AT502067A1 - Salmonella-serotypisierung - Google Patents
Salmonella-serotypisierung Download PDFInfo
- Publication number
- AT502067A1 AT502067A1 AT10762005A AT10762005A AT502067A1 AT 502067 A1 AT502067 A1 AT 502067A1 AT 10762005 A AT10762005 A AT 10762005A AT 10762005 A AT10762005 A AT 10762005A AT 502067 A1 AT502067 A1 AT 502067A1
- Authority
- AT
- Austria
- Prior art keywords
- gene
- molecules
- salmonella
- oligonucleotide
- hybridization
- Prior art date
Links
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title claims description 68
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 130
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 44
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 41
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 claims description 37
- 101150035600 atpD gene Proteins 0.000 claims description 34
- 101150038062 fliC gene Proteins 0.000 claims description 33
- 101150104647 fljB gene Proteins 0.000 claims description 30
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150099875 atpE gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101150048329 atpH gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101100281124 Aquifex aeolicus (strain VF5) flaA gene Proteins 0.000 claims description 15
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 72
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 11
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 10
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 9
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 8
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241001490312 Lithops pseudotruncatella Species 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 3
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- -1 tertiary amine salts Chemical class 0.000 description 2
- YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](CC)(CC)CC YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical class OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 240000000782 Anisomeles indica Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- 102100036250 GPI mannosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 101001074618 Homo sapiens GPI mannosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000533331 Salmonella bongori Species 0.000 description 1
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 1
- 241000863430 Shewanella Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 101150113120 garB gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
• ···· · · ·· · • · ·· · · ······ • · · · · ··· ····· ····· · ·· .....-·*1 -· ··· ·
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Bakterien-Identifikations-Verfahren, insbesondere gentechnische Verfahren zur Identifizierung charakteristischer Gen-Elemente, vorzugsweise unter Verwendung von Mikroarray-Techniken.
Salmonellae sind Bakterien, und die etiologischen Agentien verschiedener Erkrankungen, die kollektiv als Salmonellose bezeichnet werden. Humane Salmonellose kann in vier Syndrome unterteilt werden: enterisches Fieber (Typhus-artige Erkrankung), Gastroenteritis, Bakteriämie mit oder ohne Gastroenteritis, und das asymptomatische Träger-Stadium. Zur Eindämmung sowohl Typhus-artiger als auch nicht-Typhus-artiger Salmonellen ist die Überwachung humaner und tierischer Infektionen auf Labor-Basis ein wichtiger Schritt der Präventionsstrategie. Phänotypische Methoden spielen bei der Identifizierung auf Gattungs-Ebene eine wichtige Rolle. Die Serotypisierung wird zur primären Typisierung von Stämmen verwendet. Die Serotypisierung von Salmonella ist jedoch wegen der großen Anzahl erkannter Serotypen mühsam.
Die Gattung Salmonella wird in die Spezies S. enterica unterteilt, die die Subspezies I (S. e. enterica), II (S. e. sa-lamae), lila (S. e. arizonae), Illb (S. e. diarizonae), IV (S. e. houtenae) und VI (S. e. indica) und S. bongori (früher Subspezies V) inkludiert. Diese Spezies und Subspezies werden weiter in mehr als 2.500 Serotypen unterteilt.
Salmonella ist eine umfangreiche Gattung, und die Serotypisierung wird in großem Umfang verwendet um die Stämme gemäß ihrer Oberflächen-Antigen-Variabilität in Gruppen einzuteilen. Die Serotypisierung basiert auf der immunologischen Klassifizierung der Lipopolysaccharid-Anteile (O-Antigen), des flagellaren Proteins (H-Antigen) und des kapselförmigen Polysaccharids (Vi-An-tigen). Ein unikes Merkmal von Salmonella unter den Enterobacte-riaceae ist, dass dieser Stamm im Allgemeinen zwei unterschiedliche H-Antigene hat, die Flagellen-Antigene der Phase 1 und Phase 2, die so reguliert sind, dass immer jeweils nur ein Antigen exprimiert wird. Im Allgemeinen wird das Kauffmann-White-Schema für die Klassifizierung von Salmonella-Serotypen verwendet, mit welchem 46 O-Serogruppen und 114 H-Antigene erkannt werden, was zu 2.523 charakterisierten Serotypen führt. Es können in einem Flageilum mehrere antigene Faktoren Vorkommen, und daher können H-Antigene aus verschiedenen antigenen Faktoren zusammengesetzt sein (z.B. H:e,n,x bezeichnet ein Antigen, welches
NACHGEREICHT • ♦ • · • ···· ^#· ··· • · aus den Faktoren e, n und x zusammengesetzt ist). Immunologisch verwandte Flagellen-Antigene sind zu Komplexen gruppiert.
Die Serotypisierung stellt eine verlässliche und gut etablierte Methodik zur Charakterisierung von Salmonella-Stämmen dar, ist aber ziemlich zeitaufwändig und erfordert auch eine große Anzahl (167) spezifischer Antiseren. Weiters liefert die Serotypisierung eine begrenzte Information hinsichtlich der genetischen Verwandtschaft von Serovaren und reicht nicht aus für Krankheits-Assoziierungen (Beltran et al., PNAS 85: 7753-7757 (1988)). Daher werden alternativ hauptsächlich Methodiken auf DNA-Basis für die Identifizierung von Salmonella-Serotypen in mehreren Labors entwickelt (Eicheta et al., Res. Mic. 153: 107-113 (2002); Nair et al., J. Clin. Mic. 40(7): 2346-2351 (2002); Herrera-Leon et al., J. Clin. Mic. 42(6): 2581-2586 (2004)). Diese neuen Techniken zielen auf eine höhere Spezifität, bessere Reproduzierbarkeit sowie eine größere Empfindlichkeit ab und inkludieren vor allem eine Detektion of Multiplex-PCR-Basis und eine Einzelstrang-Konformations-Polymorphie-Analyse. Außerdem stellen diagnostische Mikroarrays, die einen hohen Durchsatz, eine parallele Detektion und Identifikation einer großen Anzahl von Mikroben ermöglichen, ein sich dynamisch entwickelndes neues technisches Gebiet dar. Sie wurden vor allem für Umwelt-Anwendungen entwickelt (z.B. Loy et al., App. En. Mic. 68(10):5064-5081 (2002); Bodrossy et al., Env. Mic. 5(7): 566-582 (2003); Stralis-Pavese et al., Env. Mic. 6(4): 347-363 (2004)), doch haben diagnostische Mikroarrays ein enormes Potential für eine effiziente hohe Durchsatz-Analyse von Pathogenen (Bodrossy and Sessitsch, Curr. Op. Mic. 7:245-254 (2004)). Für die Entwicklung verlässlicher Salmonella-Serotyp-spezifischer Sonden sind noch immer eine gründliche phylogenetische Analyse dieses Genus und die Identifizierung geeigneter Marker notwendig.
Das O-Antigen wird durch die konzertierte Aktivität einer wechselnden Anzahl von Enzymen, die vom rfb-Cluster codiert werden, bestimmt. So ist der Großteil der Salmonella-O-Antigen-Va-riation eine Folge der genetischen Diversität innerhalb dieses Gen-Clusters (Fitzgerald et al., App. Env. Mic. 69(10): 6099-6105 (2003)). Der hierin dargelegte Mikroarray-Ansatz ist für die Analyse einer Anwesenheit/Abwesenheit einer großen Anzahl von Genen nicht geeignet, und somit besteht ein Bedarf an einer alternativen Methode zur Beurteilung der O-Serogruppe von Sal-
I NACHGEREICHT • · · ♦ ·· - "3 - ·· ··· monella. Da die Diversität im O-Serogruppen-Status (O-Antigen) eher durch die Anwesenheit/Abwesenheit von Genen als durch Punktmutationen bestimmt wird, ist sie wahrscheinlich mit der phylogenetischen Position des analysierten Serovars verbunden.
Phylogenetische Beziehungen von Prokaryonten beruhen am häufigsten auf der Variabilität ihrer ribosomalen RNA-Gene. Für die Klassifizierung eng verwandter Spezies und Subspezies sind jedoch die rNA-Gene zu sehr konserviert, und es werden alternative Marker benötigt. Als Alternative wurde das gyrB-Gen, das für das Untereinheit B-Protein der DNA-Gyrase (Topoisomerase Typ II) codiert, für die Klassifizierung von Bakterien, einschließlich Mitgliedern der Enterobacteriaceae angewendet (Fukushima et al., J. Clin. Mic. 40(8): 2779-2785 (2002); Dauga, Int. J. Sys. Evo. Mic. 52: 531-547 (2002)). Mehrere Studien zeigten, dass die Rate der molekularen Evolution des gyrB-Gens höher ist als jene von ribosomalen RNA-Genen (Dauga et al., 2002, oben), und gyrB-Nu-kleotid-Sequenzen wurden verwendet, um verwandte Spezies oder Stämme von Acinetobacter, Pseudomonas und Shewanella zu differenzieren. Dauga (2002, oben) beschrieb die gyrB-Sequenz als nützlich zur Untersuchung intragenerischer Beziehungen der Ente-robacteriaceae, wogegen sich die 16S-rRNA-Gen-Sequenz als nützlich für die Beschreibung phylogenetischer Beziehungen zwischen entfernt verwandten Familienmitgliedern erwies. Es zeigte sich auch, dass das atpD-Gen, welches für die beta-Untereinheit bakterieller FlFO-Typ-ATP-Synthasen codiert, die phylogenetische Position von Bakterien widerspiegelt. Seine phylogenetische Auflösungsrelevanz scheint jener des garB-Gens ähnlich zu sein.
Zwei Gene codieren für die Flagellen-Antigene. Das fliC-Gen, welches für das Phasen-1-(HI)-Antigen codiert, befindet sich in einem der Flagellen-Biosynthese-Operone, ist in allen Salmonel-lae anwesend und hat ein Homolog in Escherichia coli. Das fljB-Gen, das für das Phasen-2-(H2)-Antigen codiert, befindet sich in einer Region des Genoms, die für Salmonella unik ist, und ist in vier der sechs Subspezies vorhanden. Im Allgemeinen ist der zentrale Teil der Flagellin-Gene ziemlich variabel, und bestimmt vermutlich das Epitop des H-Antigens, wogegen die 5'- und 3'-Enden typischerweise konserviert sind. McQuiston et al. (J. Clin. Mic. 42(5): 1923-1932 (2004)) schlugen die Verwendung von Fla-gellin-Genen als nützliche Ziele für die molekulare Bestimmung des Flagellen-Antigen-Typs vor. Außerdem wurde ein Multiplex-
NACHGEREICHT PCR-System auf Basis der fliC-Gen-Variabilität etabliert, um die häufigsten Phase-l-Flagellen-Antigene zu unterscheiden (Herrera Leon et al., J. Clin. Mic.: 42(6): 2581-2586 (2004)).
Die DNA-Mikroarrays sind ein leistungsfähiges Werkzeug für die parallele Hochdurchsatz-Detektion und Quantifizierung vieler Gene. Ursprünglich für Gesamt-Genom-Genexpressions-Analysen entwickelt, ist die Möglichkeit der Anwendung der DNA-Mikroarrays auf vielen Gebieten der Mikrobiologie sehr groß. Wenn entsprechende Sonden-Sätze zur Verfügung stehen, ermöglichen sie die Detektion von bis zu mehreren Tausend Mikrobenstämmen, Spezies oder Gruppen von Spezies (je nachdem, wie die Sonde entworfen ist) in einem einzigen Test. In der klinischen, veterinärmedizinischen und Pflanzen-Mikrobiologie, Nahrungsmittel- und Wasser-qualitäts-Kontrolle bedeutet dies, dass ein einziger Test entwickelt werden kann, um alle pathogenen/günstigen/verschmut-zenden Bakterien, die in der untersuchten Probe vorhanden sein könnten, zu detektieren. Das Potential für die Umwelt-Mikrobiologie ist sogar noch größer. Durch Anwenden von ineinander geschachtelten (nested) Sätzen von Oligonukleotid-Sonden, die auf Gene gerichtet sind, welche die Phylogenie des Träger-Organismus widerspiegeln, wird es möglich, die gesamte prokaryontisehe Di-versität einer Umgebung grob zu beurteilen. Das primäre Ziel für solche Studien ist das 16S-rRNA-Gen als primäre Determinante für eine Spezies, und für eine Stamm-spezifische Identifizierung, die Inter-Gen-Spacer(IGS)-Region zwischen den 16S-rRNA- und 23S-rRNA-Genen. Andere - häufig als „funktionell", d.h. für verwandte Enzyme, die eine bestimmte Funktion ausüben, codierend be-zeichnete - mögliche Target-Gene können auch verwendet werden, zumindest für eine physiologisch eingeschränkte Gruppe von Mikroorganismen. Die Anwendung funktioneller Gene engt die Analyse auf eine funktionell (manchmal auch phylogenetisch) definierte Gruppe von Mikroben ein. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass er auch die Detektion und Analyse von nicht-kultivierten Mitgliedern der untersuchten Mikroben-Gruppen ermöglicht.
Oligonukleotid-Sonden-Sätze, die auf Nylon- oder Nitrocellulose-Membranen aufgespottet sind („Makroarrays") wurden für die Diagnose von Bakteriämie, Nahrungsmittelverschmutzung, die Detektion von Enterococci oder Cyanobakterien verwendet.
