BE1000572A4

BE1000572A4 - Cellule rta, appareil et procede pour titrer un polynucleotide dans un liquide.

Info

Publication number: BE1000572A4
Application number: BE8700563A
Authority: BE
Inventors: Tomas B Hirschfeld
Original assignee: Block Myron J
Priority date: 1987-05-20
Filing date: 1987-05-20
Publication date: 1989-02-07

Abstract

Titrage de polynucléotides utilisant la réflexion totale interne d'un rayonnement d'excitation à un revetement lié à la surface d'une cellule de verre optiquement conductrice. Le revetement comprend initialement des polynucléotides à brin unique. Lorsque la surface revetue de la cellule est mise en contact avec un échantillon qui contient un polynucléotide à brin unique complémentaire du polynucléotide lié, une renaturation s'opère, engendrant une forme à double brin du polynucléotide intéressé. Un colorant fluorochromique spécifique de cette forme à double brin est lié à cette dernière, le colorant comprenant un chromophore que le rayonnement d'excitation excite pour l'amener en fluorescence. La fluorescence induite est ensuite collectée et mesurée.

Description


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  CELLULE RTA, APPAREIL ET PROCEDE POUR TITRER UN POLYNU-   CLEOTIDE   DANS UN LIQUIDE 
La présente invention concerne des titrages bio- chimiques et, de manière plus particulière, des titrages pour la mise en oeuvre desquels on utilise une étiquette capable d'émettre un rayonnement décelable en vue d'iden- tifier un acide nucléique et la mesure de la concentra- tion et de l'intercorrélation entre acides nucléiques choisis et leurs fragments. 



   Une technique connue de titrage chimique et bio- chimique, telle que celle décrite dans les brevets des E.U.A. n  4 133 639, 4 321 057,4 399 099,4 447 546 et autres, comprend un système optique faisant appel aux principes d'une spectroscopie à réflexion totale atténuée (RTA). Pour la cellule de RTA, un tel système optique utilise un guide d'onde optique, typiquement une fibre optique, une tige ou barre ou une plaque. Lorsque l'une des extrémités de la cellule est illuminée par un rayon- nement d'excitation, ce rayonnement subit une réflexion totale interne, de façon à créer une onde évanescente à la surface de la cellule.

   Le rayonnement d'excitation est choisi de façon que l'onde évanescente excite la fluorescence dans des substances à titrer et situées dans une mince zone seulement (typiquement d'une épais- seur de quelques centaines à un millier d'unités   Angstm)   entourant la surface de la cellule. La fluorescence qui en résulte peut fournir une information à partir de la- quelle on peut titrer la matière fluorescente. On a utilisé de tels systèmes jusqu'à ce jour, en vue de titrer, par exemple, des substances antigéniques, de produits chimiques et analogues. 

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   Il est également bien connu que l'information généti- que dirigeant la synthèse de séquences d'amino-acides ou acides aminés en protéines s'effectue par l'acide désoxy- ribonucléique (ADN) ou l'acide ribonucléique (ARN), qui sont tous deux des molécules complexes, très longues, qui se présentent habituellement sous la forme d'une double hélice. Etant donné que l'ADN ou l'ARN sont ubiquistes dans toute matière vivante sous des formes uniques pour chaque espèce, la nature de l'acide nucléique ou de ses fragments uniques (que l'on appellera collectivement dans la suite du présent mémoire : polynucléotides) peut ser- vir pour déterminer ou déceler la présence d'une espèce donnée. Par exemple, tous les gènes viraux contiennent de l'ARN ou de l'ADN.

   On peut aisément isoler de tels acides nucléiques viraux de l'enveloppe ou couche de pro- téines et ils sont actuellement disponibles sous une forme fortement purifiée. Nombre des acides nucléiques viraux sont linéaires et à double brin (ADN dans des virus tels que celui de la variole et SV40. par exemple, et ARN dans des virus tels que les réovirus). Les acides nucléiques à un seul brin peuvent toujours se convertir en acides nucléiques à double brin pour autant que des brins uni- ques complémentaires soient disponibles. Les doubles brins de l'acide nucléique peuvent être séparés en soumettant cet acide nucléique à des conditions de dénaturation (par exemple pH élevé ou faible, hautes températures, réactifs tels que l'EDTA et la guanidine qui brise les liaisons hydrogène , etc. ).

   La dénaturation sépare non seulement habituellement l'acide nucléique en brins uniques, mais peut également provoquer la rupture des brins en un im- portant assortiment imprévisible de fragments qu'il est extrêmement difficile de séparer les uns des autres sous une forme identifiable. On utilise fréquemment des en- zymes de restriction pour briser des acides nucléiques en des endroits ou sites spécifiés pour créer une multiplicité 

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 de fragments qui sont laborieusement séparés par mise en oeuvre de techniques électrophorétiques et d'autresencore, consommatrices de temps, en vue de leur identification dé- finitive. 



   La présente invention a donc pour objet principal un appareil et un procédé destinés au titrage ou à la détec- tion de fractions ou parties d'acides nucléiques ou de polynucléotides, lesquels appareils et procédés permet- tent d'identifier la source génétique de la partie ou fraction de manière non ambiguë et rapide. Un autre objectif important de la présente invention réside dans un appareil et un procédé de ce genre que l'on peut met- tre en oeuvre directement sur un échantillon contenant des fragments d'acides nucléiques sans devoir au préalable séparer les fragments en groupes homogènes. L'invention a également pour objet l'application au problème de la détection et de l'identification d'acides nucléiques, de la sensibilité et de la simplicité de titrages à flu- orescence faisant appel à des fibres optiques. 



