AT515576A1 - Methode zur in vitro Diagnose des Grades an Geistesschwäche im Down-Syndrom - Google Patents

Abstract

Offenbart ist ein Verfahren zur in vitro Diagnose des Grads der mentalen Behinderung im Zusammenhang mit dem Down-Syndrom (DS) in Hirngewebeproben, dadurch gekennzeichnet, dass die vorliegende Menge an Dopaminrezeptor 1-Komplex (DR1-Komplex) bestimmt und mit der in einer Kontrollgewebeprobe vorliegenden Menge verglichen wird, die von einem Individuum erhalten wurde, das nicht an dem DS leidet, wobei eine reduzierte Menge an DR1-Komplex mit dem Grad der mentalen Behinderung korreliert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose undTherapie von Patienten, die am Down-Syndrom (DS) leiden.

Beim Down-Syndrom, das ebenfalls unter der Bezeichnung Triso¬mie 21 bekannt ist, handelt es sich um eine genetische Erkrankung,die durch das Vorhandensein einer vollständigen oder unvollständi¬gen dritten Kopie des 21. Chromosoms hervorgerufen wird. Die Er¬krankung ist typischerweise mit einer Verzögerung des körperlichenWachstums, charakteristischen Gesichtszügen sowie einer schwachenbis mäßigen intellektuellen Behinderung assoziiert.

Die Identifikation des Down-Syndroms ist bereits im Verlaufder Schwangerschaft mittels pränataler Diagnostik und anschließen¬der diagnostischer Tests oder nach der Geburt anhand von direktenBeobachtungen und genetischen Tests möglich.

Im fetalen und adulten Gehirn von DS-Patienten kommt es zu ei¬ner Reihe von Proteinveränderungen [1], jedoch weisen diese Er¬kenntnisse entweder nicht den Weg zu neuen experimentellen Behand¬lungen oder sie wurden lediglich in den Gehirnen erwachsener DS-Patienten beobachtet. In den Gehirnen adulter DS-Patienten kommtes ab dem 40. Lebensjahr unweigerlich zu pathologischen Verände¬rungen, die der Alzheimer-Krankheit recht ähnlich sind. Daher istes nicht möglich, Veränderungen hinsichtlich der Proteinexpressionin einem Erwachsenen eindeutig dem Down-Syndrom zuzuordnen [2].

Granholm et al. stellten die Hypothese auf, dass das choliner-ge System an Defiziten des Gehirns beteiligt sei, die in Tiermo¬dellen des DS beobachtet wurden. Des Weiteren wurden jeweils vonWang et al. eine wahrscheinliche Beteiligung des Glutamatrezeptorssowie von Scott- McKean und Costa, Altafaj et al., Siddiqui et al.und Rueda et al. eine wahrscheinliche Beteiligung des NMDA-Rezep-torsystems angedeutet. Der Nachweis des Wirkens von GABAergen Me¬chanismen in der Pathologie des DS stammte von Best et al., Kle-schevnikov et al., Martinez-Cue et al. und Braudeau et al., denenes gelang zu zeigen, dass kognitive Defizite in einem Tiermodelldes DS durch das spezifische Targeting der Alpha-5-Untereinheitdes GABA-A-Rezeptors durch einen selektiven inversen Agonisten be¬hoben werden konnten [8, 9].

Es hat sich mittlerweile erwiesen, dass durch gezielte Förde¬rung und geeignete Betreuung eine Verbesserung der Lebensqualitätvon DS-Patienten möglich ist. Einige Kinder, die am Down-Syndromleiden, werden in herkömmlichen Schulklassen unterrichtet, während andere wiederum einer spezielleren Förderung bedürfen. Einige DS-Patienten schließen erfolgreich die Sekundarschule (High School)ab, und einzelne absolvieren sogar weiterführende Ausbildungsgän¬ge. Im Erwachsenenalter gehen in den Vereinigten Staaten etwa 20%in bestimmter Form einer bezahlten Arbeit nach, wobei viele vonihnen eine betreute Arbeitsumgebung benötigen. Unterstützung infinanziellen und rechtlichen Belangen ist in vielen Fällen erfor¬derlich. In den Industrieländern sowie unter Voraussetzung einerangemessenen Gesundheitsversorgung liegt die durchschnittliche Le¬benserwartung für DS-Patienten zwischen etwa 50 und 60 Jahren.

Der durchschnittliche IQ eines jungen, am Down-Syndrom er¬krankten Erwachsenen liegt bei 50, entspricht also etwa dem menta¬len Reifegrad eines 8- bis 9-jährigen Kindes, allerdings gibt eshier große Unterschiede. Bei den meisten am Down-Syndrom erkrank¬ten Personen findet sich eine leichte (IQ: 50-70) oder mäßige (IQ:35-50) intellektuelle Behinderung, in einigen Fällen ist diese je¬doch auch sehr ausgeprägt (IQ: 20-35). Personen mit Mosaik-Triso¬mie 21 verfügen typischerweise über einen um 10 bis 30 Punkte hö¬heren IQ. Mit zunehmendem Alter nimmt die Leistungsfähigkeit vonDS-Patienten im Vergleich zu ihren Altersgenossen immer stärkerab. Manche können ab einem Alter von 30 Jahren etwa ihre Fähigkeitzu sprechen verlieren. Dieses Syndrom ist für etwa ein Drittel derFälle von intellektueller Behinderung verantwortlich.

Im Allgemeinen ist das Sprachverständnis von DS-Patienten bes¬ser ausgeprägt als ihre Fähigkeit, selbst zu sprechen. Zwischen 10und 45 Prozent der DS-Patienten stottern entweder oder sprechensehr schnell und undeutlich, weshalb es schwer ist, sie zu verste¬hen. Typischerweise sind ihre sozialen Fähigkeiten verhältnismäßiggut ausgebildet. Verhaltensprobleme stellen bei dieser Erkrankunglängst kein so großes Problem dar, wie dies bei anderen mit intel¬lektueller Behinderung assoziierten Syndromen oftmals der Fallist. Bei Kindern mit dem Down-Syndrom kommt es bei beinahe 30% zupsychischen Erkrankungen, wobei 5 bis 10% an Autismus leiden. Men¬schen mit dem Down-Syndrom verfügen über ein sehr breites emotio¬nales Spektrum. Zwar sind sie im Allgemeinen fröhlich, jedoch kön¬nen sich im frühen Erwachsenenalter Symptome von Depressionen undAngstzuständen entwickeln.

Bei Kindern und Erwachsenen mit dem Down-Syndrom besteht einerhöhtes Risiko für epileptische Anfälle, die bei 5 bis 10% der

Kinder sowie bei bis zu 50% der Erwachsenen auftreten. Darin ein¬geschlossen ist auch ein erhöhtes Risiko für eine spezielle Artvon Anfällen, die als infantile Spasmen bezeichnet werden. Beivielen (15%) der DS-Patienten, die 40 Jahre oder älter werden,entwickelt sich eine Demenz vom Typ der Alzheimer-Krankheit. Beiden DS-Patienten, die 60 Jahre oder älter werden, tritt dieseKrankheit in 50 bis 70% auf.

Es sind Verfahren zur Verbesserung der kognitiven Entwicklungvon DS-Patienten verfügbar. So können z. B. Hörhilfen oder andereakustische Verstärkungsvorrichtungen bei den Patienten mit geschä¬digtem Gehör zweckmäßig für ein Erlernen der Sprache sein. Aucheine Sprachtherapie kann dienlich sein und es wird empfohlen, etwaim Alter von 9 Monaten mit einer solchen Therapie zu beginnen. Dadie DS-Patienten typischerweise über eine gute Hand-Augen-Koordi-nation verfügen, kann unter Umständen auch das Erlernen einer Zei¬chen- und Gebärdensprache möglich sein. Augmentative und alterna¬tive Kommunikationsmethoden, wie z. B. Deuten und Zeigen, Körper¬sprache, Objekte oder Bilder, werden oftmals zur Unterstützung derKommunikation verwendet, auch wenn hierfür wenig konkrete Nachwei¬se vorliegen. Verhaltensproblemen und psychischen Erkrankungenwird typischerweise mit therapeutischen und medikamentösen Ansät¬zen begegnet.

Auch Förderprogramme vor dem Eintritt ins Schulalter könnenzweckmäßig sein. Schulkinder, die an dem Down-Syndrom leiden, kön¬nen von einer integrierten Ausbildung profitieren (d. h. Klassenmit Schülern gleichen Alters aber unterschiedlicher Fähigkeiten),sofern der Lehrplan in geeigneter Weise angepasst wird. Dies istjedoch bei weitem nicht eindeutig erwiesen. In den VereinigtenStaaten fordert der Individuals with Disabilities Education Actvon 1975, dass Schüler mit Down-Syndrom im Allgemeinen an öffent¬lichen Schulen zugelassen werden.

Dem entsprechend gibt es viele unterschiedliche Grade des Dow-n-Syndroms, insbesondere im Hinblick auf die mentalen oder intel¬lektuellen Fähigkeiten. Es gibt zwar Trainingsmethoden zur Förde¬rung dieser Fähigkeiten, jedoch kann ein beträchtlicher Teil dermit dem Down-Syndrom assoziierten intellektuellen Behinderung al¬lem Anschein nach nicht durch die im Stand der Technik vorgeschla¬genen herkömmlichen Verfahren verbessert werden.

Es ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein diagnosti- sches und explanatives Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen, mitdem eine verbesserte Diagnose des Risikos einer mentalen oder in¬tellektuellen Behinderung in Patienten mit dem Down-Syndrom mög¬lich ist, und zwar sowohl im Rahmen wissenschaftlicher Erforschungvon Probenmaterial aus dem Hirngewebe als auch in der in vivo Dia¬gnostik. Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfin¬dung, auf Grundlage solcher explanativer Hilfsmittel neue Strate¬gien zur individuellen Behandlung von DS-Patienten zur Verfügungzu stellen, um deren mentale und intellektuelle Fähigkeiten zuverbessern.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zurin vitro Diagnose des Grads der mentalen Behinderung im Zusammen¬hang mit dem Down-Syndrom (DS) in Hirngewebeproben zur Verfügung,das dadurch gekennzeichnet ist, dass die vorliegende Menge an Do¬paminrezeptor 1-Komplex (DRl-Komplex) bestimmt und mit der in ei¬ner Kontrollgewebeprobe vorliegenden Menge verglichen wird, dievon einem Individuum erhalten wurde, das nicht an DS leidet, wobeieine reduzierte Menge an DRl-Komplex mit dem Grad der mentalen Be¬hinderung korreliert.

Die wesentlichen Veränderungen der Rezeptoren im Gehirn vonDS-Patienten erfordern unter Umständen experimentelle Behandlungenmit den jederzeit verfügbaren entsprechenden Rezeptoragonistenoder -antagonisten. Daten bezüglich der Rezeptorexpression sindderzeit jedoch nur in begrenzter Anzahl verfügbar. Florez et al.führten eine autoradiographische Studie an muskarinischen Acetyl-cholinrezeptoren im Mittelhirn zweier am DS leidender Kleinkinderdurch und schlugen ein cholinerges Defizit vor [3] . Im Gegensatzhierzu schlossen die von Bar-Peled et al. vorgelegten Ergebnissekein muskarinerges Defizit in fetalen DS-Gehirnen ein. Bar-Peledet al. führten eine autoradiographische Studie bezüglich der Dich¬te des 5-Hydroxytryptaminrezeptors 1A (5-HTiÄ) durch und stellteneine erhöhte Rezeptordichte in zwei fetalen DS-Gehirnen fest [4]Deutsch et al. beschrieben ein mögliches Nikotinrezeptordefizit,das mit einer reduzierten Aktivität des nikotinergen Acetylcholin-rezeptors a7 in fetalen DS-Gehirnen in Verbindung steht, die mitder Gegenwart von A-beta-Peptid 1-42 assoziiert ist, das von demamyloiden Vorläuferprotein abgeleitet ist, das durch ein auf dem21. Chromosom lokalisiertes Gen kodiert wird [5]. Abgesehen vonden vorstehend genannten an Patienten durchgeführten Studien lie- gen keinerlei Beweise für eine Beteiligung von zentralen Rezepto¬ren an den beim DS beobachteten Defiziten des Gehirns vor. In zweiFachartikeln wurde allerdings auf der Grundlage von aus Tiermodel¬len des DS erhaltenen Ergebnissen die Anwendung der Modifikationvon Rezeptoren als eine mögliche experimentelle Therapie vorge¬schlagen [6, 7] .