Mikroben-Gemeinschaftsstrukturen („microbial community structures") können durch quantitative Analyse von Mikro- und
NACHGEREICHT ♦ · ···· · • · · · · · · ··· · · • · · · · ··· · ···· ····· · ·· ·· ··· ·· ··* ·
Makroarray-Ergebnissen beurteilt werden. Bei einer einfachen und eleganten Methode werden zur Quantifizierung spezifischer Mikro-ben-Gene aus einer Probe Gen-Fragmente (500-900 bp lang) als Sonden verwendet. Jeder Makroarray-Spot kann aus einer Mischung einer individuellen Sonde und einem üblichen Referenz-Gen-Frag-ment bestehen. Die Hybridisierung kann mit einer mit Cy3 markierten Umwelt-Mischung und einer mit Cy5 markierten ReferenzDNA durchgeführt werden. Beim Cy3/Cy5-Marker-System beruht die Quantifizierung auf den Cy3/Cy5-Verhältnissen. Wegen der inhärenten Unterschiede in den Hybridisierungs-Effizienzen zwischen Oligonukleotid-Sonden kann dasselbe Prinzip leider nicht auf die Quantifizierung von Oligonukleotid-Chip-Ergebnissen angewendet werden. In der Praxis sollte man für jede Sonde ein anderes Re-ferenz-Oligo entwerfen.
Die CN 1396270 beschreibt einen DNA-Mikroarray zur Detektion der in Wasser häufig angetroffenen pathogenen Bakterien, wie der Bakterien der Escherichia, Salmonella, Staphylococcus usw., bei welchem das 16S-rRNA-Gen, zwei in der Konservierungsregion des 16S-rRNA-Gens entworfene Primer und eine Sonde für die variable Region des 16S-rRNA-Gens verwendet werden.
Die DE 199 45 916 beschreibt mehrere Oligonukleotid-Sequen-zen für bakterielle 23S/5S-rRNA-Sonden, die bei Tests verwendet werden können, um zwischen Bakterien verschiedener Kategorien zu unterscheiden. Die serotypologische Bestimmung von Salmonella ist darin nicht geoffenbart.
Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein rasches und effizientes Verfahren zur in vitro- und/oder in vivo-Analyse von Salmonella-Serotypen (auch als Serovaren bezeichnet) vorzusehen. Ein effizientes Verfahren sollte auch eine Mehrzahl von Serotypen (insbesondere alle oder fast alle klinisch relevanten Stämme) in einem verlässlichen, leicht verwendbaren und standardisierten Test bestimmen können, vorzugsweise ohne vorherige Bakterien-Isolierung. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine auf DNA basierende phylogenetische Analyse von mehr als 200 Salmonella-Stämmen, die zu den am meisten vorherrschenden 44 Serovaren gehören, durchzuführen.
Daher sieht die vorliegende Erfindung einen Satz von Oligo-nukleotid-Molekülen für Salmonella-Serotypisierung vor, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das gyrB-Gen spezifisch ist, mindestens ein Olioonukleotid-Mole-
NACHGEREICHT kül für das atpD-Gen spezifisch ist, mindestens ein Oligonukleo-tid-Molekül für das JfliC-Gen spezifisch ist, und mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das fljB-Gen spezifisch ist. Überraschenderweise stellte man fest, dass es möglich ist, einen Satz von Oligonukleotid-Molekülen vorzusehen, die für die große Menge der Salmonella-Serotypen spezifisch sind, die jedoch alle auf einmal im selben Hybridisierungsschritt unter denselben Hybridisierungsbedingungen ohne vorherige Isolierung verschiedener Serotypen verwendet werden können (beispielsweise können 2-3-4 verschiedene Salmonella-Serotypen in der ursprünglichen Probe vorhanden sein). Die vorliegende Erfindung sieht mehrere Oligo-nukleotid-Moleküle oder Sonden zur Serotypisierung vor. In gewissen Fällen ist es möglich, einen Serotyp mit nur einem einzigen Oligonukleotid zu identifizieren. Um jedoch ein breiteres Spektrum von Salmonella-Serotypen zu identifizieren, werden Oligonukleotide von jedem der gyrB, atpD, fliC, fljB-Gene vorgesehen. Die Kombination dieser Gene ist für dieses Ziel perfekt geeignet, da bestimmte Serovaren signifikante Unterschiede in diesen Genen aufweisen. Demgemäß besteht ein Mindest-Satz aus 4 Oligos. Für eine bestimmte Anwendung kann ein Satz von Oligonukleotid-Molekülen (auch als Oligonukleotide bezeichnet) aus der Gruppe möglicher Oligonukleotid-Moleküle ausgewählt werden, die nachstehend in Tabelle 1 angegeben sind. Verschiedene Methodiken können jedoch verschiedene Kriterien erfordern, und somit kann die Veränderung der Sonden dazu führen, dass verschiedene Sonden unter solchen verschiedenen Bedingungen perfekt funktionieren. Bei einem Beispiel eines Serotypisierungs-Vorgangs wird der erfindungsgemäße Satz vorzugsweise auf ein durch PCR vorangereichertes Produkt dieser 4 Salmonella-Gene angewendet, d.h., die Gen-Sequenzen werden amplifiziert (z.B. unter Verwendung der unten in Tabelle 2 angeführten Primer), und die resultierenden PCR-Produkte werden für die Serotypisierung mit dem Satz der vorliegenden Erfindung verwendet. Eine andere Verwendung für den erfindungsgemäßen Satz ist die Verwendung als PCR-Primer. Im letzteren Fall würde die Serotypisierung auf dem Vorhandensein/ Nichtvorhandensein von (oder signifikant schwachen) PCR-Produk-ten basieren. Erfindungsgemäße Oligonukleotid-Moleküle sind vorzugsweise ausgewählt aus Ribose- oder Desoxyribose-Nukleotiden.
Der erfindungsgemäße Satz kann aus Oligonukleotiden ausge-
NACHGEREICHT ♦ · ··· · ♦ # #* ··· ·*ι ·· ··· · wählt werden, welche für die gegebenen Salmonella-Serovaren spezifisch sind, solange spezifische Nukleotide für jedes Salmonella-Gen ausgewählt aus gyrB, atpD, fliC und fljB inkludiert sind. Die Gen-Sequenzen dieser Gene oder die Unterschiede in diesen Genen sind im Stand der Technik bekannt. Verfahren für Oligonu-kleotid-Entwürfe sind nachstehend in den Beispielen (besonders Beispiel 7) angegeben und inkludieren Programme für die Berechnung günstiger Schmelzpunkte und Hybridisierungsmodelle. Die Synthese von Oligonukleotiden ist heute eine übliche Vorgangsweise, die dem Fachmann bekannt ist und auch automatisiert werden kann.
Der Ausdruck „Oligonukleotid-Moleküle" bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Anmeldung auf jegliche Art von Oligonukleo-tid-Molekülen, vorzugsweise DNA- oder RNA-Moleküle, die eine Länge aufweisen, welche effizient ist, so dass sie für einen bestimmten Serotyp spezifisch ist. Diese Länge soll jedoch ein Maximum nicht überschreiten, so dass die Moleküle ohne sterische Behinderung in einer Analyse mit hohem Durchsatz verwendet werden können.
Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Satz dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle für bis zu 30 Nukleotide lange Regionen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens spezifisch sind. Die Spezifität für diese kurzen Regionen oder diagnostischen Regionen reicht im Allgemeinen für einen effizienten Hybridisierungs-Vorgang aus. Natürlich korrelieren die Länge der diagnostischen Regionen und somit die Länge der spezifischen Oligonukleotid-Moleküle und können für bestimmte Serovar-Spezifika angepasst werden. Besonders bevorzugte diagnostische Regionen sind jene, die mit den nachstehend in Tabelle 1 angegebenen Oligonukleotid-Sonden verwandt sind.
Ein anderer erfindungsgemäß bevorzugter Satz umfasst Oligonukleotid-Moleküle, die Gen-Sequenzen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens entsprechen, die sich an den Positionen dieser Gene befinden, die für die SEQ ID Nr. 1 bis 193 (nachstehend in Tabelle 1 angeführt) angegeben sind. An diesen Positionen besteht eine Variation zwischen ausgewählten Serovaren, was für die Serotypisierung mit einem erfindungsgemäßen Satz verwendet werden kann.
Noch mehr bevorzugt ist der erfindungsgemäß_e Satz dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle diagnostische
NACHGEREICHT ·· ·· ···· · • · · · · ··· ♦ »··· • » · · · · · ♦ ·· ^ —·· ··· ·
Moleküle umfassen, welche verschiedene Serotypen von Salmonella unterscheiden. Diese diagnostischen Nukleotide sind für ein bestimmtes oder eine Gruppe von bestimmten Serovaren spezifisch. Eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen der Oligonu-kleotid-Moleküle mit den oben definierten Salmonella-Gen-Regio-nen ist nur mit den ausgewählten Serovaren ermöglicht und führt zu Fehlpassungen („mismatches") mit anderen Serovaren, die sich in ihrem genetischen Code unterscheiden. Eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen wird z.B. in Lösung mit 124 μΐ DEPC-behandeltem Wasser, 2 μΐ 10% SDS, 4 μΐ 50x Denhardt-Reagens (Sigma), 60 μΐ 20x SSC und 10 μΐ Target-DNA oder -RNA, einschließlich Inkubation bei 65°C für 1-15 min (vgl. Beispiele unten) durchgeführt. Die optimalen Hybridisierungsbedingungen, einschließlich der Temperatur, können natürlich je nach den Oli-gonukleotid-Molekülen variieren. Die Hybridisierungstemperaturen der gegebenen Oligonukleotid-Moleküle können mit den nachstehend beschriebenen Methoden leicht berechnet werden.
Bevorzugte diagnostische Nukleotide der Oligonukleotid-Mole küle sind ausgewählt aus den unterstrichenen Nukleotiden, die in den SEQ ID Nr. 1 bis 193 angegeben sind (Tabelle 1 unten). Die Oligonukleotid-Moleküle gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 193 können direkt oder nach Umwandlung in komplementäre und umgekehrte Form mit den passenden Genen fluchtend ausgerichtet werden; da die Gene nach Amplifizierung, z.B. mittels PCR, verwendet werden können und in sense- oder anti-sense-Orientierung vorliegen können. Komplementäre Nukleotide sind A und T oder U, und G und C. Die Beispiele der in Tabelle 1 vorgesehenen Oligonukleotid-Moleküle umfassen mindestens eine diagnostische Fehlpassung (mismatch) (auch als diagnostisches Nukleotid bezeichnet), d.h. ein Nukleotid, welches zwischen bestimmten Serovaren durch selektive Hybridisierung des gegebenen Salmonella-Serotyps unterscheidet und mit anderen Serovaren Fehlpassungen bildet. Somit sind gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 193 bevorzugte diagnostische Nukleotide für das fliC-Gen an den Nukleotiden Nr. 714, 720, 730 gemäß der Sequenz für Sonde cl, und für das gyrB-Gen an den Nukleotiden Nummer 753, 762, 768 gemäß der Sonde g4, usw. Ein Nukleotid, das ein solches diagnostisches Nukleotid aufweist, während der Rest des Oligonukleotid-Moleküls, d.h. der nicht unterstrichene Teil der in Tabelle 1 unten angegebenen Sequenzen, modifiziert sein kann. Diese Modifikation der Oligonukleotid-Moleküle kann entweder
*· ···· · • · · · · · · Μ· · · • · ♦ · · ··· · ···· ·«··· · ·· ·· ···_ ·· ··· f durch Auswählen anderer Nukleotide, die durch die Sequenzen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens mit umfasst sind, oder durch Auswählen von Nukleotiden, die nicht von diesen Sequenzen mit umfasst sind, durchgeführt werden, wodurch nicht-diagnostische Fehlpassungen gebildet werden, die allen Salmonella-Serovaren gemein sind. Solche nicht-diagnostischen Fehlpassungen haben natürlich einen starken Einfluss auf den Hybridisierungszustand, ohne die Serovar-Spezifität zu verändern. Der erfindungsgemäße Satz wird vorzugsweise an durch PCR angereicherten Produkten des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens verwendet, und somit wird die Gen-Spezifität auf PCR-Ebene aussortiert. Die Serovar-Spezifität wird mit dem Oligonukleotid-Satz bestimmt, welcher daher bestimmte Freiheiten, wie nicht-diagnostische Fehlpassungen ohne unerwartete Nebeneffekte, wie genetische Kreuzreaktivität mit anderen Genen, aufweisen kann.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Satz dadurch gekennzeichnet, dass sich die Regionen (oder diagnostischen Regionen) des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens an der 5'-End-Hälfte dieser Gene oder im zentralen Teil dieser Gene befinden. Bei bestimmten Oli-gonukleotid-Molekülen erfolgt die Hybridisierung am besten so nahe wie möglich am 5'-Ende des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens. Andere Sätze, die so zentral wie möglich sind, sind am besten für die diagnostische Region. Diese Präferenzen hängen stark von der Verwendung des Oligonukleotid-Moleküls ab, d.h. von ihrer Fixierung, z.B. an einem festen Träger durch Spacer, welche wiederum unterschiedlich in Länge und Flexibilität sein können und somit die Hybridisierungs-Präferenzen der Oligonukleotid-Moleküle an Salmonella-Gen-Material beeinflussen.
Eine weitere Ausführungsform sieht den erfindungsgemäßen Satz mit 1 bis 4 nicht-diagnostischen Fehlpassungen vor. Nichtdiagnostische Fehlpassungen sind Fehlpassungen (d.h. Nukleotide, die keine Basenpaare in fluchtender Ausrichtung oder Hybridisierung des Oligonukleotid-Moleküls mit den entsprechenden Genen bilden), die für alle Salmonella-Serovaren unter Beobachtung üblich sind. Nicht-diagnostische Fehlpassungen können verwendet werden, um die Hybridisierungsbedingungen zu verändern, z.B. durch Senken der Schmelztemperatur. Mit zunehmender Anzahl [ nachgereicht 9
9 9 . · t · · · ··· · ···· • · · · · · ·
nicht-diagnostischer Fehlpassungen leidet jedoch die analytische Qualität zunehmend. Vorzugsweise sind die nicht-diagnostischen Nukleotide der SEQ ID Nr. 1 bis 193 Ziele für nicht-diagnostische Fehlpassungen.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Satz ist dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle ausgewählt sind aus SEQ ID Nr. 1 bis 193 (nachstehend in Tabelle 1 angegeben). Tests mit diesem Satz erwiesen sich als hoch effizient. Eine solche hohe Effizienz ist nicht nur durch eine hohe Spezifität für die Salmonella-Gen-Sequenzen gekennzeichnet, sondern auch durch eine effiziente Bindungs-Kinetik, was durch das Entwerfen von Oligo-nukleotiden erreicht wird, bei welchem die Bildung nachteiliger Strukturen, wie Haarnadel-Strukturen vermieden wird.
