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Nouveaux esters rétinoiques d'antibiotiques, leur procèdé de préparation et compositions pharmaceutiques et cosmétiques les contenant
La présente invention a pour objet de nouveaux esters rêtinéolques d'antibiotiques, plus précisément des estres rétinoiques d'érythromycine A, de lincomycine et de clindamycine, leur procédé de préparation et des compositions pharmaceutiques et cosmétiques les contenant dans le traitement de diverses dermatoses, notamment dans le traitement de l'acné. Par ailleurs, les études en cours ont également montré que ces estets rétinoiques selon l'invention étaient doués d'une activité anti-tumorale.
La présente invention a essentiellement pour objet l'utilisation de nouveaux esters rétinolques d'antibiotiques dans le traitement des dermatoses infectieuses 1 ou non dont l'origine peut être bactérienne, mycobactérienne et/ou liées à l'implantation de certaines levures à caractère pathogène.
L'invention vise plus particulièrement l'utilisation de nouveaux esters rétinolques d'antibiotiques dans le traitement de l'acné.
L'acné est un désordre cutané, polymorphe, (plusieurs types de lésions existant chez un même individu), survenant à la puberté et régressant spontanément, dans la majorité des cas, vers 20-25 ans.
L'acné concerne, chez les individus touchés, les zones riches en glandes sébacées telles que front, face, ailes du nez, torse, dos, ce qui montre une certaine dépendance de cette dermatose vis-à-vis du sébum, produit de synthèse de la glande.
Il n'existe pas d'acné sans séborrhée.
Bien que la séborrhée soit une des traductions du brusque flux hormonal survenant à la puberté, l'acné ne semble pas être liée à un désor- dre hormonal quelconque.
L'étiopathogènie de l'acné, bien que mal définie, prend son origine dans la formation d'une lésion caractéristique, le comédon. Celui- ci résulte de l'obstruction du canal pilosébacé, par suite d'une dis- kératinisation de la zone de l'infundibilum du canal.
Cette obstruction a pour effet majeur de modifier la viscosité du sébum et les caractéristiques physico-chimiques du milieu (pH, tension de vapeur d'oxygène...).
Cette modification permet l'hyperprolifération des souches rési- dentes cutanées, principalement le propionibactérium acnes, souche anaéro- bie ou aéro-tolérante.
L'acné ne possède en aucun cas de caractéristique infectieuse dans le sens où cette dermatose ne correspond pas à l'implantation d'une souche pathogène particulière et qu'elle n'est pas transmissible.
Enfin. l'hyperprofilération bactérienne a pour conséquence de libérer dans le milieu certaines protéases ou hyaluronidases. d'origine bactérienne qui provoquent une lyse du sac folliculaire et ainsi la libéra-
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tion de composés inflammatoires au sein du derme et déclenchent la réaction de type inflammatoire de l'organisme.
Si la nature des composés inflammatoires est à l'heure actuelle non déterminée, leur origine bactérienne semble faire peu de doute, expliquant, par là, le bon succès thérapeutique dans l'acné inflammatoire, de composés antibiotiques tant par voie orale que par voie topique.
Parmi les antibiotiques, l'érythromycine et la clindamycine sont très souvent préconisées mais nécessitent (notamment pour l'érythromycine) des concentrations relativement élevées en vue d'obtenir une action satisfaisante.
Par ailleurs, comme l'ont montré des études récentes. certaines souches de propionibacterium acnes présentent une résistance progressive à 1'érythromycine. à la lincomycine et à la clindamycine, de. telle sorte que le traitement par ces antibiotiques peut s'avérer peu efficace.
L'application topique de clindamycine et plus particulièrement d'érythromycine se heurte également à un problème de pénétration à travers le stratum corneum limitant de ce fait leur efficacité.
Les nouveaux esters rétinolques d'antibiotiques, plus particulièrement d'érythromycine A. de clindamycine et de lincomycine, selon l'invention, apportent une solution satisfaisante aux problèmes rencontrés par l'utilisation de ces antibiotiques, dans la mesure où les études réalisées ont permis de mettre en évidence que ces nouveaux esters ont une action sélective sur le principal germe responsable de l'inflammation, à savoir propionibacterium acnes, tout en ayant une très faible activité vis-àvis des germes cutanés, comme le staphylococcus epidermidis. ce qui permet de traiter les affections de la peau sans que son équilibre en soit perturbé.
On doit aussi remarquer que ces-nouveaux esters rétinolques d'antibiotiques, notamment les esters rétinolques all trans et 13-cis d'érythromycine A et de lincomycine se sont avérés être actifs vis-à-vis de souches de propionibacterium acnes résistantes à l'antibiotique pa- rent.
Les nouveaux esters rétinoiques d'antibiotiques selon l'inven- tion, se sont avérés être actifs sans présenter les inconvénients de l'acide rétinolque.
Ainsi, les nouveaux esters sont mieux tolérés par la peau et se sont révélés être beaucoup moins toxiques par voie orale que l'association antibiotique 1 acide rétino ! que.
Les esters rétinolques d'antibiotiques selon l'invention, par rapport aux autres esters connus d'antibiotiques, présentent l'avantage de posséder une activité kératolytique dans le cas des esters de l'acide
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rétinolque all trans et une activité anti-séborrhéique potentielles dans le cas de l'acide 13-cis rétinoique, ce qui confère à ces esters une image de"prodrug".
Les nouveaux esters rétinoIques d'antibiotiques selon l'invention sont plus lipophiles, ce qui permet d'améliorer la pénétration à travers l'épiderme.
L'état de la technique relatif à l'association d'acide rétinoique et d'érythromycine est constitué par le produit vendu par les Laboratoires CILAG sous la dénomination d"'Antibio-Aberel".
L'état de la technique relatif aux esters d'érythromycine A est représenté par le brevet U. S. 2.862. 921 qui se rapporte à la préparation d'esters gras saturés et mono-insaturés d'érythromycine A tels que le monostéarate d'érythromycine A et le monooléate d'érythromycine A.
L'état de la technique relatif aux esters de clindamycine et de lincomycine est représenté notamment par le brevet allemand 2.017. 003 qui décrit la préparation d'esters de lincomycine et de clindamycine dont la chaîne acyle est comprise entre 1 et 18 atomes de carbone.
La présente invention a pour objet des esters rétinoIques d'antibiotiques et plus particulièrement des esters d'acide rétinoIque all trans et 13-cis d'érythromycine A, de lincomycine et de clindamycine, et les sels desdits esters.
Les esters rétinoiques d'antibiotiques selon l'invention, peuvent éventuellement se présenter sous forme de mélanges mais. de préfé- rence, ceux-ci sont d'une part les esters rétinoiques en position 2' d'érythromycine A et d'autre part les esters rétinolques en position 3 de lincomycine et de la clindamycine.
Les esters rétinolques en position 2'd'érythromycine A peuvent être représentés par la formule suivante :
EMI3.1
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dans laquelle R représente le radical rétinoyle all trans ou le radical rétinoyle 13 Cis, le radical rétinoyle ayant pour formule :
EMI4.1
Les esters rétinolques en position 3 de lincomycine et de clindamycine peuvent être représentés par les formules suivantes :
EMI4.2
dans lesquelles R a la même signification que celle donnée ci-dessus.
La présente invention a également pour objet le procédé de préparation des esters rétinolques all trans et 13-cis d'érythromycine A. de lincomycine et de clindamycine.
Différents procédés d'estérification peuvent être utilisés mais de préférence cette estérification est réalisée en milieu solvant organique anhydre, de préférence dans le tétrahydrofuranne seul ou en mélange avec un autre solvant organique comme la pyridine, en faisant réagir un excès d'anhydride carbonique mixte des acides rétinolque all trans ou 13cis (préparé in situ, par exemple à partir de chloroformiate d'éthyle et d'acide all trans ou 13-cis) avec l'érythromycine A, la lincomycine ou la clindamycine sous forme de base en présence d'une base organique ou minérale comme la pyridine et/ou l'hydrogénocarbonate de sodium.
Cette méthode à l'anhydride mixte permet d'obtenir les esters rétinolques en position 21 de l'érythromycine A et en position 3 de la lincomycine et de la clindamycine, sans isomérisation du radical rétinoyle.
Les autres procédés d'estérification, notamment de lincomycine et de clindamycine par la méthode utilisant les imidazolides des acides rétinolques dans un solvant anhydre comme le N ; N diméthylformamide, en présence d'une base comme le tertiobutylate de sodium ou de potassium, conduisent à un mélange d'esters rétinolques de ces antibiotiques.
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Ainsi, par cette dernière méthode, l'ester en 7 de la lincomycine est obtenu majoritairement avec les esters en 2,3 et 4.
De même, on obtient un mélange de monoesters en 2,3 et 4 de la clindamycine.
Par ailleurs, cette dernière méthode provoque parfois une isomérisation du radical rétinoyle.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques administrables par voie topique, orale, parentérale ou rectale ainsi que des compositions à caractère cosmétique pour le traitement de diverses dermatoses, notamment l'acné, cette composition se présentant sous forme anhydre et contenant au moins un ester d'acide rétinolque all trans ou 13-cis d'érythromycine A, de lincomycine ou de clindamycine selon l'invention, à une concentration comprise entre 0,01 et 10% mais de préférence entre 0,05 et 1Z en poids par rapport au poids total de la composition.