Basierend auf den derzeitigen Erkenntnissen auf dem Gebiet derPathobiologie von Rezeptoren in Tiermodellen und im Menschen wur¬den daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung die bedeutendstenRezeptorsysteme in fetalen DS-Gehirnen bewertet. Es war möglich,Veränderungen auf der Ebene der Zellrezeptoren anstelle der Ebeneder Rezeptoruntereinheiten zu zeigen, da die Assemblierung von Re¬zeptoren zur Bildung von Rezeptorkomplexen zur Ausführung von Ge¬hirnfunktionen führt. Es wurde ein gelbasierter proteomischer An¬satz verwendet, um die Rezeptorkomplexe der Klassen von NMDA-Re-zeptoren, AMPA-Rezeptoren, 5-Hydroxytryptamin-Rezeptoren, nikoti-nergen Acetylcholinrezeptoren und Dopaminrezeptoren zu quantifi¬zieren. Der den Dopaminrezeptor 1 enthaltende Komplex wurde mit¬tels Massenspektrometrie identifiziert und es wurden abweichendeMengen an den DR1 enthaltenden Komplexen sowohl in weiblichen alsauch in männlichen DS-Gehirnen beobachtet.

In der Tat wurde ein DRl-Defizit in fetalen DS-Gehirnen fest¬gestellt, das die Grundlage sowie die Erfordernis für eine experi¬mentelle Behandlung mit einem aus der Reihe der verfügbaren undhinreichend etablierten spezifischen Dopaminrezeptoragonisten dar¬stellen kann.

In früheren Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Untereinhei¬ten von Hirnrezeptoren wurde bereits die Bedeutung dieser signal¬gebenden Verbindungen bezüglich des Down-Syndroms gezeigt. Es la¬gen jedoch im Stand der Technik keine Beweise im Hinblick auf Ver¬änderungen der Rezeptorkomplexe vor. Unter Anwendung eines nati¬ven, gelbasierten, immunchemischen Verfahrens zur Bestimmung dervorliegenden Mengen der hauptsächlichen Hirnrezeptorkomplexe inden Gehirnen von DS-Patienten wurde im Rahmen der vorliegenden Er¬findung gezeigt, dass die Veränderungen der Rezeptorkomplexspiegelein Rezeptorkomplexmuster in den kortikalen Hirnregionen von DS-Patienten und den entsprechenden Kontrollpersonen ergeben, das in¬dikativ für das Ausmaß des Gehirndefizits ist, insbesondere fürdas Ausmaß einer Beeinträchtigung der kognitiven Funktionen, und das mit einem schwächeren oder stärkeren Ausmaß des DS in Verbin¬dung gebracht werden kann. Diese Gehirndefekte sind, so wie vieleandere Faktoren, in unterschiedlichen DS-Patienten äußerst unter¬schiedlich ausgeprägt. Bisher stehen jedoch noch keine Mittel zurBestimmung derartiger Unterschiede zur Verfügung. Mit der vorlie¬genden Erfindung ist es nunmehr nicht nur möglich, den Grad derBeeinträchtigung der kognitiven Funktionen in Hirngewebeproben zuklassifizieren (basierend auf der vorliegenden Menge an DRl-Kom-plexen), sondern auch, ein in vivo Verfahren zur bildgebenden Dar¬stellung solcher möglichen beeinträchtigten kognitiven Funktionenzur Verfügung zu stellen (basierend auf der bildgebenden Darstel¬lung dieser Komplexe in den Patienten, insbesondere in deren Ge¬hirn oder in spezifischen Hirnregionen) und darüber hinaus die be¬treffenden Funktionen sogar zu verbessern, und zwar durch eine Be¬handlung, die die DRl-Rezeptorkomplexe oder deren Formation oderFunktion induziert, unterstützt oder aktiviert.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnenen Erkennt¬nisse offenbarten sogar ein Muster von gestörten Rezeptorkomplex¬spiegeln (insbesondere in weiblichen DS-Patienten), das indikativfür eine Verschlechterung der konzertierten Aktion dieser Rezepto¬ren sein kann, die ihrerseits wiederum indikativ für kognitive De¬fizite oder die unterschiedlichen Grade von kognitiven Defektensind, die in Patienten mit DS zu beobachten sind. Es muss betontwerden, dass es sich bei den funktionellen Einheiten um die Rezep¬torkomplexe selbst und nicht um deren einzelne Untereinheiten han¬delt (siehe auch Schwenk et al., Neuron 74 (2012), 621-633). Gemäßder vorliegenden Erfindung wurden Rezeptordefizite aufgezeigt, dieebenfalls relevant für das Design von experimentellen Therapiensind, und in der Tat ist eine spezifische pharmakologische Modula¬tion der vorstehend genannten Rezeptoren im Rahmen des pharmazeu¬tischen Repertoires und kann durch die vorliegende Erfindung imHinblick auf das Endresultat der vorliegenden Erfindung ebenfallszur Verfügung gestellt werden.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein objektives biochemi¬sches Mittel zur Diagnose von Hirndefiziten, insbesondere von ei¬ner Beeinträchtigung der kognitiven Funktionen, zur Verfügung ge¬stellt, und zwar sowohl in post mortem erhaltenen Proben aus DS-Gehirnen als auch in in vivo durchgeführten bildgebenden Verfahrenfür DRl-Rezeptorkomplexe. Dies ist äußerst vorteilhaft gegenüber der derzeit verfügbaren histologischen Diagnose des DS, bei dereine auf Erfahrungen und Kenntnissen basierende und damit nach wievor auch subjektive Analyse durch Histologen erforderlich ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgte demnach erstma¬lig eine systematische Bestimmung der vorliegenden Mengen an kor¬tikalen Rezeptorkomplexen im humanen, fetalen DS-Gehirn. FrontaleKortizes wurden sowohl von DS-Patienten (in der 19. bis 22. Gesta-tionswoche) als auch von gesunden Kontrollpersonen erhalten. DieMembranproteine wurden extrahiert, auf blauen nativen Gels unter¬sucht und mit spezifischen gegen die Hirnrezeptoren gerichtetenAntikörpern immungeblottet. In den Kortizes von männlichen undweiblichen DS-Patienten waren die vorliegenden Mengen an den DR1enthaltenden Komplexen deutlich reduziert. Bei den weiblichen DS-Patienten wurde eine deutliche Reduktion der nikotinergen Acetyl-cholinrezeptoren cx4 und a7, des NMDA-Rezeptors NR1 sowie der Re¬zeptorkomplexe, die AMPA-Rezeptor-GluRl und GluR3 enthalten, fest¬gestellt. Die vorliegenden Mengen an weiteren Hirnrezeptorkomple¬xen (5-Hydroxytryptamin 1A, die GluR2- und GluR4-Rezeptoren ent¬haltenden Komplexe) waren innerhalb der Gruppen der weiblichen DS-Patienten vergleichbar. Die Spiegel der GluR2 und GluR3 enthalten¬den Komplexe waren bei den männlichen DS-Patienten in signifikan¬ter Weise erhöht. In Kombination mit der bei den weiblichen DS-Pa-tienten beobachteten signifikanten Reduktion von al enthaltendenKomplexen können die reduzierten Spiegel an DRl-Komplexen bei bei¬den Geschlechtern eine Erklärung für die Gehirndefizite sowie dieBeeinträchtigung der Kognition liefern, die beim DS zu beobachtensind.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es daher möglich, dievorliegende Menge an DRl-Komplex in (historischen oder anderweitigbereitgestellten) Gewebeproben aus DS-Gehirnen zu analysieren undmit dem Grad des DS zu korrelieren, insbesondere im Hinblick aufeine mögliche Beeinträchtigung der kognitiven Funktionen. Das er¬findungsgemäße Verfahren ermöglicht des Weiteren eine Charakteri¬sierung von unterschiedlichen Graden des DS.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf jedebeliebige verfügbare Hirngewebeprobe angewandt werden. Es ist be¬vorzugt, dass die Zellen in den Proben homogenisiert sind und Mem¬branfraktionen der Zellen bereitgestellt werden, um die in derProbe vorliegende Menge an DRl-Komplex zu bestimmen.

Es ist bevorzugt, dass die Bestimmung der vorliegenden Mengean DRl-Komplex unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt wird,die spezifisch für den DRl-Komplex sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmungder vorliegenden Menge an DRl-Komplex unter Anwendung von Immun¬präzipitation und/oder Massenspektroskopie.

Der Unterschied bezüglich der vorliegenden Menge an DRl-Kom¬plex ist zwischen den verschiedenen Graden des DS von statisti¬scher Signifikanz. Üblicherweise liegen jedoch größere Unterschie¬de vor. Es ist daher bevorzugt, dass die reduzierte Menge an DRl-Komplex im Vergleich zu der Kontrollgewebeprobe um mindestens 30%,bevorzugt um mindestens 40%, insbesondere bevorzugt um mindestens50% reduziert ist. Für die Proben von männlichen Gehirnen stellte sich heraus,dass der DRl-Komplex den einzigen statistisch signifikanten Unter¬schied zwischen den DS-Proben und den nicht-DS Kontrollproben dar¬stellte. In den Proben aus weiblichen Gehirnen erwiesen sich auchandere Rezeptorkomplexe als relevant. Dem entsprechend wird in ei¬ner bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens zu¬sätzlich zu der vorliegenden Menge an DR-Komplex ebenfalls dievorliegende Menge an mindestens einem aus den nikotinergen Acetyl-cholinrezeptoren a4 und cx7, dem NMDA-Rezeptor NR1 sowie den Rezep¬torkomplexen, die AMPA-Rezeptor-GluRl und -GluR3 enthalten, be¬stimmt und mit der in einer von einem Individuum ohne DS erhalte¬nen Kontrollgewebeprobe vorliegenden Menge an einem oder mehrerenRezeptorkomplexen verglichen, wobei eine reduziert Menge an min¬destens einem oder mehreren Rezeptorkomplexen mit dem Grad dermentalen Behinderung korreliert, sofern die Proben aus weiblichenGehirnen erhalten wurden.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindungdes Weiteren ein bildgebendes Verfahren zur in vivo Diagnose desGrads der mentalen Behinderung bei Patienten mit dem Down-Syndrom(DS) , wobei ein markiertes Dopaminrezeptor-Bindungsagens, bevor¬zugt ein radioaktiv markierter DRl-Agonist oder ein an eine Mar¬kierungssubstanz gekoppelter DRl-Agonist, an einen DS-Patientenverabreicht wird und im Anschluss die Distribution des Agens imKörper des Patienten analysiert wird, indem die an das Agens ge¬koppelte Markierungssubstanz abgebildet wird, wobei die Bindungdes Agens an den DRl-Komplex anhand der Abbildung des markierten

Dopaminrezeptor-Bindungsagens visualisiert wird und wobei eine re¬duzierte Menge des an den DRl-Komplex bindenden Agens mit dem Gradder mentalen Behinderung korreliert.

Geeignete bildgebende Verfahren schließen die Positronenemis¬sionstomographie (PET) oder die Einzelphotonen-Emissionscomputer-tomographie (SPECT = Single Photon Emission Computed Tomography)ein.

