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SÉQUENCE NUCLÉOTIDIOUE DESTINÉE AU TRAITEMENT DU CANCER
ET DES INFECTIONS Objet de l'invention
La présente invention concerne une séquence nucléotidique destinée au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections.
L'invention s'étend également à l'utilisation de séquences nucléotidiques pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections.
Arrière-plan technologique
L'efficacité des traitements conventionnels du cancer et des infections est limitée par leur manque de sélectivité. En effet, la toxicité liée à ces traitements ne se limite pas aux cellules cibles (cellules tumorales, cellules infectées), elle affecte aussi des cellules normales d'importance vitale.
En conséquence, on a développé des systèmes de ciblage d'agents thérapeutiques qui permettent de diminuer la dose toxique administrée aux tissus normaux tout en permettant à une dose toxique efficace d'être administrée aux tissus pathologiques.
Le brevet US-4 675 382 décrit des protéines hybrides clivables et constituées de fragments cytotoxiques et de ligands cytospécifiques, ainsi que leur application thérapeutique ciblée dans le traitement de désordres médicaux.
Des protéines qui sont hautement cytotoxiques lorsqu'elles sont introduites dans les cellules de mammifères sont produites par beaucoup d'espèces de bactéries et de
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plantes (fragment A de la toxine diphtérique (DT-A), de Pseudomonas aeruginosa, du Ricin...).
Des tentatives ont été faites pour remplacer la portion de ces protéines responsable de l'entrée cellulaire par des ligands spécifiques de tumeurs (anticorps monoclonaux, peptides...) (Martinez et al, Cancer Surveys, 1,374 (1982)).
Une autre stratégie employée par Maxwell (Cancer research 46,4660-4664, september 1986), consiste à introduire l'ADN codant pour le fragment A de la toxine diphtérique, in vitro dans des cellules à l'aide de constructions comportant des éléments de régulation transcriptionnelles spécifiques de tissus agissant en cis dans le but de n'exprimer la DTA que dans les cellules contenant les facteurs agissant sur ces éléments de régulation.
D'autres techniques utilisent des gènes codant pour un enzyme conférant à la cellule transfectée une sensibilité à un agent toxique ont été décrites par Moolten F. (Human Gene Therapy 1 : 125-134 (1990) et Venkatesh (P. N. A. S., vol. 87, p. 8746-8750, novembre 1990).
Le gène codant pour la Thymidine kinase de l'Herpès simplex type 1 (HSV-TK) est approprié à ce type de thérapie. Certains analogues de la guanosine tels que l'iodovinyl- déoxyuridine (IVDU), l'acyclovir, le ganciclovir sont des substrats spécifiques pour l'HSV-TK, qui catalyse leur phosphorylation en monophosphates de façon plus efficace (plus de mille fois) que les thymidine kinases des cellules de mammifères. Une phosphorylation ultérieure en triphosphates sous l'influence de kinases cellulaires convertit ces molécules en de puissants inhibiteurs de la synthèse d'ADN.
Des doses de ganciclovir, n'affectant pas la survie in vitro de cellules HSV-TK négatives, permettent de détruire in vitro des cellules HSV-TK positives et d'éradiquer les lymphomes HSV-TK positifs in vivo chez des souris transgéniques exprimant l'HSV-TK dans leurs cellules lymphoïdes.
Toutefois, pour certaines lignées cellulaires exprimant l'HSV-TK la dose d'analogues de guanosine permet- tant une cytotoxicité in vitro proche de 100% de mort
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cellulaire induit une cytotoxicité appréciable dans des lignées cellulaires n'exprimant pas l'HSV-TK (doses entre 10 et 100 J1M).
Une approche permettant d'éviter ce problème est d'utiliser des analogues de la guanosine marqués à l'aide de radio-isotopes émetteurs d'électrons AUGER tels que l'Iode 123 (demi-vie 13h21). Ces isotopes relâchent la majeure partie de leur énergie sur un parcours de quelques nanomètres. L'efficacité de tels radio-isotopes en ce qui concerne la cytotoxicité cellulaire est complètement perdue lorsqu'ils ne sont pas liés ou tout au plus à une distance
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de quelques nanomètres de l'ADN. S'ils sont dans le voisinage de l'ADN, une cinquantaine de désintégrations sont suffisan- tes pour tuer la cellule HSV TK positive.
Une cytotoxicité maximale est obtenue lorsque les cellules incorporent l'analogue de la guanosine marqué à l'Iode 123 dans leur ADN à des doses inférieures à 10-10 M ce qui est largement inférieur au seuil de toxicité de cet analogue pour les cellules ne possédant pas de HSV-TK.
En outre, l'Iode 123 est également émetteur d'un rayonnement y qui peut être détecté à l'aide d'une gammacaméra en clinique.
Après concentration in vivo de l'analogue marqué dans les tissus exprimant l'HSV-TK et l'élimination de l'analogue de la guanosine du flux sanguin et des autres tissus,
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il y a possibilité de détecter à l'aide d'une gammacaméra les tissus exprimant l'HSV-TK (application à la détection de métastases).
Cette approche, comparée à l'expression du fragment A de la toxine diphtérique, a l'avantage de permettre un contrôle de l'intensité et du déroulement de l'attaque cytotoxique.
L'administration de l'analogue de la guanosine peut être modulée en fonction de l'évolution clinique (évolution des tissus cancéreux et toxicité infligée aux tissus normaux).
Dans la demande de brevet WO 90/11359, Baltimore et al. décrivent des constructions nucléotidiques
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recombinantes comportant des séquences régulatrices du virus HIV et des séquences codant pour des produits cytotoxiques affectant spécifiquement les cellules infectées par les virus HIV ou HTLV.