Genetisches Material wird häufig durch molekular-biologische Methoden unter Verwendung von Transkriptasen, wie PCR, vor-am-plifiziert. Bei einer PCR werden komplementäre Stränge von genetischem Material geschaffen. So kann auch eine Spezifität erreicht werden durch die Schaffung von Nukleotiden, die an einen komplementären Strang binden (in umgekehrter Reihenfolge). Einige in SEQ ID Nr. 1 bis 193 angegebene Oligonukleotide sind für einen solchen komplementären Strang spezifisch. Ein weiterer bevorzugter Satz gemäß der Erfindung umfasst Oligonukleotid-Moleküle, die komplementär und/oder in umgekehrter Reihenfolge zu Oligonukleotiden ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID Nr. 1 bis 193 sind.
Vorzugsweise weisen die Oligonukleotid-Moleküle, vorzugsweise an ihrem 5'-Ende befestigt, Spacer-Moleküle auf. Bei Befestigung an einem festen Träger verhindern diese Spacer-Moleküle die negativen sterischen Auswirkungen und eine Störung der Hybridisierungs-Eigenschaften der immobilisierten Oligonukleotid-Moleküle, die sich aus der Anhäufung dieser immobilisierten Moleküle ergibt. Mit den Spacer-Molekülen ist eine Zugänglichkeit der immobilisierten Oligonukleotid-Moleküle vorgesehen.
Noch mehr bevorzugt weisen diese Spacer-Moleküle einen C-Linker, vorzugsweise einen C5- bis C20-Linker auf, besonders bevorzugt ist dies ein C12-Linker. Es erwies sich, dass dieser C-Linker ein wirksames und funktionelles Spacer-Molekül vorsieht, ohne den Hybridisierungs-Schritt zu beeinflussen.
Vorteilhaft umfassen diese Spacer-Moleküle weiters Thymidin-Reste, vorzugsweise 2 bis 10 Thymidin-Reste. Beispielsweise sind
NACHGEREICHT extra 5 Thymidin-Reste am 5'-Ende am Oligonukleotid-Molekül oder am C-Linker befestigt. Diese Thymidin-Reste sehen ein zusätzliches optimales Abstandhalten vor. Für eine rasche und einfache Detektion ist es bevorzugt, dass die Oligonukleotid-Moleküle markiert oder mit einem Marker versehen sind. Der Fachmann kann die optimale Markierung auswählen, wobei vorzugsweise solche Markierungen verwendet werden, die ein Signal liefern oder ein Signal verändern, wenn eine Hybridisierung mit dem Target eintritt. Diese Markierungen können beispielsweise enzymatische oder chemische Markierungen, wie Cy5/Cy3 sein.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein fester Träger vorgesehen, welcher an seiner Oberfläche immobilisiert den Satz der Oligonukleotid-Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, aufweist. Dieser feste Träger kann einfach und wirksam in Hochdurchsatz-Detektions- und Quantifizierungs-Tests verwendet werden. Eine große Anzahl verschiedener fester Träger wurde im Stand der Technik beschrieben, und der Fachmann kann den optimalsten je nach der Menge der zu immobilisierenden Oligonukleotid-Moleküle, der Menge der zu de-tektierenden Proben, den Möglichkeiten in einem Labor und gemäß anderer Kriterien auswählen. Es ist möglich, einen festen Träger vorzusehen, an dem mindestens 4 Oligonukleotid-Moleküle des erfindungsgemäßen Satzes immobilisiert sind, noch mehr bevorzugt sind jedoch mindestens 20, und am meisten bevorzugt mindestens 50 Oligonukleotid-Moleküle des erfindungsgemäßen Satzes am festen Träger immobilisiert, um ein Werkzeug für eine Hochdurchsatz-Analyse vorzusehen.
Vorzugsweise ist der feste Träger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Abschnitt (slide), einer Membran, einer Säule, Kügelchen und einer Platte. Diese sind herkömmliche feste Träger für die Detektion und Quantifizierung spezifischer Targets in einer Probe und sind im Stand der Technik, wie oben erwähnt, gut beschrieben.
Noch mehr bevorzugt weist der erfindungsgemäße Oligonukleo-tid aufweisende feste Träger einen Mikroarray der Oligonukleotid-Moleküle gemäß der Erfindung auf. Ein Mikroarray weist eine große Anzahl immobilisierter Oligonukleotid-Moleküle auf, die in hoher Dichte am festen Träger vorgesehen sind. Ein Mikroarray ist ein hoch effizientes Werkzeug, um Hunderte bis Millionen von
NACHGEREICHT ·· ♦· ···· · ········· · • · · · · · · ··· · · • · · · · ··· · ···· ····« · · ♦ ·· ·Μ ·· ·*· ·
Target-Molekülen in einem einzigen Detektionsschritt nachzuweisen. Solche Mikroarrays sind oft als Abschnitte oder Platten, insbesondere Mikrotiterplatten, vorgesehen. Im Stand der Technik ist ein Mikroarray sowohl entweder als miniaturisierte Anordnung von Bindungsstellen (d.h. ein Material, der Träger), oder als Träger mit miniaturisierten Bindungsstellen (d.h. der Array) definiert. Beide Definitionen können für die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Für die erste dieser Definitionen ist die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine miniaturisierte Anordnung der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung in einem Mikroarray. Die Oligonukleotid-Moleküle sind vorzugsweise auf dem Mikroarray mit Hilfe einer Print-Vorrichtung („printing device") vorgesehen, welche eine Immobilisierung in hoher Dichte am festen Träger gewährleistet. Dieser Mikroarray ist beim Analysieren einer großen Anzahl von Proben besonders nützlich.
Vorteilhaft sind die Oligonukleotid-Moleküle in Spots an der Oberfläche immobilisiert. Durch Vorsehen von Spots werden spezifisch definierte Regionen, die die immobilisierten Oligonukleotid-Moleküle aufweisen, hergestellt. Wenn ein Spot für ein bestimmtes Bakterium spezifisch ist, ist es möglich, die in der analysierten Probe vorhandenen Bakterien genau zu definieren. Es ist weiters möglich, ein Referenz-Oligonukleotid-Molekül in den Spots vorzusehen, welches nicht nur eine positive Kontrolle ist, sondern auch als Referenz für eine Quantifizierung verwendet werden kann.
Vorzugsweise sind identische Oligonukleotid-Moleküle in einem Spot immobilisiert. Ein positives Hybridisierungssignal einer gegebenen Probe ermöglicht spezifische Angaben dahingehend, exakt welche Serotypen in der getesteten Probe vorhanden sind, da jeder Spot für eine gegebene charakteristische diagnostische Region spezifisch ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen festen Trägers, wie oben definiert, womit ein erfindungsgemäßer Satz von Oligonukleotid-Molekülen, wie oben definiert, immobilisiert wird, vorzugsweise in Spots auf der Oberfläche des festen Trägers. Für diesen Aspekt gelten dieselben Definitionen und vorteilhaften Ausführungsformen, wie oben für andere. Aspekte der vorliegenden Erfindung erwähnt. Mit diesem Verfahren wird ein
NACHGEREICHT ·· ···· · ·· ·· · ······#·· · • · · · · · · ··· · · • · · · · ··· t«··· ·«··· · · # ·· *·· _·· ··· · fester Träger vorgesehen, der in der Hochdurchsatz-Analyse jeder gegebenen Probe verwendet werden kann.
Vorzugsweise wird dieser Satz auf diese Oberfläche mit einer einzigen Nadel aufgespottet. Durch Spotten mit einer einzigen Nadel werden Variationen, die dem Spotten mit zahlreichen Nadeln inhärent sind, vermieden. Daher wird jeder Spot mit einer genau definierten Menge und Konzentration von Oligonukleotid-Molekülen vorgesehen.
Ebenfalls bevorzugt erfolgt dieses Spotten mit einem Print-Puffer („printing buffer"), vorzugsweise mit DMSO in H20. Der Print-Puffer wird verwendet, damit der feste Träger während der langen Spot-Runden nicht austrocknet. DMSO in H20, vorzugsweise etwa 50% DMSO in H20, wird verwendet, da dieser Print-Puffer im Vergleich zu wässerigen Lösungen, wie 3xSSC oder Phosphatpuffer, optimal war, um den festen Träger feucht zu halten.
Vorzugsweise ist der feste Träger, der einen Satz Oligonu-kleotide gemäß der Erfindung aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass er auch Spots mit Fehlpassungs-Gegenpaaren zu Spots mit Oligonukleotid-Molekülen, die für Salmonella-Gene spezifisch sind, aufweist. Diese Fehlpassungs-Gegenpaare (auch als Fehlpas-sungs-Kontrollen bezeichnet) weisen Fehlpassungen in ihrem (ihren) diagnostischen Nukleotid(en) auf, d.h. solche, die sich auf Nukleotide beziehen, die von Natur aus in bestimmten Salmonella-Serotypen verschieden sind, womit sie eine geänderte Serovar-Spezifität haben. Wenn die Sonde und ihre Fehlpassungs-Kontrolle in einem Test dieselbe Intensität vorsehen, wird die Sonde als negativ angesehen; nur wenn seine Fehlpassungs-Kontrolle im Signal signifikant schwächer ist, wird das Signal auf der Sonde als wirklich positiv angesehen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Serotypisierung von Salmonella in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: - Amplifizieren der gyrB-, atpD-, fliC- und fljB-Gene von Salmonella in der Probe, - Zugeben des amplifizierten Produkts zum festen Träger, wie oben definiert, - Durchführen eines Hybridisierungsschrittes zum Hybridisieren von Nukleinsäure-Molekülen aus dem amplifizierten Produkt mit den immobilisierten Oligonukleotid-Molekülen, vorzugsweise gefolgt von mindestens einem Waschschritt,
NACHGEREICHT «φ · ·· φφ φφφφ φ • φ φφ φ φ φ ·· φ φ φ · · · · φ φφφ · · • φ · · · φφφ · φφφφ φ φ φ φ φ · φ φ ΦΦ ··_· J · ··# φ - Detektieren von Hybridisierungsprodukten, wobei ein Hybridisierungsprodukt das Vorhandensein irgend eines der Serotypen in der Probe zeigt.
Wiederum gelten auch hier dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wie oben erwähnt. Vorzugsweise wird die Amplifikation mittels PCR durchgeführt.
Der Waschschritt wird durchgeführt, um jegliche nicht-immo-bilisierten Oligonukleotid-Moleküle sowie jegliche weiteren Substanzen, die während des Hybridisierungsschrittes verwendet wurden, welche die Detektion von Hybridisierungsprodukten beeinflussen könnten, weg zu waschen.
Die Detektion von Hybridisierungsprodukten wird gemäß irgend einem bekannten Verfahren durchgeführt, z.B. weisen entweder die immobilisierten Oligonukleotid-Moleküle eine Markierung auf, die ein Signal sendet, wenn eine Hybridisierung eintritt, oder es werden die Nukleinsäure-Moleküle von einer spezifischen Salmonella markiert, welche Markierung dann nach dem Waschschritt de-tektiert wird. Natürlich kann jede notwendige Vorbehandlung der Probe durchgeführt werden, bevor diese Probe zum festen Träger zugegeben wird, insbesondere eine Behandlung zum Aufbrechen von Bakterienwänden und Freisetzen der Nukleinsäure-Moleküle der Bakterien, und die Amplifikation der Nukleinsäure-Moleküle, beispielsweise mittels PCR.
Der Hybridisierungsschritt erfolgt unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine ausreichend spezifische Hybridisierung emöglichen, z.B. wird die Anzahl falsch positiver Ergebnisse minimiert. Der Fachmann kann die optimalen Hybridisierungsbedingungen durch Auswählen aus einer Vielfalt von Hybridisierungspuffern, Temperaturen und Waschbedingungen auswählen. Dabei ist die Schmelztemperatur Tm nützlich zum Auswählen optimaler Hybridisierungsbedingungen. Diese Tm kann mit Hilfe bekannter Formeln, wie sie z.B. in Sambrook et al., Mole-cular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laborato-ry, New York, 1989) angegeben sind, berechnet werden.
Vorzugsweise werden alle vier Gene, ausgewählt aus gyrB, atpD, fliC und fljB, während dem Verfahren mit PCR amplifiziert. Beispiele für Primer für die PCR sind nachstehend in Tabelle 2 angegeben, es können jedoch alle für diese Gene spezifischen Primer verwendet werden.
Um die Sonden-Spezifität zu verbessern, werden beide Stränge nachgereicht ·« · ·· #· ···· · « ···· * t · t · • · · · ♦ · · »·· · · • · · · ♦ ··· · ···· ····· · · # ♦♦ ·1· ··· · für den Sonden-Entwurf verwendet, d.h. einige Sonden zielen auf den positiven, andere auf den negativen Strang der doppelsträn-' gigen DNA ab. Diese Strategie optimiert die Fehlpassungen zwischen Sonden und nicht-Target-Sequenzen durch Auswahl des Stranges, der eine stärkere Fehlpassung gegenüber nicht-Target-Sequenzen hat.
Das Verfahren kann eine kurze (4-8 Stunden) Vor-Anreicherung von Salmonella aus der analysierten Probe inkludieren. Die DNA der Bakterien, die in der Vor-Anreicherung gezüchtet wurden, kann dann markiert und gegen den Mikroarray hybridisiert werden. Das Hybridisierungsmuster ermöglicht die Identifizierung von Salmonella-Serotypen und in vielen Fällen auch eine parallele Identifizierung.