   Ces objectifs et d'autres encore sont atteints, conformément à la présente invention, par un appareil et un procédé de titrage fluorescent de polynucléotides ou de fractions, parties ou fragments d'acides nucléiques assujettis ou liés à la surface d'une cellule allongée à réflexion totale atténuée (RTA). N'importe quel acide nucléique à double brin présent dans l'échantillon à soumettre au titrage est dénaturé, par exemple, par chauf- fage jusqu'à environ 80 C, de façon à former des brins singuliers de l'acide nucléique. La dénaturation peut être facilitée par l'addition de chélateurs de façon à éliminer des ions stabilisants, tels que Mg++. On peut briser les brins singuliers en séquences de longueur sou- haitée par le recours à des enzymes de restriction appro- priées connues.

   Des parties ou fractions choisies de brins singuliers d'acide nucléique à double brin, 

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 caractéristique de l'espèce à identifier, séparés, par exemple par électrophorèse ou chromatographie en phase liquide, sont assujettis sur le côté le moins optique- ment dense d'une interface à former entre des milieux d'indices de réfraction différents (par exemple une cellule RTA sous la forme d'un prisme,.d'une tige ou barre ou d'un élément optique fibreux et un échantillon de liquide suspecté de contenir l'acide nucléique à déceler ou titrer).

   On refroidit alors graduellement   l'échantillon en contact avec l'interface ; la me-   sure où une partie des brins uniques de l'acide nuclé- ique dans l'échantillon est complémentaire de la partie ou fraction d'acide nucléique à brin unique initialement liée à l'interface, une portion de l'acide nucléique lié sera hybridée avec l'acide nucléique de l'échantillon. 



   Les polynucléotides quelconques qui ont subi une renaturation avec les parties liées à la surface de la cellule, peuvent à présent être colorés avec un colorant fluorochromique spécifique de polynucléotides à double brin (par exemple,de préférence sous forme dimère pour accroltre la spécificité et la stabilité de la liaison). 



  En alternative, pour la liaison compétitive, on peut uti- liser des brins singuliers complémentaires pré-marqués ou pré-étiquetés   du.polynucléotide,   dont la présence doit être décelée ou titrée dans l'échantillon. Les apparie- ments partiels peuvent être éliminés en ajoutant à ce moment une enzyme qui scinde ou clive la double hélice lorsque des fragments à brin unique dans l'échantillon ne forment pas de double brin avec les parties ou frac- tions liées. Une extrémité de la cellule est ensuite illuminée avec un rayonnement d'excitation qui subit une réflexion totale interne dans la cellule, de manière à créer une onde évanescente à la surface de la cellule de RTA.

   On choisit le rayonnement d'excitation de façon que l'onde évanescente excite le fluorochrome sur les poly- 

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 nucléotides colorés dans seulement la mince zone entou- rant ou enveloppant la surface de la cellule de RTA. Si la longueur de chaîne s'adpate dans la zone illuminée par l'onde évanescente, la fluorescence qui en résulte est une mesure des polynucléotides à double brin liés à la surface de la cellule et, par conséquent, une mesure de l'acide nucléique dans l'échantillon complémentaire de l'acide nucléique préchargé sur la cellule de RTA. Les mesures de la durée de vie de la fluorescence peuvent également permettre de mesurer l'efficience quantique du fluorochrome et, par conséquent, le degré d'appariement entre les polynucléotides initialement liés à l'interface et ceux complexés à elle à partir de l'échantillon.

   Ceci permet d'établir une distinction parmi des émissions pro- venant du colorant spécifiquement lié, du colorant atypi- que ou moins spécifiquement lié et du colorant non lié, améliorant ainsi les rapports signal-fond. 



   D'autres objectifs de la présente invention appa- raitront en partie évidents et apparaîtront en partie dans la suite du présent mémoire. Par conséquent, l'in- vention a pour objet l'appareil possédant la construction, la combinaison d'éléments et l'agencement des organes et le procédé impliquant les diverses étapes et la relation et l'ordre d'une ou plusieurs de ces étapes les unes par rapport aux autres que l'on illustre dans la description détaillée qui suit, ainsi que les revendications les dé- finissent par leur portée. 



   Afin de mieux comprendre la nature et les objets de la présente invention, on se référera à présent à la description détaillée qui suit, réalisée en référence aux dessins annexés, sur lesquels les mêmes notations de référence se rapportent à des éléments identiques et où la figure 1 représente une vue en coupe transversale longitudinale d'une trousse ou set de titrage conforme aux principes de la présente invention et la figure 2 

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 représente une vue de bout de la forme de réalisation re- présentée sur la figure 1. 



   Il faut bien comprendre que dans la description dé- taillée de l'appareil suivant la présente invention, la référence à des parties " supérieures" et "inférieures" de l'appareil s'effectue totalement pour des raisons de commodité et pour amener la description en corrélation avec les illustrations schématiques des dessins. Il faut aussi comprendre que l'appareil peut fonctionner en n'importe quelle position ou orientation et par consé- quent, ceci fait partie de la portée de la présente in- vention. Il faut également saisir que la représentation telle qu'elle apparalt sur les figures est schématique et que, par conséquent, elle ne vise nullement à donner des échelles ou des rapports réels. 



   La présente invention se réalise par un rayonnement d'excitation à réflexion totale interne le long d'une cellule de RTA, laquelle excitation excite la fluorescence qui reflue dans la cellule et la détection de cette fluo- rescence, le tout comme décrit dans la demande de brevet des E.U.A. co-pendante, N  de série 406 324, déposée le 9 août 1982 et cédée au cessionnaire de la présente de- mande et à laquelle on peut se référer pour obtenir de plus amples détails relatifs au mode optique de mise en oeuvre de l'invention. 