Pour la préparation des compositions selon l'invention contenant, comme constituant actif, au moins un ester rétinolque all trans ou 13-cis d'érythromycine A, de lincomycine ou de clindamycine, on peut faire appel à des véhicules et adjuvants décrits dans la littérature pour la pharmacie, la cosmétique et les domaines apparentés.
Pour la préparation des solutions, on peut utiliser par exemple un (ou des) solvant (s) organique (s) acceptable (s) d'un point de vue physiologique.
Les solvants organiques acceptables sont pris notamment dans le groupe constitué par l'acétone, l'acool isopropylique, les triglycérides d'acides gras, les éthers de glycol, les esters d'alkyle en Cet 4 d'acides à courte chaîne et les éthers du polytétrahydrofuranne.
Les compositions selon l'invention peuvent également renfermer des épaississants tels que la cellulose et/ou des dérivés de la cellulose à raison de 0,5 à 20% en poids par rapport au poids total de la composition.
Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir en association, avec au moins un ester rétinolque d'antibiotique selon l'inven- tion, au moins un autre agent anti-acnéique connu.
On peut, si nécessaire, ajouter un adjuvant usuel pris dans le groupe formé par les agents anti-oxydants, les agents conservateurs, les parfums et les colorants.
Parmi les anti-oxydants utilisables, on citera par exemple la t-butylhydroxyquinone, le butylhydroxyanisole, le butylhydroxytoluène et l'a tocophérol et ses dérivés.
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Les transformations pharmacologiques et galéniques des composés selon l'invention s'effectuent de façon connue.
Les formes galéniques peuvent être pour la voie topique, des crèmes, des laits, des gels, des lotions plus ou moins épaissies, des lotions portées par des tampons, des pommades, des sticks ou bien des formulations aérosols se présentant sous forme de spray ou de mousses.
Les compositions par voie orale peuvent se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspension, d'émulsions, de poudres, de granulés ou de solutions. La posologie par voie orale est
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d'environ 0, 1 mg à 5 mg/Kg/jour et de préférence de l mg à 2, 5 mg/Kg/jour.
Les compositions peuvent également se présenter sous forme de suppositoires.
Le traitement de l'acné à l'aide des compositions topiques selon l'invention consiste à appliquer deux ou trois fois par jour une quantité suffisante sur les zones de la peau à traiter et ceci pendant une période de temps de 6 à 30 semaines et de préférence de 12 à 24 semaines.
Les compositions selon l'invention peuvent également être utilisées à titre préventif, c'est-à-dire sur les zones de peau susceptibles d'être atteintes d'acné.
ETUDE COMPARATIVE SUR L'ACTIVITE DES ESTERS RETINOIQUES D'ANTIBIOTIQUES
L'activité des esters rétinotques d'érythromycine A, de lincomycine et de clindamycine a été étudiée par la méthode de dilution en vue de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), méthode décrite et employée par G. A. DENYS et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1983) , 335-337 et J. J. LEYDEN et al, J. Am. Acad.
Dermatol. (1983) 8 (1) 41-5, en utilisant comme souche de propionibacterium acnes, la souche P37 fournie par CUNLIFFE et HOLLAND.
Cette souche P 37 a fait l'objet des études décrites dans les publications suivantes : - J. GREENMAN, K. T. HOLLAND et W. J. CUNLIFFE, Journal of General Microbiology (1983) 129,1301-1307, - E. INGHAM, K. T. HOLLAND, G. GOWLAND et W. J. CUNLIFFE, ibid (1980) 118. 59-65 et - K. T. HOLLAND, J. GREENMAN et W. J. CUNLIFFE, Journal of Applied bacteriology (1979) 47, 383-394.
Sélection et isolement des populations sensibles et résistantes
La souche P 37 est sensible à l'érythromycine comme le montre la
Concentration minimale inhibitrice (CMI-0, 78ng/ml)
En revanche, après 8 sous-cultures successives dans le même milieu, (RCM 19/20, DMSO 19/20 en volume) en vue d'obtenir une stabilisa- tion progressive de cette souche à ce milieu, une résistance progressive à * Reinforced Clostridium Medium (OXOID)
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t'îM ! B MnMuB MM3 la ton ! ! MMQ ! - Après étalage d'un inoculum standardisé (DO-1, 8 à 450nm) sur milieu gélosé (RCM + furazolidone). en boîte de Pétri, un disque de 9 mm de diamètre est déposé au centre de celle-ci. Sur le disque. 50g d'érythromycine (en solution dans le DMSO) sont déposés.
- Après 6 jours à 360C en milieu anaérobie (système GAS-PAK, B. B. L) une zone d'inhibition de la pousse de la souche est nettement visible (diamètre total = 42mm). l'immense majorité des colonies étant située à la périphérie de la zone d'inhibition.
En revanche à l'intérieur de celle-ci quelques colonies apparaissent nettement.
Les deux types de colonies sont alors prélevés par arrachage du milieu gélosé (Anse de platine stérilisé) :
1) à l'intérieur de la zone d'inhibition on prélève les souches dénommées P 37 E9 en raison de leur résistance apparente à l'érythromycine.
2) à lcm au-delà de la périphérie de la zone d'inhibition, on
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S prélève les souches dénommées P 37 E.
(8 0 Après isolement et culture, les souches P 37 Ee et P 37 EG montrent effectivement des sensibilités très différentes à l'érythromycine illustrées par les valeurs suivantes des CMI respectives.
EMI7.3
CMI (jg/ml) P37 0, 78 P 37 EG 0, 78 P 37 EG 50
EMI7.4
Ce phénomène est confirmé par l'étude de la CI 50 (Concentration inhibitrice à 50Z) qui représente la concentration d'érythromycine où, à un temps constant de culture, 50% de survivants parmi la population sont retrouvés.
EMI7.5
CI 50 (Jlg/m1) P 37 50 P 37 E 5 P 37 Ee 100 La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) exprimée en ilg/ml
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des esters rét1nolques d'érythromycine A, de lincomycine et de 6 clindamycine testés vis-à-vis des souches P 37 et P 37 est reportée dans le tableau suivant :
EMI8.2
<tb>
<tb> ESTERS <SEP> RETINOIQUES <SEP> P <SEP> 37 <SEP> E <SEP> P <SEP> 37 <SEP> E <SEP> e
<tb> D'ANTIBIOTIQUES <SEP> (sensible) <SEP> (résistante)
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (ail <SEP> trans)-2'-
<tb> érythromycine <SEP> A <SEP> 14 <SEP> 13
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (13-cis)-2'-
<tb> érythromycine <SEP> A <SEP> 20 <SEP> 34
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (13-cis) <SEP> -3lincomycine <SEP> 17, <SEP> 5 <SEP> 25
<tb> 0-rétinoyl(allh-trans)-3clindamycine <SEP> 18 <SEP> 50
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (13-cis)-3clindamycine <SEP> 1.5 <SEP> 35
<tb>
EMI8.3
TEMOINS :
EMI8.4
<tb>
<tb> #:
<tb> 0-oléoyl-2'-érythromycine <SEP> A <SEP> (Z-9) <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> O-oléoyl-3-lincomycine <SEP> 19 <SEP> 42
<tb> 0-oléolyl-3-3clindamycine <SEP> 54 <SEP> > 138
<tb> Erythromycine <SEP> A <SEP> 1 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Lincomycine <SEP> 13 <SEP> 66
<tb> Clindamycine <SEP> 1 <SEP> 10
<tb>
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Le tableau ci-dessous montre les concentrations minimales inhibitrices des esters rétinolques d'antibiotiques vis-à-vis de deux souches de
EMI9.1
<tb>
<tb> Staphylococcus <SEP> Epidermidis <SEP> :
<tb> ESTERS <SEP> RETINOIQUES <SEP> Staph. <SEP> Epi. <SEP> 3 <SEP> Staph. <SEP> Epi. <SEP> 6
<tb> D'ANTIBIOTIQUES
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (all <SEP> trans)-21-
<tb> érythromycine <SEP> A <SEP> 75 <SEP> 80
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (13-cis)-2'-
<tb> érythromycine <SEP> A <SEP> 110 <SEP> 110
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (13-cis)-3clindamycine <SEP> 113 <SEP> 113
<tb> 0-rétinoly <SEP> (13-cis)-3lincomycine <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> TEMOINS <SEP> :
<tb> érythromycine <SEP> A <SEP> 13 <SEP> 30
<tb> Clindamycine <SEP> 7 <SEP> 8
<tb> lincomycine <SEP> 14 <SEP> 20
<tb>
La souche"Staph. Epi. 3"est isolée d'un patient acnéique alors que la souche"Staph. Epi. 6"est isolée d'un patient non acnéique.
