenz mit den Restriktionsenzymen Nco I und Nde I verdaut, wodurch Teile des mThyl Introns A, das Kontrollgen eGFP, die mThyl 3'-UTR samt dem mThyl Poly A - Signal und den 3’-flankierenden mThyl-Sequenzbereichen entfernt wurden. Anstelle dessen wurde eine Sequenz bestehend aus der eGFP-Sequenz und dem „late SV40 Poly A Signal“ mit der verkleinerten mThyl Promotorsequenz ligiert. Die vorgenannten Schritte sind in Abb.1, dem Korrelanzdiagramm „mThyl-Gensequenz (A) / mThyl Promotorkassette (B) / mTUB Promotorkassette (C)“ dargestellt. Oberhalb der jeweiligen Abbildung ist der mThyl-Anteil beschriftet, unterhalb der Nicht-mThyl-Anteil.

Die so entstandene Sequenz exklusive der eGFP-Gensequenz wurde als mTUB-Promotor bezeichnet (mouse Thy1 Usable for Brain expression; Sequenz siehe Abb.3). Auch hier wurde die Funktionalität mittels Transfektion in SH-SY5Y und Neuro-2A-Zellen und Kontrolle der eGFP-Expression im Vergleich zu eGFP-Konstrukten unter der Kontrolle des ···· ··· ·· • ·· · · ·· ···· • · 9 · · · · · 3 unveränderten mThyl-Promotors bzw. der Promotoren für humanen Platelet-Derived Growth Factor (hPDGF) und Cytomegalovirus (CMV), wie später dargestellt, bestätigt.

Promotoreigenschaften können in-vitro und in-vivo unterschiedlich sein. So bewirkt z.B. der an sich neuronenspezifische mThyl-Promotor nach Transfektion der Hamster-Ovarienzellinie CHO-K1 mit einem mThyl/eGFP-Konstrukt eine starke Expression des eGFP-Reportergens (unpublizierte eigene Daten). Um einerseits den erfindungsgemäßen Promotor mTUB umfassend charakterisieren zu können und andererseits den zweiten Teil der erfindungsgemäßen Aufgabe zu lösen (Neuronenspezifität), wurde ein transgener Mausstamm (mTUB-eGFP-tg) generiert, welcher eGFP unter der Kontrolle des mTUB-Promotors exprimiert. Anhang 3 zeigt Fluoreszenzmikrographien von Hirnschnitten dieses Mausstammes. In den Neuronen des transgenen Mausstammes konnte eine eindeutige eGFP-Expression nachgewiesen werden. Schnitte durch verschiedenste Organe des transgenen Mausstammes zeigten außer eGFP-positiven Nervenzellen keine eGFP-positiven Körperzellen. Es kann eindeutig gezeigt werden, dass der mTUB-Promotor das Gen, welches unter seiner Kontrolle steht, neuronenspezifisch exprimiert.

Der mTUB-eGFP-transgene Mausstamm wurde wie folgt generiert, wobei zur Mikroinjektion das Promotor-Gen-Konstrukt in eine Insulatorkassette (Huhn-ß-globin Insulator-Sequenzen) eingebaut wurde, welche die Expression erleichtern und vor Fremdreguiation schützen soll (Plasmid pC2xlNS, JSW-Research). 1. Herstellen und Vorbereiten des Vektors zur Mikroinjektion: • Ausgangsplasmid = pmTUB-eGFP (JSW-Research) • Verdau mit Not /, Pvu I und Nde I zur Gewinnung des Promotor-Insert-Konstruktes • mTUB-eGFP-Konstrukt hat Not /- bzw. Nde /-Enden; Nde I-Ende wird mit Polymerase I Klenow-Fragment aufgefüllt

• Einbau des mTUB-eGFP-Konstruktes in den mit Not I und Pml I geöffneten Insulatorvektor pC2xlNS • Sequenzierung der Klonierungsübergänge

