AT523014B1 - Funktionaler Cytochrom P450 in vitro-Test - Google Patents

Funktionaler Cytochrom P450 in vitro-Test

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt bereit: Ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität einer Cytochrom P450-Enzymvariante, insbesondere einer CYP2D6-Variante oder eines ihrer Orthologe. Die vorliegende Erfindung stellt ferner bereit: Ein Kit mit den erforderlichen Reagenzien zur Durchführung des hierin offenbarten Verfahrens.

Description

Ss N
Beschreibung
FUNKTIONALER CYTOCHROM P450 IN VITRO-TEST
[0001] Die vorliegende Erfindung stellt bereit: Ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität einer Cytochrom P450-Enzymvariante, insbesondere einer CYP2D6-Variante oder eines ihrer Orthologe. Die vorliegende Erfindung stellt ferner bereit: Ein Kit mit den erforderlichen Reagenzien zur Durchführung des hierin offenbarten Verfahrens.
[0002] Cytochrom P450 (CYP450) ist eine Familie von Monoxygenase-Enzymen mit einer HämGruppe als Kofaktor, die für die Oxidation mehrerer Moleküle, darunter Steroide, Fettsäuren und Xenobiotika, verwendet wird [1]. Diese Enzyme werden in allen Lebensreichen gefunden, und in Säugetieren befinden sie sich meistens in den Mikrosomen von Hepatozyten oder anderen Zelltypen wie Dünndarm, Lunge, Plazenta und Nieren [2]. CYP450-Enzyme sind unentbehrlich für den Arzneimittelmetabolismus, und obwohl in dieser Familie mehr als 50 Isoformen identifiziert wurden, metabolisieren lediglich sechs von ihnen (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 und CYP3A5) 90% der existierenden Arzneimittel [2, 3].
[0003] Obwohl es nur 1-4% aller hepatischen CYP450 ausmacht, ist CYP2D6 eines der wichtigsten metabolischen Enzyme; es ist verantwortlich für den Metabolismus von etwa 25% der häufig verschriebenen Medikamente, mit besonderer Relevanz für Antidepressiva und Antipsychotika [4-7]. Obwohl sein Gen relativ klein ist (etwa 4.4kb, mit 9 Exons und 8 Introns), gibt es mehr als 135 einzelne Allele, definiert als Stern(*)-Allele, die in der menschlichen CYP450- Allel-Nomenklatur-Datenbank, Pharmacogene Variation Consortium (PharmVar), registriert sind [8].
[0004] Aufgrund der polymorphen Natur des Gens nimmt die Enzymaktivität von CYP2D6 ein breites Spektrum ein, was zu vier unterschiedlichen Haupt-Phänotypen führt: Ultraschnelle Metabolisierer (UM), normale Metabolisierer (NM), intermediäre oder mittlere Metabolisierer (IM) und schwache Metabolisierer (PM) [9]. Unter diesen Phänotypen besteht bei UM und PM das höchste Risiko für unerwünschte Wirkungen oder Therapieversagen. In Anbetracht dessen, dass alleine in Europa 15-25 % der Bevölkerung nicht NM des CYP2D6 sind [10, 11], ist es von besonderer Wichtigkeit, die metabolische Aktivität des Enzyms für eine zielgerichtete Behandlung zu bestimmen.
[0005] Trotz dieser Tatsache sind gemäß PharmVar [8] nur einige ausgewählte der bekannten CYP2D6-Varianten funktionell gut charakterisiert. Ein Verfahren zur Bestimmung der CYP2D6Aktivität ist die therapeutische Medikamentenspiegelbestimmung (TDM), wobei ein von CYP2D6 metabolisiertes Arzneimittel einem Patienten verabreicht wird, und die Konzentrationen von dessen Metabolit in der interessierenden biologischen Flüssigkeit unmittelbar gemessen werden [12]. Obwohl es Patienten-spezifisch ist, ist das Verfahren nur in Hinblick auf das verabreichte Arzneimittel akkurat, arbeitsaufwendig, logistisch herausfordernd (Proben müssen auf Trockeneis vorgehalten werden und innerhalb von 24 Stunden analysiert werden), kostenintensiv, und die erhaltenen Werte unterscheiden sich in hohem Ausmaß von Labor zu Labor. Und es berücksichtigt nicht ausschließlich die CYP2D6-Funktion, sondern vielmehr den gesamten Stoffwechselweg des verabreichten Medikaments, den Beitrag von epigenetischen Faktoren, sowie von Faktoren, die nicht ohne weiteres kontrolliert werden können (ernährungsbedingte Inhibierung oder Aktivierung von verschiedenen CYP-Systemen).
[0006] Ferner sollte, um die Aktivität einer spezifischen CYP2D6-Variante in vivo eindeutig zu identifizieren, der Genotyp aufschlussreich sein. Das bedeutet, dass das interessierende Allel entweder i) in Homozygosität oder ii) Heterozygosität zu einer vollständigen CYP2D6-Deletion (CYP2D6*5) vorkommen muss. Aber die meisten CYP2D6-Varianten sind selten; darum sind Patienten mit derart aufschlussreichen Genotypkonstellationen für TDM-Studien nicht leicht zu finden. Während außerdem für die genetisch prognostizierten Phänotypen (PM bis UM) spezifische Dosierungsempfehlungen z.B. über das CPIC (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium) verfügbar sind, gibt es keine so klare Dosierungsempfehlung für den Ansatz der therapeutischen Medikamentenspiegelbestimmung (TDM).
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[0007] Die Generierung einiger in silico Aktivitäts-Vorhersage-Studien war eine der früheren Strategien, die zur Identifizierung der Aktivität von CYP2D6-Allelen verwendet wurden [13-15], aber Schwierigkeiten aufgrund der heterogenen Ergebnisse und fehlendes Wissen auf der Stufe der CYP2D6-Proteinstruktur und -konformation führten zu Diskussionen, welche die Zuverlässigkeit dieser Algorithmen infrage stellten.
[0008] Auf der Suche nach einem zielgerichteteren und zuverlässigeren System für die Analyse der CYP2D6-Aktivität wurden verschiedene in vitro Hochdurchsatz-Screening-Tests, basierend auf der Messung des Metabolismus synthetischer oder nicht synthetischer Substrate, entweder mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) [16, 17], Radioaktivität [18], Fluoreszenz [19, 20], oder einer Kombination daraus, entwickelt [21-23]. Betrachtet man Fluoreszenzbasierte Tests, liegt eine der Haupteinschränkungen in der Anwesenheit von intrinsischer Fluoreszenz oder Löschung, insbesondere bei Inhibierungs-Studien mit Verbindungen, die von natürlichen Produkten abgeleitet sind, die somit jeweils zu einer Über- oder Unterschätzung der Enzymaktivität führen [24].
[0009] Um dieses Problem zu vermeiden, wurden die Biolumineszenz- Tests der zweiten Generation entwickelt [25], von denen einer die Verwendung eines Methoxy-Luciferin-Ethylenglykolesters (Luciferin-ME-EGE) involviert. Luciferin-ME-EGE ist ein Luciferinderivat, das durch CYP2D6 zu Luciferin-Ethylenglykolester (Luciferin-EGE) demethyliert wird, einem Molekül, das anschlieBend durch eine Esterase hydrolysiert wird, um freies Luciferin freizusetzen. Als ein letzter Schritt verwandelt ein Luciferase-Enzym das Luciferin zu einem Lichtsignal, das zur CYP2D6-Aktivität direkt proportional ist [26]. Das System wurde bei CYP2D6-Inhibitionierungsstudien mit Erfolg eingesetzt [27-29], aber bis dato gibt es keinen Bericht über eine extensive Studie betreffend verschiedene allelische CYP2D6-Varianten. Der Grund hierfür ist, dass Luciferin-ME-EGE nicht nur für CYP2D6 spezifisch ist. Tatsächlich kann Luciferin-ME-EGE auch von CYP1A1 und CYP1A2 metabolisiert werden, was seine Verwendung begrenzt für rekombinantes CYP2D6, das mit einem NADPH-Regenierungssytem gekoppelt ist [26], nicht für die Analyse mikrosomaler Extrakte aus der Leber oder dem Zellinneren. Da die Herstellung von rekombinantem CYP2D6 für jede einzelne Variante zeitintensiv und ressourcenintensiv wäre, ist klar, dass dieses System für eine Hochdurchsatzanalyse nicht ideal ist.
[0010] Somit besteht das technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Funktionalität von CYP2D6-Varianten auf rasche, kosteneffiziente und verlässliche Weise.
[0011] Das obige technische Problem wird durch die Bereitstellung des in den Ansprüchen gekennzeichneten Verfahrens gelöst.
KURZE BESCHREIBUNG DER SCHRITTE DER ERFINDUNG
[0012] Es ist wichtig, anzumerken, dass die offiziellen Wildtyp-Referenzsequenzen für Gene, MRNA-Transkripte und Proteine in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) angegeben sind. Für den CYP2D6-Wildtyp sind dies NG_008376.4 für das Gen, NM_000106.6 für das mRNA-Transkript und NP_000097.3 für das Protein. Der Referenz-Sequenz für CYP2D6 wurde auch eine Orts- oder Locus-Referenz-Genom(LRG)-Nummer, LRG_303, zugewiesen. Pharmacogene Variation Consortium (PharmVar) ist die offizielle Pharmakogen-Nomenklatur-Datenbank und weist ihre eigenen Identifikationsnummern zu, PharmVar IDs (PVIDs) zu CYP450-Allelen-Varianten, die sich von den Wildtyp-NCBI-Referenzsequenzen innerhalb eines bestimmten Koordinatensatzes unterscheiden, die auf der PharmVar-Website (www.pharmvar.org) definiert sind.
[0013] SEQ ID NO: 1 entspricht der Nukleinsäuresequenz des humanen Wildtyp-CYP2D6-Gens.
[0014] SEQ ID NO: 2 entspricht der Nukleinsäuresequenz des humanen Wildtyp-CYP2D6MRNA-Transkripts.
[0015] SEQ ID NO: 3 entspricht der Polypeptidsequenz des humanen Wildtyp-CYP2D6-Proteins. [0016] SEQ ID NO: 4 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanva
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riante CYP2D6*3(PV00428).
[0017] SEQ ID NO: 5 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*9(PV00434).
[0018] SEQ ID NO: 6 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*10(PV00435).
[0019] SEQ ID NO: 7 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*14(PV00439).
[0020] SEQ ID NO: 8 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*29(PV00453).
[0021] SEQ ID NO: 9 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*108(PV00525).
[0022] SEQ ID NO: 10 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*108(1 modifiziert). (c.1074A>G)
[0023] SEQ ID NO: 11 entspricht der Nukleinsäuresequenz des mRNA-Transkripts der Humanvariante CYP2D6*108(1 modifiziert). (c. 1083A>G)
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
[0024] Figur 1: Schema des Protokolls für den funktionalen CYP2D6-in vitro-Test gemäß der Erfindung.
[0025] Figur 2: Funktionale Analyse der CYP2D6*108(PV00525)-Variante und zweier Modifikationen von CYP2D6*108 gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
[0026] Figur 3: Funktionale Analyse der CYP2D6*9(PV00434), CYP2D6*10(PV00435), CYP2D6*14(PV00439) und CYP2D6*29(PV00453)-Varianten gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
[0027] In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität einer CYP450-Variante oder eines ihrer Orthologe, zumindest ein Substrat zu metabolisieren, mit den folgenden Schritten:
i) Bereitstellen humaner Zielzellen, die kein Enzym der Cytochrom P450-Familie (CYP450) exprimieren oder eine nicht-funktionale Variante eines CYP450-Enzyms exprimieren oder ein CYP450-Enzym exprimieren, das nicht in den Metabolismus des verwendeten Substrats involviert ist,
il) Transfizieren der Zielzelle mit mindestens einer Nukleinsäure, die mindestens eine CYP450Variante oder eines ihrer Orthologe kodiert,
ill) Kultivieren der transfizierten Zielzellen in der Anwesenheit von mindestens einem Substrat unter Bedingungen, die eine Expression der CYP450-Variante oder ihres Orthologs und den Metabolismus des Substrats gestatten; und
iv) Bestimmen des Ausmaßes des durch CYP450 induzierten Metabolismus des Substrats, wobei die Detektion des durch CYP450 induzierten Metabolismus des Substrats CYP-450-Aktivität anzeigt.
[0028] Der Ausdruck “CYP450-Variante” bezieht sich auf jede humane CYP450-Variante, einschließlich des Wildtyps sowie jedweden Allels, Haplotyps, oder mutierter Version davon. D.h. das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestimmung der Funktionalität von jedem CYP450Protein verwendet werden, das entweder durch die Wildtyp-Sequenz oder veränderte Varianten davon, wie bestimmte Allele, Haplotypen, Mutanten etc., kodiert ist.
[0029] Die in Schritt i) bereitgestellten humanen “Zielzellen” sind die in Schritt ii) zu transfizieren-
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den Zellen. Bevor sie transfiziert werden, werden die Zellen als “Zielzellen” bezeichnet, während sie nach der Transfizierung als “transfizierte Zellen” bezeichnet werden. Die Zielzellen umfassen keine Nukleinsäure, die ein Enzym der Cytochrom P450-Familie (CYP450) kodiert. Wenn die Zielzellen eine Nukleinsäure umfassen, die ein Enzym der Cytochrom P450-Familie (CYP450) kodiert, kodiert die Nukleinsäure lediglich eine nicht-funktionale Variante eines CYP450-Enzyms, das ein entsprechendes Substrat nicht zu metabolisieren vermag. Somit vermögen die Zielzellen nicht, ein funktionales Enzym der CYP450-Familie zu exprimieren. Mit anderen Worten exprimieren die Zielzellen kein Enzym der Cytochrom-P450-Familie endogen. Wenn ferner die Zielzellen ein funktionales CYP-Enzym exprimieren, ist es ein CYP-Enzym, das nicht in den Metabolismus des verwendeten Substrats involviert ist, d.h. das nicht vermag, das verwendete Substrat auf eine Weise wie die interessierende CYP450-Variante zu metabolisieren. Hierdurch wird sichergestellt, dass das gemessene Ergebnis, d.h. der CYP450-induzierte Metabolismus des Substrats, lediglich auf die CYP450-Variante zurückgeht, die durch die Nukleinsäure kodiert ist, die in die Zielzelle transfiziert wird.
[0030] Die Kultivierungsbedingungen in Schritt ii) sind so, dass sie eine Expression eines CYP450-Polypeptids ermöglichen. Kultivierungsbedingungen zu optimieren, um die Expression des Polypeptids zu ermöglichen, gehört zu den Routinefähigkeiten eines Fachmanns. Ferner ist die Identifikation, ob die gewählten Kultivierungsbedingungen eine Polypeptidexpression ermöglichen oder nicht, ebenfalls Routine, und das Ausmaß der Polypeptidexpression kann durch Anwendung von Standardtechniken wie ELISA oder Western Blotting bestimmt werden.
[0031] Die Kultivierungsbedingungen in Schritt ii) sind in Anwesenheit des Substrats und sind so, dass sie einen CYP450-induzierten Metabolismus des Substrats ermöglichen. Mit anderen Worten sind die Kultivierungsbedingungen so, dass wenn ein funktionales CYP450-Enzym in der Testprobe enthalten wäre, sich zumindest etwas CYP450-induzierter Metabolismus ereignen würde. Die Kultivierungsbedingungen zu optimieren, um CYP450-induzierten Metabolismus des Substrats zu ermöglichen, gehört zu den Routinefähigkeiten eines Fachmanns.