   Sur la figure 1, on a représenté une vue en coupe transversale longitudinale d'une trousse de titrage 20 réalisée conformément aux principes de la présente in- vention. Suivant une forme de réalisation préférée, la trousse 20 comprend une cellule de RTA 22, un boîtier 24 et un châssis 26. 



   La cellule 22 est de préférence un corps allongé, sensiblement cylindrique, optiquement transparent, qui se présente, de manière typique, sous la forme d'une tige ou d'une fibre optique s'étendant depuis son extrémité 

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 proximale ou face d'entrée 28 jusqu'à une extrémité dis- tale ou terminale 30. La cellule 22 est adaptée à assurer la propagation tout au long de sa longueur, par des ré- flexions totales internes multiples, de   rayonnements opti-   ques pénétrant par la face 28 dans un angle solide établi, sensiblement rotationnellement symétrique autour de l'axe longitudinal de la cellule.

   Lorsque la cellule est une fibre telle que celle représentée sur la figure 1   ((et   à des fins d'exposition, on se référera dans la suite du présent mémoire à une telle cellule 22 dans son contexte), ainsi que les spécialistes des fibres optiques le savent parfaitement, l'angle d'acceptation maximale eu égard à l'axe de la fibre, B, pour le rayonnement entrant dans la fibre et se propageant ainsi en elle, est établi par les indicesde réfraction de la fibre et du milieu environnant. 



  A la face 28, la surface de la fibre est typiquementplane, est disposée normalement au long axe de la fibre et est de préférence fortement polie de manière à minimiser les ter- nissement ou les défauts surfaciques qui pourraient ten- dre à diffuser ou diffracter leur rayonnement d'excita- tion incident. 



   Pour un rayonnement se propageant initialement à tra- vers un milieu d'indice de réfraction   n ,   incident sur une fibre d'indice de réfraction   n ,   par ailleurs enve- loppée ou entourée d'une matière d'indice de réfraction N2 , l'angle d'acceptation maximal est donné par l'équation qui suit : (1) NA = n 0 sinB = en 1 2 - n22) 1/2 où NA est ce que l'on appelle l'ouverture numérique de la fibre. 'A titre d'exemple non limitatif, la fibre 22 peut être en n'importe laquelle d'un grand nombre de matières optiquement transparentes, comme le verre, le quartz, le polypropylène, des polyoléfines, le nylon, et analogues, 

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 choisies de façon à posséder un indice de réfraction su- périeur à celui de l'échantillon du fluide à titrer. 



   L'échantillon est typiquement constitué par une solution aqueuse possédant un indice de réfraction proche de 1,33. 



   Il faut également comprendre que la matière constitutive de la fibre 22 est également choisie de façon à être re- lativement insoluble et non réactive sur le liquide de l'échantillon. Bien que le calibre.de la fibre 22 puisse varier selon qu'on le souhaite, on a constaté qu'une fibre ou tige d'un diamètre allant d'environ 1 mm à quelques centaines de microns et d'une longueur aussi réduite que 
5   mm,   était adéquate pour la plupart des titrages, étant cependant entendu qu'une telle longueur et un tel diamètre sont simplement,illustratifs et non limitatifs. 



   Suivant une forme de réalisation préférée conformé- ment à laquelle la fluorescence induite à la surface de la fibre par le rayonnement d'excitation libéré à travers la fibre, est recueillie ou observée à la même extrémité proximale de la fibre à laquelle le rayonnement d'excita- tionest injecté, il est souhaitable d'empêcher un rayonnement vagabond ou de dispersion de redescendre la fibre à par- tir de la face 30 vers la face 28. Par conséquent, la face 30 peut être façonnée de façon'à arrêter la lumière incidente à l'intérieur, mais est de préférence revêtue d'une matière s'appariant à l'indice de réfraction du milieu environnant la face 30, une telle matière étant à la fois non fluorescente et absorbante vis-à-vis du rayonnement d'excitation.

   De manière typique, une résine époxyde chargée de noir de carbone remplit une telle fonction. 



   Suivant une forme de réalisation illustrative, la partie opératoire de la surface de la fibre est définie par la région activée à laquelle on doit réaliser le ti- trage. Pour activer la surface de la partie opératoire de la fibre 22, cette dernière est traitée, de manière typique, pour réaliser le revêtement 32 en liant en 

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 premier lieu une amine aromatique à la surface de la fibre à titre d'agent pour obtenir une copulation diazo- Ique au polynucléotide ou à l'acide nucléique à un seul brin. L'amine aromatique doit être couplée à la surface de la fibre par l'intermédiaire d'un élément d'espacement de façon à ce que l'amine soit libre de réagir sans être stériquement empêchée par le verre.

   Un certain nombre de techniques de couplage avec élément d'espacement de ce genre que l'on peut utiliser sont bien connues et sont d'ailleurs illustrées dans les exemples qui suivent : EXEMPLE 1 
Les groupement hydroxyle sur la surface du verre   (que.l'on   appellera dans la suite du présent   mémoire "G")   peuvent être couplés par du triméthoxysilane substitué par une chaîne de radicaux méthylène possédant un groupe amine aromatique en bout de chaîne, typiquement 
 EMI9.1 
 
Ce réactif est mis dans le commerce par la société   , Petrarch   Chemical Company.