Vorzugsweise hybridisieren die Nukleinsäure-Moleküle von einem spezifischen Bakterium an Oligonukleotid-Moleküle, die in einer definierten Region, vorzugsweise einem definierten Spot, der Oberfläche immobilisiert sind. Dies erfolgt, wenn identische Oligonukleotid-Moleküle, die für ein Bakterium spezifisch sind, in einer definierten Region, vorzugsweise einem definierten Spot, immobilisiert sind. Ein detektiertes Hybridisierungsprodukt in einer gegebenen Region oder in einem Spot ermöglicht daher Angaben hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen Bakterien in dieser Probe.
Vorteilhaft wird die Probe vorbehandelt durch Isolieren und Reinigen der Nukleinsäure-Moleküle aus den Bakterien. Dies kann gemäß jedem bekannten Protokoll durchgeführt werden, wobei die Nukleinsäure-Moleküle intakt bleiben müssen, z.B. nicht irgendwelchen Mutationen oder Rekombinationen unterzogen werden.
Noch mehr bevorzugt sind die Nukleinsäure-Moleküle aus den Bakterien oder dem amplifizierten Produkt fragmentiert, vorzugsweise zu einer Größe von 30 bis 70, vorzugsweise 45 bis 55, Nukleotiden. Eine solche Fragmentierung führt zu einer signifikanten Verstärkung der Hybridisierung. Weiters verringert die Fragmentierung in vielen Fällen die Unterschiede zwischen den Hybridisierungs-Kapazitäten von Sonden. Eine durchschnittliche Fragment-Größe von 50 Nukleotiden ist optimal.
Gemäß einem vorteilhaften Verfahren wird die Probe vorbehandelt, so dass die Nukleinsäure-Moleküle aus den Bakterien RNA-Moleküle sind. RNA-Moleküle haben den Vorteil, dass sie auf beliebige Weise über chemische Fragmentierung fragmentiert wer-
NACHGEREICHT ·· · ·· ·· ···· · ·♦♦♦····· φ • · φ · φ β # ΦΦ· φ · φ · · · · ·*· · φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ •Φ φφφ Jg J· φφφ · den können. Weiters ermöglichen RNA-Moleküle ein direktes Einarbeiten von Markierungs-Molekülen mit beispielsweise der T7-RNA-Polymerase, die sehr effizient ist. RNA-Moleküle können z.B. durch Durchführen eines Transkriptionsschrittes, beispielsweise nach einer PCR-Reaktion, z.B. nach Amplifizierung von DNA-Mole-külen, erzeugt werden.
Wie oben erwähnt, ist vorzugsweise das Verfahren der Serotypisierung von Salmonella gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die gyrB-, atpD-, fliC- und fljB-Gene von Salmonella aus der Probe mittels PCR amplifiziert werden.
Vorteilhaft sind die Nukleinsäure-Moleküle aus Salmonella markiert, vorzugsweise mit Cy3 bzw. Cy5. Dies wird vorzugsweise durch direktes Einarbeiten der Markierung während der Polymerase-Reaktion erreicht, z.B. mit der T7-RNA-Polymerase, die sehr effizient durchgeführt wird. Obwohl Cy-Farben gegen einen nukleophilen Angriff empfindlich sind, ermöglichen diese Farben eine signifikante Erhöhung der Signale. Weiters sind Cy3- und Cy5-Farben wohl bekannt und wurden in der Literatur umfassend charakterisiert. Daher umfasst ein bevorzugtes Verfahren die Schritte der DNA-Isolierung aus der Sonde, PCR, in vitro-Transkription einschließlich eines Markierungsschrittes, und Fragmentierung der RNA.
Vorzugsweise wird der Hybridisierungsschritt unter Bedingungen durchgeführt, die eine perfekte Übereinstimmung und eine einzige Fehlpassungs-Hybridisierung ermöglichen. Die einzige Fehlpassungs-Hybridisierung reicht aus, um eine spezifische Detektion irgendeines der in Frage stehenden Bakterien vorzusehen. Solche Hybridisierungsbedingungen können beispielsweise durch Vorsehen einer Hybridisierungsmischung mit 124 μΐ mit DEPC-be-handeltem Wasser, 2 μΐ 10% SDS, 4 μΐ 50x Denhard-Reagens (Sigma), 60 μΐ 20x SSC und 10 μΐ Target-Nukleinsäure-Moleküle und mehrstündige Hybridisierung bei etwa 55°C erreicht werden. Diese Hybridisierungsbedingungen liefern ein optimales und hocheffizientes Verfahren zur Detektion und Quantifizierung jedes der oben definierten Bakterien.
Noch mehr bevorzugt wird der Hybridisierungsschritt über Nacht, vorzugsweise unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung, durchgeführt. Die Hybridisierung über Nacht gewährleistet eine vollständige Hybridisierung, die Schüttelvorrichtung ermöglicht eine optimale Verteilung der Probe am festen Träger, und im Fal- | nachgereicht ·» ·· ··*« · • · • · ·» • · · · ··· · · • · ··· · ···· • · · · · ·· ··· · ·-· rt - le der Erzeugung von Bläschen während der Hybridisierung werden diese infolge der Bewegung der Schüttelvorrichtung zum Rand des festen Trägers bewegt. Mit einer Schüttelvorrichtung wird genügend zusätzliches Mischen vorgesehen, um über den gesamten festen Träger eine angemessen gleichförmige Hybridisierung zu ermöglichen. Daher wird eine effiziente Hybridisierung erreicht.
Vorteilhaft erfolgt der Hybridisierungsschritt in einer klebrigen (sticky) Hybridisierungskammer. Dies ist ein selbstklebender Kunststoff-Film welcher, wenn er auf einen Glas-Array geklebt wird, eine geschlossene Hybridisierungs-"Kammer" mit einem Volumen von beispielsweise etwa 200 μΐ erzeugt. Eine solche Hybridisierungskammer ermöglicht signifikant höhere Volumina als jene, die zwischen einem Mikroarray und einem herkömmlichen Deckglas bestehen.
Der Satz der Oligonukleotid-Moleküle der vorliegenden Erfindung kann auch als PCR-Primer verwendet werden. Daher ist ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Serotypisieren von Salmonella in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte aufweist: - Amplifizieren von Fragmenten der gyrB-, atpD-, fliC- und fljB-Gene von Salmonella in der Probe mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden aus dem Satz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, - Detektieren von PCR-Produkten, wobei ein PCR-Produkt die Anwesenheit eines der Serotypen in der Probe anzeigt.
Die PCR-Amplifikation der Gen-Fragmente kann mittels auf dem Gebiet bekannter Standard-Methoden durchgeführt werden (vgl. Sambrook et al., oben; oder Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, New York (1994)). Die Anwesenheit eines PCR-Fragments zeigte die Hybridisierung des Primers mit dem genetischen Material und die nachfolgende Amplifikation eines Fragments desselben an, womit ein Salmonella-Serovar angezeigt wird, gegenüber welchem der Primer reaktiv oder für welchen er spezifisch ist.
Die vorliegende Erfindung ist mit Hilfe der folgenden Beispiele genauer beschrieben.
Beispiele Beispiel 1: Oligonukleotide
Tabelle 1. Oligonukleotide zur Salmonella-Serovar-Identifi- nachgereicht • · ···· · * · · · ·· ······ • · · · · ··· · ···· ····· · · ( ·· ··· L· ]_8* · zierung. Der erste Buchstabe des Sonden-Namens bezieht sich auf das Marker-Gen, auf das gezielt wird, a steht für atpD, g für gyrB, c für fliC, b für fljB. Die vierte Spalte zeigt die Sequenzen der Sonden, die gemäß Kriterien entworfen sind, welche durch die Methodik gemäß der Erfindung festgelegt sind. Diagnostische Nukleotid-Positionen sind in grau und durch Unterstreichen markiert. Die Positionen der diagnostischen Regionen sind in der fünften Spalte gemäß dem entsprechenden Gen in Salmonella Typhimurium LT2 angegeben (Hinterlegungs-Nr. NC_003197.1). Die nachstehend angeführten Oligonukleotide decken etwa 40 Serovaren ab, die für etwa 99,9% aller Fälle verantwortlich sind. Die dritte Spalte gibt die Richtung als „s" für sense und „a" für anti-sense in Bezug auf die Gen-Sequenzen an. Anti-sense-Sequen-zen entsprechen komplementären und reversen Sequenzen in sense-Orientierung. SEQ ID Nr. Sonde Rlchtg. Sequenz 5'-3· Posi tion Spezifität 1 c1 S CAAGACfiACTAAATCTACTGCTGGTAC 714 Agona/ Bovismorbificans/ Mbandaka/ Senftenberg 2 c1_rev- comp a GTACCAGCAGTAGATTTAGTCGTCTTS 714 Agona/ Bovismorbificans/ Mbandaka/ Senftenberg 3 g4 s GGTGTGGAAGTAGCGCTACAGT 751 Agona/ Senftenberg/ Mbandaka 4 c2 s TTCAAGTTGGfiGCGAAIGACG 437 Albany 5 c3 s GTGGTCCCGCAGCAGATAAATTATC 620 Albany/ houtenae 6 g5 a TGCCGCCTTCGTAGTGGAAATG 643 alle Salmonella enterica Serovaren 7 C4 a CCTGCCGCATCGTCTTTCG 122 alte Salmonella enterica Serovaren 8 b54 s CAACAACAACCTGCAGCGTGTG 255 alte Salmonella enterica Serovaren 9 b55 s GGACAACACCCTGACCATCCAG 420 alte Salmonella enterica Serovaren 10 c5 s AACAACAACCTGCAGCGTGTG 256 alte Salmonella enterica Serovaren 11 a4 a GCAGTTCCTGAGAGTTTGACAACTC 355 alte Salmonella enterica Serovaren 12 b53 s CTGAACGAAATCGACCGTGTATCCG 358 alte Salmonella enterica Serovaren 13 b56 s AACGGCGTGAAAGTCCTGGC 397 alte Salmonella enterica Serovaren 14 b57 8 GAACTGGCGGTTCAGTCTGCT 280 alte Salmonella enterica Serovaren 15 b58 a CAGCGCGCCTTCAGTGGT 229 alte Salmonella enterica Serovaren 16 b59 a CGCAGCGCATCCACCTGC 1284 alte Salmonella enterica Serovaren 17 c7 s GGAAATCCCACGGCAACAGG 595 Anatum 18 a6 s GGCTATTCACCGCGCGG 324 -— arizonae
NACHGEREICHT • ··♦ • ···· 19 •7 s GGGCTATTCACCGCGCGG 323 arizonae 20 97 a GCGTCGGACGGATTTTCCAG 1084 arizonae 21 g6 a GTACCATCGTGCCAGTTTTATCGG 479 arizonae 22 g8 a TGTCTTTGGTCTGCGAGGAAAATTTC 990 arizonae 23 g9 a TGCTTTGCA GATCCGCCC 1284 arizonae 24 g11 a <3<3CACGAGCGGCATCAAT 1126 arizonae 25 c11 a ATTGATCGGCTTTTAAATGTGCTCCA 1044 arizonae/ Blockley 26 c8 s AAACCGTTGACGCATTCCGTAG 1250 arizonae/ Blockley 27 c9 a GG£AGTACCCTC£GTäGTTTTA 1175 arizonae/ Blockley 28 gl5 a cgcaaciigaacacgqataccg 744 Blockley 29 c16 a GGAAACCATTTTTACCTGAGTCAGTCG 668 Blockley 30 b1 s ctaagaattccttaatccgggcgg 896 Blockley 31 b2 s cgttgcccgccgatgcta 920 Blockley 32 g14 a GA.€TC£££CCAICASSSI 824 Blockley 33 g16 a AGCTTATCITTGGICTGGGA GGAG 996 Blockley 34 917 s CGAACTCTACCTGGTGGAAGGG 1254 Blockley 35 b5 a GTGATTTCAGCCTAGATGGAGTCGAG 325 Bovismorbificans/ Goldcoast 36 C20 s GCGATAGCTASTG£CATTAASGGT 754 Bovismorbificans/ Senftenberg 37 b6 s ACTGCCGATGCAAATGCCG 925 Bovismorbificans/ Zanzibar/ Goldcoast/ Kottbus 38 c21 s CTGGCGACGCTACTAAAAATGGTG 698 Bradeney/ Brandenburg/ Braenderup 39 g18 s CTAATTACCGCGCTGGGCTG 1408 Bradeney/ Schwarzengrund 40 b9 s accccaagtiataccgctgctg 1072 Bradeney/ Schwarzeng rund 41 b10 a GCTTTAAGCGCATAACCACCTTCA 990 Braenderup 42 b11 a GGTTNTAGCTTTAACTGCTCCTGTCG 1049 Braenderup 43 a9 s CTGATGTGCCCGTTCGCG 406 Braenderup/ Coeln/ Newport 44 a10 a CCGSITCfiCCCAfiAACGT 269 Brandenburg 45 b12 a AGGTAGAACTGATAACGTCTGTCGC 553 Brandenburg 46 g19 a CACGCGCGGCATCGATAATATT 1120 Brandenburg/ Chester 47 a11 a AGCAGTGCIGATACTTCCGTACC 754 Cerro 48 c22 a ATCTAAGCCCAGCTCAGTTTTATCGA 488 Cerro 49 c25 a CCAAGICTACGGCAGTACCCT 1187 Cerro 50 c27 s GTGATGTAAAAATTGCGGCAGCTGAT 572 Cerro/ Blockley/ arizonae 51 g20 a CgGATGGAAACGCCIGAGTTC 591 Cerro/ London/ Kottbus 52 c28 a CNATAGIAACAAC£TCeG3jnrACCGTC 1102 Chester 53 c29 a TGATTTCGGATCCATTfiSAICAGTTG 548 Chester 54 c30 a CGAGGATGTTGGAGACTTCGGT 1381 Chester 55 b14 $ GGATACGCTGAACGTgCAGAAAG 510 Chester