[0032] Der Ausdruck “Substrat” bezieht sich auf ein Molekül, auf das ein Enzym einwirkt, d.h. für die vorliegende Erfindung, auf das ein Enzym der CYP450-Familie einwirkt. Im Fall eines einzelnen Substrats verbindet sich das Substrat mit der aktiven Stelle des Enzyms, und es wird ein Enzym-Substrat-Komplex gebildet. Das Substrat wird in ein oder mehrere Produkte umgewandelt, die dann von der aktiven Stelle freigesetzt werden. Die aktive Stelle kann dann ein weiteres Substrat-Molekül annehmen.
[0033] Das Substrat kann der transfizierten Zelle bei Beginn der Zellkultivierung zugegeben werden, oder kann später zugegeben werden, wenn die Polypeptidexpression bereits begonnen hat. Den Zeitpunkt zu optimieren, zu dem die transfizierte Zelle in Anwesenheit des Substrats kultiviert wird, gehört zu den Routinefähigkeiten eines Fachmanns.
[0034] Ferner ist es möglich, die Zellen mit mehr als einem Substrat zu inkubieren, wobei die Substrate entweder alle synthetische Substrate sind, oder alle nicht synthetische Substrate sind, oder eine Mischung aus beiden. Hierdurch kann die Funktionalität einer CYP2D6-Variante, verschiedene Substrate zur gleichen Zeit oder nacheinander zu metabolisieren, bestimmt werden.
[0035] Der Ausdruck “Ortholog” bezieht sich auf jede homologe Gensequenz für CYP2D6, die in verschiedenen Spezies, wie zum Beispiel in Pferd, Katze, Hund, etc., vorkommt.
[0036] Der Ausdruck “Transfizierung” bezieht sich auf jedes Verfahren, das den Transfer von Nukleinsäuren in Säugetierzelle ermöglicht, ohne Beschränkung auf die tatsächliche Art und Weise des Transferierens der Nukleinsäuren oder der Zielzelle/des Zielorganismus. D.h. die Ausdrücke „Transfizierung” oder „Transfektion“, “Transduzierung” oder „Transduktion“ und “Transformation” werden hierin austauschbar verwendet.
[0037] Der Ausdruck “Nukleinsäure” bezieht sich auf jede Art von Nukleinsäuresequenz, die eine CYP450-Variante kodiert. Das kann zum Beispiel eine einsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuresequenz oder ein Vektor sein. Bevorzugt ist die Nukleinsäure Teil eines Expressionsvektors (hierin als “Vektor” bezeichnet). Das Bereitstellen eines geeigneten Vektor für die Zwecke
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der vorliegenden Erfindung gehört den Routinefähigkeiten eines Fachmanns.
[0038] Der Ausdruck “Bestimmen des Ausmaßes des durch CYP450 induzierten Metabolismus des Substrats” bezieht sich auf jedes geeignete Verfahren, das es gestattet, die Funktionalität oder Aktivität der CYP450-Enzymvariante, die durch Nukleinsäure kodiert ist, basierend auf dem Ausmaß des Metabolismus des Substrats zu bestimmen, abzuschätzen oder zu messen. Dies gehört zu den Routinetätigkeiten eines Fachmanns. Dabei werden die Ausdrücke „Funktionalität“ und „Aktivität“ austauschbar verwendet. Durch die Bestimmung des Grades des Ausmaßes des Metabolismus des Substrats kann korreliert werden, wie funktional/aktiv die CYP450-Variante ist.
[0039] In dem Verfahren gemäß der Erfindung umfasst der Schritt des Bestimmens der Funktionalität der CYP450-Variante die Behandlung der transfizierten Zellen mit mindestens einem CYP450-Substrat, wobei der Grad des Metabolismus des Substrats, mit anderen Worten der Grad des CYP450-induzierten Metabolismus des Substrats, der Aktivität des durch die Nukleinsäure oder den Vektor exprimierten CYP450 entspricht, wobei ein hoher Grad an Metabolismus einer hohen Aktivität der CYP450-Variante entspricht. Um die Funktionalität der CYP450-Variante zu testen, können die Zellen, die mit dem Vektor transfiziert sind, der die CYP450-Variante kodiert, mit jeder Art interessierenden Substrats behandelt werden. Jede Variante wird dann in eine der vier Kategorien I) Funktionsverlust, ii) Funktionsabnahme, iii) normale Funktion, und iv) Funktionszunahme eingeordnet.
[0040] Der Ausdruck „nicht funktionale Variante eines CYP450-Enzyms“ oder „nicht funktionale CYP450-Enzymvariante“ bezieht sich jedes Enzym der CYP450-Familie, das kein Substrat zu metabolisieren vermag, aus welchem Grund auch immer. Mögliche nichtfunktionale Varianten sind CYP2D6*4(PV00429), CYP2C9*6(PV00542), CYP2C19*2(PV00599), CYP2A13*7 (PV00275), CYP2B6*8(PV00746), unter anderen.
[0041] Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht, CYP450-Varianten in einem Säugetier-Zellsystem leicht, rasch und zuverlässig zu testen und Information über deren Funktionalität in Bezug auf verschiedene Substrate zu erhalten.
[0042] Verglichen mit anderen eukaryotischen Zellsystemen (Hefe- oder Insektenzellen), die verwendet werden, um die Funktion von CYP-Enzymen zu untersuchen, hat die vorliegende Erfindung den Vorteil, die CYP-Enzym-Funktion in einem Säugetier-Zellsystem, insbesondere einem humanen Zellsystem, zu bestimmen, wobei hierfür die normale Umgebung bereitgestellt wird, in der menschliche Enzyme funktionieren.
[0043] Verglichen mit in vivo-Verfahren an Menschen hat die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass sie nicht invasiv ist, und dass sie ferner ermöglicht, verschiedene Substrate zu untersuchen, ohne dass es notwendig wäre, die Gesundheit eines Patienten zu riskieren.
[0044] Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren rasch durchgeführt werden, was bedeutet, dass die benötigte Information über die Funktionalität einer CYP450-Variante innerhalb weniger Tage erhalten werden kann. Hierdurch ist es möglich, innerhalb weniger Tage zu entscheiden, welche Art von medikamentöser Behandlung dem Patienten zur Verfügung gestellt werden kann, ohne Nebenwirkungen oder die Möglichkeit, dass der Patient auf die bereitgestellte medikamentöse Behandlung nicht reagieren wird, zu riskieren.
[0045] Ferner stellt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, da die transfizierten Zielzellen humane Zellen sind, ein System bereit, das der natürlichen Umgebung der humanen CYP450-Variante, die durch die Nukleinsäure kodiert ist, ähnelt. Darum besteht keine Notwendigkeit, eine künstliche Umgebung zu erzeugen, die derjenigen einer humanen Zelle nahe kommt, zum Beispiel indem ein entsprechendes NADPH-Regenierungssystem zur Verfügung gestellt wird. Die Umgebung der humanen Zelle ermöglicht der kodierten CYP450-Variante, so zu agieren, wie unter Bedingungen, die in einem menschlichen Körper vorgesehen sind. Darum ist sichergestellt, dass die Funktionalität/Aktivität der CYP450-Variante nicht behindert oder verändert ist verglichen mit ihrer Funktionalität/Aktivität im menschlichen Körper. Somit ermöglicht das Verfahren gemäß der Erfindung, die Funktionalität der kodierten CYP450-Variante unter Bedingungen zu bestimmen, die beinah identisch mit denjenigen in einem menschlichen Körper sind.
[0046] Aufgrund der Verwendung einer Zielzelllinie, die kein (funktionales) Enzym der Cytochrom P450 (CYP450)-Familie endogen exprimiert, oder wenn, dann nur ein CYP450-Enzym, das nicht in den Metabolismus des verwendeten Substrats involviert ist, wird das Ergebnis des Verfahrens lediglich die Funktionalität der CYP450-Variante widerspiegeln, die in die Zelllinie transfiziert wurde, und nicht durch eine CYP-Enzymaktivität beeinflusst sein, die durch das Genom der Zielzelle kodiert ist.
[0047] Mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann Information über die Funktionalität einer einzelnen oder verschiedener CYP450-Variante(n) rasch, leicht und auf zuverlässige Weise erhalten werden, die es ermöglicht, (i) die spezifische Funktion der einzelnen oder multiplen genetischen Varianten und/oder (ii) Substratspezifitäten von diesen zu untersuchen. Darum wird eine rasche und präzise Entscheidung über die Möglichkeiten der medikamentösen Behandlung für einen Patienten, der diese benötigt, ermöglicht.
[0048] Ferner können mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung leicht Datenbanken generiert werden, welche die Information über die Funktionalität der verschiedenen CYP450-Varianten enthalten, die helfen können, Funktionalitäten von CYP450-Varianten weiter vorherzusagen.
[0049] Die vorliegende Erfindung ist auf jede Enzym-Variante der CYP450-Familie anwendbar.
[0050] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die CYP450Variante eine CYP2D6-Variante.
[0051] Zum Beispiel basiert die Variante CYP2D6*29(PV00453) auf dem Wildtyp CYP2D6*1 (PV00126) mit den folgenden Unterschieden: c.425G>A, c.427G>C, c.905C>T, c.1031G>A, c.1476G>C.
Sämtliche CYP2D6-Allelen-Varianten sind offiziell angenommen und katalogisiert durch bzw. in PharmVar, was zum derzeitigen Zeitpunkt die folgenden CYP2D6-Varianten einschließt: CYP2D6*1 (PV00126), CYP2D6*2(PV00427), CYP2D6*3(PV00428), CYP2D6*4 (PV00429), CYP2D6*5 (PV00430), CYP2D6*6(PV00431), CYP2D6*7(PV00432), CYP2D6*8 (PV00433), CYP2D6*9 (PV00434), CYP2D6*10 (PV00435), CYP2D6*11 (PV00436), CYP2D6*12 (PV00437), CYP2D6*13 (PV00438), CYP2D6*14 (PV00439), CYP2D6*15 (PV00440), CYP2D6*17 (PV00441), CYP2D6*18 (PV00442), CYP2D6*19 (PV00443), CYP2D6*20 (PV00444), CYP2D6*21 (PV00445), CYP2D6*22 (PV00446), CYP2D6*23 (PV00447), CYP2D6*24 (PV00448), CYP2D6*25 (PV00449), CYP2D6*26 (PV00450), CYP2D6*27 (PV00451), CYP2D6*28 (PV00452), CYP2D6*29 (PV00453), CYP2D6*30 (PV00454), CYP2D6*31 (PV00455), CYP2D6*32 (PV00456), CYP2D6*33 (PV00457), CYP2D6*34 (PV00458), CYP2D6*35 (PV00459), CYP2D6*36 (PV00460), CYP2D6*37 (PV00461), CYP2D6*38 (PVO00462), CYP2D6*39 (PV00463), CYP2D6*40 (PV00464), CYP2D6*41 (PV00465), CYP2D6*42 (PV00466), CYP2D6*43 (PV00467), CYP2D6*44 (PV00468), CYP2D6*45 (PV00469), CYP2D6*46 (PV00470), CYP2D6*47 (PV00471), CYP2D6*48 (PV00472), CYP2D6*49 (PV00473), CYP2D6*50 (PV00474), CYP2D6*51 (PV00475), CYP2D6*52 (PV00476), CYP2D6*53 (PV00477), CYP2D6*54 (PV00478), CYP2D6*55 (PV00479), CYP2D6*56 (PV00480), CYP2D6*57 (PV00481), CYP2D6*58 (PV00482), CYP2D6*59 (PV00483), CYP2D6*60 (PV00484), CYP2D6*61 (PV00485), CYP2D6*62 (PV00486), CYP2D6*63 (PV00487), CYP2D6*64 (PV00488), CYP2D6*65 (PV00489), CYP2D6*68 (PV00490), CYP2D6*69 (PV00491), CYP2D6*70 (PV00492), CYP2D6*71 (PV00493), CYP2D6*72 (PV00494), CYP2D6*73 (PV00495), CYP2D6*74 (PV00496), CYP2D6*75 (PV00497), CYP2D6*81 (PV00498), CYP2D6*82 (PV00499), CYP2D6*83 (PV00500), CYP2D6*84 (PV00501), CYP2D6*85 (PV00502), CYP2D6*86 (PV00503), CYP2D6*87 (PV00504), CYP2D6*88 (PV00505), CYP2D6*89 (PV00506), CYP2D6*90 (PV00507), CYP2D6*91 (PV00508), CYP2D6*92 (PV00509), CYP2D6*93 (PV00510), CYP2D6*9 (PV00511)4, CYP2D6*95 (PV00512), CYP2D6*96 (PV00513), CYP2D6*97 (PV00514), CYP2D6*98 (PV00515), CYP2D6*99 (PV00516), CYP2D6*100 (PV00517), CYP2D6*101 (PV00518), CYP2D6*102 (PV00519), CYP2D6*103 (PV00520), CYP2D6*104 (PV00521), CYP2D6*105 (PV00522), CYP2D6*106 (PV00523), CYP2D6*107 (PV00524),
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CYP2D6*108 (PV00525), CYP2D6*109 (PVO00526), CYP2D6*110 (PV00527), CYP2D6*111 (PV00528), CYP2D6*112 (PVO00529), CYP2D6*113 (PVO0530), CYP2D6*114 (PV00531), CYP2D6*115 (PV00532), CYP2D6*116 (PV00533), CYP2D6*117 (PV00534), CYP2D6*118 (PV00535), CYP2D6*119 (PVO00536), CYP2D6*120 (PVO0630), CYP2D6*121 (PVO0631), CYP2D6*122 (PVO0632), CYP2D6*123 (PVO00633), CYP2D6*124 (PVO00634), CYP2D6*125 (PV00681), CYP2D6*126 (PVO0682), CYP2D6*127 (PVO0635), CYP2D6*128 (PVO0683), CYP2D6*129 (PV00684), CYP2D6*130 (PVO0685), CYP2D6*131 (PV00686), CYP2D6*132 (PV00687), CYP2D6*133 (PVO0688), CYP2D6*134 (PVO0689), CYP2D6*135 (PVO0690), CYP2D6*136 (PVO0691), CYP2D6*137 (PVO0692), CYP2D6*138 (PVO0722), CYP2D6*139 (PV00728).
[0052] Diese Liste ist nicht erschöpfend, und ein Fachmann ist sich dessen bewusst, dass Änderungen (Hinzufügungen, Auslassungen oder andere Änderungen) in diesen Listen vorkommen können, aber der Fachmann wird immer in der Lage sein, zu evaluieren, ob eine CYP450-Variante als eine CYP2D6-Varianteangesehen werden kann, oder nicht.
[0053] Für die Kategorisierung der Funktionalität der CYP2D6-Varianten, d.h. des CYP2D6- induzierten Metabolismus des Substrats, wird vorgegangen wie folgt: Funktionsverlust- CYP2D6Varianten haben eine Aktivität, die sich nicht signifikant unterscheidet von der von CYP2D6*3 (der Positivkontrolle für eine Funktionsverlust-Variante). Normale Funktions-Varianten weisen eine Aktivität auf, die sich nicht signifikant unterscheidet von der von CYP2D6*1 (der Positivkontrolle für die normale Funktion). Funktionszunahme-Varianten weisen eine Aktivität auf, die signifikant größer ist, als die von CYP2D6*1. Funktionsabnahme-Varianten weisen eine Aktivität auf, die signifikant höher ist, als die von CYP2D6*3, und signifikant niedriger als die von CYP2D6*1.
[0054] Das Verfahren gemäß der Erfindung kann ferner den Schritt umfassen, dass die Zielzellen mit einem Vektor transfiziert werden, der ein abgesondertes Lumineszenz-erzeugendes Enzym kodiert.