   Le réactif en question, lors- qu'il est en   solution,de   préférence tamponnée jusqu'à un pH de 8, réagit sur les radicaux hydroxyle du verre (G) de façon à éliminer du méthanol et à former une liaison siloxane comme suit : 
 EMI9.2 
 

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 EXEMPLE   II   
En alternative, on peut coupler à la surface de verre un réactif constitué de deux radicaux époxydes raccordés par une chaîne méthylénique.

   Par exemple, en utilisant un excès du réactif en solution fortement al- caline (typiquement NaOH) pour empêcher un trop grand nombre d'extrémités de chaque molécule de réactif de se coupler au verre, la réaction suivante s'opère de façon à engendrer une liaison éther : 
 EMI10.1 
 
Si l'on fait à présent réagir ce dernier intermé- diaire sur un composé sulfhydrylique ou un thiol, on forme une liaison thioéther comme suit 
 EMI10.2 
 EXEMPLE III 
Un autre couplage encore peut être réalisé par l'in- termédiaire d'une liaison d'amine aliphatique, comme suit:

   (4) G(OH)3 + (CH3O)3-Si- (CH2)3-NH2   #   GOSi-(CH2)3-NH2 
Au produit de la réaction ci-dessus, on ajoute, à un pH de 8, un excès d'isothiocyanate double avec une chaîne 

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 méthylénique intermédiaire, de façon à engendrer une liaison thio-urée : 
 EMI11.1 
 
L'addition d'un excès d'amine aromatique double, à un pH de 8, achève la formation du composé aromatique souhaité, c'est-à-dire 
 EMI11.2 
 EXEMPLE IV 
Une quatrième technique de couplage au verre en- gendrant un produit inhabituelle ment stable, consiste à traiter le verre à un pH de 8 par un triméthoxysilane possédant un radical chlorobenzyle 
 EMI11.3 
 
On fait réagir le produit de cette réaction, à un pH de 9, sur l'amine aromatique possédant un radical nitro:

   
 EMI11.4 
 

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Ensuite, on traite le produit de la réaction par un agent puissamment réducteur, comme le dithionite de sodium à un pH de 6, de façon à réduire le radical nitro en amine aromatique comme suit : 
 EMI12.1 
 
L'amine aromatique produite par n'importe laquelle des techniques susmentionnées, peut être utilisée pour lier l'acide nucléique à un seul brin souhaité. A titre d'étape préliminaire, il faut traiter l'amine aromatique liée au verre (que l'on appellera dans la suite du pré- sent mémoire   GA-#NH2)   par de l'acide nitreux (solution de nitrite acide) autour de 0 C.

   Ceci engendre un produit intermédiaire que l'on fait ensuite réagir, à un pH de 8, sur du poly-T (que l'on appellera dans la suite du pré- sent mémoire (TTT), un ADN synthétique connu, dont la seule basé est la thymidine), le tout comme décrit ci- dessous : 
 EMI12.2 
 
Il est connu que des cellules tendent à produire des brins d'acide nucléique espacés par de courts brins de polyadénine. Par conséquent, ce dernier produit est à présent amené à réagir sur la fraction d'adénine typi- quement présente au début d'une molécule d'acide nuclé- ique à un seul brin (que l'on appellera dans la suite du présent mémoire AAA-NUC) présentant de l'intérêt pour former la fraction d'acide nucléique liée à la surface de la fibre.

   Dans la mesure où l'adénine est le conjugué 

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 de la thymidine, cette dernière formera double brin en présence de Mg+, à un pH de 7, à la température ambiante, pour former une liaison. 
 EMI13.1 
 



   La liaison à double brin peut à présent être rendue permanente en traitant les conjugués   adénine-thymidine.par   du psoralène (6-lactone de l'acide   6-hydroxy-5-benzofu-   rane acrylique) ou tout autre agent de réticulation. On préfère le psoralène parce qu'il est relativement non volatil et qu'il est aisément activé par un rayonnement ultraviolet. Bien que la réaction soit parfaitement   @   connue, son utilisation pour rendre l'hybridation irré- versible est supposée être nouvelle. Pour une hybridation appropriée, le segment d'ADN lié doit avoir une longueur d'au moins 10 bases; bien qu'un plus grand nombre de bases puisse être nécessaire pour une spécificité raisonnable. 



  Il faut voir que cette technique lie la fraction de l'ADN non utilisée dans sa reconnaissance, c'est-à-dire la chaîne   polyadéninique   présente au début. Le but de pratiquer de . la sorte sert à éviter des problèmes survenant de la fixation possible de la liaison diazoïque à une partie de la sé- quence de reconnaissance de l'acide nucléique à double brin lié. En d'autres termes, la réaction sur le psoralène permet l'attachement à une extrémité de la séquence d'aci- des nucléiques sans colmater ou obstruer le site ou endroit de reconnaissance. Mais, pour le renforcement assuré par le traitement au psoralène, une dénaturation pourrait bri- ser l'acide. Bien évidemment, si l'on prévoit que le type susmentionné de problème ne se posera pas, on peut éliminer cette étape supplémentaire. 



   Les concentrations en produits chimiques que l'on uti- lise pour former le revêtement 32 dépendent empiriquement 

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 du type particulier de liaison de revêtement à former et de la nature de la fraction d'acide nucléique que l'on désire lier au revêtement. Cependant, 11 faut noter que les endroits ou sites réactifs (c'est-à-dire les endroits ou sites sur la fibre où le revêtement contient les fractions d'acides nucléiques à brin unique liées et avec lesquelles on cherche à hybrider complémentairement les fragments d'acides nucléiques) doivent en moyenne être espacés de plusieurs fois (trois ou plus de trois foie le diamètre moyen   10A   d'un double brin d'ADN typique.