L'isolement de ces souches est effectué selon la méthode de WILLIAMSON-KLIGMAN ("A new method for the quantitative investigation of cutaneous bacteria" P. WILLIAMSON et A. KLIGMAN, J. I. D., Vol. 45, n 6, 1965). Des dilutions décimales du prélèvement sont réalisées et 0, 1 ml de ces dilutions est ensemencé sur un milieu sélectif permettant l'isolement des staphylococcus.
Comme on peut le constater dans le premier tableau, les esters rétinolques d'érythromycine A et de lincomycine sont plus actifs sur les souches de propionibacterium acnes résistantes que les antibiotiques parents. De plus, l'ester oléique en 2'de 1'érythromycine A (brevet U. S.
2.862. 921) ainsi que l'ester oléique en 3 de la clindamycine (DOS
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2. 017. 003), pris comme esters de comparaison, se sont révélés être nettea ment moins actifs sur les souches sensibles (P 37 E et résistantes (P 37 EE) que les esters de l'invention renforçant ainsi l'intérêt notam- ment des esters rétinolques d'érythromycine A et de clyndamycine. Le second tableau, lui. montre l'intérêt de tous ces esters rétinolques d'antibiotiques vis-à-vis de"l'écologie cutanée"étant donné qu'ils sont beaucoup moins actifs sur les souches de staphylococcus epidermidis que les antibiotiques parents.
On va maintenant donner à titre d'illustration plusieurs exemples de préparation des esters rétinolques d'antibiotiques selon l'inven-
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tion ainsi que plusieurs exemples de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques dans le traitement des dermatoses, notamment de l'acné.
EXEMPLE 1 Préparation du 0-rétinoyl (13 cis)-2' érychromycine A
Dans un ballon, sous atmosphère inerte, on dissout 5g (16. 6 mmoles) d'acide rétinolque (13-cis) dans 35 ml de tetrahydrofuranne anhydre ; le mélange réactionnel est refroidi à OoC puis on verse 3ml (38 mmoles) de pyridine anhydre et 1, 6ml (16, 6 mmoles) de chloroformiate d'éthyle. La solution est agitée 5 minutes et on ajoute 2, 5g (30 mmoles) d'hydrogénocarbonate de sodium puis 4. 9g (6,7 mmoles) d'érythromycine A préalablement dissous dans 150ml de tetrahydrofuranne. Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation pendant 10 heures en laissant remonter à température ambiante (chromatographie sur couche mince de gel
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de silice : chlorure de méthylène/méthanol 107.).
La solution est versée sur 60ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est sèchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographie sur colonne de gel de silice (H. P. L. C) en utilisant l'éluant : acétate d'éthyle (7)/hexane (3) pour aboutir à l'isolement de 4, 4g (65% de rendement) de 0-rétinoyl (13 cis)-2'-érythromycine A pur.
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F - 820C (hexane/acétate d'éthyle) [ a2 --17" (C -6mg/ml dichlorométhane) D Microanalyse : C-Hq-NO, ; M-1016. 4
C H N Cal. % : 67. 36 9, 22 1, 38 Trouv. Z : 67,48 9,32 1,38 Infra-rouge : bande à 1735 cm1 (ester) R. M. N. du 13C (CDCl3. réf. interne T. M. S.)
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Effets y négatifs en 1' (-2. 2 ppm) et 3'(-2,ppm) indiquent la position ll de l'ester en 2'. Les carbones C"20 (20, 94ppm), C 14 (117, 28ppm) et CU12 (131, 9ppm) de la chaîne rétinolque sont en accord avec la stéréochimie 13 cis de la chaîne rétinolque.
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EXEMPLE 2 Préparation du O-rétinoyl (all trans)-2'-érythromycine A
Dans un ballon, sous atmosphère inerte on dissout 5g (16,6 mmoles) d'acide rétinoique (all trans) dans 35 ml de tétrahydrofuranne anhydre le mélange réactionnel est refroidi à 0 C puis on verse 3ml (38 mmoles) de pyridine anhydre et 1,6 ml (16,6 mmoles) de chloroformiate d'éthyle ; la solution est agitée 5 minutes et on ajoute 2, 5g (30 mmoles) d'hydrogénocarbonate de sodium puis 4,9g (6,7 mmoles) d'érythromycine A préalablement dissous dans 150 ml de tetrahydrofuranne.
Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation pendant 10 heures en laissant remonter à température ambiante (chromatographie sur couche mince de gel de silice : chlorure de méthylène/méthanol 10%). La solution est versée sur 60 ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle. La phase
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organique est sèchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (H. P. L. C. ) en utilisant l'éluant : acétate d'éthyle (7) /hexane (3) pour aboutir à l'isolement de 4, 1g (60X de rende- ment) de 0-rétinoyl (all trans)-2'-érythromycine A pur.
EMI11.2
F. 760C (acétate éthyle/hexane) r) =-65 (02 mg/ml dichlorométhane) D Microanalyse : C57H93N014, 4H20 ; M-1088, 5 C H N Cale. 7. : 62, 89 9, 35 1, 29 Trouv. 7. : 62, 91 8, 90 1, 29 R. N. M. du C CDCl3're. interne T. M. S.) effets Y négatifs en l' (-2ppm) et 3' (-1. 9ppm) indiquent la position de l'ester en 2'. Les carbones C"20 (14, 1ppm), C"14 (119, 36ppm) et C"12 (135,19ppm) sont en accord avec la stéréochimie all trans de la chaîne rétinoique.
EXEMPLE 3
Préparation du 0-rétinoyl (all trans)-3-clindamycine
Dans un ballon, sous atmosphère inerte on dissout 5g (16,6 mmoles) d'acide rétinoique (all trans) dans 30ml de tétrahydrofuranne anhydre ; le mélange réactionnel est refroidi à OoC puis on'verse 6ml (76 mmoles) de pyridine anhydre et 1, 6ml (16,6 mmoles) de chloroformiate d'éthyle ; la solution est agitée 5 minutes et on ajoute
1.25g (15 mmoles) d'hydrogénocarbonate de sodium puis 2,35g (5,5 mmoles) 1 de clindamycine préalablement dissous dans 100 ml d'un mélange
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tétrahydrofuranne (8) /pyridine (2).
Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation pendant 10 heures en laissant remonter à température ambiante (chromatographie sur couche mince de gel de silice : chlorure de méthylène/méthanol 57.). La solution est versée sur 80ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est sèchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (H. P. L. C) en utilisant l'éluant : acétate d'éthyle (5) /hexane (5) pour aboutir à l'isolement de 2,15g (55Z de rendement) de O-rétinoyl (all trans) -3 - clindamycine pur.
F-62 C [al 22 = +500 (C=100 mg/ml dichlorométhane)
D Microanalyse C38H59N2SO6Cl. 2, 5H20 ; M = 752, 5
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C H N Cale. Z : 60,44 8,08 3,23 Trouv. Z : 60, 66 8. 57 3,72 R. M. N. du 13C (CDCl, réf. interne T. M. S.) : effets (négatifs en position 4 (-2,8ppm) et en position 2 (-l, 9ppm). Les déplacements chimiques du Caf 14 (117,84ppm) et du C"20 (14, llppm) confirment la stéréochimie all trans de la chaîne rétinoyle.
EXEMPLE 4 Préparation du 0-rétinoyl (13 cis) -3-clindamycine
Dans un ballon, sous atmosphère inerte on dissout 5g (16, 6 mmoles) d'acide rétinoique (13cis) dans 30ml de tétrahydrofuranne anhydre ; le mélange réactionnel est refroidi à 0 C puis l'on verse 6ml (76 mmoles) de pyridine anhydre et 1, 6 ml (16. 6 mmoles) de chloroformiate d'éthyle ; la solution est agitée 5 minutes et on ajoute 1,25g (15 mmoles) d'hydrogénocarbonate de sodium puis 2,35g (5,5 mmoles) de clindamycine préalablement dissous dans 100ml d'un mélange tétrahydrofuranne (8)/ pyridine (2). Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation pendant 10 heures en laissant remonter à température ambiante (chromatographie sur couche mince de gel de silice ; chlorure de méthy- lène/méthanol 5Z).
La solution est versée sur 80ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est sèchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (H. P. L. C) en utili- sant l'éluant : acétate d'éthyle (5) /hexane (5) pour aboutir à l'isole- ment de 2g (51Z de rendement) de 0-rétinoyl (13cis)-3-clindamycine pur.
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EMI13.1
F = 950C (Hexane 1 acétate d'éthyle) fCl +111" (C= 15 mg/ml dichlorométhane) D Microanalyse : C 38 H59 ClN2 so6M-707, 4 JO 3 ? 0 C H Calc. Z : 64,52 8,41 Trouv. Z : 64,47 8,45 R. M. N. du 13C (CDCl3, réf. interne T. M. S.)
EMI13.2
La position de l'ester est indiquée par l'effet ss positif en 3 (+1, 77ppm) et les effets Y négatifs en 2 (-l, 4ppm) et 4 (-2, 5ppm). La configuration 13cis est confirmée par le C"20 (20, 93ppm) et le C"14 (115,94ppm).