[0055] In dem die Zielzellen mit einem Vektor transfiziert werden, der ein abgesondertes Lumineszenz-erzeugendes Enzym kodiert, kann die Lumineszenz, die von dem abgesonderten Enzym erzeugt wird, d.h. von dem Protein außerhalb der Zelle, korreliert werden mit der Erfolgsrate der Transfektion. Wenn eine hohe Lumineszenz gemessen werden kann, die von dem Protein außerhalb der Zelle stammt, kann davon ausgegangen werden, dass auch eine hohe Vektorlast, die die CYP2D6-Variante kodiert, bei der Transfektion in die Zelle eingedrungen ist, da sowohl die Nukleinsäure, vorzugsweise ein Vektor, d.h. derjenige, der die CYP2D6-Variante kodiert, und derjenige, der ein abgesondertes Lumineszenz-erzeugendes Enzym kodiert, co-transfiziert werden, d.h. parallel transfiziert werden. Das ermöglicht es, Normalisierungsberechnungen zwischen einzelnen Zellen oder Zellkulturen durchzuführen.
[0056] Jede Variante wird dann in eine der vier Kategorien i) Funktionsverlust, ii) Funktionsabnahme, iii) normale Funktion, und iv) Funktionszunahme eingeordnet. Für Details beziehen Sie sich bitte auf den „Materialien und Methoden“-Teil. Somit wird es mit der durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Information möglich, die Funktionalität der CYP2D6-Variante eines Patienten zu kategorisieren, was hilfreich sein kann, um eine Entscheidung über die medikamentöse Behandlung eines Patienten zu treffen.
[0057] In dem Verfahren gemäß der Erfindung können die Zielzellen mit zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Vektoren transfiziert werden, von denen jede oder jeder zumindest eine CYP2D6Variante oder eines ihrer Orthologe kodiert.
[0058] Durch Transfizieren der Zellen mit zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Vektoren, von denen jede oder jeder zumindest eine CYP2D6-Variante oder eines ihrer Orthologe kodiert, ist es möglich, die Situation in einem menschlichen oder tierischen Körper, der immer zwei Allele enthaltend zumindest eine CYP2D6-Variante kodiert, ein Allel von der Mutter und eines vom Vater, besser nachzuahmen.
[0059] Ferner ist es möglich, Kombinationen von CYP2D6-Varianten in einer Zelle zu untersuchen, was unbekannte synergistische oder antagonistische Wirkungen zutage fördern könnte.
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[0060] Es ist auch möglich, dass zwei oder mehr Nukleinsäuren jeweils die gleiche CYP2D6Variante oder ein Ortholog davon kodieren, um eine höhere Expressionsrate der gewünschten Variante zu erzielen.
[0061] Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Zellen auch transfiziert sein mit einer Nukleinsäure oder einem Vektor, die oder der zumindest zwei CYP2D6-Varianten oder ein Ortholog davon kodiert. Durch Transfizieren der Zielzellen mit einer Nukleinsäure oder einem Vektor, der alle interessierenden CYP2D6-Varianten kodiert, wird sichergestellt, dass die Zielzellen gleich erfolgreich mit allen kodierten CYP2D6-Varianten transfiziert wurden, da sie alle durch einen Nukleinsäure oder einen Vektor kodiert werden. Wenn Zellen mit verschiedenen Vektoren transfiziert werden, die verschiedene Gene kodieren, kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Transfektion bzw. Transfizierung eines Vektors erfolgreicher ist als die Transfizierung bzw. die Transfektion des anderen, was zu verschiedenen Mengen an Vektoren in den Zielzellen führt.
[0062] Eine bevorzugte Ausführungsform gemäß der Erfindung umfasst die Transfektion der Zielzellen mit zwei Vektoren, von denen jeder CYP2D6-Variante kodiert.
[0063] Eine bevorzugte Ausführungsform gemäß der Erfindung umfasst die Transfektion der Zielzellen mit einem Vektor, der zwei CYP2D6-Varianten kodiert. Dadurch kann die Situation wie in einem menschlichen Körper mit zwei CYP2D6-Varianten, die durch das Genom kodiert sind, erhalten werden, wobei beide Varianten in den gleichen Mengen transfiziert sind. Dies gilt entsprechend auch für die Transfektion von Zellen mit einem Vektor, der die Orthologen der CYP2D6Varianten kodiert.
[0064] Alle Kombinationen der Menge an Nukleinsäuren oder Vektoren von CYP2D6-Varianten oder ihrer Orthologen sind möglich. Zum Beispiel können die Zellen transfiziert sein mit einem Vektor der eine, zwei, drei, vier, fünf oder mehr CYP2D6-Varianten kodiert. Ein anderes Beispiel wäre, dass die Zellen transfiziert sind mit einem, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Vektoren, von denen jeder eine, zwei, drei, vier, fünf oder mehr CYP2D6-Varianten kodiert.
[0065] Da bekannt ist, dass Menschen tatsächlich multiple Kopien von Varianten haben können, insbesondere CYP2D6-Varianten (bis zu mindestens 13 Kopien), sind Transfizierungen bzw. Transfektionen mit Vektoren, die multiple Kopien kodieren, oder Transfektionen bzw. Transfizierungen mit verschiedenen Vektoren, die multiple Kopien kodieren, sind diese Variationen von dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
[0066] In einer Ausführungsform gemäß der Erfindung ist das durch den Vektor kodierte Ortholog ein Ortholog aus Pferd, Katze oder Hund, unter anderen.
[0067] In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ortholog ein equines Ortholog wie CYP2D50 oder CYP2D14-ähnlich.
[0068] Ein Fachmann ist sich über die Tatsache bewusst, dass die Identifikation oder Sequenzierung von Tiergenomen zu Änderungen führen kann in Bezug auf das, was gegenwärtig als Ortholog des humanen CYP2D6 erachtet werden kann. Darum kann es sein, dass, selbst wenn es hier nicht aufgelistet ist, ein anderes CYP2D6-Ortholog als das CYP2D50 oder CYP2D14ähnliches Ortholog als das equine CYP2D6-Ortholog gemäß dieser Ausführungsform angesehen werden muss.
[0069] Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die CYP2D6-Variante kodiert sein durch eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens 75% identisch ist mit der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.
[0070] Die Ausdrücke „Nukleinsäure“ und „Nukleinsäuresequenz“ werden hierin austauschbar verwendet.
[0071] Wie hierin verwendet, zeigt “Sequenzidentität” zwischen zwei Nukleotidsequenzen den Prozentsatz der zwischen den Sequenzen identischen Nukleinsäuren an, bevorzugt über die gesamte Länge der durch SEQ ID NO:1 und/oder SEQ ID NO:2 kodierten Nukleotidsequenzen.
[0072] Bevorzugten Nukleotidsequenzen der Erfindung weisen eine Sequenzidentität von min-
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destens 75 %, 80 % oder 85 % zu der Nukleotidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 1 kodiert ist, auf, oder weisen eine Sequenzidentität von mindestens 75 %, 80 %, 85 %, 90 % oder 95 % zur SEQ ID NO: 2 auf.
[0073] Für das Verfahren gemäß der Erfindung können die Zielzellen CYP2D6-deffiziente menschliche embryonale Nieren(HEK)-Zellen sein oder eine modifizierte Version davon und/oder die Zielzellen exprimieren keine funktionale CYP450-Enzym-Variante, die in den Metabolismus des Substrats involviert ist. HEK-Zellen sind leicht zu transfizieren und leicht in Bezug auf ihre Handhabung bei der Zellkultivierung.
[0074] Der Ausdruck „modifizierte Version davon“ bezieht sich auf HEK-Zellen, die von HEKZellen abstammen, die aber modifiziert wurden, wie zum Beispiel HEK-Blue'V-Zellen, die entwickelt wurden, um dauerhaft STAT6 zu exprimieren. Es gehört gänzlich zum Wissen eines Fachmanns, zu evaluieren, ob eine Zelle als eine modifizierte Version einer Zelle angesehen werden kann oder nicht.
[0075] In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zielzellen eine modifizierte Version von HEK-Zellen sein, die in Hinblick auf funktionale CYP2D6-Varianten defizient sind und die gegebenenfalls eine nicht funktionale Variante einer CYP2D6-Variante exprimieren.
[0076] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Zielzellen CYP2D6*4 oder jede andere CYP2D6-Allel-Variante mit vollständigem Funktionsverlust (endogen) exprimieren. Der Ausdruck „vollständiger Funktionsverlust“ bezieht sich auf jede Variante eines CYP2D6-Enzyms, das nicht vermag, irgendein Substrat zu metabolisieren. Weitere Beispiele für CYP2D6-Enzym-Varianten mit vollständigem Funktionsverlust sind, unter anderen, *3, *5, *7, *15.
[0077] Ein Beispiel für Zellen für das Verfahren gemäß der Erfindung sind HEK-Blue'M-Zellen (HEK- Blue 'M |L-4/IL-13 cells, Invivogen, Toulouse, Frankreich).
[0078] Durch die Verwendung von Zielzellen, die CYP2D6-defizient sind und/oder nur CYP2D6Varianten mit vollständigem Funktionsverlust (endogen) exprimieren, oder bei denen, wenn sie ein CYP450-Enzym exprimieren, das Enzym nicht in den Metabolismus des verwendeten Substrats involviert ist, ermöglicht das Verfahren gemäß der Erfindung, die Funktionalität lediglich derjenigen CYP2D6-Variante zu bestimmen, die durch die Nukleinsäure oder den Vektor kodiert wird, die oder der für die Transfizierung der Zielzellen verwendet wird. Durch Verwendung dieser Arten von Zielzellen wird vermieden, dass ein Hintergrund eines endogenen CYP2D6 das erhaltene Ergebnis verschlechtert. Somit ist sichergestellt, dass die bestimmte Funktionalität vollständig zurückzuführen ist auf die CYP2D6-Variante, die durch den für die Transfizierung der Zellen verwendeten Vektor kodiert wird. Das ermöglicht, eine eindeutige Aussage über die Funktionalität einer bestimmten CYP2D6-Variante, ein spezifisches Substrat zu metabolisieren, zu treffen.
[0079] Das ist insbesondere wichtig, weil nicht ausgeschlossen werden kann, dass die Expression von mehr als einem CYP2D6-Enzym in einer Zelle zu einer unterschiedlichen Funktionalität der CYP2D6-Variante führt, was bedeutet, dass verschiedene CYP2D6-Varianten einen gegenseitigen Einfluss auf ihre Funktionalität haben können. Nur wenn sichergestellt wird, dass keine andere CYP2D6-Variante für das gemessene Ergebnis verantwortlich sein kann, kann eine präzise Aussage über diese eine CYP2D6-Variante getroffen werden.
[0080] Für das Verfahren gemäß der Erfindung kann das verwendete Substrat ein synthetisches oder ein nicht synthetisches Substrat sein.
[0081] Das Verfahren gemäß der Erfindung gestattet es, die Funktionalität der interessierenden CYP2D6-Variante in Hinblick auf jedes CYP2D6-Substrat zu bestimmen, unabhängig davon, ob es sich um ein synthetisches oder nicht synthetisches Substrat handelt. Jedes Substrat oder potentielle Substrat für CYP2D6 kann bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, und die Funktionalität der gewünschten CYP2D6-Variante kann im Hinblick auf das gewählte Substrat bestimmt werden.
[0082] Ferner können die oben angeführten unterschiedlichen Substrate in der Anwesenheit oder
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Abwesenheit von Arzneimitteln getestet werden, die durch das entsprechende CYP-Enzym metabolisiert werden. Dadurch wird ermöglicht, eine Substrat-Spezifität bei dem untersuchten CYPEnzym und/oder in Anwesenheit einer mutierten Variante davon zu bestimmen.
[0083] Hierdurch kann ein rascher Screen einer spezifischen CYP2D6-Variante durchgeführt werden, um deren Funktionalität in Hinblick auf eine ganze Reihe von Substraten zu bestimmen, die von Interesse sein könnten. Somit kann innerhalb weniger Tage die Funktionalität einer CYP2D6-Variante eines Patienten in Hinblick auf ihre Funktionalität getestet werden, mögliche Substrate zu metabolisieren, die für eine Behandlung des Patienten interessant sein könnten. Basierend auf dem Ergebnis kann eine Entscheidung getroffen werden, welche Art von Arzneimittelbehandlung angewandt werden kann oder nicht.
[0084] Beispiele für synthetische Substrate sind: 3-[2-(N,N-Diethyl-N-methyl-ammonium)ethyl]7-methoxy-4-methylcumarin (AMMC), 7-Ethoxy-methyloxy-3-cyanocumarin (EOMCC), MethoxyLuciferin-Ethylenglykolester (Luciferin-ME-EGE), [O-Methyl-'*C]-dextromethorphan, und eine 5’Carboxypropargylamid-Probe, unter anderen.
[0085] Beispiele für nicht synthetische Substrate sind: Mipramin, Amitriptylin, Fluoxetin, Paroxetin, Fluvoxamine, Venlafaxin, Duloxetin, Mianserin, Mirtazapin, Codein, Tramadol, O-Desmethyltramadol, N-Desmethyltramadol, Oxycodon, Hydrocodon, Tapentadol, Haloperidol, Risperidon, Perphenazin, Thioridazin, Zuclopenthixol, lloperidon, Aripiprazol, Chlorpromazine, Levomepromazine, Remoxiprid, Minaprin, Tamoxifen, Metoprolol, Timolol, Alpresnolol, Carvedilol, Bufuralol, Nebivolol, Propranolol, Debrisoquin, Flecainid, Ropafenon, Encainid, Mexiletin, Lidocain, Spartein, Ondansetron, Donepezil, Pehnformin, Tropisetron, Amphetamin, Methoxyamphetamin, Dextromethampthetamin, Atomoxetin, Chlorphenamin, Dexfenfluramin, Destromethorphan, Metoclopramid, Perhexilin, Phenacetin, Promethazin, M-Tyramin, P-Tyramin, Diltiazem, Nifedipin, Citalopram, unter anderen.
[0086] Diese Listen synthetischer und nicht synthetische Substrate sind nicht abschließend. Ein Fachmann ist sich darüber bewusst, was als CYP2D6-Substrat angesehen werden kann. Ferner ist auch die Verwendung von möglichen Substraten oder Substraten, die nicht als solche identifiziert wurden, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
[0087] Um die Funktionalität einer CYP2D6-Enzym-Variante, ein Substrat zu metabolisieren, durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu bestimmen, bestehen verschiedene Möglichkeiten, die Funktionalität zu evaluieren, welche dem Fachmann sehr gut bekannt sind. Der CYP2D6-induzierte Metabolismus kann zum Beispiel bestimmt werden mittels ELISA, Bilderfassung lebender Zellen, Immunoblot, Chromatographie, radioaktiver Markierung, Fluoreszenz, Lumineszenz, Massenspektrometrie, etc..
[0088] Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann einen zusätzlichen Schritt zur Bestimmung der Funktionalität der der CYP2D6-Variante umfassen, welcher umfasst, ein luminogenes oder Licht erzeugendes Molekül mit der kodierten CYP2D6-Variante oder einem ihrer Orthologe und mit mindestens einem Luciferase-Enzym zu kontaktieren, um ein Reaktionsgemisch zu erzeugen, gefolgt von einer Messung der Lumineszenz des Reaktionsgemisch, um die Aktivität der CYP2D6-Variante oder ihres Orthologs zu bestimmen.
[0089] Hierzu wird ein kommerziell erhältlicher Biolumineszenz-Test der zweiten Generation verwendet, der Methoxy-Luciferin-Ethylenglykolester (Luciferin-ME-EGE) als CYP2D6-Substrat verwendet. Das Substrat wird durch die CYP2D6-Variante metabolisiert, was ein Luciferin-Product ergibt, welches mit einem Luciferin-Detektionsmittel Licht erzeugt, das hinzugefügt wird, nachdem die Enzymreaktion abgeschlossen ist. Abhängig von der gemessenen Lumineszenz kann die Funktionalität CYP2D6-Variante mit einer hohen Funktionalität korreliert werden, wenn eine starke Lumineszenz gemessen wird, und mit einer geringen Funktionalität, wenn eine niedrige Lumineszenz gemessen wird.