Nach dem gleichen Grundprinzip handelt es sich bei der Messungder quantitativen Menge an DRl-Komplex in vivo um ein wichtigesHilfsmittel zur Einschätzung des Grads des DS, insbesondere imHinblick auf eine Beeinträchtigung der kognitiven Funktionen, dasdes Weiteren eine Indikation für mögliche therapeutische Strategi¬en bietet, d. h. für die Korrektur der DRl-Komplex-Defizite durchAgenzien, die an den DRl-Komplex binden (und so die DRl-Präsenzstimulieren) , insbesondere durch DRl-Agonisten, um diesen Defizi¬ten zumindest bis zu einem gewissen Grad entgegenzuwirken.

Das bildgebende Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindungkann auf die gleiche Weise eingesetzt werden wie andere PET- oderSPECT-Verfahren. Es ist jedoch bevorzugt, die Distribution desAgens im Gehirn oder in spezifischen Hirnregionen zu analysieren.

Auch in diesem in vivo Verfahren ist der mengenmäßige Unter¬schied der vorliegenden Mengen an DRl-Komplex von statistischerSignifikanz zwischen den unterschiedlichen Graden von DS (undnicht-DS). Es ist daher im Rahmen des erfindungsgemäßen bildgeben¬den Verfahrens ebenfalls bevorzugt, dass die reduzierte Menge anDRl-Komplex im Vergleich zu der Kontrollperson, die nicht an DSleidet, um mindestens 30%, bevorzugt um mindestens 40%, insbeson¬dere bevorzugt um mindestens 50% reduziert ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Agens, dasan den DRl-Komplex bindet, zur Verwendung in dem bildgebenden Ver¬fahren gemäß der vorliegenden Erfindung sowie ebenfalls bei derBehandlung der mentalen Behinderungen von DS-Patienten.

Bevorzugte Agenzien sind DRl-Agonisten, bevorzugt Derivate vonDihydrexidin, insbesondere A-86929, Dihydrexidin, Dinapsolin, Din-oxylin und Doxanthrin; Derivate von Benzazepin, insbesondere SKF-81297, SKF-82958, SKF-38393, Fenoldopam und 6-Br-APB; oder A-68930, A-77636, CY-208,243, SKF-89145, SKF-89626, 7,8-Dihydroxy-5-phenyl-octahydrobenzo[h]isochinolin, Cabergolin und Pergolid. DieVerwendung von DRl-Antagonisten ist im Rahmen der vorliegenden Er- findung ebenfalls möglich, wie z. B. von Derivaten von Benzazepin,insbesondere SCH-23,390, SKF-83,959 oder Ecopipam (SCH-39,166).

Zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen bildgebenden Verfahrenwerden diese Substanzen in geeigneter Weise markiert, z. B. miteiner radioaktiven Markierung.

Der DR1 ist ein Protein, das beim Menschen durch das DRD1-Genkodiert wird. Dieses Gen kodiert für den Di-Subtyp des Dopaminre¬zeptors. Bei dem Di-Subtyp handelt es sich um den im zentralen Ner¬vensystem am häufigsten vorkommenden Dopaminrezeptor. Dieser andas G-Protein gekoppelte Rezeptor stimuliert die Adenylatzyklaseund bewirkt indirekt die Aktivierung von zyklischen AMP-abhängigenProteinkinasen. Der DR1 reguliert das neuronale Wachstum und dieneuronale Entwicklung, vermittelt eine Reihe von behavioralen Re¬aktionen und moduliert durch den Dopaminrezeptor D2 vermittelte Er¬eignisse. Alternierende Transkriptionsinitiationsstellen führen zuzwei Transkriptvarianten dieses Gens. Das DRD1-Gen exprimiert inerster Linie im Caudatus-Putamen im Menschen sowie in Caudatus-Pu-tamen, Nucleus accumbens und im olfaktorischen Tuberkel in Mäusen.Hier sind Genexpressionsmuster aus den Allenschen Hirnatlanten inMäusen und Menschen zu finden.

Es existieren eine Reihe von Liganden, die selektiv für denDRl sind. Bisher basieren die meisten der bekannten Liganden aufDihydrexidin oder dem prototypischen partiellen Benzazepinagonis¬ten SKF-38393 (ein Derivat ist der prototypische Antagonist SCH-23390) . Keiner der bekannten Liganden ist selektiv für den Di- vs.den D5-Rezeptor, jedoch verfügen die Benzazepine im Allgemeinenüber eine höhere Selektivität für den Dx- und D5-Rezeptor vs. dieFamilie der D2-ähnlichen Rezeptoren. Einige der Benzazepine weiseneine hohe intrinsische Aktivität auf, andere dagegen nicht.

Gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugte selektive DRl-Ago-nisten sind Derivate von Dihydrexidin, insbesondere A-86929, Dihy¬drexidin, Dinapsolin, Dinoxylin und Doxanthrin; Derivate von Ben¬zazepin, insbesondere SKF-81297, SKF-82958, SKF-38393, Fenoldopamund 6-Br-APB; oder A-68930, A-77636, CY-208,243, SKF-89145, SKF-89626, 7,8-Dihydroxy-5-phenyl-octahydrobenzo[h]isochinolin, Caber-golin und Pergolid. Die Verwendung von DRl-Antagonisten ist imRahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls möglich, wie z. B. De¬rivaten von Benzazepin, insbesondere SCH-23,390, SKF-83,959 oderEcopipam (SCH-39,166).

Bei der Positronenemissionstomographie (PET) handelt es sichum eine tomographische, nukleare Bildgebungstechnik, in der radio¬aktive Markierungsmoleküle (Tracer) verwendet werden, die Positro¬nen emittieren. Trifft ein Positron auf ein Elektron, so annihi¬lieren sich diese gegenseitig, wobei Energie in Form von Gamma¬strahlen freigesetzt wird, die dann durch den PET-Scanner detek-tiert werden. Aufgrund der Verwendung von natürlichen Substanzen,die vom Körper als Markierungsmoleküle verwendet werden, stelltdie PET nicht nur Informationen über Strukturen im Körper, sondernebenfalls über die physiologischen Funktionen des Körpers oder be¬stimmter Körperregionen zur Verfügung. Des Weiteren ist die Aus¬wahl eines Markierungs- oder Tracer-Moleküls abhängig davon, wel¬che Region des Körpers gescannt werden soll. Im Allgemeinen wirdeine Markierung verwendet, die sich in der jeweils relevanten Re¬gion anreichert oder die von einer bestimmten Gewebeart selektivaufgenommen wird, z. B. von Gehirnzellen. Das Scanning bestehtentweder aus einer dynamischen Serie von Bildern oder aus einemstatischen Bild, die bzw. das im Anschluss an ein Zeitintervallerhalten wird, während dessen das radioaktive Markierungsmolekülin den jeweils relevanten biochemischen Prozess eintritt. DerScanner detektiert die räumliche und zeitliche Verteilung der Mar¬kierungsmoleküle. Die PET ist ebenfalls ein guantitatives Bildge-bungsverfahren, das die Messung von regionalen Konzentrationen desradioaktiven Markierungsmoleküls gestattet. Üblicherweise in PET-Tracern verwendete Radionukleotide sind nC, 18F, 150, 13N oder 76Br.

Des Weiteren werden in unterschiedlichen nicht invasiven invivo Untersuchungen in Kombination mit PET häufig Tracer verwen¬det, die mit kurzlebigen Positronen emittierenden Radionukleotiden(z. B. mit nC, 11/2 = 20,3 min) markiert sind. Aufgrund der Radioak¬tivität, der kurzen Halbwertszeiten sowie der submikromolaren Men¬gen der markierten Substanzen sind zur Herstellung dieser Traceraußergewöhnliche Syntheseverfahren erforderlich. Ein wichtiger Be¬standteil bei der Ausgestaltung dieser Verfahren ist die Entwick¬lung und Handhabung von neuen mit nC und 18F markierten Vorläufern.Dies ist nicht nur für die Markierung neuer Arten an Verbindungenvon Bedeutung, sondern auch zur Verbesserung der Möglichkeit zurMarkierung einer gegebenen Verbindung an unterschiedlichen Posi¬tionen .

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werde markierte, an den DR1 bindende Agenzien eingesetzt, die in den hierin offenbartenDetektionsverfahren anzuwenden sind. Bevorzugte markierte Agenziensind radioaktiv markierte Agenzien oder radioaktive Pharmazeutika,insbesondere radioaktiv markierte DRl-Agonisten. So wie hierinverwendet bezieht sich der Begriff "radioaktives Pharmazeutikum"oder auch "Radiopharmazeutikum" auf eine Verbindung oder ein Mate¬rial, die bzw. das zur Verabreichung an den Menschen geeignet ist(und in dem bildgebenden Verfahren gemäß der vorliegenden Erfin¬dung verwendet werden kann) und an die bzw. das ein oder mehrereradioaktive Atome gebunden sind, die Photonen emittieren, die au¬ßerhalb des Körpers detektiert werden können, und zwar mithilfevon Vorrichtungen wie z. B. Positronenemissionstomographie (PET)oder Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT)-Kameras,ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.

Werden Verbindungen mit 1:LC markiert, so ist es üblicherweisewichtig, die spezifische Radioaktivität zu maximieren. Um dies zuerreichen müssen sowohl die isotopische Verdünnung als auch diefür die Synthese benötigte Zeit minimiert werden. Die isotopischeVerdünnung von atmosphärischem Kohlendioxid ist unter Umständenerheblich, wenn [ 1:LC] -Kohlendioxid in einer Markierungsreaktionverwendet wird. Aufgrund der geringen Reaktivität und atmosphäri¬schen Konzentration von Kohlendioxid (0,1 ppm vs. 3,4 x 104 ppm fürC02) wird dieses Problem abgeschwächt, wenn in Reaktionen [nC]-Koh¬lendioxid verwendet wird.

Wird ein radioaktives Pharmazeutikum (PET-Tracer) an einen Pa¬tienten verabreicht, so werden Radionukleotide verwendet, die Po¬sitronen emittieren. Reichert sich der PET-Tracer in spezifischenRegionen an und wird dann ein Positron emittiert, so werden durchdie Annihilation zwei Positronen mit hohem Energiegehalt erzeugt,die in exakt entgegengesetzte Richtungen emittiert werden und ge¬messen werden können. Aus den Koinzidenzen kann dann auf den Ortgeschlossen werden, an dem das Ereignis stattgefunden hat.

Im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen, wie z. B. De¬pressionen, Schizophrenie oder der Alzheimer-Krankheit, ist dieErzeugung von PET-Datensätzen, die die räumliche Verteilung be¬schreiben, und damit letzten Endes auch die Konzentration von Neu¬rotransmittern oder auch Neuromodulatoren im menschlichen Gehirn,aus dem Stand der Technik bereits bekannt (z. B. US 2013/296688Al). Diese Datensätze können in einfacher Weise an das bildgebende

Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung adaptiert werden.

Ist es aufgrund der Blut-Hirn-Schranke nicht möglich, die zudetektierenden Substanzen direkt als eine markierte Variante zuverabreichen, so sind weitere Wege bekannt, um die Verteilung vonNeurotransmittern und/oder Neuromodulatoren auf indirekte Weiseoder als ein Resultat primärer Produkte zu bestimmen. Insbesondereim Fall von Dopamin als Neurotransmitter ist die PET-Bildgebungbereits seit langem bekannt. Es ist daher denkbar, ein Basispro¬dukt mit X1C oder 18F zu markieren. Dessen ungeachtet wurden eben¬falls bereits Verfahren für weitere Neurotransmitter vorgeschla¬gen, wie z. B. für Serotonin oder Acetylcholin, um die räumlicheVerteilung innerhalb des Gehirns zu messen.