   Si la concentration en sites ou endroits est moins dense, la réaction d'hybridation ultime avec le revêtement sera spatialement ou stériquement empêchée et se déroulera par conséquent trop lentement pour de nombreuses fins. 



   Le procédé de liaison susmentionné comporte un certain nombre de caractéristiques souhaitables. Il assure une liaison puissante au verre. Cette liaison est irréversible, même dans des conditions de dénaturation et est photostable. La réalisation d'un élément d'espacement entre la surface de RTA et la chaine moléculaire permet un accès aisé (pour des conditions cinétiques de diffu- sion raisonnables) et donne suffisamment d'espace pour les flexions de chaîne qui constituent une partie   du.pro-   cessus d'hybridation. La liaison poly A-poly T garantit que la chaîne se lie à un endroit unique de façon à pré-' server la flexibilité ou souplesse de la chaîne néces- saire à des conditions cinétiques d'hybridation raison- nables. Cette liaison assure également que le site de reconnaissance est exclu de l'endroit de liaison. 



   L'enceinte ou boîtier 24 est un tube creux, allongé, de préférence, mais non nécessairement,optiquement trans- parent et est formé d'une matière qui est relativement insoluble dans et chimiquement non réactive sur le liquide à titrer. De manière typique, le boîtier 24 est simple- ment un tube de verre possédant un diamètre interne 

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 supérieur au diamètre externe maximum de la fibre 22 et est de préférence dimensionné de façon à délimiter un volume prédéterminé enveloppant au moins le revêtement activé 32 présent sur la fibre 22. Selon une forme de réalisation préférée, l'inter-espace entre la surface revêtue de la fibre 22 et la paroi interne du boîtier 24 peut avoir des dimensions capillaires. 



   Le chassis 26 est prévu pour maintenir la fibre 22 et le boîtier 24 en relation fixée, conformément à la- quelle, de manière plus particulière, le boîtier est espacé de la fibre de façon que le volume délimité pré- déterminé d'échantillon puisse envelopper la région acti- vée sur la surface de la fibre et que l'extrémité d'en- trée de la fibre soit maintenue avec précision de façon à permettre une injection de lumière optimale dans la fibre. 



  Par conséquent, la fibre peut être maintenue parle châssis au voisinage soit de la face 28, soit de la face 30. Ce- . pendant, le contact entre la fibre et le châssis au voi- sinage de la face 28 tend à réduire l'ouverture numérique dans la mesure où l'indice de réfraction de la matière constitutive du châssis est généralement supérieure à n1. 



  Pour obvier à ce problème, on peut, de manière typique, revêtir la fibre, au moins au voisinage de l'extrémité de la fibre dans laquelle le rayonnement se propage, d'un enrobage, typiquement d'un polymère transparent, de poids moléculaire élevé, disposé de manière à former un milieu à indice de réfraction faible, interposé entre le châssis et la fibre. Pour éviter des problèmes dùs à la présence du châssis au voisinage de l'extrémité proximale de la fibre, le châssis représenté sur la figure 1 est montré simplement sous la forme d'un berceau 36 possédant l'une de ses parties 38 couplées au et supportant le boîtier 24, une autre partie 40 de ce berceau étant cou- plée à et supportant la bague 42 dans   laquelle l'extrémité   distale 30 de la fibre 22 est fermement montée.

   Lamatière 

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 dont la bague 42 est constituée n'a pas d'importance du point de vue de l'optique, mais doit être chimiquement relativement non réactive avec le liquide de l'échantil- lon à titrer. Selon la forme de réalisation représentée sur la figure 1, le boîtier 24 et la fibre 22 sont montés de façon que les axes longitudinaux tant du boitier que de la fibre soient sensiblement horizontaux,la fibre 20 étant par conséquent posée en porte-à-faux pour s'étendre vers l'intérieur dans le bottier 20 avec son extrémité 28 qui fait saillie à l'extérieur du boitier, la fibre 22 étant maintenue en relation espacée de la surface interne du boîtier 24.

   Suivant cette forme de réalisation parti- culière, le boîtier est ouvert aux deux extrémités, de façon à permettre à du liquide d; être introduit ou retiré par n'importe quelle extrémité. 



   Au cours du fonctionnement de la forme de réalisation représentée,sur la figure 1, le revêtement 32 de la fibre 
22 est formé de n'importe lesquelles d'un certain nombre de parties d'acides nucléiques à brin unique. Ces der- nières sont liées de la manière précédemment décrite pour donner des sites ou endroits de fixation à la fibre pour les parties d'acides nucléiques de l'échantillon et les   @   parties fixées sont ensuite déterminées ou mesurées par ,coloration. 



   L'échantillon est d'abord traité par des techniques connues pour concentrer l'acide nucléique potentiel (si cela se révèle nécessaire) et ensuite, les capsides vi- rales ou des structures cellulaires biologiques sont ly- sées, comme par un choc osmotique, un détergent ou tous autres agents de lyse, pour libérer des acides nucléiques. 



  L'échantillon est ensuite soumis à un traitement qui dé- nature n'importe quel acide nucléique à double brin li- béré et brise la chaine de l'acide nucléique en fragments. 



  Par exemple, l'ADN à double brin peut etre dénaturé sim- plement par traitement par de la chaleur modérée (75 C) 

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 et de l'EDTA. L'utilisation d'EDTA élimine également les ions Mg++ si ces derniers sont présents, soit de l'échan- tillon, soit de l'étape de liaison de la polyadénine/ thymidine ; une telle élimination des ions Mg ++ est ex- trêmement souhaitable pour empêcher les ions métal de renaturer l'acide nucléique à brin unique. Bien évi- demment, on peut utiliser des techniques de scission d'ADN enzymatiques connues pour fragmenter l'acide nucléique. 