[0090] Eine andere Möglichkeit, die Funktionalität der CYP2D6-Variante oder ihres Orthologs zu messen, ist mittels Massenspektrometrie. Dazu werden die transfizierten Zellen mit einem interessierenden Substrat behandelt. Dem folgt eine Zell-Lyse. Die Metabolite werden dann aus den
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Lysaten isoliert unter Verwendung von Festphasenextraktionskolonnen und mittels Hochdurchsatzflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt. Die HPLC-Spitzen oder -Peaks für jeden unterschiedlichen Metabolit werden unter Verwendung eines Massenspektrometers detektiert, und das Peakflächenverhältnis, verglichen mit dem Peakflächenverhältnis eines internen Standards bekannter Konzentration wird verwendet, um die Metabolit-Konzentration zu bestimmen. Abhängig von der Metabolit-Konzentration kann die Funktionalität der CYP2D6-Variante mit einer hohen Funktionalität korreliert werden, wenn hohe Metabolit-Konzentrationen gemessen werden, und mit einer niedrigen Funktionalität, wenn niedrige Konzentrationen gemessen werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese kombinierte Strategie es ermöglicht, die gemessene Metabolit-Konzentration (siehe auch TDM) mit einem bestimmten Phänotyp (PM mit UM) zu korrelieren, für den Dosierungsempfehlungen existieren.
[0091] Darum ermöglicht die vorliegende Erfindung, schnell und leicht CYP2D6-Varianten in Hinblick auf ihre Funktionalitäten auf verschiedene Substrate zu untersuchen. Somit können innerhalb weniger Tage CYP2D6-Varianten von einem oder mehreren Individuen leicht in Hinblick auf ihre Funktionalität auf ein oder mehr Substrate getestet werden. Dies kann von hoher Relevanz sein, wenn über die Behandlung, und insbesondere über die Arzneimittelbehandlung eines Patienten entschieden wird.
[0092] Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Bestimmung der Funktionalität einer CYP450-Variante oder oder eines ihrer Orthologe umfassend a) CYP450defiziente Zellen oder eine modifizierte Version davon, wie HEK-Blue Zellen, und b) Vektoren, die CYP450-Kontrollvarianten kodieren.
[0093] Mit einem solchen Kit kann ein Fachmann einen Funktionalitätstest einer interessierenden CYP450-Variante gemäß der vorliegenden Erfindung durchführen.
[0094] Die Zellen unter a) wurden an anderer Stelle hierin genau beschrieben.
[0095] Gegebenenfalls umfasst das Kit ferner eine oder mehrere Nukleinsäure(n) oder einen oder mehrere Expressionsvektor(en), welche die interessierende(n) CYP450-Variante(n) kodieren.
[0096] Gegebenenfalls umfasst das Kit ferner einen Vektor, der ein lumineszentes abgesondertes Protein kodiert, sowie Reagenzien zur Quantifizierung des lumineszenten abgesonderten Proteins.
[0097] Gegebenenfalls umfasst das Kit ferner ein (synthetisches) Substrat für CYP2D6 und Reagenzien zur Quantifizierung des metabolisierten (synthetischen) Substrats.
[0098] In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Kit bestimmt für die Bestimmung der Funktionalität einer CYP2D6-Variante oder eines ihrer Orthologe.
[0099] Die CYP2D6 Kontrollvarianten können Vektoren umfassen, die kodieren: Nicht-funktionale CYP2D6-Varianten (e.g. CYP2D6*3 (PV00428), CYP2D6*4 (PV00429), CYP2D6*15 (PV00440), etc.) die keine Funktionalität aufweisen, den CYP2D6-Wildtyp (CYP2D6*1 (PV00126)) und/oder Varianten mit einer verminderten Funktionalität (e.g. CYP2D6*9 (PV00434), CYP2D6*10(PV00435), CYP2D6*17(PV00441), etc).
[00100] Mögliche interessierende CYP2D6-Varianten, die Teil des Kits sein können, sind CYP2D6*1 (PV00126), CYP2D6*2(PV00427), CYP2D6*3(PV00428), CYP2D6*4 (PV00429), CYP2D6*5 (PV00430), CYP2D6*6 (PV00431), CYP2D6*7 (PV00432), CYP2D6*8 (PV00433), CYP2D6*9 (PV00434), CYP2D6*10 (PV00435), CYP2D6*11 (PV00436), CYP2D6*12 (PV00437), CYP2D6*13 (PV00438), CYP2D6*14 (PV00439), CYP2D6*15 (PV00440), CYP2D6*17 (PV00441), CYP2D6*18 (PV00442), CYP2D6*19 (PV00443), CYP2D6*20 (PV00444), YP2D6*21 (PV00445), CYP2D6*22 (PV00446), CYP2D6*23 (PV00447), CYP2D6*24 (PV00448), CYP2D6*25 (PV00449), CYP2D6*26 (PV00450), CYP2D6*27 (PV00451), CYP2D6*28 (PV00452), CYP2D6*29 (PV00453), CYP2D6*30 (PV00454), CYP2D6*31 (PV00455), CYP2D6*32 (PV00456), CYP2D6*33 (PV00457), CYP2D6*34 (PV00458), CYP2D6*35 (PV00459), CYP2D6*36 (PV00460), CYP2D6*37 (PV00461), CYP2D6*38 (PVO00462), CYP2D6*39 (PV00463), CYP2D6*40 (PV00464), CYP2D6*41
(PV00465), CYP2D6*42 (PVO0466), CYP2D6*43 (PVO0467), CYP2D6*44 (PVO00468), CYP2D6*45 (PV00469), CYP2D6*46 (PVO00470), CYP2D6*47 (PVO00471), CYP2D6*48 (PV00472), CYP2D6*49 (PV00473), CYP2D6*50 (PVOO474), CYP2D6*51 (PV00475), CYP2D6*52 (PV00476), CYP2D6*53 (PVO00477), CYP2D6*54 (PV00478), CYP2D6*55 (PV00479), CYP2D6*56 (PV00480), CYP2D6*57 (PVO00481), CYP2D6*58 (PV00482), CYP2D6*59 (PV00483), CYP2D6*60 (PVOO0484), CYP2D6*681 (PV00485), CYP2D6*62 (PV00486), CYP2D6*63 (PV00487), CYP2D6*64 (PVO00488), CYP2D6*65 (PV00489), CYP2D6*68 (PV00490), CYP2D6*69 (PVO00491), CYP2D6*70 (PVO00492), CYP2D6*71 (PV00493), CYP2D6*72 (PV00494), CYP2D6*73 (PVO0495), CYP2D6*74 (PV00496), CYP2D6*75 (PV00497), CYP2D6*81 (PV00498), CYP2D6*82 (PV00499), CYP2D6*83 (PV00500), CYP2D6*84 (PV00501), CYP2D6*85 (PVO0502), CYP2D6*86 (PV00503), CYP2D6*87 (PV00504), CYP2D6*88 (PVO00505), CYP2D6*89 (PVO00506), CYP2D6*90 (PV00507), CYP2D6*91 (PV00508), CYP2D6*92 (PVO0509), CYP2D6*93 (PVO0510), CYP2D6*9 (PVO00511)4, CYP2D6*95 (PVO00512), CYP2D6*96 (PV00513), CYP2D6*97 (PV00514), CYP2D6*98 (PVO00515), CYP2D6*99 (PVO0516), CYP2D6*100 (PV00517), CYP2D6*101 (PV00518), CYP2D6*102 (PV00519), CYP2D6*103 (PVO00520), CYP2D6*104 (PV00521), CYP2D6*105 (PVO0522), CYP2D6*106 (PVO0523), CYP2D6*107 (PVO0524), CYP2D6*108 (PV00525), CYP2D6*109 (PV00526), CYP2D6*110 (PV00527), CYP2D6*111 (PV00528), CYP2D6*112 (PVO0529), CYP2D6*113 (PVO00530), CYP2D6*114 (PVO00531), CYP2D6*115 (PV00532), CYP2D6*116 (PV00533), CYP2D6*117 (PV00534), CYP2D6*118 (PV00535), CYP2D6*119 (PVO00536), CYP2D6*120 (PVO0630), CYP2D6*121 (PVO0631), CYP2D6*122 (PVO0632), CYP2D6*123 (PVO0633), CYP2D6*124 (PVO00634), CYP2D6*125 (PV00681), CYP2D6*126 (PVO0682), CYP2D6*127 (PVO0635), CYP2D6*128 (PVO0683), CYP2D6*129 (PV00684), CYP2D6*130 (PVO00685), CYP2D6*131 (PV00686), CYP2D6*132 (PV00687), CYP2D6*133 (PVO0688), CYP2D6*134 (PVO0689), CYP2D6*135 (PVO0690), CYP2D6*136 (PVO0691), CYP2D6*137 (PVO0692), CYP2D6*138 (PVO0722), CYP2D6*139 (PV00728).
[00101] Gegebenenfalls umfasst das Kit ferner Reagenzien zur Detektion von Luciferaseaktivität. Geeignete Reagenzien sind aus dem Stand der Technik bekannt und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Luciferin, Furimazin, Coelenterazin, ATP und andere bekannte LuciferaseSubstrate.
[00102] Die Kits können eines oder alle der Folgenden einschließen: Testreagenzien, Puffer, und selektive Bindungspartner für eines oder mehrere der metabolisierten Substrate, von denen alle in einem für den Transport geeigneten Behälter untergebracht sein können.
[00103] Zusätzlich können die Kits Instruktionsmaterial einschließen, welches Anleitungen (d.h. Protokolle) für die Verwendung des in dem Kit bereitgestellten Materials enthält. Obwohl Instruktionsmaterial typischerweise schriftliche oder gedruckte Materialien umfasst, kann es auf jedem Medium bereitgestellt werden, dass in der Lage ist, derartige Instruktionen zu speichern und einem Endbenutzer mitzuteilen. Geeignete Medien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf elektronische Speichermedien (zum Beispiel Magnetplatten, Bänder, Kassetten, Chips) und optische Medien (zum Beispiel CD-ROM). Die Medien können Website-Adressen einschließen, die Lehrmaterialien bereitstellen. Solche Instruktionen können in Übereinstimmung sein mit jedem oder jeder der hierin genau beschriebenen Verfahren oder Verwendungen.
[00104] Sofern hier nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie sie für gewöhnlich von einem Fachmann verstanden wird, an den sich die Erfindung richtet. Dem Fachmann stellen zum Beispiel Singleton und Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1 94); und Hale und Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) ein allgemeines Wörterbuch von vielen der im Rahmen der Erfindung verwendeten Begriffe bereit. Obwohl jedwede Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu denjenigen sind, die hier beschrieben sind, bei der Verwirklichung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind die bevorzugten Verfahren und Materialien hier beschrieben. Dementsprechend sind die unmittelbar nachfolgend definierten Begriffe vollständiger beschrieben unter Bezug-
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nahme auf die gesamte Beschreibung. Auch schließen die Singular-Ausdrücke “ein”, “eine” und “der/die/das“ den Plural ein, es sei denn, aus dem Kontext ergibt sich eindeutig etwas anderes. Sofern nicht anders angegeben, sind Nukleinsäuren von links nach rechts in der Orientierung 5' zu 3' geschrieben; Aminosäuresequenzen sind jeweils von links nach rechts von Amino zu Carboxy orientiert geschrieben. Es versteht sich, dass die Erfindung nicht beschränkt ist auf die besondere Methodik, Protokolle und Reagenzien wie beschrieben, da diese abhängig von dem Kontext, In dem sie von einem Fachmann verwendet werden, variieren können.
[00105] Aspekte der Erfindung werden durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele demonstriert.
BEISPIELE
[00106] Die Erfinder haben gezeigt, dass durch die Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Funktionalität einer CYP2D6-Variante auf zeitsparende und kostensparende Weise bestimmt werden kann.
[00107] Hierzu wird die interessierende CYP2D6-Kodiersequenz (CDS) in einen pcDNA3.1HISC-Vektor geklont, und interessierende Varianten werden mittels ortsspezifischer Mutagenese erzeugt (Fig. 1; Schritt 1). Die pcDNA3.1-HISC-(A) und pNL1.3CMV[secNluc/CMV]- (B) Vektoren werden in HEK-Blue'M-Zellen kotransfiziert (Fig. 1; Schritt 2). 48 Stunden nach der Transfizierung wird sekretiertes NanoLuc detektiert und gemessen mittels Lumineszenz unter Verwendung einer Multiplattenauslesevorrichtung (Fig. 1; Schritt 3). Im Anschluss an die NanoLuc-Detektion werden alte Medien durch Luciferin-ME-EGE enthaltende Medien ersetzt (Fig. 1; Schritt 4). Nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C werden die Zellen Iysiert und die Luciferinproduktion (proportional zur CYP2D6-Aktivität) wird unter Verwendung einer Multiplattenauslesevorrichtung gemessen (Fig. 1; Schritt 5).
[00108] Vektoren enthaltend das CYP2D6*108(PV00525)-Allel, oder nur eine der beiden es charakterisierenden Nukleotidvarianten (c.1074A>G und c.1083A>G), wurden mit dem beschriebenen Verfahren getestet, zusammen mit Nicht-CYP2D6-(MOCK), Positiv- (*1 (PV00126) -wt; wt = Wildtyp) und Negativ-(*3(PV00428) -c. 794delA; del = Deletion) -Kontrollen (Figur 2).
[00109] Es wird gezeigt, dass das *108-Allel etwa 65% der Aktivität bezogen auf *1 aufweist, und es wird gezeigt, dass die Nukleotidvariation, die zu der verminderten Funktion führt, c.1083A>G (etwa 50% gemessene Aktivität), während die c.1074A>G-Variante keinen Einfluss auf die CYP2D6-Aktivität (98% gemessene Aktivität) hat. Die Balken stellen Mittelwerte +SD (Standardabweichung) einer Gesamtmenge von 24 Wiederholungen aus 4 unterschiedlichen Experimenten dar. ****P < 0,0001 wie angegeben als Einweg-ANOVA gefolgt von einem Dunnett post hoc-Test. ANOVA steht für Varianzanalyse, n.s. = nicht signifikant.
[00110] Vektoren enthaltend CYP2D6*9 (PV00434), *10 (PV00435), *14 (PV00439) und *29 (PV00453)-Allele wurden mittels des beschriebenen Verfahrens getestet, zusammen mit den Nicht-CYP2D6-(MOCK), Positiv- (*1 (PV00126) -wt) und Negativ-(*3(PV00428) -c.794delA) Kontrollen (Figur 3). Diese Allele wurden gewählt, weil ihre Aktivität bereits verifiziert war, wie angegeben auf der Website des Pharmacogene Variation Consortium (PharmVar). Da sie sich alle signifikant von den Kontrollen *1 und *3 unterscheiden , passten im Anschluss an die Kategorisierung wie in dem Methodenteil beschrieben die ganzen vier Varianten zu der bekannten Abnahme der Funktionsaktivität. Die Balken stellen Mittelwerte +SD (Standardabweichung) einer Gesamtmenge von 24 Wiederholungen aus 4 unterschiedlichen Experimenten dar. ****P < 0,0001 wie angegeben als Einweg-ANOVA gefolgt von einem Dunnett post hoc-Test. ANOVA steht für Varianzanalyse.