• Entfernung der Vektorsequenzen (pKO Backbone) und Linearisierung des Insulator-mTUB-eGFP-lnsulator-Konstruktes mit Mlu I (siehe Abb. 2: Konstrukt vor Linearisierung) • Gelelution des linearen Konstruktes „Insulator-mTUB-eGFP-lnsulator“ (7280 bp) 2. Mikroinjektion des linearen Konstruktes Für die Mikroinjektion wurde das lineare Insulator-mTUB-eGFP-lnsulator-Konstrukt aus einem 0.8% TAE-Agarosegel ohne Ethidiumbromid isoliert, gereinigt und soweit mit Mikroinjektionspuffier verdünnt, dass pro Injektionsvolumen 1000 DNA-Moleküte vorhanden waren. Die Injektion erfolgte laut Standardprotokoll (Brem et al., 1985). Dazu wurden im Vorfeld 3 Wochen alte hormonbehandelte weibliche CB6F1 Mäuse mit C57BL/6 Männchen verpaart. Die resultierenden befruchteten CB6F1(B6) Oozyten wurden entnommen und kultiviert, bis zwei klare Pronuklei sichtbar waren. Das gereinigte DIMA-Konstrukt wurde dann in den Pronukleus injiziert gefolgt von einer Obemacht-Kultivierung bis zum Zweizellstadium. Die Zweizell-Embryonen wurden dann in pseudopregnante Fostermäuse implantiert. Nach 18-19 Tagen wurden die Jungen geboren.

Das Kontrollgen eGFP wurde verwendet, um Promotoreigenschaften und Transgen-Expression möglichst schnell und einfach charakterisieren zu können. Das eGFP-Gen kann durch jedes andere neuronenspezifisch zu exprimierende Gen ersetzt werden (siehe Abb.3, Sequenz der mTUB Promotorkassette).

Dabei sind die funktionellen Bereiche folgenden Nukleotidbereichen in der Sequenz zugewiesen: 1-222 223 - 291 292 - 345 537 - 545 592 - 733 346-1378 1379-1392 1393-2112 2113-2130 2131 -2350

3-TeildermThyl 5’-UTR 1. nonamerer mThyl-Promotor und flankierende Regionen mThyl Exon 1a 2. nonamerer mThyl-Promotor mThyl Exon 1b

5’-Teil vom mThyl-Intron A Polylinker I

Kontrollgen eGFP (nicht Teil des Patentes)

Polylinker II SV40 late Poly A Signal

Nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich des erfindungsgemäßen mTUB-Promotors mit dem unveränderten murinen Thy1-Promotor, sowie den Promotoren des menschlichen Platelet-derived Growth Factor (hPDGF) und des Cytomegalovirus (CMV). Es wurden sowohl SH-SY5Y- als auch Neuro-2A-Zellen mit dem eGFP-Reportergen unter Kontrolle des jeweiligen Promotors transfiziert und die Transfektionseffizienz (TE in %) sowie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI in willkürlichen Einheiten), beides gemessen mittels FacScan, verglichen (Transfektionseffizienz in Prozent = (fluoreszierende Zellen/nicht fluoreszierende Zellen) x 100). mTUB-eGFP (TE/MFI) mThyl-eGFP (TE / MFI) hPDGF-eGFP (TE / MFI) CMV-eGFP (TE / MFI) SH-SY5Y 5%/13 Nicht messbar / Nicht messbar 0,2%/16 10%/110 Neuro-2A 79% / 293 9%/25 52%/46 86% / 201

Somit ist der mTUB-Promotor in beiden neuronalen Zelllinien dem mThyl-Promotor sowohl hinsichtlich der Transfektionseffizienz als auch der Expressionsintensität weit überlegen. In SH-SY5Y-Zellen erzielt mTUB eine 25-fach höhere Transfektionseffizienz als der hPDGF-Promotor bei etwa gleicher durchschnittlicher Signalintensität, in Neuro-2A-Zellen eine 1.5-fach höhere Transfektionseffizienz als der hPDGF-Promotor bei etwa 6-facher durchschnittlicher Signalintensität. Die Transfektionseffizienz ist mit der des CMV-Promotors vergleichbar, bei deutlich höherer durchschnittlicher Signalintensität (in Neuro-2A).

In Abb.4 sind fluoreszenzmikroskopische Bilder von Gehimschnitten des transgenen Mausstammes mTUB-eGFP-tg im Vergleich zum entsprechenden nicht transgenen Stamm C57BI6 ntg gezeigt. In den Hirnschnitten erkennt man ganz deutlich die eGFP-exprimierenden Neuronen der transgenen Maus im Vergleich zu dem eGFP-negativen Hirnschnitt der nicht-transgenen Maus.