  L'ordre dans lequel la fragmentation et la dénaturation s'opèrent   n'apas,d'   importance aux fins de la présente in- vention. 



   On injecte ensuite l'échantillon dans l'inter-espace 44 situé entre le boîtier 24 et la fibre 22, comme avec une seringue hypodermique, l'échantillon.étant maintenu dans l'inter-espace 44 par les ménisques formés aux ex- trémités opposées du boîtier 24. On laisse incuber l'échantillon dans l'inter-espace 44 selon qu'on le sou- haite, afin de permettre à la matière à titrer dans léchan- tillon liquide de diffuser vers et renaturer ou complémen- ter les parties d'acide nucléique dans le revêtement ou enrobage 32. La réversibilité des réactions de conju- gaison de l'acide nucléique donne une limite réglée d'avi- dité à la sensibilité du système, en particulier si le système est lavé de manière à éliminer simplement l'acide nucléique absorbé, mais non conjugué.

   Cette différence d'avidité ou d'affinité entre l'absorption et la conju- gaison peut être augmentée si, avant de procéder au la- vage, des composés de la famille du psoralène sont ajoutés à l'échantillon. Ces composés se lient aux régions de l'acide nucléique à double brin et, par exposition à de la lumière, servent à réticuler de manière irréversibles ces régions à double brin. 



   L'acide nucléique renaturé à double brin est coloré, de préférence, en piquant la solution d'échantillon di- rectement avec un colorant fluorochromique possédant une 

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 large affinité spécifique vis-à-vis de l'acide nucléique à double brin. Les colorants préférés possèdent plus d'un endroit ou site de liaison d'acide nucléique indépendant pour augmenter l'avidité ou affinité et réduire ainsi l'arrière-fond et la concentration en colorant libre. 



  Des colorants typiques utilisés aux fins de la présente invention sont le bromure d'éthidium, l'orange d'acridine (CI N  46005), la quinacrine, le bromure de diéthidium, l'orange de diacridine, les divers hétéromères et analo- gues. Le,bromure d'éthidium possède une longueur d'onde d'excitation optimale qui varie de 480 à 550 um et la gamme de longueurs d'onde defluorescence optimale de 580 à 650 um. On suppose que la structure du bromure d'éthi- dium est la suivante : 
 EMI18.1 
 
En alternative, pour réduire une éventuelle insta- bilité du réactif, on peut initialement fournir le colo- rant sous une forme très faiblement préliée seulement à la fibre, de façon à ce qu'il se libère dans de l'eau en l'espace de millisecondes.

   Le colorant choisi est de préférence un colorant dont le signal de fluorescence est fortement affecté par la liaison et, par conséquent, par le degré auquel les deux chaînes d'acide nucléique    sont hybridées ; colorants de ce genre sont couramment   connus sous l'appellation de colorants fluorochromiques. 



  Pour des colorants fluorochromiques, comme le bromure d'éthidium et l'orange d'acridine ou leurs dimères, la 

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 concentration nécessaire en échantillon dans l'interface 44 peut être faible, par exemple varier d'environ 10-10 à 10-14M. 



   Il faut noter que la surface de la solution injectée dans l'inter-espace 44 est supposée contenir environ 6 ordres de grandeur de plus de l'acide nucléique à brin unique que celui présent dans la masse de la solution. 



  Par conséquent, il existera une vitesse de recombinaison d'acide nucléique supérieure à l'interface de la solution et de la fibre et le colorant sera préférentiellement lié aux doubles brins formés sur la fibre, lesquels brins sont les seuls illuminés. Le colorant flotte librement avant la réaction entre l'acide nucléique soumis à l'essai et le réactif sur la fibre, et constitue une étiquette ou marque pour la forme conjuguée seulement. Etant donné que le colorant est un fluorochrome, il est, de manière inhé- rente, moins efficient à l'état non lié qu'à l'état lié. 



  L'utilisation de la forme dimère du colorant sert à assu- rer une liaison plus puissante qui porte au carré l'avi- dité ou affinité du colorant pour l'acide nucléique à double brin. Par conséquent, avec des colorants dimères, on obtient une augmentation de la sélectivité vis-à-vis de   l'ADN   à double brin et un moindre arrière-fond, parce- qu'une plus faible proportion de colorant libre est né- cessaire dans la masse de la solution, assurant ainsi un rapport signal à bruit extrêmement élevé. 



   L'appareil est couplé au fluorimètre 43, de façon que la face d'entrée 28 soit illuminable par le rayonne- ment, typiquement capable d'exciter ou d'induire la flu- orescence dans le revêtement ou enrobage 32 sous l'effet d'une onde évanescente accompagnant la transmission du rayonnement à travers la fibre. La fluorescence induite dans le complexe étiquetté ou marqué au revêtement 32 reflue ensuite dans la fibre à partir de la matière excitée et ensuite à l'extérieur à travers la face 28 

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 de façon à être lue par le fluorimètre 83. L'intensité de la fluorescence sera proportionnelle à la quantité d'acide nucléique à double brin présente et constitue par conséquent une,fonction de la quantité relative d'acide nucléique apparié présent dans l'échantillon d'origine. 