MATERIALIEN UND METHODEN
[00111] Plasmidherstellung und MutageneseCYP2D6cDNA wurde gewonnen aus Gesamt-Leber-RNA (Ambion®, Life Technology, Wien, Österreich), gefolgt von einer reversen Transkriptions- PCR (Reverse-Transcription-PCR, RT-PCR) unter Verwendung des Quantitect® Reverse Transcription kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß Anleitung des Herstellers. Die CYP2D6-
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Kodiersequenz (CDS) wurde dann unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer amplifiziert: 5-AATATAAGCTAGCGCCCATTTGGTAGTGAGGCAGGTATGG-3' (Vorwärtsprimer) und 5'- CTAGGGAGCAGGCTGGGGACTAGG-3' (Rückwärtsprimer). Die CYP2D6-CDS wurde dann in den eukaryotischen Proteinexpressionsvektor pcDNA3.1-HISC geklont unter der Kontrolle des CMV Immediate Enhancer und Promoter, unter Verwendung der Nhel und Kpnl Restriktionsverdauungsenzyme (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Ortsgerichtete Mutagenese der geklonten Sequenz wurde durchgeführt unter Verwendung des Phusion Site-Directed mutagenesis kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß der Anleitung des Herstellers, um voll funktionale (*1 (PV00126)), Vollfunktionsverlust- (*3 (PV00428)) und Funktionsabnahme- (*10(PV00435)) CYP2D6-Varianten zu erhalten, die als Kontrollen für den Test gewählt wurden. Alle anderen getesteten CYP2D6-Varianten wurden auf ähnliche Weise hergestellt. Nach der Herstellung wurden Vektoren und geklonte Inserts mittels Sanger-Sequenzierung gegen die Wildtyp-Referenzsequenz (SEQ ID NO. 2) getestet.
ZELLKULTUR UND TRANSFIZIERUNG
[00112] Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK)-Blue (HEK-Blue'M |L-4/IL-13-Zellen, Invivogen, Toulouse, Frankreich), eine modifizierte Zelllinie, die abgeleitet ist von HEK-293-Zellen, wurden kultiviert in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C mit 5% CO2 mit Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) ergänzt mit 4,5 g/L Glucose, 10% (v/v) fötalem Kälberserum (FBS), 1,5% NaHCOs, 50 U/mL Penicillin, 50 ug/mL Streptomycin, 10 ug/mL Blasticidin und 100 ug/mL Zeocin 'M (Invivogen, Toulouse, Frankreich). Die Medien wurden dreimal wöchentlich ausgetauscht.
[00113] Diese Zellen wurden gewählt, weil ihr Genotyp für CYP2D6*4/*4ist, was zu einem vollständig nicht-funktionalen endogenen CYP2D6 führt. Ferner bestätigte die Analyse mit einem Western Blot, dass diese Zellen keine detektierbaren Schwellwerte von endogenem CYP2D6 exprimieren.
[00114] HEK-Blue'“-Zellen wurden in NunclonTM A Surface-Platten mit 96 Vertiefungen (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) platziert, unter Verwendung einer Anordnung von 6 Vertiefungen für jede Kontrolle oder jeden Testvektor. 24 Stunden nach der Platzierung wurden die Zellen zeitweilig kotransfiziert mit den pcDNA3.1-HISC-CYP2D6-Konstrukten und dem pNL1.3.CMV [secNIuc/CMV]-Vektor (Promega, Mannheim, Germany) durch Ersetzen der alten Medien mit Medien enthaltend eine Transfizierungsmischung, zusammensetzt aus 7,5 mmol/L CaCl,, 4,2 mmol/L NaCl, 0,045 mmol/L NazHPOs4, 1,5 mmol/L HEPES, 0,27 fM pcDNA3.1-HISC-Vektor und 0,038fM pNL1.3CMV [secNluc/CMV]-Vektor.
Das pNL1.3.CMV [secNluc/CMV]-Plasmid exprimiert einen kleinen Luciferasereporter (NanoLuc®), der unter der Kontrolle des menschlichen CMV Immediate Enhancer und Promoter an ein N-terminales Sekretionssignal gebunden wird. NanoLuc®-Sekretion ermöglicht die Normalisierung der Transfizierungspegel, ohne die Zellen zu stören.
[00115] Ausgehend von dieser Platte wurden zwei separate Tests durchgeführt: In dem ersten wurden Aliquots des Überstandes aus jeder Vertiefung für die NanoLuc®-Detektion verwendet, während in dem zweiten die Zell-Monoschichten verwendet wurden, um die CYP2D6-Aktivität zu bestimmen.
NANO-GLO® LUCIFERASE -TEST
[00116] 48 Stunden nach der Transfizierung wurde ein 20 UL Aliquot des Überstandes aus jeder Vertiefung transferiert in eine neue weiße Nunclon’M A Surface-Platte mit 96 Vertiefungen zur Detektion der sekretierten NanoLuc®-Pegel unter Verwendung des Nano-Glo® Luciferase - Tests (Promega, Mannheim, Germany). Die Überstand-Aliquots enthaltend die sekretierte Luciferase wurden in jeder Vertiefung auf 100 uL verdünnt unter Verwendung von HEK Blue "M-Zellmedium und dann kombiniert mit 100 uL Nano-Glo® Luciferase -Testreagenz enthaltend das luminogene bzw. Licht erzeugende Molekül Furimazin als NanoLuc®-Luciferase- Substrat. Im Anschluss an drei Minuten Inkubation bei Raumtemperatur (RT) wurde die Lumineszenz gemessen unter Verwendung der Spark® 10M Multimode Multiplate-Auslesevorrichtung (Tecan, Grödig, Österreich), bei Halten eines optischen Dichtefilters auf 1 (OD1) und einer Sekunde Integrationszeit. Lumi-
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neszenzpegel entsprechen unmittelbar der Menge an sekretiertem NanoLuc®, die für die Normalisterung der Transfizierungseffizienz verwendet wird.
P450-GLOTM-TEST
[00117] Im Anschluss an die Detektion des sekretierten NanoLuc® wurde der Überstand entfernt und die Zellen getestet, um den Aktivitätsspegel der exogen exprimierten CYP2D6-Variante zu bestimmen. Die Zellen wurden einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. 100 UL frischen HEK-Blue'M-Mediums enthaltend 50 uM Luciferin-ME-EGE (Promega, Mannheim, Deutschland) wurden dann jeder Vertiefung hinzugefügt. Luciferin-ME EGE ist eine ProLuciferin-Verbindung, die durch CYP2D6 in D-Luciferin umgewandelt wird. CYP2D6- transfizierte Zellen wurden dann drei Stunden inkubiert bei 37°C und 5% CO», um die Meta- bolisierung durch das exogen exprimierte CYP2D6 zu ermöglichen. Nach drei Stunden wurden 100 uL Lueciferin Detektionsreagenz (Promega, Mannheim, Deutschland) jeder Vertiefung hinzugefügt und die Zellen wurden 20 Minuten bei RT inkubiert. Das generierte Licht wird gemessen unter Verwendung der Spark® 10M Multimode Multiplate-Auslesevorrichtung (Tecan, Grödig, Österreich), mit 1 Sekunde Integrationszeit und ohne Filter. Das detektierte Lichtsignal ist proportional zu den D-Luciferin-Ständen und darum zur CYP2D6-Aktivität, und es wird normalisiert über zuvor gemessene sekretierte NanoLuc®-Pegel, die Variabilität der Transfizierungseffizienz berücksichtigend.
KATEGORISIERUNG DER EVALUIERTEN VARIANTEN
[00118] Aktivitätswerte von CYP2D6-Varianten werden ausgedrückt in Prozent relativ zu denjenigen, die von dem Wildtyp CYP2D6 (*1) generiert werden. Die Graphen wurden erstellt mittels der GraphPad Prism software version 7.0c (GraphPad software, San Diego, CA). Jede Variante wird dann in eine der vier Kategorien I) Funktionsverlust, ii) Funktionsabnahme, iii) normale Funktion, und iv) Funktionszunahme eingeordnet. Funktionsverlustvarianten haben Werte, die sich nicht signifikant unterscheiden von CYP2D6*3 (der Positivkontrolle für eine Funktionsverlustvariante), Varianten mit normaler Funktion haben Werte, die sich nicht signifikant unterscheiden von CYP2D6*1 (der Positivkontrolle für die normale Funktion). Funktionszunahmevarianten haben Werte, die signifikant größer sind als CYP2D6*1. Funktionsabnahmevarianten haben Werte, die signifikant höher sind als CYP2D6*3 und signifikant niedriger als die von CYP2D6*1.
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<213> Homo sapiens
<400> 1
gtgtetgcca agggtgccag Ccacagccgcc CCactccagg gBaaßgaggag tgccagcccCct 60 tacccacctg agtgggcaca gtgtagcatt tattcattag ckCccacact BECCLgACC8 120 teteccctgt gggetgcatg acaagpagag agaacapgct gaggtgagag ctactgtcaa 180 cacctaaacc tTaaaaaatct ataattggacC tgBECagBEt BECECcacECC tgtaatccCca 2498 gcactttgeg aggccgagat gggtggatca cctpaggteca gatgttcgag accaßcctge 300 Cccaacatggt gaaacccecgt cCtctactaaa aatacanaaa attagctggg cgtggtggtg 360 getgcctgta atcccagecta CcLcappagec tgaggcapga gaattgcttg aacctggpag 428 gcagaggttg cagtgagccg agatcacacc attgaactecc agtectgggtg ataagtatga 488 aacgccatct ccaaaacaaa agaaaapcct aattccccaa gaactgtcag tctttcacct 540 gtctgetage tcccagggag accccacttg ccagggctgt ctacattigt cctgagatct 600 cttctggtga gaacagcact ttcctcagga aagtttgttg aaagtcatca gateccatgat 660 tgaaaatcga agctgectgt ggtgatggat aacagctggg gttaaadagl aRCaRCtEEB 720 gcatgagcegg tccacagtga gtttttgetg tttttgteEtE tttgggtggE ggatggggtc 780 ttgctaggtc tcaasactect ggactkcaagt catcecteccca ttacagcctt ctgagtcact 840 gacactacag gtgtgagcca ccatgtccag cLtgtagtgg tttigaacag CLCkEtgCCCC 980 ttcttgggaa tctaggtgcc ctgcacgtgg gtaaggctgt ctgeagetgt geccatatte 9698 aggaadggCcCg ECaaggCcCCt gagccCtcal acgtgactga Cctgpaggtgc tgtgcagaCca 1028 Ecaggtgacg Ectaaggpaa agttgagcac tgcctageccg agcactgaag CCaCcEHCCCcHE 1080 Cacacagaga gagacccacCt cggcaaagac ttcgcttcca ggcacctaag gaactctetg 1140
18 / 42
accagtcatt agctgaccac tgecgtaact gaagagcgac ttcagtggcc acagctegca 1200 gggaatpgag acattaatgc ttagtcagaa ttagttcaga adagtcaccc agcaasapaaa 1260 cagetccaac aggcaacaac aacaacacat ccttggcagg gaagagaatc tgacttccgg 1320 agttgccaca ttategcccg tgaaatptcc apgttttaac aaattatgag acatggadag 1380 gasaccgaaa ggacgaCCCa gacCaCgggaa Aagtcaccaa tggHaCCage CCHatECLEC 1440 aattgctaga casagacgtt cagtcagetc atttaastat gttcaaagac ctadaacatg 1500 ctgcatctga ggctgcaccg gctggaacct gctgatctcg gaagctaage atggtcaggc 1560 ctggctagta Cctticaaaggg agaaaccCacg tgtaggecctg gtgcagtggc tcacacctat 1820 aatcctagca ctectgggaag ctgaggıccg tgpgattgett gagcccagga gtttgagagc 1680 agcettgggaa atgtggtgag acccccatcet ctacaaasaaa atttaaasaa Etagctggect 1748 gsctatggtc ccagectetc aggatgetga ggtaggagga tcacttcagc ccaggaagtt 1800 gaggctgcag tgagccatga ctgcatcact gecactecage ttggEcgaca gagagacıct 1860 ctcccaagaa aaagaaaaga accatgtcaa aagaactaac gaaagtgtgeg gaacaatgtc 1920 tcaccaatta pagaatatca ataatgegat gaaccttata aaagaggggct gEgcatggtg 1980 gcetcatgcct ataatcccag cactttggga ggctgaggcg ggCatatcat gaggtclaapa 2040 gattgagacc agcctggcca acatggtgaa accecgtetec tacktaaaat acagaaatta 2100 E19 / 42
Taggggaggc aancctgctckg Bgaggatcag cctcaaccta ECccatgcagc agggactcca 2830 cctgtecctc” tccgtagtec cacacctgga acccagagec atctgectet teccagatca 2940 tggccgacag cactccacca gacCtgcggct ggagcaggca Caggattcac ttattgaggg 3008 ctgtggcctg gcacagatca tagcctatac ccagggacag ttgtgtcact tctgccaCcCca 3060 Ccacatccgce Cttetgcagc Cacatcaagpt accactcatg gatgagceccg tcacccccag 3126 cggacttatc aaccccgcgt Ccagctccac agccgeccacg Egctecggtga geactggetc 3180 caagcatggc agctgccata caatccacct gtagagggcc cggtcctact gtcetcagtg 3240 gatgatcccg tagaagtcca gagctcecggca getgEccctec cacaaaagac aggattttgpa 3300 aagcagcaag agagaagaga Cgtatcaggt agtcacagtg getecaggect gtaatcccag 3360 Cactttggga EBECCCaBEtE ggaggategc t£ECaCcCcCCaB Baattcaaga CCagcCcLgga 3420 Caacttggaa gaacccggtec tctacaaaaa atacadaatt agetgggatt gggtgcggtE 3480 gctcatgect ataateccap cactttggga gcctgaggtg ggtggatcac ctgaagtcag 3540 gagttcaaga ctagecctgec caacatggtg aaaccctatc tctactgaaa atacaaaaag 3600 ctagacgtgg tggeacacac ctgtaatecc äagctacttag gaggetgagg caggagaatt 3660 gettgaagec tapaggtgaa ggttgtagtg agecgagatt gcatcattgc acaatggagg 3720 ggagccacca gcctgggcaa Caagaggada tectccgtetc casaaaaaaa aaadadaada 3780 asagaattag gctgggtggt gectgtagtc ccagctactt gggaggecagg gggtccactt 3840 gatgtcgaga ctgcaptgag ccatgatect gecactgecac ECCBECCLEB gCaacCagagt 3900 gagaccctgt ctaaagaaaa aaaaanataaa gcaacatatc ctgaacaaag gatcctccat 3960 aacgttcecca Cccagatttct aatcagaaac atggaggcca gaasgcagtg BapgaggacCg 4020 accctcaggc agcccgggag gatgttgtca caggetgggg caagggcctt ccgsctacca 4080 actgggaget ctgggaacag ccctgttgca aacaagaaglC catagcccgg CCagagccca 4140 ggaatgtggE cCEgBBECtEBE agcagcctct ggacaggagt ggtcccatec aggaadaccatc 4200