NACHGEREICHT • · · · • · · · · 56 b13 s AGGTTGGCGCgAACGACG 440 Chester 57 a12 a acaactcttcstaagaaggcgct 339 Chester/ Brandenburg 58 a13 a CGGCTGATAACCTACIGCGGAA 789 Chester/ Brandenburg 59 a14 a CGAACAGCASIACATCACGACCT 702 Choleraesuis 60 921 a GTTGGTAAAGGTTTCGTGGCTCG 512 Choleraesuis 61 b15 s caaaacitccatgcctmgcgaact 209 Choleraesuis 62 b16 s CGATTTCTGACTGTGTTAGCCTGG 249 Choleraesuis 63 b19 s CCCAAAGCGTAACCAIQTGTGAA 117 Choleraesuis 64 b26 s GTTATTGTGTAGCCA GAATGCCGC 186 Choleraesuis 65 b20 s AAGCGAACTGTTGAGAGTACGTTTC 225 Choleraesuis 66 b21 s GGAAGTGCTTGTCCCAACCTTG 271 Choleraesuis 67 b22 s ΑΑΤΠΤGAGCTAGTAGGGTTGCAGC 142 Choleraesuis 68 b24 s CAGCCACGAGTA A GTCTTCCCTTG 163 Choleraesuis 69 b25 s GAGAGATCCCCTCATAATTTCCCCA 96 Choleraesuis 70 b28 s GACGGCACTAgCAAAACAGCAG 1093 Choleraesuis/ Infantis 71 c41 a CGTCAGCAGCAGTATAACTTGTGGTT 1038 Coeln 72 c42 a TTAATTGCTCCTGTCG£TTCATCG 1008 Coeln 73 c36 s GTAAMCAATTgAAGGCGeiTATGCG 947 Coeln 74 c37 a GTTGGTTAGCCGCTGTTTTGGTA 1068 Coeln 75 c39 a AAAGTTGTGACCTTCAGCTTTGCT 1150 Coeln 76 a31 a ACAACTCTTCATAGGAAGGSGCTG 338 Derby 77 g2 a TCAGCGTGGCCACTTCCT 1394 Derby 78 c44 a GATCGATTTCCTCCAGACGTTGC 351 Derby 79 g22 s CGTAACCGTAAAAACCAGGCGAT 1306 Derby/ Virchow/ Anatum/ Albany/ Kottbus 80 a15 a TTCATATCGA£CGGTTCACCCAG 274 diarizonae 81 c47 a gccagcgcagcatcaattttc 1230 diarizonae 82 g25 a CGGATCGCGTTCCTGACAATC 1225 diarizonae 83 927 s AAAATTATCGACGCCGCCCG 1120 diarizonae 84 o46 a GGCTTTACTCGCAGCGTAAGTTT 1136 diarizonae 85 C48 a GAATCTGCGCACGAGACATGTT 1393 diarizonae 86 c50 a CCGCGCCAATGGCAATATCA 903 Dublin 87 c51 a CTTTATCCGGTGCTACTGCATCAGT 610 Dublin 88 c52 s CT GTAGTG ACTGATG CA GCAGC 602 Enteritidis 89 g28 a TCCAGCAAGTATTCGCTCAGCA 1067 Enteritidis/ Dublin 90 c54 s ACGCCACGGGTGATAAGATCA 1103 Enteritidis/ Dublin 91 b30 a GACCTTTAATGTTCGCGGTGAAACG 157 Goldcoast 92 a17 s TCACCGACCTCCAGCACC 206 — Goldcoast
[ NACHGEREICHT ·· ···· · • ···· · · · · · • · · · ♦ · · ··· « t • · · · · ♦♦· ♦ ···· • · · · · » ♦ · ·· ··· ·· 4·· · 93 c55 6 £TCCAACATGTC£CGCG£ 1389 Goldcoast 94 a16 a T£71CACCfiATQXCSCCTTTCA 293 Goldcoast 95 a18 a GGCTTTACCIACeGGAACTICSAT 226 Goldcoast 96 g30 a GCTGTAGCCIICI1IGTCCATATAGG 884 Goldcoast 97 b32 s ACCAACTGCAACTGAIATTAAAGCTGC 606 Hadar 98 c59 a acaacttcagitttaccstctgcg 1098 Hadar/ Mbandaka 99 c57 a C£GGTTTTCgGTAGTT£TAGCAG 1202 Hadar/ Mbandaka 100 c58 s ggtgatsactactatgctgcaact 985 Hadar/Mbandaka 101 a19 a GGAAGTSATAGAACCGGTCTTGGT 856 Hadar/Zanzibar 102 b34 a CGGTACCCAGIGCGGACT 65 Heidelberg 103 c60 a CCTGGATfiGTCAASGTGTTGTC 421 Heidelberg/ Infantis 104 a20 a TTCATCTGACCATACACCAGGGAT 609 houtenae 105 a22 s CGGTATSSTACGTACCATCGCfi 147 houtenae 106 c62 s gcaaacggctqsaactctgg 298 houtenae 107 c69 a AAATCAGTTTGTTCCGCGACACG 373 houtenae 108 g31 a gtggaaatgatcctctttgccgtc 628 houtenae 109 c63 a TGAAAGTTGCATTCCCGTCTTTATCT 1125 houtenae 110 c66 a ACGCSCCTTCAGTCGTCT 227 houtenae 111 c68 a GCGCATCATCAATTTTTGCCAGC 1224 houtenae 112 b35 a CGCCAACGCTGCATCAATTTTC 1263 Infantis 113 b36 a TGTTGGAGACTTCGGTCGCATAG 1407 Infantis 114 a23 s CGAAGGTCGTGACGTGGTGC 699 Infantis/ Newpt 115 g38 s GCTCTGCSAASCA6GGCC 1289 Infantis/ Senftenberg/ Agona/ Mbandaka 116 a24 a TACTTCCGTACCAGCAAGGGTG 744 Kedougou 117 b38 a TTTCTGCACATTCAGTGAATCCAGG 507 Kedougou 118 a25 a CCQG71TTGGTTGAG GTGATACG 844 Kedougou 119 g39 a CAGCGCTACTTCCACACC 751 Kedougou 120 b37 a CAGCCACTTCCGCCAGCT 1220 Kedougou 121 c70 a GCAGACCAGAAGACAGACGCT 89 Kedougou/ Goldcoast/ Kottbus/ Newport 122 C72 a CAATCGTAGIATCGG6ATATCCTGT 565 Kedougou/ Typhimurium 123 c73 s GCTACTGGTCTTGGTGGTACTGAC 619 Kedougou/ Typhimurium 124 c71 s TTAAGCCTCGGCTACTGGTCTT 609 Kedougou/ Typhimurium 125 b41 a CTTTGCTGGCATTGTATGTTTTACCG 1164 Kottbus/ Manhattan 126 b42 a STAGCAGCCGCTTCGGCC 1224 Livingstone/ Goldcoast/ Muenchen/ Mbandaka 127 a1 s TCCGCGGTAGGCTATCAGC 790 Livingstone/ Infantis 128 c75 s GCTTTGGCGCAGG7TGATG 1243 Livingstone 129 c74 a CTGCAG£GGGmTCAGTCTT 1210 Livingstone/ Muenchen
NAOHQEREICHT φφ φ φφ ·· φφφφ φ • φφφφφφφφ φ • · · · · · · φφφ · φ • · ♦ · · ··· φφφφφ • # φ φ φ · φ · φφ φφ· ·Φ 22* j·· φ nachgereicht 130 c77 a GGTCTGGCCAGAAACACGGTC 370 London 131 c76 a GCTACG£GCIGAAGACAGGTT 1336 London 132 c81 a GCCAGCGGGI 11ICAGTgG 1211 London 133 a2 a GGTTTTACCCACACCCGCAC 452 London/Thompson 134 c82 a TGTAGGCATC£TG£ACATTAAGCTT 514 Manhattan/ Muenchen 135 942 a AfiACGfiATSSAfiACeCCIG 596 Mbandaka 136 c83 s AA£AACCTGICTTCIGC£CGT 1333 Mbandaka 137 b43 a cagacctttaatgttcgcgstaaaacg 157 Mbandaka 138 b44 a GCGCAATAGAQATACCGTCGTTAGC 202 Mbandaka 139 b45 s SGATGCAAATGCCGCSAC 930 Mbandaka 140 b46 s GCGGCAGGTCAGGCÄATT 133 Mbandaka 141 c86 a GCTGCATASGTSTCÄTAACCCGT 580 Montevideo 142 c87 s CAG£GGGTGCCAATAAATATCGT 599 Montevideo 143 a32 s GTAAAGCIACGCT£GG£CG 242 Newport 144 c90 s GAAGTGAAT£TTGAT ASTG£GACAGG 733 Newport/ Braenderup/ Anatum 145 c94 a TCAGATCTATATCGATGGTTTCACCG 456 Newport/ Kottbus 146 a26 s acgmccgccgggaaacc 632 Oranienburg/ Brandenburg 147 c95 s GGCTATCGCäACIICTATCAAAGGC 753 Oranienburg/ Senftenberg 148 c96 s TTCTAATATGTC£AAAGCGCAGATCC 1389 Oranienburg/ Senftenberg 149 a27 a TGATACGACCCAACGTGGCTTTAC 242 Panama 150 c97 s CACCGAAAACCCACTGGCT 1212 Panama 151 c98 s KGKWAAGTCTTCTTCGATGCA£TGA 660 Panama 152 b47 a ACCAGAAGACAGACGCTCAATAGC 82 Panama 153 b48 s TTGCTTCAGCAGATGCTAAAAATGCC 878 Panama 154 b52 s CCGATGCTAATGCCGCTACAT 929 Panama/ Blockley 155 b49 s TCGGGTCTTA£TGATGCAGCTAT[ 601 Panama/ Infantis 156 b50 a ATCGGCATAAGCTGTCGTTGTTAC 556 Panama/ Infantis 157 b51 a CGTACCAGTCGTACCACCCG 635 Panama/ infantis 158 g43 s cgtgaaggtaccggacccg 972 Panama/ Montevideo/ Oranienburg 159 c101 a GCGGCTTTGATAGCAGTAGCATC 607 Saintpaul/ Anatum/ Kottbus/ Braenderup/ Newport 160 g46 a GGCATCATCGCCAGTGGC 928 Saintpaul/ Newport 161 a28 s ACATGATGGAGCTCAT£CGTAACA 476 salamae 162 g48 a GGTGGAGAA£TAGAAIATATTCGGGTG 709 salamae 163 g49 a GTTTTATC£GTATCfiCCAfiTAACGG 464 salamae 164 g50 a CCACGATTTTCGCGTCAGACG 1094 salamae 165 c105 s TGGATACTGCAGG£ACTTACTGG 576 salamae 166 c108 s GCAAAGCT GTGACCGGT£TTTC 548 salamae *-* 23* -·· *-* 23* -·· 187 C112 a GCATAACCICCSTCAATCGTCTT 952 salamae 188 C113 s CCCAGAAAAAAGAIGQIAGCTirAGTS 1007 salamae 169 947 a GGCAGAAT£GC£TGATTCTTGC 1313 salamae 170 g51 a ATTTCACGGGCACGACGC 1155 salamae 171 c103 s AATAQfiACfiTCTTAßACCGCAAC 1038 salamae 172 d08 a GCTATCTACATCATACGCTTTCTGCA 524 salamae 173 c110 a CCCAGTTGGTTSAGTGCIATTTTGG 1070 salamae 174 c111 a CTGGATAGTCAGGGTGTTGTCCT 419 salamae 175 c115 a TCTGGGCTGTAACAGTATCTGTACC 588 Schwarzengrund 178 b61 a CCCCAGTAAAAGCC£CCAATAGIAA 710 Schwarzengrund 177 c116 a TCAgCGCICCTTCAGTGGTC 228 Schwarzengrund 178 c117 s TACTGATATCgAAACTGCAATTGGCG 615 Schwarzeng rund 179 b62 s agttgtttccgcagatgctaamatg 876 Schwarzeng rund/ Bradeney 180 b63 a TCGGTCGCATAGTCAGAATCTTCG 1395 Schwaizengrund/Bradeney 181 a29 a ATCTCGCCTTTCATSTCAACCGG 283 Senftenberg 182 g53 a ATCTTCTTTACCATCGCGCTTGTC 619 Senftenberg/ Goldcoast 183 a30 a GGTTTTA CCCACACCCGCAC 452 Thompson/ London/ Kottbus 184 c125 s AAGACSATTGATGGCGGSTTC 952 Thompson/ZanzBrar 185 C126 a GGCGTTAATGCTGATCGATCCATCTT 1016 Thompson/ Zanzibar 186 C128 s GTTGGAGACGATATTTATGCTGCAACT 982 Thompson/ Zanzibar 187 c123 a GTTGGTTCAGTGCAGTTTTIGTGTTG 1065 Thompson/ Zanzibar 188 C127 a CGGTGTATTTAGTCCCTGAACTTCAGT 826 Thompson/ Zanzibar 189 c130 s CGACTTCCCCGCTTACAGGTG 788 Typhimurium 190 g55 a TGGTCTGTGAGGAAAATTTCGGGT 986 Typhimurium/ Uvingstone/ Goldcoast 191 c134 a CTGGGTAATTTCAGCCTGGATAGAGT 329 Virchow 192 g57 a GGTTTTTACGGTTACGCCCCTG 1300 Virchow/ Derby/ Anatum/ Albany 193 a33 a GGCCATACACCAGGGAGACTTTA 603 Virchow/ Goldcoast
Somit befinden sich die diagnostischen Nukleotide für das fliC-Gen an den Nukleotiden Nr. 714, 720, 730 gemäß der Sequenz für die Sonde cl (SEQ ID Nr. 1) und für das gyrB-Gen an den Nukleotiden Nr. 753, 762, 768 gemäß der Sonde g4 (SEQ ID Nr.3) usw. Die SEQ ID Nr. 59, wie oben angeführt, ist komplementär (und revers) - angegeben als „a" für anti-sense - zur Gen-Sequenz des atpD-Gens, somit passt das 3'-Ende (T) dem genomischen Nukleotid (A) an der oben angegebenen Position 702. Daher befinden sich diagnostische Nukleotide gemäß SEQ ID Nr. 59 an den Positionen 705, 708, 711, 714, 715, 717 und 718 des atpD-Gens._
NACHGEREICHT • · · ··· · · • ··· · ·«··
•A 2*4
Beispiel 2: Mikroarray-Herstellung
Oligonukleotide für die Immobilisation wurden kundenspezifisch synthetisiert (VBC Genomics, Wien, Österreich), mit einer 5' NH2-Gruppe, gefolgt von einem C12-Spacer und 5 Thymidin-Resten, die der Sonden-Sequenz vorangingen. Eine Platte mit 384 Vertiefungen und flachem Boden wurde mit 30 μΐ von 50 μΜ Oligonukleo-tid-Lösungen in 50% DMSO bereitet. Die Proben wurden mit einem OmniGrid-Spotter (1 TeleChem SMP3-Nadel) bei 50% relativer Feuchtigkeit (unter Verwendung der Feuchtigkeits-Steuerung des Spötters), 22°C, auf silylierte Abschnitte (mit Aldehyd-Chemie, Cel Associates, Houston) aufgespottet. Arrays wurden immer im Triplikat gespottet, um eine statistische Korrektur auf Fehler zu ermöglichen. Die gespotteten Abschnitte wurden über Nacht bei Raumtemperatur bei <30% relativer Feuchtigkeit inkubiert, zweimal in 0,2% (Gew./Vol.) SDS 2 min lang bei Raumtemperatur mit heftigem Schütteln gespült, um die nicht gebundene DNA zu entfernen. Die Abschnitte wurden dann zweimal in destilliertem Wasser (dH20) 2 min lang bei Raumtemperatur mit heftigem Schütteln gespült, in auf 95-100°C vorgeheiztes dH20 2 min lang transferiert und auf Raumtemperatur abkühlen lassen (~5 min). Die Abschnitte wurden 5 min lang in einer frisch (unmittelbar vor Verwendung) zubereiteten Natriumborhydrid-Lösung bei Raumtemperatur behandelt, um freie Aldehyde zu reduzieren. Herstellung der Natriumborhydrid-Lösung: 0,5 g NaBH4 wurden in 150 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2P04, 0,24 g KH2P04, in 1000 ml H20, pH 7,4, autoklaviert) gelöst, dann wurden 44 ml 100% Ethanol zugegeben, um die Blasenbildung zu reduzieren. Die Abschnitte wurden dreimal in 0,2% (Gew./Vol.) SDS und einmal in dH20 je 1 min lang bei Raumtemperatur gespült. Schließlich wurden die Abschnitte einzeln getrocknet, wobei eine Luftpistole verwendet wurde, die innen mit einem Wattefilter ausgestattet war (um Öl-Mikrotröpfchen von der Abschnitt-Oberfläche fernzuhalten). Die getrockneten Abschnitte wurden bei Raumtemperatur im Dunkeln vor Verwendung gelagert.