   Il se produira une erreur dans les données susmen- tionnées, provoquée par la variation en efficience quan- tique du colorant qui peut réfléchir le degré de perfec- tion de l'appariement d'hybridation. Une manière de corriger une telle erreur consiste à procéder à une mesure supplémentaire de la durée de vie de la fluorescence qui est proportionnelle à l'efficience quantique. Le rapport de l'intensité du signal à la durée de vie est indépen- dant de l'efficience quantique et par conséquent non en- taché de l'erreur. Les valeurs de la durée de vie réelle peuvent également servir de mesure du degré de corrélation mutuelle des brins d'acide nucléique. 



   La durée de vie de la fluorescence naturelle peut être définie comme étant la durée nécessaire à la dispa- rition de la fluorescence, suivant la cessation de l'exci- tation, à partir de son maximum I à une valeur de I/e où e est la base népérienne. En utilisant un appareil et des techniques que l'on connaît parfaitement, on peut dé- terminer la durée de vie de la fluorescence en illuminant d'abord la matière avec un rayonnement d'excitation rapi- dement modulé pour le colorant fluorochromique utilisé, par exemple, un rayonnement d'amplitude fluctuante, comme celui d'un laser ou d'un LED sous-seuil et en mesurant en- suite l'amplitude de modulation de la fluorescence engen- drée. 



   Un autre procédé de titrage que l'on peut réaliser avec l'appareil suivant la présente invention, consiste à pratiquer un titrage du type à liaison de compétition. 



  Suivant ce dernier, on marque ou étiquette une quantité 

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 connue du polynucléotide à brin unique que l'on cherche à identifier ou à mesurer; de manière connue, de préfé- rence avec n'importe lequel d'un grand nombre de colorants fluorescents fonctionnalisés connus. On procède à une première mesure du rayonnement fluorescent total d'une telle quantité marquée ou étiquettée à l'aide d'un fluorimètre approprié à des fins de calibrage. On ajoute ensuite une quantité connue du polynucléotide étiqueté ou marqué à la solution d'échantillon.

   Le mélange des polynucléotides étiquettés ou marqués et non étiquettés ou non marqués est ensuite placé au contact d'une cellule de RTA et on les laisse entrer en compétition pour des endroits ou sites d'hybridation, la cellule étant préparée et illuminée de la manière décrite plus haut. On procède ensuite à la mesure de l'intensité de fluorescence provenant de la cellule. Le rapport de cette dernière intensité de flu- orescence à l'intensité mesurée au cours du calibrage est ensuite proportionnelle à la quantité de polynucléotide non étiquette ou non marqué présente dans l'échantillon. 



   Etant donné que l'on peut apporter certains autres changements au procédé et à l'appareil décrits plus haut, sans pour autant sortir du cadre de la présente invention, il est bien entendu que toute la substance que contient la description ci-dessus ou les dessins qui l'accompagnent doit être interprétée comme étant illustrative et dépourvue de sens limitatif.

Claims

REVENDICATIONS 1. Appareil pour titrer un polynucléotide sous forme de double brin qui comprend une étiquette ou marque fluo- rescente capable d'émettre un rayonnement fluorescent à l'état excité par un rayonnement d'excitation, appareil caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison : une cellule à réflexion interne totale atténuée op- tiquement transmissive à la fois vis-à-vis du rayonnement d'excitation et du rayonnement fluorescent précité, un revêtement lié à une surface de la cellule en question, ce revêtement comprenant un polynucléotide à brin unique, complémentaire, au moins en partie, du poly- nucléotide à brin unique que l'appareil est destiné à ti- trer.

2. Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen pour illuminer intérieure- ment ladite cellule par le rayonnement d'excitation pré- cité, de façon à engendrer, au voisinage de la surface précitée, une onde évanescente capable d'interréagir avec l'étiquette ou marque fluorescente précitée, de façon à en provoquer la fluorescence, un moyen ou dispositif pour collecter le rayonnement fluorescent provenant d'une excitation de l'étiquette ou marque précitée et sortant d'une extrémité de la cellule en question et un moyen ou dispositif pour mesurer le rayonnement . fluorescent recueilli.

3. Cellule à réflexion interne totale atténuée pos- sédant un revêtement lié à une surface de cette cellule, caractérisée en ce que le revêtement en question comprend un polynucléotide à brin unique.

4. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vant la revendication 3, caractérisée en ce que le re- vêtement comprend un groupement aromatique couplé au <Desc/Clms Page number 23> polynucléotide à brin unique précité.

5. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vant la revendication 4, caractérisée en ce que le grou- pement est couplé au polynucléotide à brin unique par l'intermédiaire d'une liaison diazolque.

6. Cellule à réflexion interne totale atténuée suivant la revendication 3,caractérisée en ce qu'elle comprend un colorant si faiblement couplé à ladite surface qu'il s'en dissout sensiblement immédiatement par solution, le colorant en question étant -un colorant qui se couple de manière spécifique uniquement à la forme à double brin du polynucléotide précité, lequel colorant comprend un chromophore qui émet un rayonnement fluorescent dans une première bande à l'état soumis à un rayonnement d'excitation dans une seconde bande.

7. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vant la revendication 4, caractérisée en ce que cette cellule est optiquement transmissive à la fois vis-à-vis du rayonnement d'excitation précité et du rayonnement fluorescent précité.

8. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vant la revendication 4, caractérisée en ce que le grou- pement aromatique précité est couplé à ladite surface par l'intermédiaire d'une molécule d'espacement.

9. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vant la revendication 4, caractérisée en ce que ladite molécule d'espacement est un triméthoxysilane substitué par une chaîne de radicaux méthylène.

10. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- van la revendication 8, caractérisée en ce que ladite molécule d'espacement est formée d'une paire de groupes époxyde reliés par une chaîne méthylénique.