Cggcatggct gggaagtggg grtacttggtg Ccgggtctgt atgtgtgtgt gactggtgtg 4260
tgtgagagag aatgtgtgcc Ctaagtgtca gtgtgagtect gtgtatgtgt gaatattgtc 4320 tttgtgtggg tgattttctg cgtgtgtaat cgtgtecctg caagtgtgaa caaptggaca 4380 agtgtctggg agtggacaag agatetgtgec accatcaggt gtgtgecatag egtetgtgea 4440 tgtcaagagt gcaaggtgaa gtgaagggac caggecccatg atgecactea tcatcaggag 45008
20 / 42
CtCtaaggcc CCagglaagt gccagtgaca gataagggtg ctgaagptca cCLictggagtg 4560 ggcaggtgEg gEtagggaaas ggecaaggcc atgttictgga ggaggggttg tgactacatt 4620 agggtgtatg agcctagcetg ggaggtggat ggeccgggtcc actgaaaccc tggttatceac 45680
agaaggcettt gcaggctica ggagckLtgga gtEgggagag KggEtgactt CEcCgacCCcag 4740
geccctacacl CggcCtaccl tppgtaaggg CCtEgHagcag KaagCaARBBB CaapaaCcCcte 4800 tggagcagcc catacccgcc ctggcctgac Ectgccactg geagcaCagt Caacacagca 4860 ggttcactca cagcagagggs caaaggecat catcagctec ctttataagg gaagggtcac 4920
gegeteggtg tgectgagagt gtecctgectg gtcstctgtg CCtgStgEEN LEHRBBETRCC 4980
aggtgtgtcc agaggagecc atttggtagt gaggcaggta tgeggctaga agcactggtg 5040
cecctggccg tgatagtggc catettectg cteetggtgpg acctgatgca CCBBCRCCAa 5100 cgectggsctg cacgctaccc accapgeccr ctgecactgc ccgggctggg Ccaacctgetg 5160 catgtggact tccagaacac accatactgc ttcgaccapg tgagggagga Bgtcctsgag 5220 BecHECagag gtgctgaggc tcccctacca gaagcadaca tggatggtgg gtgaaaclac 5286
aggetggacc agaagccapg ctgagaagge gaagcaggtt tpggepacgt cctpgagaag 5340
ggcatttata catggcatga aggactggat tttccaaagg ccaaggaaga gtagggcaag 5400 ggEcctggagg tggagctgpa cttggcagtg ggecatgcaag Ccccattgggc aacatatgtt 5460 atggagtaca aagtcccttc tgectmacacı apaaggasag geccttgggaa tpgaagatga 5520 gttagtcctg agtgecgttt aaatcacgaa atcgaggatg aagggggtgc agtgacccHg 5580 ttcaaacctt ttgecactgtg ggtcakecggg cctcactget caccggcatg gaccatcatc 5640 tEEgaAatggg atgctaactg gggcctctcg gCaattittgg tgackcttgc aaggtcatac 5700 Ctgggtgacg catccaaact gagttcctec atcacapaag KgEgtgacclt CaCclClCCHCC 5760 ccacgatcag gaggctgggt ctecteccttc cacctgetaca CtccEggtag ccCccggggat 5820 cgtcecaaggt tcaaatagga ctaggacctg tagtctgggg tgatcctggc ttgacaagag 5850 Becctgaccc tccctetgca gttgecggcgc CacttegggEg acgtgttcag cCctgcagctg 5940
gectggacgc cgatggtegt getcaatggg ctggcggecg tBCRCHABEC Bctggtgacc 6000
CaCgECgagg aCaCccgCCga CCBECCHCECETLt gtgacCALCA CCCagateCt gggtttcHggn 6060 CegcegttccC aaggCaagca gCggtgggga Cagagacaga tttccgtggg acccggstgg 6120 Etgatgaccg tagtccgagc tgggcagaga SgBCERCHBEN tCgtggacat gaaacaggclc 6180
agcgagtggg gacagcgggc caagaaacca cctgcactag ggaggtgtga gcatggggac 6240 Baggecgggg cttigtgacga BtggscCcHESE CCcaCckgcCga BaCcckggcag gagcccaatg 6300 ggtgaggcetg gegcatttec cagctggaat ccggtgicga agtggEgegcC EKERBACCHCA 6360 cctgtgctgt aagectcagtE tgggtggcsc gEgggcCCHCE ggg£fcttecc tgagtgcaaa 8420 BeCggtcagg gtggecagag acgaggtgeg BcaaagCcCcct BCCCCABCCA apggagcaag 6450 gtggatpcac aaagagtggg ccctgtgacc apctggacag apccagggpac tLgCHEgaBaC 6540
cagggggagc atagggttgg agtgggtggt ggatggtggg gctaatgect tcatggccac 5600
gegtacgtgc ccgtcccacCl Cccaggggtg ttccktggecgsc getatgggcc Cgcecgtggege 5660 gagcagaggc gettctecegt gtecaccttg cgecaacttgg gecctgggcaa gaagtegetg 6720 pagcagtgegg tgaccgagga gECcgcctge ctttgtgccg cettegccaa CCAaCtECHET 6780
EBEtHAtEER Cagaagepca Caaagcgega actgpgaagg CEPBEHACLE KEAABBCHAC 5840
tecttacccg catetcecac CCcCccaggacg Cecctttecge crcaacggte tcttgpacaa 6900 agccgtgagc aacgtgateg cctccctcac ctgegggCSC CgC£Ltecgagt acgaCcHalcl 960 tcgettectc aggetgetgg acctagcetca gpagggactg aaggaggagt cBEBCttECT 7020
ScCECHAaBEtE CHEapcgaßa gaCccCcHaggag tctctgcagg gegagcteCC KagaggtgcCC 7080
ggppcCtggac tgggegcctcg gaagpagcagg atttgcatap atgggttkigg Kaaagpacat 72140 tccaggagac cccactgtaa gaagggcctg Baggapggagg ggacatctca gacatggtcg 7200 tgggagaggt gtgeccgggt cCaggggEcac caggagaggc caaggactct gtacctccta 7260 tccacgtcag agatttcgat tttaggtttc tectetggec aaggagagag ggtggaggct 7320
ggcactteggE gagggacttE gtgapgtcag tggtaaggac aggcapgecc tgggtctace 7380
tggagatggc tggggcctga gacttgtcca ggtgaacgca gagcacagga gggattgaga 7440 Cccegttcktg tctggtptag gtgectgaatg ctptecacLgt ccotcctgeat atcccagege 7560 tggctggcaa ggtcctacge ttccaaaagg cttticckgac ccagctggat gagctgctaa 7560 ctgagcacag gatgacctgg gacccagccC agcccreccg agacctgact gaggccttec 7628
tEgcagagat ggagaaggtg agagtggcitg CCacCggtggg gEKCaaggEt gEtEggtiga 7688
Ecgtcccagg apgaatgagg gEaggectEgg casaaggttg gaccagtgca LCaACcCCcHBCH 7740 agccgeatet gggectgacag gtgcagaatt ggaggtcatt tgggggctac ccacgttctgt 7800 cccgagtatg ctckcggccc tgctcaggecc aaggggaacc Ctgapagcag Cttcaastsat 7868
gagaacctgc gcatagtggt ggetgacctg ttctctgecg ggatggtgac Cacctcgacc 7920 acgctggecct ggggcctect getcatgatec ctacatecgg atgtgcaßgcg tgagcccatc 7986 tgggaaacag tgcaggggcc gagggaggaa gggtaCcaggc gggggccCccat gaactttgct 8040 gggacacCcCCEg EEgCtccaag Cacaggcttg accaggatcc tgtaagcctg acctecteca 81060 acataggagg caagaaggag tgitcagggcc ggaccccctg ggtgectgacc Cattgtgggs 8160 acgcatgtect gteccaggccg tgtccaacag gagatcgacg acgtgatagg gcaggtEcgE 8220 cgaccagaga tgggtgacca ggetcacatg ccctacacca Ctgccgtgat tCcatgaggtg 8280 Cagcgctttg gggacatcgt ccccctgggt gtgacccata tgacatcccg tgacatcgaa 83406 gtacagggect teecgeateece taaggtagge ctggegecct cctcaclecca gerCagCcaCC 8400 agcacctggt gatagcccca gcatggctac tgccaggtgg gcccactcta ggaaccctgg 8460 ccacctagtc ctcaatgeca ccacactgac tgtccccact tgggtggggg giccagagta 8520 TaggCagggc tggcctgtecc atccagagecc CCccCcgtctagt ggggagacaa aCcCCaggaCcct 8586 gccagaatgt tggaggaccc aacgectgca gggagagggg gcagtgtges tscctctgas 8640 aggtgtgact gegecctgect gtggggtcCgg agagggtact gtggagcttc tCHRBECEHECAB 8700 gactagttga cagagtecag ctgigtigeca ggecagtgtgt gieccccgtg tgtttggtgg 3760 Caggggtecc agcatecctag agtecagtec ccactetcac cctgecatetec ctgcecececaßgg 8820 aacgacactc atcaccaacc tgtcatecggt getgaaggat gaggeacgtet gggagaagec 8880 ctteccgettc caccccgaac acttcctgga tLgCcCccagggCc cactttgtga agCccgBaßgc 8940 cttectgect ttetecagecag gtgecctgtgg ggagcccggc tecctgtecc CtLeCStSBa 9000 gtcttgcagg ggtatcaccc aggagcCcagg cCtcactgacg CCCCtCCCCLt CCCCACABBC 9060 Cgccgtgcat gectLecgggga geCCCcLggEC Cgeatggage tatteactkett cLtcacctec 9120 ctgetgecage acttecagett ctcggtgccc acCtggacagc CCCggCCCag Cccaccatggt 91860 gtetttgett tectggtgag cccatccccc tatgagcattt gtgeatgtgeac ccgckagaat 9240 ggggtaccta gtccccagec tgetacctag ccagaggctc taatglacaa tasagcaatg 93006 tggtagttcc aactegggte cectgetecac gecctegttg ggatcatect Ccctcagggca 9360 accccacccc tgectecatte ctgettaccc CaccgcCctgg CcgCcatttga gacaggggta 9426 cgttgaggct gagcagatgt cagttaccct tgeccataat cccatgtacc CCactgaccC 9480 aactctgact geccagattg gtgacaagga ctacattgtc ctggcatgtg gEBASEBBEBEC 9540
cagaatgggc tgactagagg tgtcagtcag cccotggatgt ggtggagagg gCaggactca 9600 gcctggaggc ccatatttca gEcctaacte agccCaCcCcCC aCcCatcagpga Cagcagtecct 3660 gccagcacca tcacaaCagt Ccacctacctt catatatgac accccaaaac ggaagacaaa 9728 tcatgscgtc agggEagctat atgecagggc tacctacctec Ccagggetca gtcgpcaggt 780 gccagaacgt tccctgggaa ggeCcCcCatgg aagcCccagpa CLHagCllaCl aCCCtCaABCEC 9840 tcgtcacctc accacaggac tpgctacctc tetgpgccct cagegatgct gctgtacaga 9900 Cccctgacca gtigacgagtt cgcactcagg gccaßBgetgg cgctggaßga ggacacttgt 2960
ttggctecaa ccctaggtac cateckeccca gtagggatca ggCcagggccc acaggectgc 19020 Cctagggaca ggagtcaacc ttggacccat aaggecactgg BECESECaga gaagpapgag 180086 gtggcatgeg cagctgagag cCagagaccc tgaccctagt ccttgeticectg CCcattacccC 18140 gtgtgacccc gggeccactce FttCccacaccc TtCCLCACLE ECCCCACLE CgggettetLE 10200 tttceccttet gecaacgaga aggctgette acctgecccg agptecktgtet tectgetetg 10268 ccttctgggg ctgtggccct tgetggestg Bagceccaac caapggcage gactgetgtc 109326 ctecacgtet gtcctcaccg acataatggg ctgggetggg cacacaggca gtgcccaaga 10380 gtttcktaatg agcatatgat tacctgagtc ctigggcagac cttctkaggg aacagcctgeg 10440 gacagagaac cacagacact ctpaggagec acctgagpgcc tetttetgeca gaggacccta 10500 cagpcctccct ggcagcagtt ccgccagcat ttctgtaaat geccktcatgn. cagggtgcgg 10568 CCCggctgtc agcacgagag ggacgttggt ctgteccctg gcaccgagtec agtcaßgaagg 10620 gtggccaggg cccccttggg ccccktecaga gacaatccac tgtggtcaca cggetcggtg 10686 gcaggaagtg ctgttcctgc agctgtgggg acagggagtg tggatgaagc Caggctgggt 10740 ttgtctpaag acggaggccc Cpadapgtgg cagpcctggcc tatagcaßca grcaactcttg 10800 gatttattgg aaagattttc ttcacggttc tgagtcttgg gggtgttaga ggctcagaacC 180860 cagtccagec agagetetgt catgggcacg tagacccggt cccagggect ttgetetttg 10928 ctgiccetcag aggectetge aaagtagaaa Caggcagect tgtgagtecc Cctcctgggag 10980 Caaccaaccc tecctetgag atgccccggg gccaggtcag ctgtgstgaa aggtagggat 11040 gcagccaget caggggagtg gceccagagtt ccetgececace caaggagpct Cccaggaagg 11108 tcaaggcacc tgactcctgg getgettecc tccackacee ECCCCABELC aggaaggtgg 11169
gaaagggctg ggetgtctgt gaccctgpca gtcactgaga agcagggtgg Bagcageccc 11220
24 / 42
SS N 8
ctgcagcacg ctgggtecagt ggtecttacca gatggatacg cagcaacttc cttttgaacc 11280
tttttatttt cctgacagga agaagaggga €c 11312 <210> 2
<211> 1588
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atttggtagt gappcaggta tgegpctaga agcactggtg cccctggecg tgataptggcC 508 catcttcctg ctectggtgg acctgatgca CCggc8gCcCaa CBCtgggctg Cacsctaccc 120 accaggececc ctgecactge ccgggctggg caaccatgetg catgtggact tccagaacac 180 accatactge ttcgaccagt tgcggcgecg cttcggggac gtgtitcagec tgcagctgac 240 ctggacgcCg gitggEtcgtgc tcaatggagct BECgECCHtE CECHAaBBCEC kggtHaCccca 380 Ccpgcgaggac accgccgacc gecegectgt geccatecace cagatectgg gtttecpggec 360 gegttcccaa ggggtgttec tgacgcCgcta ERBECCLCHCE tEggCHCHAaBC aAgaggCgCtt 420 £tccgtgice accttgepca acttgggect gggcaagaag tcgetgBagec agtgggtgac 480 cgaggaggcc gcctgeccttt gtgecgecctt cgCccaaccac tCcCcggacCgCeCc CCTtELCHCCC 548 caacggtetc ttpgacaaag ccgtgagcaa cgtgatecgcce tecatcacet pcggBeBCCE 600 cttcgagtac gacgacccte gettectcag getgetggac ctagetcagg agggactgaa 660 ggaggagtcg ggetttetgc gecgaggtgct gaatgutgte cccgtectec tpcatatcac 720 agcgetggct ggecaaggtcc tacgctteca aaaggcttte ctgacccagc tggpatgaget 780 gctaactgag cacapgatga cctggpaccc agpcccagccc CccCccgagacc tgactgaggc 848 cttcctgeca gagatggaga aggocaaggg gaaccctgag agcagcttea atgatgagaa 980 cctpgcgcata gtgetggctg acctgttctc. tgeccgggatg gtgaccaccet cBaccacCHct 960 ggcctgggac ctcckgetca tgatcctaca tccggatgtg Cagcgacgtg tcCaacagga 1020 gatcgacgac gtgatagggc aggtgcHEgcg accagagatg ggtgaCcagg CtCcacCatgeC 10808 ctacaccact gccogtgattc atgaggtgca gegetttggg gacatagtec ccctgggtgt 1140 gacccatatg acatcccgtg acatcgaagt acagggettc Cgecateccta agggaacgac 1200 actcatcacc aacctgtcat cggtgectgaa ggatgaggcc gtctgggpaga agccctteeg 1260 cttecacccc gaacacttcc tggatgccca gggCccacttt geEgaagCCgEg aggccttact 1320 gectttctca gcapprecgec gtgcatgect cEBggagccc ctpgcccgca tggagetctt 1380
cctcttette acetecetgec tgeagcactt cagetteteg gtgeccactg BaCcaglcccg 1440 gcccagccac catggtgtet ttgetttect ggtgagacca tcorcctatg agetttgtgc 1500 tgtgecccgc tagaatgggg tacctagtec ccagcctget ccctageccag aggetetaat 1560 gtacaataaa gcaatgtggt agttccaa 1588 <210> 3
<211> 497
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 3