EXEMPLE 5
EMI13.3
Préparation du 0-rétinoyl (13cis)-3-lincomycine Dans un ballon, sous atmosphère inerte on dissout 5g (16, 6 mmoles) d'acide rétinolque (13cis) dans 30ml de tétrahydrofuranne anhydre ; le mélange réactionnel est refroidi à 0 C puis l'on verse 6ml (76 mmoles) de pyridine anhydre et 1,6ml (16,6 mmoles) de chloroformiate d'éthyle la solution est agitée 5 minutes et on ajoute 1, 25g (15 mmoles) d'hydrogénocarbonate de sodium puis 2,2g (5,4 mmoles) de lincomycine préalablement dissous dans 100ml d'un mélange tétrahydrofuranne (7)/pyridine (3). Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation pendant 10 heures en laissant remonter à température ambiante (chromatographie sur couche mince de gel de silice : chlorure de méthylène/méthanol 10%).
La solution est versée sur 100ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est sèchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (H. P. L. C. ) en utilisant l'éluant : acétate d'éthyle (8)/hexane (2) pour aboutir à l'isolement de 1, 85g (50Z de rende-
EMI13.4
ment) de 0-rétinoyl (13cis)-3-lincomycine pur.
F-95" (hexane/acetate d'éthyle) PJ 20. +103" (C-7 mg/ml dichlorométhane) D Microanalyse : C38H60N2SO, 2, 50 ; M-734, 5 C H Cale. Z : 62, 18 9, 03 Trouv. Z : 62. 33 8,64 R. M. N. du 13C (CDCl3, réf. interne T. M. S. )
<Desc/Clms Page number 14>
La position de l'ester est indiquée par l'effet ss positif en 3 (+l, 6ppm) et les effets Y négatifs en position 2 (-2,4ppm) et 4 (-1, 9ppm).
La configuration 13cis est confirmée par le C"20 (20, 98ppm) et le C" (115,83ppm).
EXEMPLE 6
EMI14.1
Préparation du mélange de monoesters de O-rétinoyl (all trans) -7-lincomycine, O-rétinoyKall trans)-3 lincomycine et O-rétinoyl (all trans)-2 lincomycine Dans un ballon sous atmosphère inerte, on dissout 30g (74 mmoles) de lincomycine dans 300ml de N, N-diméthylformamide anhydre puis 830 mg (7,4 mmoles) de tertiobutylate de potassium sont ajoutés et l'on poursuit l'agitation à température ambiante pendant 90 minutes. On verse alors une solution de 13g (37 mmoles) de rétinoyl (all trans) -1 imidazole dans 150 ml de N, N-diméthylformamide et le milieu résultant est agité à température ambiante pendant 12 heures (chromatographie sur couche mince de gel de silice : chlorure de méthylène/méthanol 7, 5Z). La solution est versée sur 500 ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle.
La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (H. P. L. C. ) en utilisant l'éluant : acétate d'éthyle (7) /hexane (3) pour aboutir à l'isolement de 39g (77%) d'un mé- lange de monoesters rétinoiques (all trans) de lincomycine en positions 2, 3 et 7.
R. M. N. du 13C (CDCI3'ref. interne T. M. S.).
- Effets Y négatifs en 8 (-2,5 ppm) et en 6 (-3,8 ppm) indiquent le lieu d'estérification d'un monoester en position 7, - Effet y négatif en position 1 (-4 ppm) indique le monoester en position 2 et les effets Y négatifs en 2 (-2 ppm) et 4 (-2, 6 ppm) indiquent la position du monoester en position 3. Les positions du C. sont à 85,06 ppm pour le monoester en 2, à 88, 45 ppm pour le monoester en 7 et à 89,67 ppm pour le monoester en position 3.
La configuration de la chaîne rétinolque all trans est indiquée
EMI14.2
pour le C"14 à 117, 78 ppm et pour le C"20 à 14, 08 ppm ; on note une trace d'isomérisation par la présence d'un pic à 115, 2 ppm (C") indi- quant l'isomère 13 cis.
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
EXEMPLE 7 Préparation du mélange des monoesters de O-rétinoyl (all trans)-2 clindamycine. O-rétinoyl (all trans)-3 clindamycine et O-rétinoyl (all trans)-4 clindamycine
Dans un ballon sous atmosphère inerte, on dissout 20g (47 mmoles) de clindamycine dans 250 ml de N. N-diméthylformamide anhydre puis 527mg (4, 7 mmoles) de tertiobutylate de potassium sont ajoutés au milieu réactionnel qui est alors agité à température ambiante pendant 90 minutes.
On verse alors une solution de 8, 250g (23,5 mmoles) de rétinoyl (all trans) -1 imidazole dans 150 ml de N. N-diméthylformamide anhydre et le milieu résultant est agité à température ambiante pendant 12 heures (chromatographie sur couche mince de gel de silice : chlorure de méthylène/méthanol 5%). La solution est ensuite versée sur 500ml d'eau puis extraite à l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous vide partiel. Le produit brut ainsi obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (H. P. L.
C. ) en utilisant l'éluant : acétate d'éthyle (5) /hexane (5) pour aboutir à l'isolement de 28g (85Z) d'un mélange de monoesters rétinolques (all trans) de clindamycine en positions 2, 3 et 4.
R. M. N. du C (CDC13'ref. interne T. M. S.) - Effet Y négatif en position 1 (-3 ppm) indique la position de l'ester en 2.
- Effets Y négatifs en position 4 (-2, 8 ppm) et 2 (-1, 9 ppm) indiquent le monoester en position 3 et effet Y négatif faible en position 3 indique le monoester en position 4.
Les positions du C. sont à 84,63 ppm pour le monoester en 2, à 88,79 ppm pour le monoester en 3 et à 87, 98 ppm pour le monoester en 4.
La configuration all trans de la chaîne rétinolque est majori- taire (C"., à 117,5 ppm et C"20 à 14, 08 ppm) mais des traces d'isomérisation sont nettes, notamment en C"20 et en C".,.
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET COSMETIQUES
EMI15.2
A-GELS POUR LE TRAITEMENT TOPIQUE DE L'ACNE
EMI15.3
<tb>
<tb> 1. <SEP> Hydroxypropyl <SEP> cellulose <SEP> 1g
<tb> Butylhydroxyto1uène............................... <SEP> 0. <SEP> 05g
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (13cis)-3-lincomycine.................... <SEP> 0. <SEP> 5g
<tb> Isopropanol <SEP> q. <SEP> s. <SEP> p.................................. <SEP> 100g
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb>
<tb> 2. <SEP> Hydroxypropyl <SEP> cellulose <SEP> 1. <SEP> 5g
<tb> Butylhydroxytoluène <SEP> 0. <SEP> 05g
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (all <SEP> trans)-3-clindamycine............... <SEP> 0. <SEP> 3g
<tb> Isopropanol <SEP> q. <SEP> s. <SEP> p.................................. <SEP> 100g
<tb>
EMI16.2
B-LOTIONS POUR LE TRAITEMENT TOPIOUE DE L'ACNE
EMI16.3
1. Butylhydroxytoluène O.
OSg O-rétinoyl (all trans)-2' érythromycine A...................................... 19 Triglycérides d'acides gras en C g-C q. s. p............................ 100g Dans cet exemple, le composé actif peut être remplacé par la même quantité de O-rétinoyl (13-cis) -2' érythromycine A.
EMI16.4
<tb>
<tb>
2. <SEP> Butylhydroxytoluène <SEP> 0. <SEP> 05g
<tb> O-rétinoyl <SEP> (13cis)-3-clindamycine................... <SEP> 0. <SEP> 7g
<tb>
EMI16.5
Diméthyl éther du polytétrahydrofuranne (viscosité 22Cpo) de formule : CH 0 -[ (CH) -CH -CH -t CH 3 2 2 2 2 3.... q. s. p.... 100g n nez
EMI16.6
C-STICK POUR LE TRAITEMENT TOPIQUE DE L'ACNE
EMI16.7
<tb>
<tb> Vaseline <SEP> blanche <SEP> 52g
<tb> Huile <SEP> de <SEP> vaseline <SEP> 15g
<tb> Paraffine <SEP> raffinie <SEP> 32g
<tb> 0-rétinoyl <SEP> (all <SEP> trans)-2'
<tb> érythromycine <SEP> Aug
<tb>
EMI16.8
D-SUPPOSITOIRE (COMPOSITION POUR 1 UNITE)
EMI16.9
<tb>
<tb> 0-rétinoyl(all <SEP> trans)-2'-érythromycine <SEP> A...........0. <SEP> 05g
<tb> Triglycérides <SEP> d'acides <SEP> gras <SEP> C <SEP> 8 <SEP> -C <SEP> 12 <SEP> .............0. <SEP> 25g
<tb> Glycérides <SEP> semi-synthétiques <SEP> q.
<SEP> s. <SEP> p.................... <SEP> 2g
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
E-CAPSULES DE 500 mg -----------------Les parois des capsules sont constituées de glycérine, de sorbitol et de gélatine. 1. Capsule à 50 mg de composé actif.