Beispiel 3: Target-Zubereitung gyrB-, atpD-, fliC-, fljB-Gene können amplifiziert werden unter Verwendung der PCR-Primer UPI und UP2r (Fukushima und Ka-waguchi, J. Clin. Mic. 40 (8): 2779-2785 (2002)), atpDF (5737) und atpDR (6625) (Christensen und Olsen, FEMS Mic. Lett. 161:89-96 (1998)), FSal und rFSal (Dauga et al., J. Clin. Mic. 36 (10):
NACHGEREICHT 2835-2843 (1998)), FSa2 bzw. rFSa2 (Dauga et al. (1998)). Die Primer für die Amplifikation und Sequenzierung der atpD-, gyrB-, fliC- und fljB-Gene sind nachstehend in Tabelle 2 aufgezählt.
Tabelle 2. Primer für gyrB-, atpD-, fliC-, fljB-Amplifikation
Primer-Bezeichnung Sequenz (5' · 3') Produkt Große Literaturstelle Anlagerungs temperatur atpDF (5737) (atpD vorw.-Primer) TÄCaP TGACGTCGAATTCC CT- 888 bp Christensen und Olsen 1998 55*C atpDR (6625) (atpD rückw.-Primer) GGAGACGGGTCAGTCAA GTCATC FSa1 (fliC vorwärts-Primer) CAAGTCAtfAATAC(AC) AACAGCCTGTCGC 1500bp Dauga et al. 1998 55*C rFSal (ff/C rückwärts-Primer) TTAACGCAGTAAAGAGA GGACGTTTTGC FSa2* (fljB vorwärts-Primer) GGCACAAGTAATGAACA CTAACAGTCTGT 1478bp 58*C rFSa2“ (fljB rückwärts-Primer) CGtAACAGAGACAGCAC GTT(CT)TG(CT)G UP1 (gyrB vorwärts-Primer) GAAGTCATCATGAC-CGTT CTGCA(CT)GC (ACGT)GG (ACGT)GG (ACGT)AA(AG) TT(CT)GA 1200 bp Fukushima und Kawagu-chi 2002 63*C UP2r {gyrB rückwärts-Primer) AGCAGGGTACGGATGTG CGAGCC(AG)TC(ACGT)A C(AG)TC(ACGT)GC(AG)T C(ACGT)GTCAT Für jedes Target wurden drei PCR-Reaktionen von je 50 μΐ Volumen, bestehend aus lx PCR-Puffer, 1,5 mM MgCi2, 50 nM für je vier dNT-Ps, 15 pMol von beiden Primern, 1 ng Genom-DNA oder 0,1 ng kloniertes PCR-Produkt als Matrize, und IE Taq-Polymerase (Gibco BRL) in einem Hybaid Combi Thermal-Reaktor TR2 unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Die Amplifikationsbedingungen waren: 95°C für 5 min vor Zugabe der Matrize, dann 32 Zyklen von: 1 min bei 95°C, 1 min bei Anlagerungstemperatur, 1 min bei 72°C; gefolgt von einem endgültigen Elongationsschritt von 10 min bei 72°C. Parallele PCR-Produkte wurden gepoolt und unter Verwendung des HighPure-PCR-Reinigungs-Sets (Macherey-Nagel) gemäß den Instruktionen des Herstellers gereinigt. Gereinigte DNA wurde in ultrareinem Wasser gelöst, und die DNA-Konzentration wurde auf 50 ng/μΐ eingestellt und bei -20°C gelagert.
Beim Arbeiten unter RNAse-freien Bedingungen wurde die in vitro-Transkription wie folgt durchgeführt: 8 μΐ gereinigtes PCR-Produkt (50 ng/μΐ), 4 μΐ 5 x T7 RNA-Polymerase-Puffer, 2 μΐ DTT (100 mM), 0,5 μΐ RNAsin (40 E/μΙ) (Promega), je 1 μΐ von ATP, CTP, GTP (10 mM), 0,5 μΐ ÜTP (10 mM), 1 μΐ T7-RNA-Polymerase (40 E/μΙ) (Gibco BRL) und 1 μΐ Cy3- oder Cy5-UTP (5 mM) wurden
NACHGEREICHT ·· t··· · ·· t··· · ♦ + • · • · ·· ·· · · · · · · • · · · · ··♦ · · • · · ··· · ·«·· ♦ · · · · t ··· ·· 2^ j·· · in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zugegeben und bei 37 °C 4 Stunden lang inkubiert. Cy3 und Cy5 sind fakultative Marker für die spätere Detektion. Die RNA wurde sofort gereinigt, wobei das Quiagen RNeasy-Set gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde. Die gereinigte RNA wurde in 50 μΐ dH20 eluiert.
Die gereinigte RNA wurde durch 30 min langes Inkubieren mit 10 mM ZnCl2 und 20 mM Tris.Cl, pH 7,4, bei 60°C fragmentiert. Die Fragmentation wurde gestoppt, indem 10 mM EDTA, pH 8,0, zur Reaktion zugegeben und diese auf Eis gegeben wurde. 1 μΐ 40 Ε/μ1 RNAsin wurde zum fragmentierten Target zugegeben. Fragmentierte, markierte RNA-Targets wurden bei -20°C gelagert.
Referenz-Targets und künstliche Target-Mischungen zum Testen des Quantifizierungspotentials wurden synthetisiert, indem bekannte Mengen gereinigter PCR-Produkte gemischt und eine in vi-tro-Transkription und Target-Fragmentierung wie oben beschrieben durchgeführt wurde.
Beispiel 4: Hybridisierung
Es wurde keine Prähybridisierung vorgenommen. Die Hybridisierung erfolgte in einem auf die Kundenbedürfnisse zugeschnittenen Aluminiumblock, der als Insert für einen Temperaturgesteuerten Belly Dancer (Stovall Life Sciences Inc., Greensboro, NC, USA) verwendet wurde, der auf maximale Biegung (etwa 10°) eingestellt war. Der Hybridisierungsblock wurde mindestens 30 min lang auf 55°C vorerhitzt, um eine Stabilisierung der Temperatur zu ermöglichen. Ein Eppendorf-Inkubator wurde ebenfalls auf 65°C vorerhitzt. HybriWell (Grace BioLabs) Aufklebe-Hybridi-sierungskammern (200 μΐ im Volumen) wurden auf die die Arrays enthaltenden Abschnitte aufgebracht. Die zusammengefügten Abschnitte, die die oben in Tabelle 1 angegebenen Oligonukleotid-Moleküle aufwiesen, wurden oben auf dem Hybridisierungsblock vorerhitzt. Für jede Hybridisierung wurden 124 μΐ mit DEPC behandeltes Wasser, 2 μΐ 10% SDS, 4 μΐ 50x Denhardt-Reagenz (Sigma), 60 μΐ 20x SSC und 10 μΐ Target-RNA in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen zugegeben und 1-15 min lang bei 65°C inkubiert. Vorgewärmte Hybridisierungsmischungen wurden auf zusammengefügte Abschnitte über die Öffnung in den unteren Positionen aufgetragen (um das Risiko des Einschlusses von Luftbläschen in der Kammer zu minimieren). Die Kammern wurden mit Siegelungs-Spots versiegelt und über Nacht bei 55°C bei einer Zirkulation von 30-40 U/min und maximaler Biegung inkubiert. _
NACHGEREICHT
Nach der Hybridisierung wurden einzelne klebrige („sticky") Kammern entfernt, und die Abschnitte wurden sofort in 2x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur eingetaucht. Die Abschnitte wurden gewaschen, indem sie 5 min lang bei Raumtemperatur in 2x SSC, 0,1% SDS geschüttelt wurden, zweimal 5 min lang in 0,2x SSC, und letztlich 5 min lang in 0,lx SSC. Die Abschnitte wurden einzeln unter Verwendung einer Luftpistole mit einem Wattefilter darinnen getrocknet. Die Abschnitte wurden bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert und am selben Tag gescannt.
Beispiel 5: Scannen und Daten-Analyse
Hybridisierte Abschnitte wurden bei 3 Linien im Durchschnitt, bei 10 pm Auflösung, mit einem GenePix 4000A Laser-Scanner (Axon, Foster City, Kalifornien, USA) bei Wellenlängen von 532 nm und 635 nm auf Cy3 bzw. Cy5 gescannt. Fluoreszierende Bilder wurden als mehrschichtige Tiff-Bilder aufgenommen und mit der GenePix Pro 3.0-Software (Axon) analysiert. Microsoft Excel wurde für die statistische Analyse und zur Präsentation der Ergebnisse verwendet.
Beispiel 6: Protokoll-Optimierung
Eines der Hauptprobleme beim Designen von Oligonukleotid-Mi-kroarrays ist das Erreichen beinahe identischer Schmelztemperaturen für alle Oligonukleotid-Sonden auf dem Array. Ein potentieller Ansatz, um dies zu erreichen, ist die Verwendung von Hybridisierungspuffern, die tertiäre Amin-Salze enthalten. Tetramethylammoniumchlorid (TMAC1) oder Tetraethylammoniumchlorid (TEAC1) wurden erfolgreich angewendet, um eine vom GC-Gehalt unabhängige Hybridisierung auf Nitrocellulose- oder Nylon-Membranen zu ermöglichen. Die derzeitige Schwäche dieses Ansatzes ist, dass der Thermodynamik-Hintergrund fehlt, was es unmöglich macht, die Auswirkungen weiterer Faktoren auf das Verhalten einer gegebenen Oligo-Sonde vorherzusagen. Weiters ist die Wirkung tertiärer Amin-Salze auf die derzeitigen und zukünftigen Ober-flächen-Chemien weitgehend unbekannt. Somit wurde ein anderer Ansatz gewählt, indem Oligos entworfen wurden, die fast identische Schmelztemperaturen in „traditionellen" Hybridisierungspuffern haben sollten.