Il. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vant la revendication 8, caractérisée en ce que ladite <Desc/Clms Page number 24> molécule d'espacement est une amine aliphatique.

12. Cellule à réflexion interne totale atténue sui- vant la revendication 8, caractérisée en ce que ladite molécule d'espacement est un triméthoxysilane possédant un radical chlorobenzyle.

13. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- van la revendication 5, caractérisée en ce que ladite liaison diazoïque est conjuguée à de la polythymidine, avec le groupement polyadénine présent au commencement du polynucléotide à brin unique précité.

14. Cellule à réflexion interne totale atténuée sui- vantla revendication 13, caractérisa*en ce que la polyadé- nine et la polythymidine conjuguées précitées sont réti- culées.

15. Procédé pour titrer un échantillon liquide en ce qui concerne un polynucléotide présentant un intérêt sous forme à brin unique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : lier un polynucléotide à brin unique choisi à une surface d'une cellule à réflexion interne totale atténuée optiquement transmissive, ledit polynucléotide à brin unique choisi étant complémentaire, au moins en partie, au polynucléotide précité présentant un intérêt, mettre en contact ladite surface possédant le poly- nucléotide lié avec au moins ledit échantillon dans des conditions qui suffisent au polynucléotide à brin unique présentant de l'intérêt à se renaturer avec ledit poly- nucléotide lié, coupler au polynucléotide renaturé sur ladite surface de cellule,

un groupement colorant qui comprend un chromo- phore capable de subir une fluorescence à l'état soumis à un rayonnement d'excitation dans une bande de longueurs d'ondes prédéterminée, intérieurement éliminer ladite cellule par ledit rayonnement d'excitation de façon à engendrer, au voisinage <Desc/Clms Page number 25> de ladite surface, une onde évanescente capable d'iner- réagir sur le chromophore précité pour y induire une fluorescence, recueillir ou collecter le rayonnement fluorescent provenant de l'excitation du chromophore en question et sortant par une extrémité de la cellule en question, et mesurer le rayonnement fluorescent recueilli ou collecté.

16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de mise en contact de ladite surface s'effectue seulement avec ledit échantillon de façon que le polynucléotide à brin unique qui se renature avec le polynucléotide lié précité appartienne sensiblement uni- quement audit échantillon, et le colorant utilisé pour colorer le polynucléotide renaturé est un colorant qui se couple spécifiquement à la forme à double brin appartenant uniquement au poly- nucléotide précité.

17. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que ladite étape de couplage comprend les stades de coloration d'une quantité connue dudit polynucléotide à brin unique choisi par un colorant fluorescent et d'ad- dition de la quantité connue de polynucléotide coloré au- dit échantillon avant la mise en contact de ladite sur- face avec ledit échantillon, de façon à ce que ledit polynucléotide à brin unique coloré entre en compétition avec un polynucléotide à brin unique originellement pré- sent dans ledit échantillon au cours du procédé de rena- turation.

18. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de liaison comprend la liaison à la- dite surface d'une amine aromatique et ensuite la copu- lation diazoïque de ladite amine aromatique audit poly- nucléotide à brin unique choisi. <Desc/Clms Page number 26>

19. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que ladite amine aromatique est couplée,à ladite surface par l'intermédiaire d'une molécule d'espacement.

20. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que ladite molécule d'espacement est un triméthoxy- silane substitué par une chaîne de groupes méthylène.

21. Procédé suivant la revendication 19, caracté- risé en ce que ladite molécule d'espacement est formée d'une paire de groupes époxyde. liés par une chaîne méthyl- énique.

22. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que ladite molécule d'espacement est une amine aliphatique.

23. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que ladite molécule d'espacement est un triméthoxy- silane possédant un radical chlorobenzyle.

24. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que ladite copulation diazoïque se réalise en conver- tissant en premier lieu ladite amine en un groupe diazo- Ique, en couplant le radical diazoïque en question à la polythymidine et en conjuguant ladite polythymidine avec un groupement polyadénine présent au commencement dudit polynucléotide à brin unique choisi.

25. Procédé suivant la revendication 24, caractérisé en ce que ladite amine est convertie en un radical dia- zolque par traitement par un halogénure de diazonium.

26. Procédé suivant la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de réticulation de ladite polyadénine avec ladite polythymidine.

27. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de mesure comprend la mesure de l'in- tensité dudit rayonnement fluorescent.

28. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de mesure comprend la mesure de la durée de disparition de la fluorescence dudit rayonnement <Desc/Clms Page number 27> fluorescent.

29. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que le colorant en question est un colorant dimère.

30. Procédé suivant la revendication 29, caractérisé en ce que le colorant en question est le bromure de di- éthidium.

31. Procédé suivant la revendication 29, caractérisé en ce que le colorant en question est l'orange de di- acridine.

32. Appareil pour titre un polynucléotide sous forme de double brin, comprenant une étiquette ou marque fluo- rescente capable d'émettre un rayonnement fluorescent à l'état excité par un rayonnement d'excitation, caractéri- sé en ce qu'il comprend, en combinaison : une cellule à réflexion interne totale atténuée en verre, optiquement transmissive à la fois vis-à-vis du rayonnement d'excitation précité et du rayonnement fluo- rescent précité, un revêtement comprenant des molécules dudit poly- nucléotide à double brin chacune liée par covalence à un endroit ou site unique respectif sur la surface de ladite cellule par l'intermédiaire d'une molécule d'espacement couplée à une séquence poly T- poly A irréversiblement liée au voisinage de l'extrémité de ladite molécule pos- sédant une chaîne polyadéninique.