EMI17.2
<tb>
<tb>
0-rétinoyl <SEP> (13 <SEP> cis)-z'-érythromycine <SEP> A <SEP> ............. <SEP> 50 <SEP> mg
<tb> Huile <SEP> de <SEP> vaseline <SEP> fluide <SEP> 200 <SEP> mg
<tb> Huile <SEP> de <SEP> vaseline <SEP> épaisse <SEP> 250 <SEP> mg
<tb> ,
<tb>
EMI17.3
2. Capsule à 10 mg de composé actif.
EMI17.4
<tb>
<tb>
0-rétinoyl <SEP> (13 <SEP> cis)-2'-érythromycine <SEP> A <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Butylhydroxyaminose <SEP> 0,05 <SEP> mg
<tb> Butylhydroxytoluène <SEP> .................................... <SEP> 0,05 <SEP> mg
<tb> Tribéhénate <SEP> de <SEP> glycérol <SEP> 100 <SEP> mg
<tb> Triglycérides <SEP> d'acides <SEP> gras <SEP> en
<tb> C-C <SEP> q. <SEP> s. <SEP> p. <SEP> ................................. <SEP> 500 <SEP> mg
<tb> 8 <SEP> 12
<tb>
F-CELULES
EMI17.5
- --- Les parois des gélules sont constituées de gélatine et de bioxyde de titane.
EMI17.6
<tb>
<tb> O-rétinoyl <SEP> (all <SEP> trans) <SEP> -2'-érythromycine <SEP> A........... <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> Silice <SEP> colloidale <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Stéarate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 76 <SEP> mg
<tb> Lactose <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> p..................................... <SEP> 250 <SEP> mg
<tb>
<Desc / Clms Page number 1>
New retinoic esters of antibiotics, process for their preparation and pharmaceutical and cosmetic compositions containing them
The present invention relates to new retineol esters of antibiotics, more specifically retino esters of erythromycin A, lincomycin and clindamycin, their preparation process and pharmaceutical and cosmetic compositions containing them in the treatment of various dermatoses, in particular in the treatment of acne. Furthermore, ongoing studies have also shown that these retinoic estets according to the invention are endowed with anti-tumor activity.
The present invention essentially relates to the use of new retinol esters of antibiotics in the treatment of infectious dermatoses 1 or not whose origin may be bacterial, mycobacterial and / or linked to the implantation of certain yeasts of pathogenic nature.
The invention relates more particularly to the use of new retinol esters of antibiotics in the treatment of acne.
Acne is a polymorphic skin disorder (several types of lesions existing in the same individual), occurring at puberty and regressing spontaneously, in the majority of cases, around 20-25 years.
Acne concerns, in the affected individuals, the areas rich in sebaceous glands such as forehead, face, wings of the nose, chest, back, which shows a certain dependence of this dermatosis vis-à-vis sebum, synthetic product of the gland.
There is no acne without seborrhea.
Although seborrhea is one of the translations of the sudden hormonal flow occurring at puberty, acne does not seem to be linked to any hormonal disorder.
The etiopathogenesis of acne, although ill-defined, originates in the formation of a characteristic lesion, the comedo. This results from the obstruction of the pilosebaceous canal, as a result of diskeratinization of the infundibilum area of the canal.
This obstruction has the major effect of modifying the viscosity of the sebum and the physico-chemical characteristics of the medium (pH, oxygen vapor pressure, etc.).
This modification allows hyperproliferation of resident skin strains, mainly propionibacterium acnes, anaerobic or aero-tolerant strain.
Acne has in no case an infectious characteristic in the sense that this dermatosis does not correspond to the implantation of a particular pathogenic strain and that it is not transmissible.
Finally. The consequence of bacterial hyperprofiltration is to release certain proteases or hyaluronidases into the environment. of bacterial origin which cause lysis of the follicular sac and thus release it
<Desc / Clms Page number 2>
tion of inflammatory compounds within the dermis and trigger the body's inflammatory type reaction.
If the nature of inflammatory compounds is currently not determined, their bacterial origin seems to be in little doubt, explaining, thereby, the good therapeutic success in inflammatory acne, of antibiotic compounds both orally and topically. .
Among the antibiotics, erythromycin and clindamycin are very often recommended but require (especially for erythromycin) relatively high concentrations in order to obtain a satisfactory action.
Furthermore, as recent studies have shown. certain strains of propionibacterium acnes show progressive resistance to erythromycin. with lincomycin and clindamycin, from. so treatment with these antibiotics may not be very effective.
The topical application of clindamycin and more particularly of erythromycin also encounters a problem of penetration through the stratum corneum thereby limiting their effectiveness.
The new retinal esters of antibiotics, more particularly erythromycin A. of clindamycin and lincomycin, according to the invention, provide a satisfactory solution to the problems encountered by the use of these antibiotics, insofar as the studies carried out have enabled to demonstrate that these new esters have a selective action on the main germ responsible for inflammation, namely propionibacterium acnes, while having very little activity against skin germs, such as staphylococcus epidermidis. which allows to treat skin conditions without disturbing its balance.
It should also be noted that these new retinol esters of antibiotics, especially the all trans and 13-cis retinol esters of erythromycin A and lincomycin have been shown to be active against propionibacterium acnes resistant strains. antibiotic parent.
The new retinoic esters of antibiotics according to the invention have been found to be active without having the disadvantages of retinolic acid.
Thus, the new esters are better tolerated by the skin and have proven to be much less toxic by the oral route than the antibiotic combination 1 retino acid! than.
The retinal esters of antibiotics according to the invention, compared to the other known esters of antibiotics, have the advantage of having keratolytic activity in the case of acid esters
<Desc / Clms Page number 3>
retinolque all trans and potential anti-seborrheic activity in the case of 13-cis retinoic acid, which gives these esters a "prodrug" image.
The new retinoic esters of antibiotics according to the invention are more lipophilic, which makes it possible to improve penetration through the epidermis.
The state of the art relating to the combination of retinoic acid and erythromycin consists of the product sold by CILAG Laboratories under the name "Antibio-Aberel".
The state of the art relating to erythromycin A esters is represented by patent U. S. 2,862. 921 which relates to the preparation of saturated and monounsaturated fatty esters of erythromycin A such as erythromycin A monostearate and erythromycin A monooleate.
The prior art relating to the clindamycin and lincomycin esters is represented in particular by German patent 2,017. 003 which describes the preparation of lincomycin and clindamycin esters whose acyl chain is between 1 and 18 carbon atoms.
The subject of the present invention is retinoic esters of antibiotics and more particularly esters of all trans and 13-cis retinoic acid of erythromycin A, lincomycin and clindamycin, and the salts of said esters.
The retinoic esters of antibiotics according to the invention can optionally be in the form of mixtures but. preferably, these are on the one hand the retinoic esters in position 2 ′ of erythromycin A and on the other hand the retinol esters in position 3 of lincomycin and clindamycin.
The retinal esters in position 2 ′ of erythromycin A can be represented by the following formula:
EMI3.1
<Desc / Clms Page number 4>
in which R represents the all-trans retinoyl radical or the 13 Cis retinoyl radical, the retinoyl radical having the formula:
EMI4.1
The retinol esters in position 3 of lincomycin and of clindamycin can be represented by the following formulas:
EMI4.2
in which R has the same meaning as that given above.
The present invention also relates to the process for the preparation of all trans and 13-cis retinal esters of erythromycin A. of lincomycin and of clindamycin.
Different esterification processes can be used, but preferably this esterification is carried out in an anhydrous organic solvent medium, preferably in tetrahydrofuran alone or in mixture with another organic solvent such as pyridine, by reacting an excess of mixed carbon dioxide retinolic all trans or 13cis acids (prepared in situ, for example from ethyl chloroformate and all trans or 13-cis acid) with erythromycin A, lincomycin or clindamycin in the form of a base in the presence of an organic or mineral base such as pyridine and / or sodium hydrogencarbonate.
This mixed anhydride method makes it possible to obtain the retinol esters in position 21 of erythromycin A and in position 3 of lincomycin and clindamycin, without isomerization of the retinoyl radical.
The other esterification processes, in particular of lincomycin and of clindamycin by the method using the imidazolides of retinolic acids in an anhydrous solvent such as N; N dimethylformamide, in the presence of a base such as sodium or potassium tert-butoxide, lead to a mixture of retinol esters of these antibiotics.
<Desc / Clms Page number 5>
Thus, by this last method, the ester in 7 of lincomycin is obtained mainly with the esters in 2,3 and 4.
Likewise, a mixture of monoesters in 2,3 and 4 of clindamycin is obtained.
Furthermore, the latter method sometimes causes isomerization of the retinoyl radical.
The present invention also relates to pharmaceutical compositions which can be administered topically, orally, parenterally or rectally as well as compositions of a cosmetic nature for the treatment of various dermatoses, in particular acne, this composition being in anhydrous form and containing at least an all-trans or 13-cis retinol acid ester of erythromycin A, lincomycin or clindamycin according to the invention, at a concentration of between 0.01 and 10% but preferably between 0.05 and 1% by weight per relative to the total weight of the composition.