Um nun eine Diagnose auf Grundlage dieser Art von PET-Daten zuerstellen, ist es erforderlich, die Aktivitätsverteilungen derPET-Messungen auf quantitative Weise mit den Hirnregionen des je¬weiligen Patienten zu korrelieren, d. h. das gemessene Vorliegendes Neurotransmitters oder Neuromodulators muss in Relation zuspezifischen Regionen (insbesondere Nuklei) des Gehirns gesetztwerden. Ein Ansatz kann z. B. darin bestehen, den Gehalt an DR1-Komplex im Striatum zu bestimmen. In diesem Fall besteht jedochdie Schwierigkeit, dass nur eine grobe Zuordnung zu einer Regiondes Gehirns erfolgen kann, da die entsprechenden anatomischen In¬formationen aus dem PET-Datensatz nicht erhalten werden können. Esist daher nicht möglich, den Gehalt an DRl-Komplex in einer spezi¬fischen Hirnregion, insbesondere einem Nukleus, zu bestimmen. Ste¬hen komplementäre Computertomographiedaten zur Verfügung so ge¬stattet dies aufgrund der beschränkten Niedrigkontrastauflösung imGehirn keine ausreichend gute Segmentierung von anatomischenStrukturen und Regionen des Gehirns. In solchen Fällen kann derPET-Datensatz z. B. anhand von Informationen evaluiert werden, diedie räumliche Auflösung von mindestens einem PET-Liganden gemäßder vorliegenden Erfindung im Gehirn eines DS-Patienten betreffen,und zwar mittels eines Verfahrens, das zusätzlich zu dem PET-Da¬tensatz die Aufzeichnung eines morphometrischen Magnetresonanzda¬tensatzes umfasst, der in dem PET-Datensatz registriert wird oderbereits in diesem registriert ist, wobei Konzentrationsdaten derräumlichen Verteilung mindestens einer spezifischen Region des Ge¬hirns zugeordnet werden, und zwar unter Berücksichtigung der Ma¬gnetresonanz-Bilddaten zur Bestimmung von der betreffenden Region zugeordneten Ergebnisdaten (US 2013/296688 Al).

Die radiopharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorlie¬genden Erfindung können zur SPECT- oder PET-Bildgebung an Patien¬ten verabreicht werden, und zwar jeweils in einer Menge, die aus¬reicht, um das gewünschte Signal zu erzeugen. Normalerweise sinddie üblichen Dosierungen von Radionukleotiden von 0,01 bis 100mCi, bevorzugt 0,1 bis 50 mCi, pro 70 kg Körpergewicht zu diesemZweck ausreichend.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eineVorgehensweise zur Erstellung von Histogrammen aus PET (Positrone¬nemissionstomographie) - oder SPECT (Einzelphotonen-Emissionscompu-tertomographie)-Scans von DRl-Bildern im Gehirn eines Patientenzur Verfügung gestellt. In einer weiteren Ausführungsform der vor¬liegenden Erfindung wird ein Histogramm dazu verwendet, den Gradder Bindung von an den DR1 bindenden Agonisten zu diagnostizieren.In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindungwird ein Histogramm dazu verwendet, die in dem Gehirn eines Pati¬enten vorliegende Gesamtmenge an DRl-Agonisten, deren höchste re¬lative Konzentration im Gehirn sowie die Häufigkeitsverteilungverschiedener Konzentrationen solcher Antagonisten im gesamten Ge¬hirn oder über spezifische Volumenebenen des Gehirns einzuschät¬zen, um so den Grad des DS in einem Patienten zu diagnostizierenoder zu beobachten.

Gemäß bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung wird einhistographisches Tool, das in verschiedenen Instrumenten zur Bild¬darstellung sowie in zur Analyse von Gehirnscans eingesetztenSoftwareprogrammen eingeschlossen ist, dazu verwendet, Balkengra¬fiken zu erstellen, in denen Voxel gegen den numerischen Bereichaufgetragen sind. Diese Histogramme können ein komplettes Bildvo¬lumen darstellen, einschließend den gesamten Schädel und den umge¬benden Bereich. Die Histogramme können zusammen mit aus einem PET-oder SPECT-Scan rekonstruierten dreidimensionalen Abbildungen ana¬lysiert oder dargestellt werden oder sie können analysiert oderdargestellt werden, ohne dass irgendeine Form der Bearbeitung oderPräsentation von Abbildungen erforderlich ist, wobei auch nichtzwingend ein fundamentales Wissen über die Anatomie des Gehirnsvonnöten ist, um zweckmäßige Informationen bezüglich der Quantitätoder Konzentration eines gegebenen pathologischen Ziels im Gehirneines Patienten ableiten zu können. Die Verteilungen der Vo- xel-Werte und die damit assoziierten Histogrammformen unterschei¬den sich auf eine regelmäßige und sich wiederholende Weise zwi¬schen den Abbildungen von gesunden Kontrollsubjekten und denen vonDS-Patienten. An sich kann eine visuelle Prüfung des Histogrammsdurchgeführt werden, um die Elemente dieser beiden Gruppen (d. h.normale und anomale) zu differenzieren.

Verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung be¬treffen ein Verfahren zur Detektion und Diagnose des Grads dermentalen Behinderung in einem DS-Patienten anhand der Evaluierungvon Histogrammen von Bilddaten, die nach der Verabreichung einesfür den DR1 spezifischen Radiopharmazeutikums aus dem Gehirn desjeweiligen Patienten erhalten wurden.

Gemäß weiteren Aspekten wird ein Verfahren zur Diagnose desGrads der mentalen Behinderung in einem DS-Patienten zur Verfügunggestellt, umfassend die Verabreichung von mindestens einem für denDR1 spezifischen Radiopharmazeutikum zur Bindung an den DRl-Kom-plex, die Messung der Verteilung der Radioaktivität des Radiophar¬mazeutikums in einer Körperregion des Patienten, umfassend eineHirngeweberegion des Patienten, die Anwendung einer auf einem Com¬puter ausführbaren Logik zur Manipulation der gemessenen Vertei¬lung der Radioaktivität des Radiopharmazeutikums zur Erstellungeines Histogramms sowie die Analyse der Charakteristika des Histo¬gramms zur Detektion und Quantifizierung des Vorliegens des an denDR1 bindenden Agonisten.

Die vorliegende Erfindung wird anhand des nachfolgenden Bei¬spiels sowie der Zeichnungen näher erläutert, ohne jedoch auf die¬se beschränkt zu sein.

Figur 1A. Zwischen 480 und 720 kDa wurde eine einzelne Bandedetektiert. Die Expression des den DRD1 enthaltenden Rezeptorkom¬plexes war sowohl in männlichen als auch in weiblichen DS-Patien¬ten signifikant reduziert.

Figur 1B. Die Expression des D2 enthaltenden Rezeptorkomplexesin weiblichen DS-Patienten unterscheidet sich von dessen Expressi¬on in weiblichen Kontrollpersonen.

Figur 2. Die Expression des Komplexes, der den Acetylcholinre-zeptor cx4 enthält, in weiblichen DS-Patienten unterscheidet sichvon dessen Expression in weiblichen Kontrollpersonen.

Figur 3. Die Expression des Komplexes, der den Acetylcholinre-zeptor cx7 enthält, war bei den weiblichen DS-Patienten im Ver¬ gleich zu dessen Expression bei den weiblichen Kontrollpersonensignifikant reduziert.

Figur 4. Die Expression des Rezeptorkomplexes, der den NR1enthält, war bei den weiblichen DS-Patienten signifikant redu¬ziert, wohingegen sich bei den männlichen DS-Patienten lediglicheine leichte Tendenz zu einer Reduktion zeigte.

Figur 5. Die GluRl-Spiegel waren bei den weiblichen DS-Patien¬ten signifikant reduziert.

Figur 6. Die Expression des GluR2 war bei den männlichen DS-Patienten signifikant erhöht, nicht jedoch bei den weiblichen.

Figur 7. Die Expression des GluR3 war bei den weiblichen DS-Patienten signifikant reduziert, bei den männlichen DS-Patientendagegen signifikant erhöht.

Figur 8. SDS-PAGE-Analyse eines Immunpräzipitats unter Verwen¬dung eines gegen den Dl-Rezeptor gerichteten Antikörpers. Der Dl-Rezeptor und weitere Rezeptoren wurden mittels Massenspektrometrieidentifiziert. BEISPIEL: Reduzierte Spiegel des kortikalen Dopamin-Dl-Rezep-tors im fetalen DS-Gehirn 1. Einleitung

Basierend auf den derzeitigen Erkenntnissen auf dem Gebiet derPathobiologie von Rezeptoren in Tiermodellen und im Menschen wur¬den in dem vorliegenden Beispiel die bedeutendsten Rezeptorsystemein fetalen DS-Gehirnen bewertet. Dieses Beispiel zeigte ebenfallsVeränderungen auf der Ebene der Zellrezeptoren anstelle der Ebeneder Rezeptoruntereinheiten, da die Assemblierung von Rezeptorenzur Bildung von Rezeptorkomplexen zur Ausführung von Gehirnfunk¬tionen führt. Es wurde ein gelbasierter proteomischer Ansatz ver¬wendet, um die Rezeptorkomplexe der Klassen von NMDA-Rezeptoren,AMPA-Rezeptoren, 5-Hydroxytryptamin-Rezeptoren, nikotinergen Ace-tylcholinrezeptoren und Dopaminrezeptoren zu quantifizieren. Derden Dopaminrezeptor 1 enthaltende Komplex wurde mittels Massen¬spektrometrie identifiziert und es wurden abweichende Mengen anden Dl-Dopaminrezeptor (DRD1) enthaltenden Komplexen sowohl inweiblichen als auch in männlichen DS-Gehirnen beobachtet.

In der Tat wurde ein Defizit an dem dopaminergen Rezeptor 1 infetalen DS-Gehirnen festgestellt, das die Grundlage sowie die Er¬fordernis für eine experimentelle Behandlung mit einem der zahl¬ reichen verfügbaren und bestens etablierten spezifischen Dopamin¬rezeptoragonisten darstellen kann. 2. Materialien und Verfahren 2.1. Proben aus dem fetalen humanen Gehirn

Die im Rahmen dieses Projekts verwendeten, vom Menschen stam¬menden biologischen Proben wurden zusammen mit der erforderlichenGenehmigung der Ethikkommission von der Fetal Tissue Bank of Valld'Hebron University Hospital Biobank zur Verfügung gestellt.