Met Gly Leu Giu Ala Leu Val Pro Leu Ala Val Iie Val Ala Xle Phe 1 5 18 15
Leu Leu Leu Val Asp Leu Met His Arg Ärg Gln Arg Trp Ala Ala Arg 20 25 30
Tyr Pro Pro Giy Pro Leu Pro Leu Pro Gly Leu Giy Asn Leu Leu His 35 40 45
Val Asp Phe Gin As Thr Pro Tyr Cys Phe Asp Gin Leu ÄArg Arg Arg
Phe Gly Asp Val Phe Ser Leu Gln Leu Ala Trp Thr Pro Val Val Val 65 78 75 80
Leu Asrı Gly Leu Ala Ala Val ÄArg Glu Ala Leu Val Thr His Gly Glu 85 98 95
Asp Thr Ala Asp Arg Pro Pro Val Pro Ile Thr Gin Ile Leu Gly Phe 180 105 118
Gly Pro Arg Ser Gln Giy Val Phe Leu Ala Arg Tyr Gly Pro Ala Trp 115 120 125
Arg Glu Gin Arg Arg Phe Ser Val Ser Thr Leu Arg Asrn Leu Gly Leg 130 135 140
Gly Lys Lys Ser Leu Glu Gin Trp Val Thr Glu Giu Ala Ala Cys Leu 145 150 155 160
26 / 42
Cys Ala Ala Phe Ala Asn His Ser Gly Arg Pro Phe Arg Pro Asn Gly 165 178 175
Leu Leu Asp Lys Ala Val Ser Asn Val Ile Ala Ser Leu Thr Cys Gly 188 185 190
Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Arg Phe Leu Arg Leu Leu Asp Leu 195 200 205
Ala Gin Glu GIy Leu Lys Glu Glu Ser Gly Phe Leu Arg Glu Val Leu 210 215 220
Asn Ala Val Pro Val Leu Leu His Ile Pro Ala Leu Ala Gly Lys Val 225 230 235 240
Leu Arg Phe Gln Lys Ala Phe Leu Thr Gln Leu Asp Glu Leu Leu Thr 245 250 255
Glu His Arg Met Thr Trp Asp Pro Ala Gin Pro Pro Arg Asp Leu Thr 266 265 270
Glu Ala Phe Leu Ala Glu Met Glu Lys Ala Lys Gly As Pro Gilu Ser 275 280 285
Ser Phe Asrnı Asp Glu Asrı Leu Arg Ile Val Val Ala Asp Leu Phe Ser 290 295 300
Ala Giy Met Val Thr Thr Ser Thr Thr Leu Ala Trp Gly Leu Leu Leu 305 318 315 320
Met Iie Leu His Pro Asp Val 6ln Arg Arg Val Gin 6ln Glu Ile Asp 325 330 335
Asp Val Ile Gly Gln Val Arg Arg Pro Glu Met Gly Asp Gln Ala His 340 345 350
Met Pro Tyr Thr Thr Ala Val Ile Mis Glu Val Gin Arg Phe Gly Asp 355 360 365
Ile Val Pro Leu Gly Val Thr His Met Thr Ser Arg Asp Ile Glu Val 370 375 380
Gin Gly Phe Arg Ile Pro Lys Gly Thr Thr Leu Ile Thr Asrn Leu Ser 385 390 395 400
Ser Val Leu Lys Asp Glu Ala Val Trp Glu Lys Pro Phe Arg Phe His 405 410 415
Pro Glu His Phe Leu Asp Ala Gin Gly His Phe Val Lys Pro Glu Ala 428 425 430
Phe Leu Pro Phe Ser Ala Gly Arg Arg Ala Cys Leu Gly Glu Pro Leu 435 440 445
Ala Arg Met Gliu Leu Phe Leu Phe Phe Thr Ser Leu Leu Gln His Phe 450 455 460
ser Phe Ser Val Pro Thr Gly Gin Pro Arg Pro Ser His His Giy Val 465 470 475 480
Phe Ala Phe Leu Val Ser Pro Ser Pro Tyr Glu Leu Cys Ala Val Pro 485 490 495
Arg
<210> 4
<211> 1587
<212> DNA
<213> Homo sapiens
Su etastant gaggEcaggta tggggctaga agcactggtg cccctggCccg tEatagtgg.c 560 catcttcectg ctcctggtgg acctgatgca CCcggCcgCCan CgCtgggCtEg CacHgckacel 120 accaggeccc ctgecackge ccgggetggg caacctgetg catgtggact tccagaacac 180 accatactgc ttcgaccagt tgcggcgccg cttcggggac gtgttcagcc EgCcagctgaC 240 CtggacgcCCcg gtggtcgtgc tcaatgggct BECERBCCHtE CECgaggCgc tggtgaccca 308 CEEcgaggac accgeCcgacCcl BCCCRCCtpE gecccatcacc cagatectgg gtttCHBACC 360 gegtteccaa BgBgtgttccC tggcgegckta tgggeCCBCH tBLCHCHARC aBapgcCcBCLTt 420 ctccgtgtcc accttgegea acttgggpcct gpacaagaap tcgctggage agtgggtgac 480 Ccgaggagscc gectgeckttt gtgccCcgCCEr CgeCaaccacCc tecHBaCHEC CCLELCACCC 540
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SS N 8
caacggtctc ttggacaaag Cccgtgagcaa cCgtgatcgec tcecctaacct SCHEECECCE 660 cttcgagtac gBacgaccctc gettecctcag Ectgctggac Cctagctcagg agggactgaa 660 ggaggagtcg Bgctttctgc gecgaggtgect paatgetgtc cccgtaeckec tgcatatacc 720 agcgetgget ggcaaggtecc tacgetteca asaggetttc ctgacccagec tggatgagct 780 gctaactgag cacggatgac CTHgggaCCcca BCCCABCCCC CCCcgagacct gacCtgaggcC 840 ttcctggcag agatggagaa gECCaaBBES aacCcCckgaga gCcagctecaa tgatgagaac 9008 ctgcegcatag tggtggctga cctgttcktct gccHEgatgg tgaccacctc gaCccacCcgCtE 960 gectggggcc tcctgetcat gatectacat ccggatgtec agcgccgtgt ccaacaggag 1620 atcgacgacg tgatagggca ggtgcgecka ccagagatgg gtgaccaggc tcacatgecc 1080 tacaccactg ccgtgattca tgaggtgcag cgctttggeg acatcgtccc cetgggtgtg 1140 acccatatga cCatcccgtga catcgaagta Cagggcttec gcatccctaa gggaacHaca 1200 ctcatcacca acctgtcatc ggtgctgaag gatgaggccg tctgggagaa BeccticCgC 1260 ttccaccccg asacacttect ggatgcccag ggccactttg tgaagccgga ggcecttcctg 1320 ccetttectcag caggeegecg tgecatgecte pgggageccc tggeccgcat ggagetette 1380 ctettcttca cctccekget gecagcacttc agcttctegg tgcccacteg aCaBClCCCHE 1440 cccagccacc atggtgtctt tgectttcetg gtgageccat cecccctatga getttgtget 1500 gtgecccget agaatggggt acctagptecc cagcctgete cctagecaga ggctctaatg 1560 tacaatanag caatgtggta gpttccaa 1587 <210> 5
<211> 1585
<212> DNA
<213> Homo sapiens
tttpetagt gaggcageta tgggECctaga agcactggtg cccectggecg tgatagtggc 60 Catettcctg ctcctkggtgg acctgatgca CCcggcgecaa Cgetgggetg CacCgCctalll 128 accaggecse ctgecactgc Ccgggctggs caacctgetg cCatgtggact tccagaacal 180 accatactgc ttcgaccagt tEcggCHCCE CttcHgggaC EtgttcaKCcC EgCagetggc 248 ctggacEccg gtggtcgtgec tCcaatgggct gecHgCCgtE CECcgagpCcgcC tgEtgaccca 300 CEECgaggac accgccgace BeCcgCcCtgt geccatcacc Ccagatectgg gtttcgggcC 360
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<211> 131588
<212> DNA
<213> Homo sapliens
u tttegtagt Eaggcaggta tgpBgctaga agcactggtg cccctggecg Egatagtpgc 60 catettcctg CEcCtEStER acctgatgc3 CCHECACCAa CaCtggECtg Cacgctacte 120 acCaggcccC CcTgccactgc CCcpggctggE Caacctgetg Catgtggact LCCaHaARCAC 180 accatactgc ttegaccagt tgecggegccg cttcggggac gtgittcagec tgecagetpgc 240
30 / 42
SS N 8
ctggacgıcg gtggtegtgc.c Lcaatggget gBCgECCEHETLE CECHaBECEC EBptBacCCa 306 CESCgaggaCc aCcCcgcCcgacCcCc geCCHCCIgt geccatcacc Ccagatectgg gitttggscCc 368 gcgttcccaa ggpptgttcc tggcgegcta tEBBECCHCH LEBCRCHAaBC agagpcgett 420 ctccgtetecc accttgcgca acttgggacct gggcaagaag tcgetggagc agtgeggtgac 480 Cgagpaggcc gectgecttt geKCCgCeCTT Cgccaatcac tcCHgaACKEC CCTLLICHECL 540 caacggtete ttggacaaag ccgtgagcaa cgtgatcgec tccetecacct geggecgCCEH 600 cttcgagtac gacgaccctc gettcctcag getgetggac Ctagctcagg agggactgaa 560 Egaggagtcg ggctticktgc gecgaggtget gaatgetgte cccgtacten Egcatatcac 728 agcgetggct ggEcaaggtec tacgcttcca aaaggcettte ctgacccagc tggatgagct 780 gctaactgag cacaggatga CCtggBacccl aßclccagecc CCcCCHgagacc tgactgaggc 840 Ccttcctgeca gagatgpaga apgeccasgeg gaaccctgag agcagctteca atgatgagaa 908 Cctgegeata gtggtpgectg acctgttete tgecgggatg gtgaccacet cpaccacgct 960 ggcetggggc ctcctgetca tgatcctaca Eccggatgtg Cagcgecgtg tccaacagga 1028 gatcgacgac gtgatageggc aggtgcggcg accagagatg ggtgaccagg ctcacatgcc 1088 ctacaccact gecgtgattc atgaggtgca gCgectttggg gacatcgtec Ccctgggtgt 1148 gacccatatg acatcccgtg acatcgaagt acagggettc cgeatcccta agggaacgac 12060 actcatcacc aacctgtcat cggtgetgaa ggatgaggcc gtectgggaga apcceattecg 1260 ctEccactccc gaacacttcc tpBatgccca gggccacttt gigaagcecgg aggecttect 1320 gectttecteca gcaggecgac gtgcatgect cgegmagecc ctggcecgca tpgagectett 13806 cctettette acctasctgn. tgecagcactt cagettctecg gEBCCCLACTEH BaACAEBCECLCCE 1440 BCCccagccac cCatggtgtct ttgcetttcct pEtgacccca tecccctatg agetttgtge 1500 tgtgecccge tapaatggggp tacctagtec ccagectget ccctagecagp aggectetaat 1560 gtacaataaa gcaatgtgegt agtteccaa 1588 <210> 7
<211> 1588
<212> DNA <213> Homo sapiens
<408> 7 atttggtagt gagecaggta tggggctaga akcactgetg CCCCtggCCH tgatagtggc 58
catcttcctg ctuctggtegg acctgatgeca Ccggecgecaa Cgclgggctg Cacgctaclce 120 accaggeccc ctgecactgc ccgggctggB Caacctgetg catgtggact tccagaacac 180 accatactgc ttcgaccagt tgcggegeecg ctteogggpgac gtgttcagec tgcagetggc 240 ctggacgccg gtggtcgtgc tcaatgggct ggeggccCcEtg cgcecBaggcgc tgEtgacCcca 300 Cgecgaggac accgccgacc BeCCgeCtgt grecatcacc caBatcctgg BEttCgEBCC 360 gegttcccaa ggggtgtitecc tggcgecgcta LEgBBCCCHCE tgEgCECHAaBC apaggegCtt 420 ctecgtetec accttgegea acttgggcct gggcaagaag tcgectggagc agtgggtgac 480 Cgaggaggscc gectgecttt gtgacgectt cgecaaccac tccagacgec CctttcRCCC 540 caacggtectc ttggacanag ccgtpagcaa cptgatcgcc tccctcaccet SCHERCHCCE 600 cttcgagtac gacgaccctc gettectcag getgctggac Ctagcetcagpg agggactgaa 660 EgEaggagtcg ggetttctec gcgaggtgct gaatgetgte cccgtecten tgecatatace 720 agcgetggct ggcaaggtec tacgcttcca aaaggectttc crgacccagc tggatgasct 780 gcetaactgpag cacapgatga cctgggaccc agcccageCcc CCcccpagacc tgactgagegc 840 cttcctggca gagatggaga aggccaaggE gaaccctgag agcagcttca atgatgagaa 900 cctgtgcata gtggtggetg acctgttcte tgecgggatg gtgaccacct CHaCccacgct 960 ggsctgggac ctcctgctca tgatcctaca Lccggatetg CapcHgccgtg tccaacapga 1020 gatcgacgac gtgatagggc aggtgcggcg accagagatg ggtgaccagg ctcacatgec 1080 ctacaccact gccgtgattc atgaggtgca gcgcetttggg gacatecgtec ccctgggtgt 1149 gacccatatg acatcccgtg acatecgasgt acagggette cgcatecccta agggaacgac 1200 actcatcacc aacctgtcat cggtgctgaa gpatgaggcc gtctgggapa ageccctticg 1260 cttccacccc Baacactterc tggatgccca gggcCcacttt gtgaagceckg aggecttect 1320 gcectttctca gcaggecgec gtgcatgect CggEBagCCC CtggcCCcgcCa tggagctett 1380 cctettecttc aceteacctaec tgcagcactt cagettetcg gtgeccactg gacaglcCccg 1440 gcccagccac catggtgtct ttpctrtttcct pgtgacecccCa tcccCcctatg apctttgtgc 1500 tgtgecccge tagaatgggg tacctagtec ccagcectgect Ccctagccag apgctetaat 1560 gtacaataaa gcaatgiggt agttccaa 1588 <210> 8
<211> 1588
<212> DNA
<213> Homo sapiens
st etoptagt gaggcaggta tggggctaga agcactggtg cccctggecs tgatagtggc 50 catcttcctg ctecEtggtgg acctgatgeca ccggegccaa CHEctgggctg CacgckaccaC 120 accaggcccct ctgccactgc CCBggCtEBE Caacctgetg catgitggact tccagaacac 180 accatactgc ttcgaccagt tgcggegccg cCttcggggac Etgttcapcc tgcagctggc 240 ctggacgccg gtggteptgc tecaatgggct gecgaccgtg cacgaggegc tgatgaccca 300 CggCgaggac accgecgacc geCccgCCtgt geccatcacc Capatcctgpg gILLCHBBCC 366 gegttcccaa ggggtgttcc tggcgcgcsta TgERCCCHCH LEBCHCHAaRC ABaASECHCTT 420 cetccatctec accttigegpca acttgggect gggcaagaag tcgctggage agtgggtBac 4850 Cgaggapgec geetgecttt gigecgectt cgecaaccal tecggacgec CCtItCHELC 540 caacgegtctc ttpgacaaag ccgtgagcaa cgtgatcgec tccctcacct BCBESCHLECH 609 cttcgagtac gacgacccttc gettactcag gcectgetggac ctagetcags agggactgaa 650 gEaggagtcE ggctttectgc gcgaggtgct gastgctgtc cecgteckerc tgcatatacc 720 agcgetgect gecaagpgtec tacgcetteca aaaggctttc ctgacccagcl tggatgagct 780 getaactgag cacaggatga cctgggacccC agcccagccc CCCCgagacc tgactgaggc 840 cttcctgeca gagatggpaga aggcCcaaggg gaacccCtgag agcapcttca atgatgapgaa 900 ccotgtgcata gtggitggctg acctgttakc Tgccgggatg gtgaccacct CgaLcacCHct 960 ggcctgggge ctcctgcetca tgatcctaca TCccggatgtg CagcHccagtg LCCAaCaBHa 1020 gatcgacgac atpgatagggc aggtgcggcg acCagagatg ggtgaccagg ctcacatgcc 1080 ctacaccact gecgtgattc atgaggtgca gegetttggg gacategtce cactgggtgt 1140 gacccatatg acatcccgtg acatcgaagt acagggcttc cgcatcccta agggaacgac 1200 actcatcacc aacctgtcat cggtgetgaa ggatgaggcc gtctgggaga agcccttecg 1260 cttccacccc gaacacttcc £ggatgccca gggccacttt gtgaagccgg aBBccttectk 1320 gestttc£ca geaggcrgec gtgcatgect cggggagecc ctggeccgca tEgagctett 1380 cetcttette acctecctge tgcagcactt cagettecteg gtgeecactg gacaßccccg 1440 geccagccac cCatggtgtct ttgcetttect ggtgaccccCa taCcCcCcCctatg agctttgtgc 1500 tgtgccccgec tagaatggeg tacctagtec ccagectget cectagecag aggetctaat 1560 gtacaataaa gcaatgtpgt agttccaa 1588
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<210> Q@
<211> 1588
<212> DNA
<213> Homo sapiens