Viele unabhängige Untersuchungen zeigten, dass sterische Auswirkungen (störender Einfluss des festen Trägers auf die Hybridisierungseigenschaften der immobilisierten Oligos, und sterische Behinderung, die sich aus der Anhäufung immobilisierter | nachgereicht • · • · • · ·· • ·· *· ···# · ·· · · · · · · • · · · · ··· · · • · · ··· · ···· • · · · I · ··· u 29 *·· ·
Oligos ergibt) die Zugänglichkeit immobilisierter Oligonukleo-tid-Sonden ernstlich behindern können. Diese Auswirkungen werden erfolgreich durch die Anwendung von Spacer-Molekülen abgeschwächt. Es zeigte sich, dass ein Ci2-Linker und zusätzliche 5 Thymidin-Reste am 5'-Ende einen optimalen Abstand ergaben; die Zugabe weiterer Thymidin-Reste hatte keine signifikante Auswirkung auf die Hybridisierungskapazität (Zugänglichkeit) der getesteten Oligos. 50% DMSO in dH20 wurde als Print-Puffer gewählt, weil es, anders als wässerige Lösungen, wie 3xSSC- oder Phosphat-Puffer, während der langen Spötter-Runden nicht austrocknete (ein routinemäßiges Spotten von 100 Oligos auf 100 Abschnitte dauert etwa 6 Stunden). Weiters lieferte es gleichförmige Spots auf den Abschnitten. Die Standard-Abweichung in Signal-Intensitäten zwischen Replikat-Spots war 10-15% (gegenüber 20-30% für 3xSSC) . Das Spotten erfolgte mit einer einzigen Nadel, um Variationen, die beim Spotten mit mehreren Nadeln inhärent sind, zu vermeiden. Für die Target-Herstellung wurden mehrere alternative Vorgangsweisen verwendet. Zu diesen zählte das direkte Einarbeiten von mit Cy markierten dNT-Ps in DsDNA während der PCR, das Anwenden eines markierten PCR-Primers für die Erzeugung von dsDNA-Targets, und das Anwenden eines markierten PCR-Primers und eines biotinylierten für die Erzeugung von ssDNA-Targets über die nachfolgende Trennung der beiden Stränge unter Verwendung von mit Streptavidin beschichteten Magnet-Kügelchen. Da die Sekun-där-Struktur des Targets eine sehr signifikante Rolle bei der Bestimmung des mit einer bestimmten Sonde erhältlichen maximalen Hybridisiersignals spielt („Hybridisierungskapazität"), war es unbedingt erforderlich, das Target vor der Hybridisierung zu fragmentieren. Da RNA auf randomisierte Weise über eine chemische Fragmentierung fragmentiert werden kann, beschloss man, RNA-Targets zu verwenden. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von RNA-Targets ist, dass der direkte Einbau der mit Cy markierten Nukleotide durch die T7-RNA-Polymerase sehr effizient ist.
Nur eine vierfache Abnahme wurde in der RNA-Ausbeute beobachtet, wenn 50% des UTP durch Cy3-UTP während der in vitro-Transkripti-on ersetzt wurden. Die erreichten Ausbeuten des Target-Präparats liegen im Bereich von 50 ng/μΐ Konzentration (in 50 μΐ Endvolumen, ausgehend von 8 μΐ 50 ng/μΐ Matrize), wobei jedes 10. bis 12. Nukleotid markiert ist. -------
NACHGEREICHT #
• · #«· ·· ·· ···· ·
• · · • ··· • # &
Die Fragmentierung der Target-RNA zu einer durchschnittlichen Fragment-Größe von 50 nt führte zu einer signifikanten Verstärkung der Hybridisierung. Trotz der Empfindlichkeit der Cy-Farben gegen einen nukleophilen Angriff (wie alkalische Behandlung mit divalenten Kationen, die zur Fragmentierung der RNA verwendet werden), wurde eine Steigerung von über einer Größenordnung bei Cy3-, sowie bei den Cy5-Signalen beobachtet. Weiters verringerte die Fragmentierung in vielen Fällen die Unterschiede zwischen den Hybridisierungskapazitäten von Sonden.
Cy3- und Cy5-Farben wurden wegen der erhältlichen, ziemlich umfangreichen Literatur über das Verhalten dieser Farben verwendet. Es zeigte sich, dass Cy5 sehr wohl eine signifikante Photobleichung während des Scan-Prozesses durchmachte. Somit wurden alle gestarteten Scan-Vorgänge bis zum Ende durchgeführt, um eine selektive Photobleichung von nur einigen der Cy5-Signale auf dem Array auszuschließen.
Hybridisierungsbedingungen wurden gewählt, die ausreichend waren, um die Hybridisierung von sowohl perfekt passenden („perfect match, PM) Targets als auch von Targets mit einer einzigen Fehlpassung („single mismatch", 1MM) zu ermöglichen. Da die Hybridisierung zwischen Oligonukleotiden und jedem anderen Nukleotid ein reversibler Prozess ist, wurden alle Hybridisierungen über Nacht durchgeführt, um eine vollständige Hybridisierung zu gewährleisten. Bei Mikroarray-Hybridisierungen besteht oft das Problem, dass die Hybridisierungslösung sich nicht bewegt und die Diffusion der einzige Prozess ist, der eine gewisse Durchmischung vorsieht. Statistische Fehler im endgültigen Signal sind einem solchen Diffusions-beschränkten System inhärent. Weiters führen solche Umstände gewöhnlich dazu, dass die Ränder von Sonden-Sätzen effizienter hybridisieren, wodurch sich für den Rand des Spots ein relativ starkes Signal und ein viel schwächeres für die Mitte ergibt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein nach den Kundenwünschen modifizierter BellyDancer Labor-Schüttler und klebrige („sticky") Hybridisierungskammern mit signifikant höheren Volumina, als jenen, die zwischen einem Mikroarray und einem traditionellen Deckglas bestehen, verwendet. Die unvermeidlich innerhalb dieser Kammer gebildeten winzigen Bläschen wurden aufgrund der Bewegung des BellyDancers langsam zum Rand hin bewegt, und dies lieferte genügend zusätzliche Durchmischung, um über den gesamten Mikroar-
NACHGEREICHT ** · ·· ·· ···· · ········· · • · · · · · · ··· · · • · · · · ·«· · ···· • · · · · · · · ·· ··· Μ 2Q* -5·· * ray eine angemessen gleichförmige Hybridisierung vorzusehen.
Standard-Abweichungen von Ergebnissen für (Triplikat-)Spots einzelner Sonden waren 3% bis 30% zwischen parallelen Abschnitten, die mit parallel zubereiteten Targets hybridisiert waren.
Beispiel 7: Allgemeiner Überblick über den Sondensatz-Ent-wurf und die Validierung für die vorliegende Erfindung
Der am meisten kritische Schritt des Sonden-Entwurf-Prozes-ses für die praktische Optimierung ist die Feinabstimmung des Sondensatzes in einer Form, dass alle Sonden im Satz ein möglichst identisches Hybridisierungsverhalten zeigen. In einer ersten Stufe wurde versucht, Oligonukleotide mit vorhergesagten Schmelztemperaturen (gemäß dem „nearest neighbour"-Modell) von 60+2°C zu entwerfen. Mit den derzeitigen Modellen sind jedoch nur Schmelztemperaturen in Lösung vorhersagbar.
Das Hybridisierungsverhalten von Oligonukleotid-Sonden, die an einer festen Oberfläche immobilisiert sind, hängt von mehreren Faktoren ab: (i) Länge, GC-Gehalt und exakte Sequenz der Sonde. Diese werden gemeinsam berücksichtigt, wenn man die Tm für die Oligos vorhersagt, indem man die Methode des „nearest neighbour" verwendet . (ii) Position von GC- und AT-Paaren. Die Mitte der Sonde ist wichtiger bei der Stabilisierung der Hybridisierung. Eine Sonde, in welcher die Mitte alle Gs und Cs enthält, bindet stärker an ihr Targets als eine andere mit einer homogenen GC-Verteilung (aber mit identischer Länge und GC-Gehalt). (iii) Sekundär-Strukturen der Sonde und des entsprechenden Targets. Wenn eine von diesen beiden von signifikanter Stärke ist, im Vergleich zur Stärke der Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Target, wird ein signifikantes Abfallen der Hybridisierungs-Effizienz erwartet. (iv) Das genaue Wesen der überhängenden Nukleotide am Target (Nukleotide unmittelbar neben dem von der Sonde angepeilten Bereich) . Dies kommt vom „nearest neighbour"-Modell, wird jedoch normalerweise nicht ausgewiesen, weil die Überhänge der Target-Sequenz nicht berücksichtigt werden. (v) Anzahl und Art der Fehlpassungen. Einige Fehlpassungen haben nur eine geringe, während andere eine sehr stark destabilisierende Wirkung haben. (vi) Position der Fehlpassungen. Fehlpassungen in der Mitte
NACHGEREICHT ·· • · ·· • · • · ·· ··· • · • · ·· ···· • · • ··· ··· · • · *-· 3T -#· • · ···· sind mehr destabilisierend als Fehlpassungen an Endpositionen. (vii) Faktoren, die sich daraus ergeben, dass die Sonden immobilisiert sind. Sterische Auswirkungen können die Bildung von Hybriden zwischen dem Target und der gebundenen Sonde behindern. Diese Auswirkung ist am immobilisierten Ende der Sonde viel stärker. Somit spielt das gebundene Ende der Sonde eine geringere Rolle bei der Hybridisierung als das freie Ende. Dies gilt für die Punkte 2 und 6. (viii) Die Hybridisierung zwischen DNA-Oligos und RNA-Fragmenten, wie im vorliegenden Fall, hat eine geringfügig andere Thermodynamik wie jene der DNA-DNA-Hybridisierung.
Auf Basis der obigen Kriterien, anfänglicher Ergebnisse vom Testen des Hybridisierverhaltens unserer Sonden, und veröffentlichter Daten wurde ein Satz einfacher Regeln erzeugt, welcher die Vorhersage des Hybridisierverhaltens der Sonden signifikant verbesserte. Diese Regeln sind: (i) U->C-Veränderungen in der Target-Sequenz führen zu einer rG-dT-Bindung, die beinahe so stark ist wie die ursprüngliche rA-dT-Bindung (für Fälle mit perfekter Passung). Diese werden nicht als Fehlpassungen angesehen. (ii) G->A-Veränderungen in der Target-Sequenz führen zu einer rü-dG-Bindung, die beinahe so stark ist wie die ursprüngliche rC-dG-Bindung (für Fälle mit perfekter Passung). Diese Fehlpassungen werden nur berücksichtigt, wenn sie zusammen mit anderen Arten von Fehlpassungen vorliegen. (iii) Fehlpassungen in den Endpositionen werden nicht berücksichtigt. Fehlpassungen angrenzend an die Endpositionen werden nur berücksichtigt, wenn sie zusammen mit anderen Arten von Fehlpassungen vorliegen. (iv) Wenn der Großteil des GC-Gehalts einer Sonde nahe dem 5'-(immobilisierten) Ende ist, weist die Sonde eine signifikant niedrigere Schmelztemperatur auf als ursprünglich vorhergesagt. Wenn das 3'-Nukleotid ein G oder C ist, wird es auf dieselbe Weise angesehen. (v) Sonden mit starken Haarnadel-Strukturen (deltaG >= 2,0) wurden als eine zusätzliche Fehlpassung zum Target aufweisend angesehen.
I NACHGEREICHT (vi) Sonden mit hohem GC-Gehalt, deren Länge kürzer als 17 Nukleotide ist, zeigen unter den angewandten Vexsjuchsbedingungen ein unverlässliches Hybridisierungsverhalten.
Claims (33)
- • · • · • · • · ·· ·· • · • · •Λ ·· ·«·· • · • ··· ··· · 32 L··· • · ' ···· Patentansprüche; 1. Satz von Oligonukleotid-Molekülen für Salmonella-Serotypisierung, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonu-kleotid-Molekül für das gyrB-Gen spezifisch ist, mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das atpD-Gen spezifisch ist, mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das fliC-Gen spezifisch ist, und mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das fljB-Gen spezifisch ist.
- 2. Satz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oli-gonukleotid-Moleküle für bis zu 30 Nukleotide lange Regionen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens spezifisch sind.
- 3. Satz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle Gen-Sequenzen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens entsprechen, die sich an den Positionen dieser Gene befinden, die für die SEQ ID Nr. 1 bis 193 angegeben sind.
- 4. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle diagnostische Nukleotide umfassen, welche verschiedene Serotypen von Salmonella unterscheiden.
- 5. Satz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die diagnostischen Nukleotide ausgewählt sind aus den unterstrichenen Nukleotiden, die in den SEQ ID Nr. 1 bis 193 angeführt sind.
- 6. Satz nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich spezifische Regionen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens auf der 5'-Ende-Hälfte dieser Gene oder dem zentralen Teil dieser Gene befinden.
- 7. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er 1 bis 4 nicht-diagnostische Fehlpassungen aufweist.
- 8. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich net, dass die Oligonukleotid-Moleküle ausgewählt sind aus der NACHGEREICHT Gruppe der SEQ ID Nr. 1 bis 193.
- 9. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle komplementär und/oder in umgekehrter Reihenfolge zu Oligonukleotiden vorliegen, die aus der Gruppe der SEQ ID Nr. 1 bis 193 ausgewählt sind.
- 10. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle, vorzugsweise an ihrem 5’-Ende befestigt, Spacer-Moleküle aufweisen.
- 11. Satz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer-Moleküle einen C-Linker, vorzugsweise einen C5- bis C20-Linker, aufweisen.
- 12. Satz nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer-Moleküle weiters Thymidin-Reste, vorzugsweise 2 bis 10 Thymidin-Reste, aufweisen.
- 13. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle mit einem Marker markiert sind.
- 14. Fester Träger, dadurch gekennzeichnet, dass er an seiner Oberfläche immobilisiert den Satz der Oligonukleotid-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 13 aufweist.
- 15. Eester Träger nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Abschnitt, einer Membran, einer Säule, Kügelchen und einer Platte.
- 16. Fester Träger nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Mikroarray der Oligonukleotid-Moleküle aufweist.
- 17. Fester Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle in Spots an der Oberfläche immobilisiert sind.
- 18. Fester Träger nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, NACHGEREICHT ·· ♦ ·· ♦· ···· · • #··· · » t · I t · · · · ♦ · M# t I • · · · · ··· » ···· • # · * · · · · ·· ··· m± *.·· · dass identische Oligonukleotid-Moleküle in einem Spot immobilisiert sind.
- 19. Fester Träger nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass er auch Spots mit Fehlpassungs-Gegenpaaren zu Spots mit Oligonukleotid-Molekülen, die für Salmonella-Gene spezifisch sind, inkludiert.
- 20. Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Satz von Oligonukleotid-Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, vorzugsweise in Spots, an der Oberfläche des festen Trägers immobilisiert werden.
- 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Satz mit einer einzigen Nadel auf die Oberfläche aufgespottet wird.