In der vorliegenden Studie wurden Proben aus dem frontalenKortex verwendet. Die entsprechenden Hirnbank-Zugangsnummern, Ge-stationswochen und Geschlechter zu den jeweiligen Proben sind inder nachstehenden Tabelle 1 zusammengefasst. 2.2. Biochemische Analysen 2.2.1. Aufbereitung der Proben

Es wurden insgesamt 26 Proben (4 männliche Kontrollpersonenund 6 männliche Personen mit Trisomie 21 jeweils in der 21. und 22Gestationswoche; 8 weibliche Kontrollpersonen und 8 weibliche Per¬ sonen mit Trisomie 21 in der 19. bis 21. Gestationswoche) in eis¬kaltem Homogenisierungspuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 300 mM Saccha¬rose und 1 ganze Proteaseinhibitor-Tablette [Roche Molecular Bio-chemicals, Mannheim, Deutschland) pro 50 mL) unter Verwendung ei¬nes Ultra Turrax Homogenisiergeräts (IKA, Staufen, Deutschland)homogenisiert. Im Anschluss wurde das Homogenat für 10 min bei 1.000 x g zentrifugiert und das erhaltenen Pellet wurde verworfen.Dann erfolgte die Zentrifugation des Überstands für 30 min bei 50.000 x g in einer Ultrazentrifuge (Beckman Coulter Optima L-90K)und das so erhaltene Pellet wurde in 5 mL Waschpuffer (Homogeni¬sierungspuffer ohne Saccharose) homogenisiert, für 30 min auf Eisinkubiert und für weitere 30 min bei 50.000 x g zentrifugiert. 2.2.2. Ultrazentrifugation mit Saccharosegradient zur Fraktio¬nierung der Membranen

Das Verfahren zur Aufreinigung der Plasmamembranen aus den er¬haltenen Pellets wurde wie bereits zuvor beschrieben, allerdingsmit geringfügigen Modifikationen, durchgeführt [10] . Zur Fraktio¬nierung der Membranen wurden Zentrifugationslösungen mit einemSaccharosegradienten (700 pL) und mit einem Saccharosegehalt vonjeweils 69%, 54%, 45%, 41% und 37% (w/v) verwendet. Die erhaltenen

Membranpellets (500 pL) wurden in Homogenisierungspuffer resuspen-diert und in bereits mit Homogenisierungspuffer gefüllte Gefäße von oben zugefüllt. Im Anschluss wurden die Proben für 3 h bei 4°Cund 70.000 x g ultrazentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurdedie 41%-Fraktion an der Saccharose-Schnittstelle gesammelt, 10-fach mit Homogenisierungspuffer verdünnt und dann für 30 min bei4°C und 100.000 x g ultrazentrifugiert. Dann wurde der Überstandverworfen und das Pellet wurde bis zur weiteren Analyse bei -80 °Cgelagert [11] . 2.2.3. Blau/native Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE)

Membranpellets aus der ultrazentrifugierten Fraktion mit 41%

Saccharosegradient wurden in Extraktionspuffer (1,5 M 6-Aminoca-pronsäure, 300 mM Bis-Tris, pH 7,0) und 10% Triton X-100 (es er¬folgte die Zugabe einer Stammlösung im Verhältnis 1:4, um eineEndkonzentration von 2% Triton X-100 zu erreichen) solubilisiertund über einen Zeitraum von 1 h alle 10 min gevortext. Im An¬schluss an die Solubilisierung wurden die Proben mittels Zentrifu¬gation für 60 min bei 4°C und 20.000 x g geklärt. Die Proteinkon¬zentration wurde unter Verwendung des BCA Proteinassay Kits (Pier¬ce, Rockford, IL, USA) bestimmt und es wurden 50 pg des Membran¬proteinpräparats auf die Gels aufgetragen. Eine Gesamtmenge von 16pL an BN-PAGE-Ladepuffer [5% (w/v) Coomassie G250 in 750 mM 6-Ami- nocapronsäure] wurde mit 100 pl des Membranproteinpräparats ver¬mischt, bevor die Gels damit beladen wurden. Die BN-PAGE erfolgtein einer PROTEAN II xi Zelle (BioRad, Deutschland) unter Verwen¬dung eines 4%-igen Sammelgels sowie eines 5- bis 18%-igen Lauf¬gels. Der BN-PAGE Gelpuffer enthielt 500 mM 6-Aminocapronsäure und50 mM Bis-Tris, pH 7,0. Der Kathodenpuffer enthielt 50 mM Tricin,15 mM Bis-Tris und 0,05% (w/v) Coomassie G250, pH 7,0. Der Anoden¬ puffer enthielt 50 mM Bis-Tris, pH 7,0. Die Spannung wurde für 1 hauf 50 V und für 6 h auf 75 V eingestellt und dann sequentiell bis400 V erhöht (maximale Stromstärke 15 mA/Gel, maximale Spannung500 V), bis die Farbfront das Ende des Gels erreicht hatte [11].Native hochmolekulare Massenmarker wurden von Invitrogen (Carls¬bad, CA, USA) bezogen. 2.2.4. Immunobiotting

Im Anschluss an die BN-PAGE wurden die Membranproteine aufPVDF-Membranen transferiert. Nach der Blockierung der Membranenfür 1 h mit 10%-iger fettarmer Trockenmilch in 0,1% TBST (100 mMTris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,1% Tween 20) wurden diese mit denfolgenden primären Antikörpern inkubiert: Kaninchen-anti-GluRl (Abeam, ab31232, Cambridge, UK; 1/5.000), Kaninchen-anti-GluR2(Abeam, ab52932, Cambridge, UK; 1/5.000), Kaninchen-anti-GluR3(Abeam, ab87609, Cambridge, UK; 1/3.000), Kaninchen-anti-GluR4(Abeam, abl09431, Cambridge, UK; 1/2.500), Kaninchen-anti-Dopamin-rezeptor D1 (Abeam, ab85608, Cambridge, UK; 1/2.500), Kanin-chen-anti-Dopaminrezeptor D2 (Millipore, AB5084P; 1/2.000), Kanin-chen-anti-nikotinerger Acetylcholinrezeptor a4 (Abeam, ab41172,Cambridge, UK; 1/2.500), Kaninchen-anti-nikotinerger Acetylcholin¬rezeptor a 7 (Abeam, abl0096, Cambridge, UK; 1/2.500), Kanin-chen-anti-NMDARl (Abeam, ab28669, Cambridge, UK; 1/2.000) und Ka-ninchen-anti-5HTlA (GenScript, Piscataway, NJ, USA; 1/20.000). DieAntikörper wurden unter Verwendung von mit Meerrettichoxidase kon¬jugiertem Anti-Kaninchen-IgG (Abcan, ab6721, Cambridge, UK;1/10.000) detektiert und die Entwicklung der Membranen erfolgteunter Verwendung des Detektionssystems ECL Plus Western Blotting(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

Willkürliche optische Dichten der immunreaktiven Banden wurdenunter Verwendung der Software ImageJ (http;//rsb.info.nih.qov/il/)gemessen. Die Färbung der Blottingmembranen wurde (gemäß der Emp¬fehlung) als Beladungskontrolle für Membranproteine verwendet[12] . 2.2.5. Immunpräzipitation des Dopamin-Dl-Rezeptors

Zur Identifikation der interagierenden Partner des Dl-Rezep-tors, d. h. zur Bestimmung der Zusammensetzung des Komplexes, wur¬den unter Verwendung von kortikalem humanem Hirngewebe Immunpräzi-pitationsanalysen durchgeführt. Alle Membranfraktionen [24] wurdenaus kortikalem Gewebe erhalten, in Lysepuffer, enthaltend 1% Tri¬ton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 50 mM Tris-Hcl (pH 8,0), 10 mMNaF, 10 mM Na3V04 sowie einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche,Mannheim, Deutschland), suspendiert und für 1 h bei 4°C auf einemRotationsschüttler platziert. Im Anschluss an die Zentrifugationfür 10 min bei 4°C und 15.300 x g wurde der Überstand mit einemaffinitätsaufgereinigten gegen den Dopamin-Dl-Rezeptor gerichtetenKaninchen-Antikörper (D1DR, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA) inku¬biert. Die Probe wurde mit Protein G-Agarose-Beads (GE Healthcare,Uppsala, Schweden) für 4 h bei 4°C unter sanfter Rotation inku¬biert. Nach fünf Waschschritten mit jeweils dem gleichen Lysepuf¬fer wurden die gebundenen Proteine in Probenpuffer, enthaltend 125mM Tris (pH 6,8), 4% SDS 20% Glycerin, 10% Beta-Mercaptoethanol und 0,02% Bromphenolblau, für 3 min bei 95°C denaturiert (Ghafariet al., 2012b). Dann wurden die Proben auf 10%-ige SDS-Poly-acrylamidgels geladen, elektrophoretisch getrennt und im Anschlussdaran auf PVDF-Membranen transferiert (Pall, Ann Arbor, MI, USA) .Nach der Blockierung der Membranen für 1 h in 5%-iger fettarmerTrockenmilch in 0,1% TBST (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5,und 0,1% Tween 20) wurden diese mit einem verdünnten primären An¬tikörper aus der Ziege, der gegen den Dopamin-Dl-Rezeptor gerich¬tet war (1:1.000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA),inkubiert und unter Verwendung von Anti-Ziege-IgG (1:5.000, Abeam,Cambridge, UK) detektiert und die Entwicklung der Membranen er¬folgte unter Verwendung des Detektionssystems ECL Plus WesternBlotting (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). 2.2.6. In-Gel-Verdau von Proteinen und Peptiden

Die aus den SDS-Gels selektierten Spots, die von dem gegen dieUntereinheit des Dopamin-Dl-Rezeptors gerichteten Antikörper er¬kannt wurden, wurden in 1,5 mL Eppendorfgefäße transferiert. DieGelstücke wurden zunächst mit 50 mM Ammoniumbicarbonat und im An¬schluss zwei Mal mit Waschpuffer (50% 100 mM Ammoniumbicarbo-nat/50% Acetonitril) für jeweils 30 min gewaschen (mit Vortexen).Dann erfolgte die Zugabe von Acetonitril (100%, 100 pL) bis dieGelstücke vollständig bedeckt waren und das Gemisch wurde für 10min inkubiert. Als nächstes wurden die Gelstücke unter Verwendungeines SpeedVac Konzentrators vollständig getrocknet und die Cy¬steinreste wurden unter Verwendung einer 10 mM Dithiothreitol(DTT)-Lösung in 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,6, für 60 min bei56°C reduziert. Nachdem die DTT-Lösung verworfen worden war, er¬folgte die Zugabe eines identischen Volumens einer 55 mM Jodaceta-mid (IAA)-Lösung in 100 mM Ammoniumbicarbonatpuffer, pH 8,6, unddie Probe wurde für 45 min bei 25°C im Dunkeln inkubiert, um eineAlkylierung der Cysteinreste zu erreichen. Im Anschluss wurde dieIAA-Lösung durch Waschpuffer (50% 100 mM Ammoniumbicarbonat/50%Acetonitril) ersetzt und es erfolgten 2 Waschschritte von jeweils15 min unter Vortexen. Dann wurden die Gelstücke in 100% Acetoni¬tril gewaschen und getrocknet, gefolgt von einer Trocknung imSpeedVac. Die getrockneten Gelstücke wurde in einer Lösung von12,5 ng/pL Trypsin (Promega, Deutschland) rehydriert, die entwedermit einer 25 mM Ammoniumbicarbonatlösung oder mit einer in 25 mMAmmoniumbicarbonat gepufferten 12,5 ng/pL Chymotrypsinlösung (Ro¬ che, Deutschland) rekonstituiert wurde. Im Anschluss wurden dieGelstücke für 16 h (über Nacht) bei 37°C (Trypsin) oder bei 25°C(Chymotrypsin) inkubiert. Der Überstand wurde in ein frisches 0,5mL Gefäß überführt und es erfolgte eine Extraktion der Peptide mit50 pL 0,5% Ameisensäure/20% Acetonitril (v/v) für 20 min in einemUltraschallbad. Dieser Schritt wurde zwei Mal wiederholt. Die Pro¬ben in dem Extraktionspuffer wurden in 0,5 mL Gefäßen gepoolt undin einem SpeedVac Konzentrator evaporiert. Das Volumen wurde aufetwa 20 pL reduziert und hierzu erfolgte die Zugabe von 20 pL Was¬ser mit HPLC-Reinheitsgrad (Sigma, Deutschland) [13].