For the preparation of the compositions according to the invention containing, as active ingredient, at least one all-trans or 13-cis retinol ester of erythromycin A, lincomycin or clindamycin, use may be made of vehicles and adjuvants described in the literature for pharmacy, cosmetics and related fields.
For the preparation of the solutions, one can use for example an (or) organic solvent (s) acceptable (s) from a physiological point of view.
Acceptable organic solvents are taken in particular from the group consisting of acetone, isopropyl alcohol, fatty acid triglycerides, glycol ethers, short chain acid C 4 alkyl esters and ethers polytetrahydrofuran.
The compositions according to the invention may also contain thickeners such as cellulose and / or cellulose derivatives in an amount of 0.5 to 20% by weight relative to the total weight of the composition.
The compositions according to the invention may also contain, in combination, with at least one retinol ester of antibiotic according to the invention, at least one other known anti-acne agent.
It is possible, if necessary, to add a usual adjuvant taken from the group formed by antioxidants, preservatives, perfumes and dyes.
Among the antioxidants which can be used, there may be mentioned for example t-butylhydroxyquinone, butylhydroxyanisole, butylhydroxytoluene and a tocopherol and its derivatives.
<Desc / Clms Page number 6>
The pharmacological and galenical transformations of the compounds according to the invention are carried out in a known manner.
The dosage forms can be for the topical route, creams, milks, gels, more or less thickened lotions, lotions carried by tampons, ointments, sticks or aerosol formulations in the form of spray or of mosses.
The oral compositions can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspension, emulsions, powders, granules or solutions. The oral dosage is
EMI6.1
from about 0.1 mg to 5 mg / kg / day and preferably from 1 mg to 2.5 mg / kg / day.
The compositions can also be presented in the form of suppositories.
The treatment of acne using the topical compositions according to the invention consists in applying a sufficient amount two or three times a day to the areas of the skin to be treated and this for a period of time of 6 to 30 weeks and preferably 12 to 24 weeks.
The compositions according to the invention can also be used as a preventive, that is to say on the areas of skin liable to be affected by acne.
COMPARATIVE STUDY ON THE ACTIVITY OF RETINOIC ANTIBIOTICS ESTERS
The activity of the retinotic esters of erythromycin A, lincomycin and clindamycin was studied by the dilution method in order to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), method described and used by GA DENYS et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1983), 335-337 and JJ LEYDEN et al, J. Am. Acad.
Dermatol. (1983) 8 (1) 41-5, using as strain of propionibacterium acnes, the strain P37 provided by CUNLIFFE and HOLLAND.
This strain P 37 has been the subject of the studies described in the following publications: - J. GREENMAN, KT HOLLAND and WJ CUNLIFFE, Journal of General Microbiology (1983) 129,1301-1307, - E. INGHAM, KT HOLLAND, G GOWLAND and WJ CUNLIFFE, ibid (1980) 118. 59-65 and - KT HOLLAND, J. GREENMAN and WJ CUNLIFFE, Journal of Applied bacteriology (1979) 47, 383-394.
Selection and isolation of susceptible and resistant populations
The P 37 strain is sensitive to erythromycin as shown in
Minimum inhibitory concentration (CMI-0, 78ng / ml)
On the other hand, after 8 successive subcultures in the same medium, (RCM 19/20, DMSO 19/20 by volume) with a view to obtaining a progressive stabilization of this strain in this medium, a progressive resistance to * Reinforced Clostridium Medium (OXOID)
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
you! B MnMuB MM3 the tone! ! MMQ! - After spreading a standardized inoculum (DO-1, 8 to 450nm) on agar medium (RCM + furazolidone). in a petri dish, a 9 mm diameter disc is placed in the center of it. On the disc. 50g of erythromycin (in solution in DMSO) are deposited.
- After 6 days at 360C in an anaerobic medium (GAS-PAK system, B.B.L) a zone of inhibition of the growth of the strain is clearly visible (total diameter = 42mm). the vast majority of colonies being located on the periphery of the inhibition zone.
On the other hand inside this one some colonies clearly appear.
The two types of colonies are then removed by uprooting the agar medium (sterilized platinum loop):
1) inside the inhibition zone, the strains called P 37 E9 are sampled because of their apparent resistance to erythromycin.
2) at 1 cm beyond the periphery of the inhibition zone, we
EMI7.2
S takes the strains called P 37 E.
(8 0 After isolation and culture, the strains P 37 Ee and P 37 EG indeed show very different sensitivities to erythromycin, illustrated by the following values of the respective MICs.
EMI7.3
MIC (jg / ml) P37 0.78 P 37 EG 0.78 P 37 EG 50
EMI7.4
This phenomenon is confirmed by the study of IC 50 (Inhibitory concentration at 50Z) which represents the concentration of erythromycin where, at a constant culture time, 50% of survivors among the population are found.
EMI7.5
CI 50 (Jlg / m1) P 37 50 P 37 E 5 P 37 Ee 100 The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) expressed in ilg / ml
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
rethnolic esters of erythromycin A, lincomycin and 6 clindamycin tested against strains P 37 and P 37 is given in the following table:
EMI8.2
<tb>
<tb> ESTERS <SEP> RETINOICS <SEP> P <SEP> 37 <SEP> E <SEP> P <SEP> 37 <SEP> E <SEP> e
<tb> ANTIBIOTICS <SEP> (sensitive) <SEP> (resistant)
<tb> 0-retinoyl <SEP> (garlic <SEP> trans) -2'-
<tb> erythromycin <SEP> A <SEP> 14 <SEP> 13
<tb> 0-retinoyl <SEP> (13-cis) -2'-
<tb> erythromycin <SEP> A <SEP> 20 <SEP> 34
<tb> 0-retinoyl <SEP> (13-cis) <SEP> -3lincomycin <SEP> 17, <SEP> 5 <SEP> 25
<tb> 0-retinoyl (allh-trans) -3clindamycin <SEP> 18 <SEP> 50
<tb> 0-retinoyl <SEP> (13-cis) -3clindamycin <SEP> 1.5 <SEP> 35
<tb>
EMI8.3
WITNESSES:
EMI8.4
<tb>
<tb> #:
<tb> 0-oleoyl-2'-erythromycin <SEP> A <SEP> (Z-9) <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> O-oleoyl-3-lincomycin <SEP> 19 <SEP> 42
<tb> 0-oleolyl-3-3clindamycin <SEP> 54 <SEP>> 138
<tb> Erythromycin <SEP> A <SEP> 1 <SEP>> <SEP> 50
<tb> Lincomycin <SEP> 13 <SEP> 66
<tb> Clindamycin <SEP> 1 <SEP> 10
<tb>
<Desc / Clms Page number 9>
The table below shows the minimum inhibitory concentrations of the retinol esters of antibiotics against two strains of
EMI9.1
<tb>
<tb> Staphylococcus <SEP> Epidermidis <SEP>:
<tb> ESTERS <SEP> RETINOICS <SEP> Staph. <SEP> Epi. <SEP> 3 <SEP> Staph. <SEP> Epi. <SEP> 6
<tb> ANTIBIOTICS
<tb> 0-retinoyl <SEP> (all <SEP> trans) -21-
<tb> erythromycin <SEP> A <SEP> 75 <SEP> 80
<tb> 0-retinoyl <SEP> (13-cis) -2'-
<tb> erythromycin <SEP> A <SEP> 110 <SEP> 110
<tb> 0-retinoyl <SEP> (13-cis) -3clindamycin <SEP> 113 <SEP> 113
<tb> 0-retinoly <SEP> (13-cis) -3lincomycin <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> WITNESSES <SEP>:
<tb> erythromycin <SEP> A <SEP> 13 <SEP> 30
<tb> Clindamycin <SEP> 7 <SEP> 8
<tb> lincomycin <SEP> 14 <SEP> 20
<tb>
The "Staph. Epi. 3" strain is isolated from an acne patient while the "Staph. Epi. 6" strain is isolated from a non-acne patient.
The isolation of these strains is carried out according to the method of WILLIAMSON-KLIGMAN ("A new method for the quantitative investigation of cutaneous bacteria" P. WILLIAMSON and A. KLIGMAN, J. I. D., Vol. 45, n 6, 1965). Decimal dilutions of the sample are made and 0.1 ml of these dilutions is inoculated on a selective medium allowing the isolation of staphylococcus.
As can be seen in the first table, the retinol esters of erythromycin A and lincomycin are more active on the resistant propionibacterium acnes strains than the parent antibiotics. In addition, the 2'-oleic ester of erythromycin A (U. S. patent
2,862. 921) as well as the oleic ester in 3 of clindamycin (DOS
EMI9.2
2 017. 003), taken as comparison esters, have been found to be significantly less active on the sensitive strains (P 37 E and resistant (P 37 EE) than the esters of the invention, thus reinforcing in particular the interest The retinol esters of erythromycin A and clyndamycin. The second table shows the interest of all these retinol esters of antibiotics in "skin ecology" since they are much less active on staphylococcus epidermidis strains as parent antibiotics.
We will now give by way of illustration several examples of preparation of the retinol esters of antibiotics according to the invention.