- 22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Spotten mit einem Print-Puffer, vorzugsweise mit DMSO in H20, durchgeführt wird.
- 23. Verfahren zur Serotypisierung von Salmonella in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte aufweist: - Amplifizieren der gyrB-, atpD-, fliC- und fljB-Gene von Salmonella in der Probe, - Zugeben des amplifizierten Produkts zum festen Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 19, - Durchführen eines Hybridisierungsschrittes zum Hybridisieren von Nukleinsäure-Molekülen aus dem amplifizierten Produkt mit den immobilisierten Oligonukleotid-Molekülen, vorzugsweise gefolgt von mindestens einem Wasch-Schritt, - Detektieren von Hybridisierungs-Produkten, wobei ein Hybridisierungs-Produkt das Vorhandensein eines der Serotypen in der Probe zeigt.
- 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels PCR erfolgt.
- 25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeich- NACHGEREICHT net, dass Nukleinsäure-Moleküle aus einem spezifischen Salmonella-Serotyp mit Oligonukleotid-Molekülen hybridisieren, die in einer definierten Region, vorzugsweise in einem definierten Spot, dieser Oberfläche immobilisiert sind.
- 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe durch Isolieren, Reinigen und/oder Amplifizieren von Nukleinsäure-Molekülen von Salmonella vorbehandelt wird.
- 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Moleküle von Salmonella oder das amplifizierte Produkt fragmentiert werden, vorzugsweise zu einer Größe von 30 bis 70, vorzugsweise 45 bis 55, Nukleotiden.
- 28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch ge kennzeichnet, dass die Probe RNA-Moleküle von Salmonella aufweist. 1
- 29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Moleküle von Salmonella markiert sind, vorzugsweise mit Cy3 bzw. Cy5.
- 30. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsschritt unter Bedingungen durchgeführt wird, die eine perfekte Passung und eine einzige Fehlpassungs-Hybridisierung erlauben.
- 31. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsschritt über Nacht, vorzugsweise unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung, durchgeführt wird.
- 32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsschritt in einer klebrigen („sticky") Hybridisierungskammer durchgeführt wird.33. Verfahren zur Serotypisierung von Salmonella in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte aufweist: - Amplifizieren von Fragmenten der gyrB-, atpD-, fliC- und fljB- NACHGEREICHT Gene von Salmonella in der Probe mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden aus dem Satz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, - Detektieren von PCR-Produkten, wobei ein PCR-Produkt das Vorhandensein eines der Serotypen in der Probe anzeigt. PW/fm NACHGEREICHT R 45603 32 A 1076/2005 - 2 Patentansprüche: 1. Satz von Oligonukleotid-Molekülen für Salmonella-Serotypisierung, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonu-kleotid-Molekül für das gyrB-Gen spezifisch ist, mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das atpD-Gen spezifisch ist, mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das fliC-Gen spezifisch ist, und mindestens ein Oligonukleotid-Molekül für das fljB-Gen spezifisch ist. 2. Satz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oli-gonukleotid-Moleküle für bis zu 30 Nukleotide lange Regionen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens spezifisch sind. 3. Satz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle Gen-Sequenzen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens entsprechen, die sich an den Positionen dieser Gene befinden, die für die SEQ ID Nr. 1 bis 193 angegeben sind. 4. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle diagnostische Nukleotide umfassen, welche verschiedene Serotypen von Salmonella unterscheiden . 5. Satz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die diagnostischen Nukleotide ausgewählt sind aus den unterstrichenen Nukleotiden, die in den SEQ ID Nr. 1 bis 193 angeführt sind. 6. Satz nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich spezifische Regionen des gyrB-Gens, des atpD-Gens, des fliC-Gens oder des fljB-Gens auf der 5'-Ende-Hälfte dieser Gene oder dem zentralen Teil dieser Gene befinden. 7. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er 1 bis 4 nicht-diagnostische Fehlpassungen aufweist. 8. net, Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich-dass die Oligonukleotid-Moleküle aus gewallt sind--aus dej?- NACHGEREICHT• · • ♦ ♦ • · · • ♦ ♦ • · ♦ R 45603 33 A 1076/2005 - 2 Gruppe der SEQ ID Nr. 1 bis 193. 9. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle komplementär und/oder in umgekehrter Reihenfolge zu Oligonukleotiden vorliegen, die aus der Gruppe der SEQ ID Nr. 1 bis 193 ausgewählt sind. 10. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle, vorzugsweise an ihrem 5'-Ende befestigt, Spacer-Moleküle aufweisen. 11. Satz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer-Moleküle einen C-Linker, vorzugsweise einen C5- bis C20-Linker, aufweisen. 12. Satz nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer-Moleküle weiters Thymidin-Reste, vorzugsweise 2 bis 10 Thymidin-Reste, aufweisen. 13. Satz nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle mit einem Marker markiert sind. 14. Fester Träger, dadurch gekennzeichnet, dass er an seiner Oberfläche immobilisiert den Satz der Oligonukleotid-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 13 aufweist. 15. Fester Träger nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Objektträger, einer Membran, einer Säule, Kügelchen und einer Platte. 16. Fester Träger nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Mikroarray der Oligonukleotid-Moleküle aufweist. 17. Fester Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Moleküle in Spots an der Oberfläche immobilisiert sind. R 45603 34 A 1076/2005 - 2 18. Fester Träger nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass identische Oligonukleotid-Moleküle in einem Spot immobilisiert sind. 19. Fester Träger nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass er auch Spots mit Fehlpassungs-Gegenpaaren zu Spots mit Oligonukleotid-Molekülen, die für Salmonella-Gene spezifisch sind, inkludiert. 20. Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Satz von Oligonukleotid-Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, vorzugsweise in Spots, an der Oberfläche des festen Trägers immobilisiert werden. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Satz mit einer einzigen Nadel auf die Oberfläche aufgespottet wird. 22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Spotten mit einem Print-Puffer, vorzugsweise mit DMSO in H20, durchgeführt wird. 23. Verfahren zur Serotypisierung von Salmonella in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte aufweist: - Amplifizieren der gyrB-, atpD-, fliC- und fljB-Gene von Salmonella in der Probe, - Zugeben des amplifizierten Produkts zum festen Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 19, - Durchführen eines Hybridisierungsschrittes zum Hybridisieren von Nukleinsäure-Molekülen aus dem amplifizierten Produkt mit den immobilisierten Oligonukleotid-Molekülen, vorzugsweise gefolgt von mindestens einem Wasch-Schritt, - Detektieren von Hybridisierungs-Produkten, wobei ein Hybridisierungs-Produkt das Vorhandensein eines der Serotypen in der Probe zeigt. 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels PCR erfolgt. | NACHGEREICHT R 45603 35 A 1076/2005 - 2 25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass Nukleinsäure-Moleküle aus einem spezifischen Salmonella-Serotyp mit Oligonukleotid-Molekülen hybridisieren, die in einer definierten Region, vorzugsweise in einem definierten Spot, dieser Oberfläche immobilisiert sind. 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe durch Isolieren, Reinigen und/oder Amplifizieren von Nukleinsäure-Molekülen von Salmonella vorbehandelt wird. 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Moleküle von Salmonella oder das amplifizierte Produkt fragmentiert werden, vorzugsweise zu einer Größe von 30 bis 70, vorzugsweise 45 bis 55, Nukleotiden. 28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass RNA-Moleküle der Salmonella Probe detektiert werden. 29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Moleküle von Salmonella markiert sind, vorzugsweise mit Cy3 bzw. Cy5. 30. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsschritt unter Bedingungen durchgeführt wird, die eine perfekte Passung und eine einzige Fehlpassungs-Hybridisierung erlauben. 31. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsschritt über Nacht, vorzugsweise unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung, durchgeführt wird. 32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsschritt in einer klebrigen („sticky") Hybridisierungskammer durchgeführt wird.
- 33. Verfahren zur Serotypisierung von Salmonella in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schrittexaufweist: NACHGEREICHT R 45603 36 Ά 1076/2005 - 2 - Amplifizieren von Fragmenten der gyrB-, atpD-, fliC- und fljB-Gene von Salmonella in der Probe mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden aus dem Satz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, - Detektieren von PCR-Produkten, wobei ein PCR-Produkt das Vorhandensein eines der Serotypen in der Probe anzeigt. NACHGEREICHT
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT10762005A AT502067B1 (de) | 2005-06-27 | 2005-06-27 | Salmonella-serotypisierung |
| EP06450087A EP1739193A3 (de) | 2005-06-27 | 2006-06-26 | Serotypisierung von Salmonella |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT10762005A AT502067B1 (de) | 2005-06-27 | 2005-06-27 | Salmonella-serotypisierung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| AT502067A1 true AT502067A1 (de) | 2007-01-15 |
| AT502067B1 AT502067B1 (de) | 2007-10-15 |
Family
ID=37114415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| AT10762005A AT502067B1 (de) | 2005-06-27 | 2005-06-27 | Salmonella-serotypisierung |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1739193A3 (de) |
| AT (1) | AT502067B1 (de) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1975253A1 (de) * | 2007-03-30 | 2008-10-01 | Institut Pasteur | Verfahren zur Unterscheidung der Spezies der Familie Enterobacteriaceae durch Genotypisierung und Anwendungsmöglichkeiten dafür |
| WO2010133257A1 (en) * | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Fondazione Parco Tecnologico Padano | Method for detection and identification of bacterial strains belonging to the classes escherichia coli, salmonella, campylobacter and listeria |
| EP2633082B1 (de) * | 2010-10-26 | 2018-08-15 | The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Schnelles salmonellen-serotypisierungsassay |
| US9115408B2 (en) | 2010-10-26 | 2015-08-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Rapid Salmonella serotyping assay |
| WO2012145557A1 (en) * | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for detecting and identifying salmonella enterica strains |
| US10287638B2 (en) | 2014-03-26 | 2019-05-14 | Texas Tech University System | Molecular discrimination of regulated and non-regulated Salmonella serotypes |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0409159B1 (de) * | 1989-07-18 | 1998-11-25 | Shimadzu Corporation | Verfahren zur Untersuchung von durch Mikroorganismen verursachten Lebensmittelvergiftungen und Reagens dafür |
| CA2307010A1 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-19 | Infectio Diagnostic (I.D.I.) Inc. | Highly conserved genes and their use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes and amplification primers to rapidly detect and identify bacterial,fungal and parasitical pathogens from clinical specimens for diagnosis |
| US6087104A (en) * | 1997-03-24 | 2000-07-11 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides for detection of Bacillus cereus group bacteria harmful to mammals, and method of detection with the oligonucleotides |
| US20020146697A1 (en) * | 1997-12-12 | 2002-10-10 | Satoshi Yamamoto | Method for identification and detection of microorganisms using gyrase gene as an indicator |
| AUPP363498A0 (en) * | 1998-05-21 | 1998-06-11 | University Of Sydney, The | Antigens and their detection |
-
2005
- 2005-06-27 AT AT10762005A patent/AT502067B1/de not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-06-26 EP EP06450087A patent/EP1739193A3/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AT502067B1 (de) | 2007-10-15 |
| EP1739193A2 (de) | 2007-01-03 |
| EP1739193A3 (de) | 2007-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AT503862B1 (de) | Pathogen-identifizierung anhand eines 16s oder 18s-rrna mikroarray | |
| DE3486467T2 (de) | Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren | |
| EP2776585B1 (de) | Bifunktionale oligonukleotidsonde zur universellen echtzeit multianalyt detektion | |
| Van Doorn et al. | Quantitative multiplex detection of plant pathogens using a novel ligation probe-based system coupled with universal, high-throughput real-time PCR on OpenArrays™ | |
| CN102844445A (zh) | 增强的多重fish | |
| EP2188397A1 (de) | Verfahren zum nachweis von bakterien und pilzen | |
| KR20150139582A (ko) | 나노파티클-지원 신호 증폭을 이용한 rna 마이크로칩 검출 | |
| AU2015215750B2 (en) | Nucleic acid detection or quantification method using mask oligonucleotide, and device for same | |
| DE69019393T2 (de) | Nukleinsäure-Sonde zum Nachweis von humanen Salmonella Pathogenen. | |
| DE102007036678B4 (de) | Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion | |
| DE60133321T2 (de) | Methoden zur Detektion des mecA Gens beim methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus | |
| AT502067B1 (de) | Salmonella-serotypisierung | |
| Herrera et al. | Pursuing new periodontal pathogens with an improved RNA-oligonucleotide quantification technique (ROQT) | |
| Satokari et al. | Multiplexed quantification of bacterial 16S rRNA by solution hybridization with oligonucleotide probes and affinity capture | |
| EP1397518A2 (de) | Verfahren zum spezifischen schnellnachweis von trinkwasser relevanten bakterien | |
| EP3673075B1 (de) | Verfahren zum spezifischen nachweis von mikroorganismen | |
| DE19934510B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen | |
| WO2003083131A1 (de) | Verfahren zum nachweis von mikroorganismen mittels in situ-hybridisierung und durchflusszytometrie | |
| EP1335991B1 (de) | Verfahren zum nachweis von protozoen der gattung naegleria | |
| AT6635U1 (de) | Oligonukleotid-set | |
| WO2002064824A2 (de) | Oligonukleotidsonden zur detektion von parodontopathogenen bakterien mittels in situ-hybridisierung | |
| Boateng et al. | Novel stem–loop probe DNA arrays: Detection of specific acetotrophic 16S ribosomal RNA signatures | |
| WO2005071108A2 (de) | Verfahren zur geno- und pathotypisierung von pseudomonas aeruginosa | |
| EP1723254A1 (de) | Qualitätssicherungssystem zum nachweis von mikroorganismen | |
| WO2024231269A1 (de) | Enzymsubstrat für die detektion von shigatoxin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EIH | Change in the person of patent owner | ||
| EIH | Change in the person of patent owner | ||
| MM01 | Lapse because of not paying annual fees |
Effective date: 20150627 |