2.2.7. Nano-LC-ESI-CID/ETD-MS/MS

In diesen Analysen wurde das System Ultimate 3000 HPLC (Dio-nex, Sunnyvale, CA, USA) eingesetzt, das mit einer PepMaplOO C-18Trap-Säule (300 pm x 5 mm) sowie einer PepMaplOO C-18 Analysesäule(75 pm x 150 mm) ausgestattet war. Es wurde der folgenden Gradientangelegt: A = 0,1% FA in Wasser und B = 0,08% FA in Acetonitril: 4bis 30% B von 0 bis 105 min, 80% B von 105 bis 110 min und 4% Bvon 110 bis 125 min. Es wurde das Massenspektrometer HCT Ultra ETDII (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) verwendet, um die Pep¬tidspektren über einen Massenbereich von m/z 350 - 1.500 und dieMS/MS-Spektren anhand einer informationsabhängigen Datenerhebungüber einen Massenbereich von m/z 100 - 2.800 aufzuzeichnen. Die MS-Spektren wurden wiederholt aufgezeichnet, gefolgt von 4 daten¬abhängigen CID MS/MS-Spektren sowie 4 ETD MS/MS-Spektren, die vonden 4 Vorläuferionen mit der höchsten Intensität generiert wordenwaren. Ein aktiver Ausschluss von 0,4 min nach 2 Spektren wurdedazu eingesetzt, Peptide mit geringer Häufigkeit zu detektieren.Die Spannung zwischen der Ionensprayspitze und dem Sprayschildwurde auf 1.500 V eingestellt. Trocknendes Stickstoffgas wurde auf150°C erhitzt und die Durchflussrate wurde auf 10 L/min einge¬stellt. Die Kollisionsenergie wurde in Abhängigkeit von der Masseund dem Ladungszustand der zur Fragmentierung ausgewählten Peptideautomatisch eingestellt. Es wurden mehrere geladene Peptide auf¬grund ihrer guten Fragmentierungscharakteristik für die MS/MS-Ex-perimente ausgewählt. Die so erhaltenen MS/MS-Spektren wurden in¬terpretiert und Peaklisten wurden mit der Software DataAnalysis 4.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) erstellt.

Zur Identifikation der Proteine wurden MASCOT-Recherchen gegendie aktuellste Version der Uni-ProtKB-Datenbank durchgeführt, und zwar unter Verwendung von MASCOT 2.2.06 (Matrix Science, London,UK). Die Rechercheparameter wurden wie folgt festgesetzt: Enzym¬ auswahl Trypsin oder Chymotrypsin mit maximal 2 fehlenden Spal¬tungsstellen; Klassifizierung der Spezies eingegrenzt auf "mensch¬lich"; Massentoleranz von 5 ppm für die Peptidtoleranz; 20 mmuMS/MS-Toleranz; Ionen-Score-Schwellenwert unter 15; fixierte Modi¬fikation von Carbamidomethyl (C) ; und variable Modifikation vonOxidation (M), Deamidierung (N, Q) und Phosphorylierung (S, T, Y).Die positive Identifikation der Proteine erfolgte auf Grundlageeines signifikanten MOWSE-Scores. Im Anschluss an die Identifika¬tion der Proteine wurde eine fehlertolerante Recherche durchge¬führt, um nicht spezifische Spaltungen und nicht zugeordnete Modi¬fikationen zu detektieren. Die daraus erhaltenen Informationen be¬züglich der Proteinidentifikation wurde manuell überprüft und ge¬filtert, um die Proteinidentifikationslisten zu validieren.

Eine höhere Sequenzabdeckung wurde mit der Software Modiro ®und den folgenden Parametern erzielt: ausgewählte Enzyme mit maxi¬mal zwei fehlenden Spaltungsstellen; Peptidmassentoleranz von 0,2Da als Peptidtoleranz; 0,2 Da als Fragmentmassentoleranz; sowieModifikation 1 für Carbamidomethyl (C) und Modifikation 2 für dieMethioninoxidation. Eine positive Identifikation der Proteine er¬folgte zuerst auf Grundlage der erhaltenen Spektren und im An¬schluss wurde jedes identifizierte Peptid aufgrund seines Ionenla¬dungszustands, der b- und y-Ionen-Fragmentierungsqualität, des Io-nen-Scores (> 200) sowie des Signifikanz-Scores (> 80) als signi¬fikant erachtet. Die Informationen bezüglich der Proteinidentifi¬kation wurde manuell überprüft und gefiltert, um die validiertenListen identifizierter Proteine zu erhalten [13]. 2.3. Statistische Auswertung

Die aus dem Western-Blot erhaltenen Daten wurden unter Anwen¬dung des Student-t-Tests analysiert und sind als Mittelwerte +Standardabweichung (SD) angegeben. Unter Verwendung von IBM SPSSfür Windows 19.0 wurden Pearson-Korrelationen durchgeführt. 3. Ergebnisse

3.1. BN-PAGE

Wie in Figur 1A dargestellt, wurde eine einzelne Bande zwi¬schen 480 und 720 kDA detektiert. Die Spiegel an den DRD1 enthal¬tenden Komplexen waren sowohl in den männlichen als auch in denweiblichen DS-Föten signifikant und deutlich reduziert.

Figur 1B zeigt eine einzelne Bande für den den DopaminrezeptorD2 enthaltenden Komplex zwischen 480 und 720 kDa und zeigt weiter¬hin, dass die Spiegel an den DRD2 enthaltenden Komplexen in derweiblichen DS-Gruppe erhöht waren, nicht jedoch in der männlichenDS-Gruppe. Allerdings zeigte sich in der männlichen DS-Gruppe eineTendenz in Richtung reduzierter Spiegel.

Figur 2 zeigt einen den Acetylcholinrezeptor a4 enthaltendenKomplex, der zwischen 480 und 720 kDA migriert und dessen Spiegelin den Gehirnen von Föten mit dem Down-Syndrom signifikant redu¬ziert waren.

In der männlichen Gruppe waren die Spiegel dieses Komplexesbei den Kontrollpersonen und den DS-Patienten vergleichbar.

Figur 3 zeigt einen den Acetylcholinrezeptor a7 enthaltendenKomplex, der zwischen 480 und 720 kDA migriert. In der weiblichenGruppe war die Expression dieses Komplexes auf höchst signifikanteWeise reduziert. In der männlichen Gruppe wurde kein signifikanterUnterschied beobachtet und die Spiegel dieses Komplexes zeigteneine Tendenz zu einer erhöhten Immunreaktivität.

Figur 4 zeigt die Untereinheit NR1 des NMDA-Rezeptors enthal¬tende Rezeptorkomplexe, die zwischen 480 und 720 kDa migrieren.Das Expressionsniveau dieses Komplexes war in der weiblichen Grup¬pe mit dem Down-Syndrom signifikant reduziert. In der männlichenDS-Gruppe war eine Tendenz zu einer reduzierten Expression zu be¬obachten .

Wie in Figur 5 gezeigt ist, migrierte der GluRl zwischen 480und 720 kDa und seine Expression war in der weiblichen Gruppe mitDS signifikant reduziert und in der männlichen Gruppe zwischen denDS-Patienten und den Kontrollpersonen vergleichbar.

In Figur 6 migrierte der GluR2 zwischen 480 und 720 kDa undseine Spiegel waren in der männlichen Gruppe mit DS signifikanterhöht, nicht jedoch in der weiblichen Gruppe.

Figur 7 zeigt, dass der GluR3 zwischen 480 und 720 kDa mi¬grierte. Die Spiegel dieses Proteins waren in der weiblichen Grup¬pe der DS-Patienten signifikant reduziert, in der männlichen DS-Gruppe dagegen signifikant erhöht.

Zwischen den einzelnen Rezeptoren enthaltenden Komplexen wareneine Reihe von Korrelationen zu beobachten. 3.2. Charakterisierung des den Dl-Rezeptor enthaltenden Kom¬plexes

Figur 8 zeigt das SDS-PAGE-Muster sowie einen Immunblot (unterVerwendung eines gegen den DRD1 gerichteten Antikörpers) immunprä-zipitierter Proteine, aus denen die Banden für die massenspektro-metrische Bestimmung der in dem Komplex vorhandenen Proteine aus¬gewählt wurden.

Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, offenbarte eine gelbasierte Mas¬senspektrometrie des Immunpräzipitats das Vorliegen von mehrerenRezeptoren sowie der katalytischen Alpha- und Beta-Untereinheitender cAMP-abhängigen Proteinkinasen. Die Dopaminrezeptoren DIB, D3und D4; der GluR2; NR1; NR2A; und 5HT3D wurden mit einer Sequenz-abdeckung von mehr als 30% eindeutig in dem Rezeptorkomplex nach¬gewiesen. Eine Reihe von zusätzlichen Rezeptoren, die in Tabelle 2aufgelistet sind, wurden mit einer geringeren Sequenzabdeckung (15- 29%) ebenfalls beobachtet. 4 . Besprechung

In erster Linie wurde in dieser Studie festgestellt, dass dieSpiegel an den Dl-Rezeptor enthaltenden Komplexen in den Kortizesvon fetalen DS-Gehirnen signifikant und deutlich reduziert sind.Darüber hinaus bestehen zwischen den Geschlechtern auffällige Un¬terschiede bezüglich der vorliegenden Mengen an Rezeptorkomplexen.

Kognitive Defizite sind ein herausragendes Symptom des Down-Syndroms und bei dem Dl-Rezeptor handelt es sich um einen bedeu¬tenden Signalgebungskomplex, der kognitive Funktionen im neurobio-logischen System von Nagern und Menschen vermittelt. Die Beteili¬gung des Dl-Rezeptors an der Lern- und Gedächtnisleistung ist ge¬meinhin anerkannt. So sind z. B. in Dl-Rezeptor-Knockout-MäusenDefizite bezüglich des räumlichen Lernens zu beobachten [14] undder Dl-Rezeptor spielt sowohl im räumlichen Arbeitsgedächtnis alsauch im räumlichen Gedächtnis eine Rolle. El-Ghundi et al. liefer¬ten zu diesem Thema eine umfassende Abhandlung [15]. Des Weiterenist der Dl-Rezeptor in vitro sowie in vivo an einer Reihe vonLern- und Gedächtnisfunktionen beteiligt und wird für die Lang-zeitpotenzierung [16], für das konditionierte geschmacksaversiveLernen [17], für inhibitorische Vermeidungsaufgaben [18], fürdurch das Arbeitsgedächtnis gesteuerte Bewegungen [19], für dieSpeicherung von Objekten im Arbeitsgedächtnis [20] sowie für dieAuslöschung von Angsterinnerungen [21] benötigt.

Diese Erkenntnisse bezüglich der reduzierten Spiegel von denDl-Rezeptor enthaltenden Komplexen ist von zentralen Interesse, und zwar nicht nur im Hinblick auf das Verständnis des Mechanis¬mus, der den kognitiven Defiziten in DS-Gehirnen zugrunde liegt,sondern ebenfalls bezüglich der Bereitstellung eines pharmakologi¬schen Ziels für eine wahrscheinliche Verbesserung des kognitivenGedächtnisses [22]. Das Gleichgewicht des dopaminergen Systems imHinblick auf Dl ist von größter Bedeutung, da dieses zentrale Neu¬rotransmittersystem durch Agonismus und Antagonismus gestört wer¬den kann. In der nachfolgenden Besprechung werden zahlreiche In¬formationen angesprochen, die unter Umständen für mögliche zukünf¬tige experimentelle Therapien von Bedeutung sind, in denen eineStimulation oder Blockade von Dl in DS-Patienten eine Rollespielt. Zwar bleibt die Frage offen, ob der Dl-Agonismus für expe¬rimentelle Behandlungen in Frage kommt, jedoch belegen mehrere gutangelegte Studien die Wirkung von Agonisten. So führt z. B. dieVerabreichung einer geringen Dosis an Dopaminagonisten zu einerVerbesserung des Gedächtnisses [23] und die Aktivierung von post¬synaptischen Dl-Rezeptoren verbessert den Gedächtnisabruf [24].Cai und Arnsten sowie Arnsten et al. deuteten an, dass sehr gerin¬ge Dosierungen an Dl-Rezeptoragonisten in gealterten Affen einekognitionsverstärkende Wirkung hervorrufen können. Darüber hinausverbessert die Aktivierung von Dl-Rezeptoren im medialen Septumvon Ratten eine durch Scopolamin induzierte Amnesie [25] und dieVerwendung von Dl-Rezeptoragonisten kehrt in Ratten ein durchPhencyclidin induziertes Defizit des Wiedererkennens von Objektenum [26]. Der Dl-Rezeptoragonist SKF-38393 verbessert in Ratten dieGedächtnisleistung bezüglich der zeitlichen Reihenfolge [27] . DieAgonisten SKF-38393 und SKF-81297 verkürzen in Ratten mit hohemAlter und beeinträchtigter Gedächtnisleistung die Latenzzeit imMorris-Wasserlabyrinth [28]. Eine supra-physiologische Stimulation [29] blockiert dagegen sowohl aversive als auch mit Belohnungenassoziierte Erfahrungen.