<Desc / Clms Page number 10>
tion as well as several examples of pharmaceutical or cosmetic compositions in the treatment of dermatoses, in particular acne.
EXAMPLE 1 Preparation of 0-retinoyl (13 cis) -2 ′ erychromycin A
In a flask, under an inert atmosphere, 5 g (16.6 mmol) of retinolic acid (13-cis) are dissolved in 35 ml of anhydrous tetrahydrofuran; the reaction mixture is cooled to OoC and then poured 3 ml (38 mmol) of anhydrous pyridine and 1.6 ml (16.6 mmol) of ethyl chloroformate. The solution is stirred for 5 minutes and 2.5 g (30 mmol) of sodium hydrogen carbonate are added, followed by 4. 9 g (6.7 mmol) of erythromycin A previously dissolved in 150 ml of tetrahydrofuran. The reaction mixture is then left under stirring for 10 hours, allowing to rise to room temperature (chromatography on a thin layer of gel
EMI10.1
silica: methylene chloride / methanol 107.).
The solution is poured into 60 ml of water and then extracted with ethyl acetate. The organic phase is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a column of silica gel (HPL C) using the eluent: ethyl acetate (7) / hexane (3) to result in the isolation of 4.4 g (65% yield ) of pure 0-retinoyl (13 cis) -2'-erythromycin A.
EMI10.2
F - 820C (hexane / ethyl acetate) [a2 --17 "(C -6mg / ml dichloromethane) D Microanalysis: C-Hq-NO,; M-1016. 4
C H N Cal. %: 67. 36 9, 22 1, 38 Found. Z: 67.48 9.32 1.38 Infrared: band at 1735 cm1 (ester) R. M. N. du 13C (CDCl3. Internal ref. T. M. S.)
EMI10.3
Negative effects therein in 1 '(-2.2 ppm) and 3' (-2.2 ppm) indicate the position ll of the ester in 2 '. The carbons C "20 (20, 94ppm), C 14 (117, 28ppm) and CU12 (131, 9ppm) of the retinal chain are in agreement with the 13 cis stereochemistry of the retinal chain.
<Desc / Clms Page number 11>
EXAMPLE 2 Preparation of O-retinoyl (all trans) -2'-erythromycin A
In a flask, under an inert atmosphere, 5 g (16.6 mmol) of retinoic acid (all trans) are dissolved in 35 ml of anhydrous tetrahydrofuran the reaction mixture is cooled to 0 ° C. then 3 ml (38 mmol) of anhydrous pyridine are poured in and 1.6 ml (16.6 mmol) of ethyl chloroformate; the solution is stirred for 5 minutes and 2.5 g (30 mmol) of sodium hydrogencarbonate are added, followed by 4.9 g (6.7 mmol) of erythromycin A previously dissolved in 150 ml of tetrahydrofuran.
The reaction mixture is then left under stirring for 10 hours, allowing to rise to room temperature (chromatography on a thin layer of silica gel: methylene chloride / methanol 10%). The solution is poured into 60 ml of water and then extracted with ethyl acetate. The sentence
EMI11.1
organic is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a column of silica gel (HPLC) using the eluent: ethyl acetate (7) / hexane (3) to result in the isolation of 4.1 g (60X yield ) of pure 0-retinoyl (all trans) -2'-erythromycin A.
EMI11.2
F. 760C (ethyl acetate / hexane) r) = -65 (02 mg / ml dichloromethane) D Microanalysis: C57H93N014, 4H20; M-1088, 5 C H N Wedge. 7.: 62, 89 9, 35 1, 29 Found. 7.: 62, 91 8, 90 1, 29 R. N. M. du C CDCl3're. internal T. M. S.) negative Y effects in the (-2ppm) and 3 '(-1. 9ppm) indicate the position of the ester in 2'. The carbons C "20 (14, 1 ppm), C" 14 (119, 36 ppm) and C "12 (135.19 ppm) are in agreement with the all trans stereochemistry of the retinoic chain.
EXAMPLE 3
Preparation of 0-retinoyl (all trans) -3-clindamycin
In a flask, under an inert atmosphere, 5 g (16.6 mmol) of retinoic acid (all trans) are dissolved in 30 ml of anhydrous tetrahydrofuran; the reaction mixture is cooled to OoC and then poured 6 ml (76 mmol) of anhydrous pyridine and 1.6 ml (16.6 mmol) of ethyl chloroformate; the solution is stirred for 5 minutes and added
1.25 g (15 mmol) of sodium hydrogen carbonate then 2.35 g (5.5 mmol) 1 of clindamycin previously dissolved in 100 ml of a mixture
<Desc / Clms Page number 12>
tetrahydrofuran (8) / pyridine (2).
The reaction mixture is then left under stirring for 10 hours, allowing to rise to room temperature (chromatography on a thin layer of silica gel: methylene chloride / methanol 57.). The solution is poured into 80 ml of water and then extracted with ethyl acetate. The organic phase is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a column of silica gel (HPL C) using the eluent: ethyl acetate (5) / hexane (5) to result in the isolation of 2.15 g (55Z yield) of pure O-retinoyl (all trans) -3 - clindamycin.
F-62 C [al 22 = +500 (C = 100 mg / ml dichloromethane)
D Microanalysis C38H59N2SO6Cl. 2.5H20; M = 752.5
EMI12.1
C H N Wedge. Z: 60.44 8.08 3.23 Found Z: 60, 66 8. 57 3.72 13C NMR (CDCl, internal TMS ref.): Effects (negative in position 4 (-2.8ppm) and in position 2 (-l, 9ppm). Caf 14 (117.84 ppm) and C "20 (14, 11 ppm) confirm the all trans stereochemistry of the retinoyl chain.
EXAMPLE 4 Preparation of 0-retinoyl (13 cis) -3-clindamycin
In a flask, under an inert atmosphere, 5 g (16.6 mmol) of retinoic acid (13 cis) are dissolved in 30 ml of anhydrous tetrahydrofuran; the reaction mixture is cooled to 0 ° C. and then 6 ml (76 mmol) of anhydrous pyridine and 1.6 ml (16.6 mmol) of ethyl chloroformate are poured; the solution is stirred for 5 minutes and 1.25 g (15 mmol) of sodium hydrogencarbonate are added, then 2.35 g (5.5 mmol) of clindamycin previously dissolved in 100 ml of a tetrahydrofuran (8) / pyridine (2) mixture . The reaction mixture is then left under stirring for 10 hours, allowing to rise to room temperature (chromatography on a thin layer of silica gel; methylene chloride / methanol 5Z).
The solution is poured into 80 ml of water and then extracted with ethyl acetate. The organic phase is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a silica gel column (HPL C) using the eluent: ethyl acetate (5) / hexane (5) to result in the isolation of 2g (51Z of yield) of pure 0-retinoyl (13cis) -3-clindamycin.
<Desc / Clms Page number 13>
EMI13.1
F = 950C (Hexane 1 ethyl acetate) fCl +111 "(C = 15 mg / ml dichloromethane) D Microanalysis: C 38 H59 ClN2 so6M-707, 4 JO 3? 0 CH Calc. Z: 64.52 8, 41 Find Z: 64.47 8.45 13C NMR (CDCl3, internal ref. TMS)
EMI13.2
The position of the ester is indicated by the positive ss effect in 3 (+1, 77ppm) and the negative Y effects in 2 (-l, 4ppm) and 4 (-2, 5ppm). The 13cis configuration is confirmed by the C "20 (20, 93ppm) and the C" 14 (115.94ppm).
EXAMPLE 5
EMI13.3
Preparation of 0-retinoyl (13cis) -3-lincomycin In a flask, under an inert atmosphere, 5 g (16.6 mmol) of retinolic acid (13cis) are dissolved in 30 ml of anhydrous tetrahydrofuran; the reaction mixture is cooled to 0 ° C., then 6 ml (76 mmol) of anhydrous pyridine and 1.6 ml (16.6 mmol) of ethyl chloroformate are poured in, the solution is stirred for 5 minutes and 1.25 g (15 g) are added. mmol) of sodium hydrogen carbonate followed by 2.2 g (5.4 mmol) of lincomycin previously dissolved in 100 ml of a tetrahydrofuran (7) / pyridine (3) mixture. The reaction mixture is then left under stirring for 10 hours, allowing to rise to room temperature (chromatography on a thin layer of silica gel: methylene chloride / methanol 10%).
The solution is poured into 100 ml of water and then extracted with ethyl acetate. The organic phase is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a column of silica gel (H. P. L. C.) using the eluent: ethyl acetate (8) / hexane (2) to result in the isolation of 1.85 g (50Z of render-
EMI13.4
ment) of pure 0-retinoyl (13cis) -3-lincomycin.
F-95 "(hexane / ethyl acetate) PJ 20. +103" (C-7 mg / ml dichloromethane) D Microanalysis: C38H60N2SO, 2.50; M-734.5 C H Wedge. Z: 62, 18 9, 03 Found. Z: 62. 33 8.64 R. M. N. from 13C (CDCl3, internal ref. T. M. S.)