stttpetaet gaggcaggta tpgggctaga agcactggtg cccctggecg tgataptgac 60 catcttecctg ctectpgtgg acctpatgca ceggegecaa cgetgggetg cacgetacce 129 accaggeccc ctgccactge cegggetggg caacctgetg catgtggact tccagaacac 180 accatactgc ttegaccagt tgcggecgccg cttecggggac gtgttcagec tgcagctgEcC 240 ctggacgccg gtggEtcgtgc tcaatgggct EBCHEECCHEN CHCHABECEC tggtgaccca 300 CHECHagBaC accgccgaCcc geCccCKCECTHT geccatcaCcc cagatectgg gtttecgggcC 360 gcgtteccaa ggggtgttcc tggegcgeta tBBKCCCKCH TBECHRCHARC agaggcgett 420 ctecgtgtcec acettgecgca acttgggcct gggcaagaag tcgctgpagec agtggptgac 480 cgaggaggecc gaeetgecttE gtgecgectt cgCCcaaccac tccggacgenr ccttLcgCCC 540 caacggtcte t£tggacasag Cccgtgagcaa cgtgategcc tccckcacct ECBEBCECCEH 6008 cttcgagtac gacgaccctc gettectcag getgetggac ctagcetcagg agggactgaa 660 Sggaggagtcg ggctttctgc gegaggtgcet gaatactgte cccgtectec tscatatacc 720 agcgctggct gecaaggtcc tacgctteca aaaggetttc ctgacccage tggatgaget 780 gctaactgag cacaggpatga cctgggaccc aßcccaßgccc CCccgagacc tgactgaggc 840 ctticctggca gapatggapga apgcecaaggg Kaaccctgag agcagettca atgatpagaa 900 cctgecgcata gtggtggetg acctgätcete. tpccggpakg grgaccacct Cgalcacgct I68 ggcctgggg. ctcctgeteca tgatcctaca tccggatgtg cagıegcecgtg tccaacagga 1920 gatcgacgacCc gigatagggc aggtECBECH accagagatg ggtgaccagg ctcHCcatgcC 1880 ctgcaccact gcecgtgattc atgaggtgca gegetttggg gacatcgtec cactgggtgt 1149 gacccatatg acatcccgtg acatcgaagt acagggettc cgcateccta agpggaacgac 1200 actcatcacc aacctgtcat cgetgetgaa ggatgaggec gtectgggaga agcccttecCcg 1268 cttccaccce gaacacttcc tggatgccca gggccacttt gtgaagccgg aggecttect 1320 gcctttctea pecaggccgcc gtgcatgecct cpgggagccc ctggcccgca tggKagctett 1380 cctettette acetecctgc tscagcactt cagcettetesg gtgcccactg BacCagelCCCcEH 1440
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SS N 8
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<211> 1588
<212> DNA
<213> Homa sapiens
NS eteptat gaggcaggta tggegctaga agcactggtg Cccctggccg tgatagtggc 60 catc£tcctg ctcctggtgg acctgatgca ccggegccaa CECtgggECtg CaCcgCtacCC 120 accappccec Ctgecactpr ccpggetggg caacctpctg catgtggact tccagaacac 180 accatactkgc tticgaccagt tgcpgegccg cttcggpgpac gtgttcagcc tgcagctggc 240 ctggacgccg gtggtcgtge tcaatgggct ggecgeccgtg cEcgaggcgec tggtgaccca 300 Cgecgaggac accgeccgacc gecegectgt geaccatcacc cagateactgg gtttegggCc 360 gcgtteccaa ggggtgttec tggcgegeta tgggeccpcg tggcgcgagc agaggegett 420 ctecgtgtec accttgesca acttgggcct gggcaagaag tcgetggagc agtgggtgac 489 Cgaggaggcc gectgecttt gigecgecCctt cgecaaccal tCcCHgaCcgec Cctttegeacc 540 caacggtetc ttggacaaag ccgtgagcaa cgtgategec tecctcacat SCHEBCRCCE 509 cttcgagtac gacgaccctc gettcctcag getgetggac CtagckLcageg agggactgaa 550 ggaggagtcg Bgctt£tctgc gegaggtgct gaatgakgtc cccgtacten tgcatatecc 720 agcegetggct gEgEcaaggtcc tacgcttecca aaaggctttc ctgacccage tggatgagct 780 gctaactgag cacaggatga CCtgggaccCc ageccageCcc CCCCgagacc Egactgaggc 840 cttcctggeca gagatspaga aggccaagge gaaccctgag agcagcttca atgatgagaa 980 cctgegecata gtggtggctg acctgttectec tgecgggatg gtgaccacct cgaccacgct 960 ggectggggc ctcectgectca tpatecctaca tccggatgtg cagckgccgtg tccaacagga 1020
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<211> 1588
<212> DNA
<2313> Homo sapiens
N eteetaet gaggcaggta tggggctaga agcactggtg cccctggccg tgatagtggc 50 catcttcctg ctcctggtgeg acctgatgca CCBBCHCCaa CgcetggaCctg CaCgCctaCcll 128 accaggecec ctgecactge ccgggetggg caacctgetg catgtggact tccagaacac 180 accatactgc ttcgaccagt tgcggcgecg cEtcggggac gtgttcagcc tgCcagctggc 240 ctggacgccg gtggicgtgpc tcaatggect ggEcggcCgtg CECHaggcCRC tEEtgaCCCA 308 Cggcgaggac accgecgacc BrecgeCctgt gcecatcacc Cagatectgg gtttecgggeec 360 gcgttcccaa ggggtgttcc tgascgcgcta tgegccaCgCR tgecHcHagCc agaggcgctt 420 ctccgtgtec accttgcgca acttggECCt gggcaaßaag tcgctggagcl agtgggtgac 480 Cgaggaggce geckgecttt gtgecgcctt egccaaccacl tecggackgcC CCtttcHECE 540 Caacggtecte ttggacaaag CCgtgagcaa cgtgatcgce tecctcacct SCHBLCHCCE 5600 cttcgagtac gacgacccte gcettcctcag getgctggac cCtagctcagg agggactgaa 650 ggaggagtcg ggetttctgc gegaggtsct gaatgetgtc cacgtectec tgcatateacc 720 agcgetggct ggcaaggtcc tacgcktcca asaggetttc ctgacccagc tggatgagct 780 gectaactgag cacaggatga CCtgggacCcCCl aBcCcCagClCC CCCCHABACC tpactgaggpc 840 cttcctggca gagatpgaga aggccaapgg gaaccctpag agcagcettca atgatgagaa 9800 cctgcegcata gtggtggctg accetgttetc tgecgggBatg gigaccacct Ccgaccacgct 960 ggcctgggge ctcctgctca tgatcctaca tLeCHgAtEtE CARCHCCHTE tCcaacakpa 1020 gatcgacgac gtgatagggc aggtgcgscg accagagatg ggtgaccagg ctcacatgcc 1080 Ctgcaccact gccgtgattc atgaggtgca gegctttggg gacatcgtac cactgggtgt 1140
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Claims (39)

x bes AT 523 014 B1 2025-09-15 Ss N Patentansprüche
1. In vitro-Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität einer CYP450-Variante oder eines ihrer Orthologe, zumindest ein Substrat zu Metabolisieren, mit den folgenden Schritten: i) Bereitstellen humaner Zielzellen, die kein Enzym der Cytochrom P450-Familie(CYP450) exprimieren oder eine nicht-funktionale Variante eines CYP450-Enzyms exprimieren oder ein CYP450-Enzym exprimieren, das nicht in den Metabolismus des verwendeten Substrats involviert ist, il) Transientes Transfizieren der Zielzelle mit mindestens einer Nukleinsäure, die mindestens eine CYP450-Variante oder eines ihrer Orthologe kodiert, ill) Kultivieren der transfizierten Zielzellen in der Anwesenheit von mindestens einem Substrat unter Bedingungen, die eine Expression der CYP450-Variante oder ihres Orthologs und den Metabolismus des Substrats gestatten; und iv) Bestimmen des Ausmaßes des durch CYP450 induzierten Metabolismus des Substrats, wobei die Detektion des durch CYP450 induzierten Metabolismus des Substrats CYP-450Aktivität anzeigt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die CYP450-Variante eine CYP2D6-Variante ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, in dem die Zielzellen ferner transfiziert sind mit einem Vektor, der ein abgesondertes Lumineszenz-erzeugendes Enzym kodiert.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3, in dem die Zellen transfiziert sind mit zwei oder mehr Nukleinsäuren, die jeweils zumindest eine CYP2D6-Variante oder eines ihrer Orthologe kodieren.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, in dem die Zellen mit einer Nukleinsäure transfiziert werden, die zumindest zwei CYP2D6-Varianten oder eines ihrer Orthologe kodiert.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, in dem das Ortholog ein Ortholog ist vom Pferd, der Katze, oder dem Hund, bevorzugt worin das Ortholog ein equines Ortholog von CYP2D6 ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, in dem die CYP2D6-Variante durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert ist, die zu mindestens 75% identisch ist mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO. 2.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, in dem die Zielzellen CYP450-defiziente menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) oder eine modifizierte Version davon sind und/oder in dem die Zielzellen keine funktionale CYP450-Enzym-Variante exprimieren, die in den Metabolismus des Substrats involviert ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8, in dem die Zielzellen eine modifizierte Version der HEK-Zellen sind, die defizient in Hinblick auf funktionale CYP2D6-Varianten sind und die gegebenenfalls eine nichtfunktionale Variante einer CYP2D6-Variante exprimieren.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, in dem die Zielzellen CYP2D6*4 oder jedwede andere Vollfunktionsverlust-CYP2D6-Variante exprimieren.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in dem die Zellen mit einem oder mehreren synthetischen oder nicht synthetischen Substrat(en) inkubiert werden, oder mit einer Mischung aus synthetischen und nicht synthetischen Substraten.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 11, das zusätzlich den Schritt aufweist, ein luminogenes oder Licht erzeugendes Molekül mit der kodierten CYP2D6-Variante oder einem Ortholog davon und mit zumindest einem Luciferase-Enzym zu kontaktieren, um ein Reaktionsgemisch zu bilden, gefolgt von Messen der Lumineszenz des Reaktionsgemischs, um die Funktionalität der CYP2D6-Variante oder von deren Ortholog zu bestimmen.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, in dem die Funktionalität der kodierten Variante oder ihres Orthologs mittels Massenspektrometrie bestimmt wird.
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14. Ein Kit zur Bestimmung der Funktionalität von mindestens einer CYP450-Variante oder eines ihrer Orthologe umfassend a) Zellen, die kein Enzym der Cytochrom P450-Familie (CYP450) exprimieren, oder die eine nicht funktionale Variante eines CYP450-Enzyms exprimieren und b) Vektoren, die CYP450-Kontroll-Varianten kodieren.
15. Kit gemäß Anspruch 14, wobei das Kit ferner umfasst c) einen Vektor, der die interessierende CYP450-Variante kodiert.
16. Kit gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei das Kit ferner umfasst d) einen Vektor, der ein lumineszentes abgesondertes Protein kodiert und Reagenzien für die Quantifizierung des lumineszenten abgesonderten Proteins.
17. Kit gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Kit ferner umfasst e) ein synthetisches oder nicht synthetisches Substrat für CYP2D6 und Reagenzien für die Quantifizierung des metabolisierten Substrats.
18. Kit gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die zu testende CYP450-Variante eine CYP2D6-Variante ist und wobei die Kontroll-Varianten CYP2D6-Varianten sind.
19. Kit gemäß Anspruch 18, in dem die interessierenden Varianten ausgewählt sind aus der Liste bestehend aus, aber nicht beschränkt auf:CYP2D6*1, CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*6, CYP2D6*7, CYP2D6*8, CYP2D6*9, CYP2D6*10, CYP2D6*11, CYP2D6*12, CYP2D6*13, CYP2D6*14, CYP2D6*15, CYP2D6*17, CYP2D6*18, CYP2D6*19, CYP2D6*
20, CYP2D6*
21, CYP2D6*
22, CYP2D6*
23, CYP2D6*
24, CYP2D6*
25, CYP2D6*
26, CYP2D6*
27, CYP2D6*
28, CYP2D6*
29, CYP2D6*
30, CYP2D6*
31, CYP2D6*
32, CYP2D6*
33, CYP2D6*
34, CYP2D6*
35, CYP2D6*
36, CYP2D6*
37, CYP2D6*
38, CYP2D6*39, CYP2D6*40, CYP2D6*41, CYP2D6*42, CYP2D6*43, CYP2D6*44, CYP2D6*45, CYP2D6*46, CYP2D6*47, CYP2D6*48, CYP2D6*49, CYP2D6*50, CYP2D6*51, CYP2D6*52, CYP2D6*53, CYP2D6*54, CYP2D6*55, CYP2D6*56, CYP2D6*57, CYP2D6*58, CYP2D6*59, CYP2D6*60, CYP2D6*61, CYP2D6*62, CYP2D6*63, CYP2D6*64, CYP2D6*65, CYP2D6*68, CYP2D6*69, CYP2D6*70, CYP2D6*71, CYP2D6*72, CYP2D6*73, CYP2D6*74, CYP2D6*75, CYP2D6*81, CYP2D6*82, CYP2D6*83, CYP2D6*84, CYP2D6*85, CYP2D6*86, CYP2D6*87, CYP2D6*88, CYP2D6*89, CYP2D6*90, CYP2D6*91, CYP2D6*92, CYP2D6*93, CYP2D6*94, CYP2D6*95, CYP2D6*96, CYP2D6*97, CYP2D6*98, CYP2D6*99, CYP2D6*100, CYP2D6*101, CYP2D6*102, CYP2D6*103, CYP2D6*104, CYP2D6*105, CYP2D6*106, CYP2D6*107, CYP2D6*108, CYP2D6*109, CYP2D6*110, CYP2D6*111, CYP2D6*112, CYP2D6*113, CYP2D6*114, CYP2D6*115, CYP2D6*116, CYP2D6*117, CYP2D6*118, CYP2D6*119, CYP2D6*120, CYP2D6*121, CYP2D6*122, CYP2D6*123, CYP2D6*124, CYP2D6*125, CYP2D6*126, CYP2D6*127, CYP2D6*128, CYP2D6*129, CYP2D6*130, CYP2D6*131, CYP2D6*132, CYP2D6*133, CYP2D6*134, CYP2D6*135, CYP2D6*136, CYP2D6*137, CYP2D6*138, CYP2D6*139.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
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