Was den Antagonismus angeht, so zeigten Granado et al., dassLTP von der Aktivität des Dl-Rezeptors abhängig ist, da die Verab¬reichung von SCH-23390 sowie die genetische Ablation des Dl-Rezep¬tors zu einer Beeinträchtigung der Langzeitpotenzierung (LTP) so¬wie des räumlichen Lernverhaltens führten [30]. Nach einer syste¬mischen oder limbischen Verabreichung der vorstehend genanntenAntagonisten kommt es zu Defiziten bezüglich des Erkundungsverhal¬tens und des Gedächtnisses, wie von Clausen et al. gezeigt wurde [31] .

Des Weiteren zeigten da Silva et al., dass der Antagonist SKF-38393 die Verarbeitung im räumlichen Gedächtnis beeinträchtigt;diese Verbindung moduliert ebenfalls die Konsolidierung des unter¬scheidenden Lernens [32] und beeinträchtigt die Konsolidierung derWiedererkennung von Objekten [36] . Darüber hinaus zeigten Pezzeund Bast, dass eine Blockade des Dl-Rezeptors während des Lernpro¬zesses das Trial-Place-Gedächtnis beeinträchtigt [33, 34].

Bei den reduzierten kortikalen Spiegeln des den Dl enthalten¬den Rezeptorkomplexes, die in DS-Patienten beiderlei Geschlechtszu beobachten waren, handelt es sich möglicherweise um eine bedeu¬tende neurochemische Entdeckung, da die Rezeptorkomplexe vielmehrals die Rezeptoruntereinheiten für die Ausführung von Gehirnfunk¬tionen verantwortlich sind. Die den Dl-Rezeptor enthaltenden Kom¬plexe, die in der vorliegenden Arbeit durch ein gelbasiertes im¬munchemisches Verfahren isoliert wurden, wiesen ein scheinbaresMolekulargewicht zwischen 480 und 720 kDA auf, was indikativ fürdie Bildung eines Heterooligomers ist, das aus mehreren Rezeptorenbesteht (Tabelle 2) . DIB, D3 und D4 (DIB ist ein Vertreter der Fa¬milie der Dl-Rezeptoren, wohingegen D3 und D4 zur Familie der D2-Rezeptoren gehören) [35] ebenso wie GluR2, NR1, NR2A, 5HT3D unddie katalytischen Alpha- und Beta-Untereinheiten der cAMP-abhängi-gen Proteinkinasen wurden in dem Rezeptorkomplex eindeutig identi¬fiziert. In der Tat interagieren einige der Rezeptoren entwederdirekt (durch eine Bindung an den Rezeptor) oder indirekt mit demDl-Rezeptor, wie z. B. AMPARs [36, 37] und NMDARs [38, 39]. ImRahmen der vorliegenden Erfindung wurden eine Reihe an zusätzli¬chen Rezeptoren bewertet, die in Tabelle 2 aufgeführt sind undmittels Massenspektrometrie identifiziert wurden. Die Rezeptorenmit einer geringeren Häufigkeit wurden mit einer niedrigeren Se¬quenzabdeckung und die Rezeptoren mit einer größeren Häufigkeitwurden mit einer höheren Sequenzabdeckung identifiziert, was siein eindeutiger Weise als Komponenten des Komplexes identifizierte.Des Weiteren wurde der Serotoninrezeptor 5HT3D, der eindeutigidentifiziert wurde, zuvor noch nie als eine Komponente des Dl-Re¬zeptor komplexes genannt. Dl und D2 bilden heterooligomere Rezep¬torkomplexe [40, 41], obwohl sie sich bezüglich ihrer jeweiligenAktivitäten bei der Ausübung ihrer biochemischen, elektrophysiolo-gischen oder psychomotorischen Wirkung gegenseitig funktionell op¬ ponieren oder verstärken können [42]. Die Ergebnisse der vorlie¬genden Studie zeigen, dass die vorliegenden Mengen an D2 enthal¬tenden Rezeptorkomplexen in weiblichen DS-Patienten erhöht waren,während die Spiegel der männlichen DS-Patienten mit denen der Kon-trollpersonen vergleichbar waren. Die Erkenntnisse reflektierenunter Umständen die mögliche Entkopplung von Dl und D2, die mitden geschlechtsabhängigen Verhaltensdefiziten in Verbindung stehenkönnten, wie sie beim Down-Syndrom zu beobachten sind [50] . Diedurch die Ergebnisse der vorliegenden Studie aufgezeigten ge-schlechtsabhängigen Unterschiede bezüglich der untersuchten Rezep¬torkomplexe stellen unter Umständen eine Reflexion oder Paralleleder primären Veränderungen in Anomalien des Dl-Rezeptors dar undkönnen zu den mentalen Defiziten beitragen, die mit dem Down-Syn¬drom assoziiert sind. In der Tat sind die mentalen Defizite undVerhaltensveränderungen, die in männlichen und weiblichen DS-Pati-enten zu beobachten sind, unterschiedlich [43, 44] . An diesen Un¬terschieden kann das cholinerge System beteiligt sein, da eine Ak¬tivierung von Dl-Rezeptoren die cholinerge Transmission verstärktund in Patienten mit dem Down-Syndrom ein nikotinerges cholinergesDefizit auftritt (siehe oben). Die vorliegenden Mengen der nikoti-nergen a4- und a7-AChR enthaltenden Komplexe waren in den fetalenGehirnen von weiblichen DS-Patienten signifikant reduziert. Die inden fetalen Gehirnen von Patienten mit dem Down-Syndrom gemachtenBeobachtungen legen nahe, dass Veränderungen der vorliegenden Men¬gen an Hirnrezeptorkomplexen den neuropathologischen Veränderungenvorausgehen, die unweigerlich im späteren Leben auftreten werden[45] . Es wurde bereits angedeutet, dass der Dl-Rezeptor ein zen¬traler Faktor in neurodegenerativen Erkrankungen ist [46], wiez. B. der Parkinson-Krankheit [47], der Chorea Huntington [48],der Schizophrenie [49] und der Alzheimer-Krankheit), in denen an¬omale striatale Dl-Rezeptoren, nicht jedoch D2-Rezeptoren, sowieeine reduzierte Dichte an Dl-Rezeptoren im Hippocampus vorliegen[50] .

Tabelle 1. Aufgeführt sind Code, Gestationswoche, Diagnose undGeschlecht der jeweiligen Individuen. In dieser Studie wurde Gewe¬be aus dem frontalen Kortex verwendet.

Tabelle 2. In einer gelbasierten Massenspektrometrie von Im¬munpräzipitaten zeigte sich das Vorliegen einiger Rezeptoren undProteinkinasen.