<Desc / Clms Page number 14>
The position of the ester is indicated by the positive ss effect at 3 (+1.6ppm) and the negative Y effects at position 2 (-2.4ppm) and 4 (-1.9ppm).
The 13cis configuration is confirmed by the C "20 (20, 98ppm) and the C" (115.83ppm).
EXAMPLE 6
EMI14.1
Preparation of the mixture of monoesters of O-retinoyl (all trans) -7-lincomycin, O-retinoyKall trans) -3 lincomycin and O-retinoyl (all trans) -2 lincomycin In a flask under inert atmosphere, dissolve 30g (74 mmol ) of lincomycin in 300 ml of anhydrous N, N-dimethylformamide then 830 mg (7.4 mmol) of potassium tert-butoxide are added and stirring is continued at room temperature for 90 minutes. A solution of 13 g (37 mmol) of retinoyl (all trans) -1 imidazole is then poured into 150 ml of N, N-dimethylformamide and the resulting medium is stirred at room temperature for 12 hours (chromatography on a thin layer of silica gel : methylene chloride / methanol 7.5Z). The solution is poured into 500 ml of water and then extracted with ethyl acetate.
The organic phase is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a column of silica gel (HPLC) using the eluent: ethyl acetate (7) / hexane (3) to result in the isolation of 39g (77%) of a mixture. - diaper of retinoic monoesters (all trans) of lincomycin in positions 2, 3 and 7.
R. M. N. from 13C (CDCI3'ref. Internal T. M. S.).
- Negative Y effects in 8 (-2.5 ppm) and in 6 (-3.8 ppm) indicate the place of esterification of a monoester in position 7, - Negative y effect in position 1 (-4 ppm) indicates the monoester in position 2 and the negative Y effects in 2 (-2 ppm) and 4 (-2, 6 ppm) indicate the position of the monoester in position 3. The positions of C. are at 85.06 ppm for the monoester in 2, at 88.45 ppm for the monoester in position 7 and 89.67 ppm for the monoester in position 3.
The configuration of the all trans retinal chain is indicated
EMI14.2
for C "14 to 117.78 ppm and for C" 20 to 14, 08 ppm; a trace of isomerization is noted by the presence of a peak at 115.2 ppm (C ") indicating the 13 isomer cis.
<Desc / Clms Page number 15>
EMI15.1
EXAMPLE 7 Preparation of the mixture of monoesters of O-retinoyl (all trans) -2 clindamycin. O-retinoyl (all trans) -3 clindamycin and O-retinoyl (all trans) -4 clindamycin
In a flask under an inert atmosphere, 20 g (47 mmol) of clindamycin are dissolved in 250 ml of anhydrous N. N-dimethylformamide and then 527 mg (4.7 mmol) of potassium tert-butoxide are added to the reaction medium which is then stirred at room temperature for 90 minutes.
A solution of 8.250 g (23.5 mmol) of retinoyl (all trans) -1 imidazole is then poured into 150 ml of anhydrous N. N-dimethylformamide and the resulting medium is stirred at room temperature for 12 hours (layer chromatography thin silica gel: methylene chloride / methanol 5%). The solution is then poured into 500 ml of water and then extracted with ethyl acetate. The organic phase is dried over magnesium sulfate, filtered and then concentrated under partial vacuum. The crude product thus obtained is chromatographed on a column of silica gel (H. P. L.
C.) using the eluent: ethyl acetate (5) / hexane (5) to result in the isolation of 28 g (85Z) of a mixture of retinol monoesters (all trans) of clindamycin in positions 2, 3 and 4.
R. M. N. du C (CDC13'ref. Internal T. M. S.) - Negative effect Y in position 1 (-3 ppm) indicates the position of the ester in 2.
- Negative Y effects in position 4 (-2, 8 ppm) and 2 (-1, 9 ppm) indicate the monoester in position 3 and weak negative Y effect in position 3 indicates the monoester in position 4.
The positions of C. are at 84.63 ppm for the monoester in 2, at 88.79 ppm for the monoester in 3 and at 87.98 ppm for the monoester in 4.
The all trans configuration of the retinal chain is predominant (C "., At 117.5 ppm and C" at 20 to 14.08 ppm) but traces of isomerization are clear, in particular in C "20 and in C" .,.
PHARMACEUTICAL AND COSMETIC COMPOSITIONS
EMI15.2
A-GELS FOR TOPICAL TREATMENT OF ACNE
EMI15.3
<tb>
<tb> 1. <SEP> Hydroxypropyl <SEP> cellulose <SEP> 1g
<tb> Butylhydroxyto1uene ............................... <SEP> 0. <SEP> 05g
<tb> 0-retinoyl <SEP> (13cis) -3-lincomycin .................... <SEP> 0. <SEP> 5g
<tb> Isopropanol <SEP> q. <SEP> s. <SEP> p .................................. <SEP> 100g
<tb>
<Desc / Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb>
<tb> 2. <SEP> Hydroxypropyl <SEP> cellulose <SEP> 1. <SEP> 5g
<tb> Butylhydroxytoluene <SEP> 0. <SEP> 05g
<tb> 0-retinoyl <SEP> (all <SEP> trans) -3-clindamycin ............... <SEP> 0. <SEP> 3g
<tb> Isopropanol <SEP> q. <SEP> s. <SEP> p .................................. <SEP> 100g
<tb>
EMI16.2
B-LOTIONS FOR TOPIOUE TREATMENT OF ACNE
EMI16.3
1. Butylhydroxytoluene O.
OSg O-retinoyl (all trans) -2 'erythromycin A ..................................... 19 Triglycerides of C gC q fatty acids. s. p ............................ 100g In this example, the active compound can be replaced by the same amount of O-retinoyl (13 -cis) -2 'erythromycin A.
EMI16.4
<tb>
<tb>
2. <SEP> Butylhydroxytoluene <SEP> 0. <SEP> 05g
<tb> O-retinoyl <SEP> (13cis) -3-clindamycin ................... <SEP> 0. <SEP> 7g
<tb>
EMI16.5
Dimethyl ether of polytetrahydrofuran (viscosity 22Cpo) of formula: CH 0 - [(CH) -CH -CH -t CH 3 2 2 2 2 3 .... q. s. p .... 100g n nose
EMI16.6
C-STICK FOR TOPICAL TREATMENT OF ACNE
EMI16.7
<tb>
<tb> Vaseline <SEP> white <SEP> 52g
<tb> Oil <SEP> from <SEP> petroleum jelly <SEP> 15g
<tb> Paraffin <SEP> refined <SEP> 32g
<tb> 0-retinoyl <SEP> (all <SEP> trans) -2 '
<tb> erythromycin <SEP> Aug
<tb>
EMI16.8
D-SUPPOSITORY (COMPOSITION FOR 1 UNIT)
EMI16.9
<tb>
<tb> 0-retinoyl (all <SEP> trans) -2'-erythromycin <SEP> A ........... 0. <SEP> 05g
<tb> Triglycerides <SEP> of acids <SEP> bold <SEP> C <SEP> 8 <SEP> -C <SEP> 12 <SEP> ............. 0. <SEP> 25g
<tb> Glycerides <SEP> semi-synthetic <SEP> q.
<SEP> s. <SEP> p .................... <SEP> 2g
<tb>
<Desc / Clms Page number 17>
EMI17.1
E-CAPSULES OF 500 mg ----------------- The walls of the capsules are made of glycerin, sorbitol and gelatin. 1. Capsule with 50 mg of active compound.
EMI17.2
<tb>
<tb>
0-retinoyl <SEP> (13 <SEP> cis) -z'-erythromycin <SEP> A <SEP> ............. <SEP> 50 <SEP> mg
<tb> Oil <SEP> from <SEP> petroleum jelly <SEP> fluid <SEP> 200 <SEP> mg
<tb> Oil <SEP> from <SEP> petroleum jelly <SEP> thick <SEP> 250 <SEP> mg
<tb>,
<tb>
EMI17.3
2. 10 mg capsule of active compound.
EMI17.4
<tb>
<tb>
0-retinoyl <SEP> (13 <SEP> cis) -2'-erythromycin <SEP> A <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Butylhydroxyaminose <SEP> 0.05 <SEP> mg
<tb> Butylhydroxytoluene <SEP> .................................... <SEP> 0.05 <SEP> mg
<tb> Tribéhénate <SEP> from <SEP> glycerol <SEP> 100 <SEP> mg
<tb> Triglycerides <SEP> of acids <SEP> bold <SEP> in
<tb> C-C <SEP> q. <SEP> s. <SEP> p. <SEP> ................................. <SEP> 500 <SEP> mg
<tb> 8 <SEP> 12
<tb>
F-CELLS
EMI17.5
- --- The walls of the capsules are made of gelatin and titanium dioxide.
EMI17.6
<tb>
<tb> O-retinoyl <SEP> (all <SEP> trans) <SEP> -2'-erythromycin <SEP> A ........... <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> Silica <SEP> colloidal <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Stearate <SEP> from <SEP> magnesium <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Starch <SEP> from <SEP> but <SEP> 76 <SEP> mg
<tb> Lactose <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> p ..................................... <SEP> 250 <SEP> mg
<tb>