Claims

···· ··· ·· • · t « · ·· · ··· • •·· ···· ♦ ·»······· · 1 PATENTANSPRÜCHE 1. Promotor umfassend eine vom Thy-1 Säugetieren abgeleitete Nukleinsäuresequenz, welche die neuronenspezifische Transkription einer heterologen, 3’-abwärts zum Promotor befindlichen Nukleinsäuresequenz sowohl in Säuger- als auch in Nicht-Säugerzellen bewirkt.
2. Nukleinsäuresequenz bestehend aus den Abschnitten (a) der rnlhyl 5’-„untranslated region“ (UTR), der 5’-UTR vorgelagerten 20bp umfassenden Sequenz und der Sequenz des ersten nonameren Promotors bestehend aus 9 Nukleotiden und flankierenden Regionen des Maus-Thy-1 -Gens (b) der Sequenz des Exons la des Maus-Thy-1-Gens. (c) der Sequenz des zweiten nonameren Promotors bestehend aus 9 Nukleotiden des Maus-Thy-1-Gens (d) der Sequenz des Exons lb des Maus-Thy-1-Gens (e) der kompletten oder teilweisen Sequenz des Introns A des Maus-Thy-1- Gens (f) der Sequenz eines Poly A Signals (g) der Säuger-Thy-1-Gen-Promotorsequenz, welche mit der unter (a), (b), (c), (d), (e) und (f) beschriebenen Sequenz hybridisiert, wobei die Promotorsequenz, wenn sie kombiniert wird mit einer heterologen Gensequenz, diese neuronenspezifisch sowohl in Säuger- als auch in Nicht-Säugerzellen transkribiert.
3. Nukleinsäure-Konstrukt, umfassend eine Expressionskassette, welche die gemäß Anspruch 2 gekennzeichneten Abschnitte (a), (b), (c), (d), (e), (f) und (g) sowie eine hetero-loge Nukleinsäure-Sequenz, welche zwischen den Abschnitten (e) und (f) positioniert und operativ mit diesen assoziiert ist, enthält.
4. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt (g) eine therapeutische Gensequenz ist.
5. Nukleinsäure-Konstrukt umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 als Bestandteil eines Plasmides.
6. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäure-Sequenz zwischen den Abschnitten (e) und (f) für ein Protein kodiert.
7. Nukleinsäure-Konstrukt umfassend einen Vektor und ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2.
8. Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass dar Vektor ein Virus ist oder von einem Virus stammt.
9. Isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend den Promotor nach Anspruch 1.
10. Isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2.
11. Isolierte Zelle oder Zelllinie umfassend ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8.
12. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend den Promotor nach Anspruch 1.
13. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2. • · • · • · • · • · • · • · · · 2
14. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis Anspruch 8.
15. Verfahren zur Genexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen, welches die Transformation/Transfektion der Zellen mit einem Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 beinhaltet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor für den Gentransport mit einer polymeren Trägersubstanz gemischt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als polymere Trägersubstanz um ein kationisches Polymer und/oder ein Lipid eingesetzt wird (werden).
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als polymere Trägersubstanz Polyethylenimin eingesetzt wird.
19. Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen,ijwelehe) für das Injizieren in das Zentralnervensystem oder in die Zerebrospinalflüssigkeit.
20. Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen zur Behandlung von neuronalen Funktionsstörungen, wie Schlaganfall, I-schämie, Epilepsie, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, Morbus Huntington, Hirn- und Rückenmarkstrauma, Amyotrophe Lateralsklerose.
21. Verwendung eines Vektors umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Herstellung von Injektionslösungen zur Behandlung von neurogenetischen Funktionsstörungen.
22. Kit zur Expression rekombinanter Genprodukte umfassend isolierte Zellen oder Zelllinien nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
23. Arzneimittel umfassend einen Promotor nach Anspruch 1.
24. Arzneimittel umfassend ein Protein, welches durch die Nukleinsäureseqenz gemäß Anspruch 2 codiert ist.
25. Arzneimittel umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 8. JSW-Research Forschungslabor GmbH vertreten durch: .BEER iNreto i. Kann Dungier Ä PATENTANWÄLTE DIP* ---------- durch:

DIPL.-ING. Dipl.-Ing. Dr. techn. (Ausweis-Nr.: 419)