Referenzen : 1. Gardiner KJ. Molecular basis of pharmacotherapies forcognition in Down syndrome. Trends Pharmacol Sei. 2010; 31(2): 66-73. 2. Arai Y, Mizuguchi M, Takashima S. Excessive glutamatereceptor 1 immunoreactivity in adult Down syndrome brains. PediatrNeurol. 1996; 15(3): 203-6. 3. Florez J, del Arco C, Gonzalez A, Pascual J, Pazos A.Autoradiographic studies of neurotransmitter receptors inthe brain of newborn infants with Down syndrome. Am J Med Genet Suppl. 1990; 7:301-5. 4. Bar-Peled 0, Israeli M, Ben-Hur H, Hoskins I, Groner Y,Biegon A. Developmental pattern of muscarinic receptors in normaland Down's syndrome fetal brain--an autoradiographic study.Neurosci Lett. 1991; 133(2): 154-8. 5. Deutsch SI, Rosse RB, Mastropaolo J, Chilton M.Progressive worsening of adaptive functions in Down syndrome maybe mediated by the complexing of soluble Abeta peptides with thealpha 7 nicotinic acetylcholine receptor: therapeuticimplications. Clin Neuropharmacol. 2003; 26(5): 277-83. 6. Costa AC. On the promise of pharmacotherapies targeted atcognitive and neurodegenerative components of Down syndrome. DevNeurosci. 2011; 33(5): 414-27. 7. Wallace TL, Ballard TM, Pouzet B, Riedel WJ, WettsteinJG. Drug targets for cognitive enhancement in neuropsychiatricdisorders. Pharmacol Biochem Behav. 2011; 99(2): 130-45. 8. Granholm AC, Sanders LA, Crnic LS. Loss of cholinergicphenotype in basal forebrain coincides with cognitive decline in amouse model of Down's syndrome. Exp Neurol. 2000; 161(2): 647-63. 9. Wang X, Zhao Y, Zhang X, Badie H, Zhou Y, Mu Y, et al.Loss of sorting nexin 27 contributes to excitatorysynaptic dysfunction by modulating glutamate receptorrecycling in Down's syndrome. Nat Med. 2013; 19(4): 473-80. 10. Chen P, Li X, Sun Y, Liu Z, Cao R, He Q, et al. Proteomicanalysis of rat hippocampal plasma membrane: characterization ofpotential neuronal-specific plasma membrane proteins. J Neurochem.2006; 98 (4) : 1126-40 . 11. Ghafari M, Falsafi SK, Hoeger H, Lubec G. Hippocampallevels of GluRl and GluR2 complexes are modulated by training inthe Multiple T- maze in C57BL/6J mice. Brain Struct Funct. 2012;217(2) : 353-62. 12. Welinder C, Ekblad L. Coomassie staining as loadingcontrol in Western blot analysis. J Proteome Res. 2011; 10(3):1416-9. 13. Ghafari M, Hoger H, Keihan Falsafi S, Russo-Schlaff N,Poliak A, Lubec G. Mass spectrometrical identification ofhippocampal NMDA receptor subunits NR1, NR2A-D and five novelphosphorylation sites on NR2A and NR2B. J Proteome Res. 2012;11 (3) : 1891-6. 14. El-Ghundi M, Fletcher PJ, Drago J, Sibley DR, O'Dowd BF,George SR. Spatial learning deficit in dopamine D(l) receptorknockout mice. Eur J Pharmacol. 1999; 383(2): 95-106. 15. El-Ghundi M, O'Dowd BF, George SR. Insights into the roleof dopamine receptor systems in learning and memory. Rev Neurosci.2007; 18(1): 37-66. 16. Kerr JN, Wickens JR. Dopamine D-l/D-5 receptoractivation is required for long-term potentiation in the ratneostriatum in vitro. J Neurophysiol. 2001; 85(1): 117-24. 17. Fenu S, Bassareo V, Di Chiara G. A role for dopamine D1receptors of the nucleus accumbens shell in conditioned tasteaversion learning. J Neurosci. 2001; 21(17): 6897-904. 18. Manago F, Castellano C, Oliverio A, Mele A, De LeonibusE. Role of dopamine receptors subtypes, Dl-like and D2-like,within the nucleus accumbens subregions, core and shell, on memory consolidation inthe one- trial inhibitory avoidance task. Learn Mem. 2009; 16(1):46-52 . 19. Sawaguchi T. The role of Dl-dopamine receptors in workingmemory-guided movements mediated by frontal cortical areas.Parkinsonism Relat Disord. 2000; 7(1): 9-19. 20. Castellano C, Cabib S, Puglisi-Allegra S, Gasbarri A,Sulli A, Pacitti C, et al. Strain-dependent involvement of D1 andD2 dopamine receptors in muscarinic cholinergic influences onmemory storage. Behav Brain Res. 1999; 98(1): 17-26. 21. El-Ghundi Μ, Ο'Dowd BF, George SR. Prolonged fearresponses in mice lacking dopamine Dl receptor. Brain Res. 2001;892(1): 86-93. 22. Barch DM. Pharmacological manipulation of human workingmemory. Psychopharmacology (Berl). 2004; 174(1): 126-35. 23. White NM, Packard MG, Seamans J. Memory enhancement bypost- training peripheral administration of low doses of dopamineagonists: possible autoreceptor effect. Behav Neural Biol. 1993;59 (3) : 230-41. 24. Zarrindast MR, Sattari-Naeini M, Motamedi F. Effect of D-1 or D-2 receptor stimulation on memory retrieval in mice. JPsychopharmacol. 1992; 6(4): 526-31. 25. Zarrindast MR, Ardjmand A, Ahmadi S, Rezayof A.Activation of dopamine D1 receptors in the medial septum improvesscopolamine- induced amnesia in the dorsal hippocampus. BehavBrain Res. 2012; 229(1): 68-73. 26. Horiguchi M, Hannaway KE, Adelekun AE, Huang M,Jayathilake K, Meitzer HY. D(l) receptor agonists reverse thesubchronic phencyclidine (PCP)-induced novel object recognition(NOR) deficit in female rats. Behav Brain Res. 2013; 238: 36-43. 27. Lejeune S, Dourmap N, Martres MP, Giros B, Dauge V,Naudon L. The dopamine D1 receptor agonist SKF 38393 improvestemporal order memory performance in maternally deprived rats.Neurobiol Learn Mem. 2013. 28. Hersi AI, Rowe W, Gaudreau P, Quirion R. Dopamine D1receptor ligands modulate cognitive performance and hippocampalacetylcholine release in memory-impaired aged rats. Neuroscience.1995; 69(4): 1067-74. 29. Lauzon NM, Bechard M, Ahmad T, Laviolette SR. Supra-normal stimulation of dopamine D1 receptors in the prelimbiccortex blocks behavioral expression of both aversive and rewardingassociative memories through a cyclic-AMP-dependent signalingpathway. Neuropharmacology. 2013; 67: 104-14. 30. Granado N, Ortiz 0, Suarez LM, Martin ED, Cena V, SolisJM, et al. D1 but not D5 dopamine receptors are critical for LTP,spatial learning, and LTP-Induced arc and zif268 expression in thehippocampus. Cereb Cortex. 2008; 18(1): 1-12. 31. Clausen B, Schachtman TR, Mark LT, Reinholdt M,Christoffersen GR. Impairments of exploration and memory aftersystemic or prelimbic Dl-receptor antagonism in rats. Behav BrainRes . 2011; 223 (2) : 241-54 . 32. Schicknick H, Reichenbach N, Smalla KH, Scheich H,Gundelfinger ED, Tischmeyer W. Dopamine modulates memoryconsolidation of discrimination learning in the auditory cortex.Eur J Neurosci. 2012; 35(5): 763-74. 33. de Lima MN, Presti-Torres J, Dornelles A, Scalco FS,Roesler R, Garcia VA, et al. Modulatory influence of dopaminereceptors on consolidation of object recognition memory. NeurobiolLearn Mem. 2011; 95(3): 305-10. 34. Pezze M, Bast T. Dopaminergic modulation of hippocampus-dependent learning: blockade of hippocampal Dl-class receptorsduring learning impairs 1-trial place memory at a 30-min retentiondelay. Neuropharmacology. 2012; 63(4): 710-8. 35. Beaulieu JM, Gainetdinov RR. The physiology, signaling,and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 2011;63 (1) : 182-217. 36. Yang SN. Sustained enhancement of AMPA receptor- and NMDAreceptor-mediated currents induced by dopamine D1/D5receptor activation in the hippocampus: an essential role ofpostsynaptic Ca2+. Hippocampus. 2000; 10(1): 57-63. 37. Gao C, Sun X, Wolf ME. Activation of D1 dopaminereceptors increases surface expression of AMPA receptors andfacilitates their synaptic incorporation in cultured hippocampalneurons. J Neurochem. 2006; 98(5): 1664-77. 38. Mele A, Castellano C, Felici A, Cabib S, CacciaS, Oliverio A.

Dopamine-N-methyl-D-aspartate interactions in the modulation oflocomotor activity and memory consolidation in mice. Eur JPharmacol. 1996; 308(1): 1-12. 39. Rios Valentim SJ, Jr., Gontijo AV, Peres MD, RodriguesLC, Nakamura-Palacios EM. D1 dopamine and NMDA receptorsinteractions in the medial prefrontal cortex: modulation ofspatial working memory in rats. Behav Brain Res. 2009; 204(1):124-8. 40. Pei L, Li S, Wang M, Diwan M, Anisman H, Fletcher PJ, etal. Uncoupling the dopamine D1-D2 receptor complex exertsantidepressant- like effects. Nat Med. 2010; 16(12): 1393-5. 41. Hasbi A, 0'Dowd BF, George SR. Dopamine D1-D2 receptorheteromer signaling pathway in the brain: emerging physiologicalrelevance. Mol Brain. 2011; 4: 26. 42. Seeman P, Niznik HB, Guan HC, Booth G, Ulpian C. Linkbetween Dl and D2 dopamine receptors is reduced in schizophreniaand Huntington diseased brain. Proc Natl Acad Sei USA. 1989;86(24): 10156-60. 43. Maatta T, Tervo-Maatta T, Taanila A, Kaski M,Iivanainen M. Mental health, behaviour and intellectual abilitiesof people with Down syndrome. Downs Syndr Res Pract. 2006; 11(1):37-43. 44. Asher 0, Tanya R, Shula P. Adaptive and BehavioralDevelopment in Children with Down Syndrome at School Age withSpecial Emphasis on Attention Deficit Hyperactivity Disorder(ADHD); 2011. 45. Unterberger U, Lubec G, Dierssen M, Stoltenburg-Didinger G, Farreras JC, Budka H. The cerebral cortex in fetalDown syndrome. J Neural Transm Suppl. 2003; (67): 159-63. 46. Lebel M, Robinson P, Cyr M. Canadian Association ofNeurosciences Review: the role of dopamine receptor function inneurodegenerative diseases. Can J Neurol Sei. 2007; 34(1): 18-29. 47. Rinne JO, Rinne JK, Laakso K, Lonnberg P, Rinne UK.Dopamine D-l receptors in the parkinsonian brain. Brain Res. 1985;359(1-2): 306-10. 48. Tang TS, Chen X, Liu J, Bezprozvanny I. Dopaminergicsignaling and striatal neurodegeneration in Huntington's disease.J Neurosci. 2007; 27(30): 7899-910. 49. Goldman-Rakic PS, Castner SA, Svensson TH, Siever LJ,Williams GV. Targeting the dopamine Dl receptor in schizophrenia:insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl).2004; 174 (1) : 3-16. 50. Kemppainen N, Ruottinen H, Nagren K, Rinne JO. PET showsthat striatal dopamine Dl and D2 receptors are differentially af¬fected in AD. Neurology. 2000; 55(2): 205-9.

Claims (10)

1. Patentansprüche : 1. Verfahren zur in vitro Diagnose des Grads der mentalenBehinderung im Zusammenhang mit dem Down-Syndrom (DS) in Hirngewe¬beproben, dadurch gekennzeichnet, dass die vorliegende Menge anDopaminrezeptor 1-Komplex (DRl-Komplex) bestimmt und mit der ineiner Kontrollgewebeprobe vorliegenden Menge verglichen wird, dievon einem Individuum erhalten wurde, das nicht an dem DS leidet,wobei eine reduzierte Menge an DRl-Komplex mit dem Grad der menta¬len Behinderung korreliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dassdie Zellen in den Proben homogenisiert sind und Membranfraktionender Zellen bereitgestellt werden, um die vorliegende Menge an DRl-Komplex in der Probe zu bestimmen.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,dass die Bestimmung der vorliegenden Menge an DRl-Komplex unterVerwendung von Antikörpern durchgeführt wird, die spezifisch fürden DRl-Komplex sind.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge¬kennzeichnet, dass die Bestimmung der vorliegenden Menge an DRl-Komplex unter Anwendung von Immunpräzipitation und/oder Massen¬spektroskopie erfolgt.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge¬kennzeichnet, dass die reduzierte Menge an DRl-Komplex im Ver¬gleich zu der Kontrollgewebeprobe um mindestens 30%, bevorzugt ummindestens 40%, insbesondere bevorzugt um mindestens 50% reduziertist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge¬kennzeichnet, dass zusätzlich zu der vorliegenden Menge an DR-Kom-plex ebenfalls die vorliegende Menge an mindestens einem aus dennikotinergen Acetylcholinrezeptoren a4 und cx7, dem NMDA-RezeptorNR1 sowie den Rezeptorkomplexen, die AMPA-Rezeptor-GluRl und GluR3enthalten, bestimmt und mit der in einer von einem Individuum ohneDS erhaltenen Kontrollgewebeprobe vorliegenden Menge an einem odermehreren Rezeptorkomplexen verglichen wird, wobei eine reduzierteMenge an mindestens einem oder mehreren Rezeptorkomplexen mit demGrad der mentalen Behinderung korreliert, sofern die Proben ausweiblichen DS-Gehirnen erhalten wurden.
7. 7. Bildgebendes Verfahren zur in vivo Diagnose des Grads dermentalen Behinderung bei Patienten mit dem Down-Syndrom (DS), da¬ durch gekennzeichnet, dass ein markiertes Dopaminrezeptor-Bin¬dungsagens, bevorzugt ein radioaktiv markierter DRl-Agonist oderein an eine Markierungssubstanz gekoppelter DRl-Agonist, an einenDS-Patienten verabreicht und im Anschluss die Distribution desAgens im Körper des Patienten analysiert wird, indem die an dasAgens gekoppelte Markierungssubstanz abgebildet wird, wobei dieBindung des Agens an den DRl-Komplex anhand der Abbildung des mar¬kierten Dopaminrezeptor-Bindungsagens visualisiert wird und wobeieine reduzierte Menge des an den DRl-Komplex bindenden Agens mitdem Grad der mentalen Behinderung korreliert.
8. 8. Bildgebendes Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn¬zeichnet, dass die Distribution des Agens im Gehirn oder in spezi¬fischen Hirnregionen analysiert wird.
9. 9. Agens, das an den DRl-Komplex bindet, zur Verwendung indem Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 oder zur Behandlung der men¬talen Behinderungen von DS-Patienten.
10. 10. Agens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass essich bei dem Agens um einen DRl-Agonisten, bevorzugt um Derivatevon Dihydrexidin, insbesondere A-86929, Dihydrexidin, Dinapsolin,Dinoxylin und Doxanthrin; um Derivate von Benzazepin, insbesondereSKF-81297, SKF-82958, SKF-38393, Fenoldopam und 6-Br-APB; oder umA-68930, A-77636, CY-208,243, SKF-89145, SKF-89626, 7,8-Dihydroxy-5-phenyl-octahydrobenzo[h]isochinolin, Cabergolin und Pergolidhandelt, wobei die Verwendung von DRl-Antagonisten, wie z. B. De¬rivaten von Benzazepin, insbesondere SCH-23,390, SKF-83,959 oderEcopipam (SCH-39, 166), im Rahmen der vorliegenden Erfindung eben¬falls möglich ist.