La séquence virale conservée est constituée de tout ou partie de la séquence régulatrice LTR (Long Terminal Repeat) du virus. Cette séquence peut être transactivée au niveau d'une séquence promotrice TAR par les facteurs de transactivation viraux spécifiques TAT des virus HIV et TAX des virus HTLV, exprimés dans les cellules infectées par ces virus (Sodroski J. et al., Science (1985) 227,171-173).
L'activation de la séquence promotrice permet ensuite l'expression de la séquence codant pour des produits cytotoxiques entraînant la mort des cellules infectées par le virus HIV.
Cependant de telles constructions nucléotidiques peuvent comporter des séquences de LTR, autres que la séquence TAR.
Ces séquences, telles que les éléments enhancer NF-Kappa B (Greene, Annual Rev. Immunol., 1990,8, p. 453) sont transactivables par des activateurs cellulaires, ou telles que l'élément NRE (Négative Regulatory Element) sont transactivables par le facteur viral NEF (Kieny, Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 3, p. 395 (1990).
De tels facteurs peuvent donc activer les gènes cytotoxiques dans des cellules saines ou les désactiver dans des cellules infectées par le virus.
La demande de brevet WO 90/07936 et le document "Aids Research and Human Retroviruses" (vol. 8, n 1, 1992, Mary Ann Liebert, Inc., Publisher) décrivent l'intégration dans des vecteurs viraux ou des plasmides des constructions nucléotidiques comportant des séquences régulatrices transactivables par des facteurs spécifiques d'une affection (telle que le SIDA) et des séquences codant pour des produits cytotoxiques affectant spécifiquement les cellules soumises à des désordres hyper-prolifératifs ou à des infections.
Cependant, ces vecteurs viraux ou plasmidiques présentent un danger potentiel en s'intégrant dans les cellu-
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les hôtes d'activer des protooncogènes ou d'annihiler des gènes suppresseurs de tumeurs.
Buts de l'invention
L'invention a pour but de fournir un vecteur viral intégrant une séquence nucléotidique susceptible de détruire ou de normaliser des cellules cancéreuses ou soumises à des infections.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un vecteur viral qui, sans s'intégrer dans leur génome, est susceptible de s'exprimer efficacement dans l'environnement intracellulaire desdites cellules.
Eléments principaux de l'invention
L'invention concerne une séquence nucléotidique destiné au traitement de cellules cancéreuses ou soumises à des infections, comprenant, intégré dans un vecteur viral appartenant au groupe des parvovirus, un gène effecteur susceptible d'assurer la destruction ou la normalisation des cellules.
On entend par le terme"traitement"une réduction ou un allégement des symptômes de l'affection, l'élimination ou l'inhibition des agents causaux, la prévention de l'infection ou du désordre cellulaire du sujet soumis à l'affection.
Le terme"infection"se rapporte à des infections de cellules par des agents viraux, bactériens ou d'autres parasites infectieux intracellulaires.
L'invention concerne tout particulièrement des agents infectieux viraux tels que le HIV-I, le HIV-II, le HIV-III, le HTLV-I, le HTLV-II, l'herpès simplex virus (HSV), le cytomégalovirus (CMV), les papillomavirus humains (HPV) et d'autres virus similaires.
Les vecteurs les plus appropriés pour ce transfert génique in vivo sont les virus appartenant au groupe des parvovirus autonomes. Ce sont de petits virus sans enveloppe dont le génome est constitué d'un ADN simple brin linéaire d'environ 5 KD. Leur faible complexité génétique les rend totalement dépendant de facteurs exogènes pour leur réplication. Ils ne se répliquent efficacement que dans l'environnement intracellulaire des cellules tumorales dans
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lesquelles ils se trouvent sous forme épisomique (J.
Rommelaere, Handbook of Parvoviruses, 1990, vol. 2, p. 41-57, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida).
Ils ne s'intègrent pas dans le génome des cellules comme les rétrovirus et ne présentent donc pas le danger potentiel d'activer des protooncogènes ou d'annihiler les gènes suppresseurs de tumeurs. Leur oncotropisme et leur caractère épisomique en font des vecteurs de choix pour la thérapie génique ciblée de tumeurs et d'infections intracellulaires.
Préférentiellement, le vecteur viral utilisé est le Parvovirus Hl ou le Parvovirus fibrotropique du"minute virus of mice" (MVMp).
La plupart des lignées de cellules cancéreuses humaines testées à ce jour se sont révélées permissives pour l'infection par les parvovirus Hl et le variant fibrotropique du"minute virus of mice (MVMp). Ces virus ont des propriétés oncoprotectrices in vivo et peuvent causer la régression de tumeurs humaines en souris nues même après inoculation virale à un site distant de la tumeur. L'Hl et le MVMp sont de petits virus contenant un ADN simple brin de 5 kb bordé de 2 boucles palindromiques en épingle à cheveu.
Chez ces parvovirus, deux promoteurs, P4 et P38, contrôlent respectivement l'expression de deux protéines non structurelles (NSI et NSII) et de deux protéines de capsides (VP1 et VP2). P4 contrôle NSI et NSII et P38, VP1 et VP2. NSI est un facteur de transactivation de P38 et est responsable de l'activité cytotoxique. NSI est en outre nécessaire pour la réplication virale et la restriction ou permissivité pour l'infection virale semble liée au niveau de transcription de NSI.
Préférentiellement, le vecteur viral utilisé est choisi parmi le Parvovirus Hl et le Parvovirus variant fibrotropique du"Minute virus of Mice" (MVMp).
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le vecteur viral est dépourvu des gènes codant pour les protéines de capsides (VP1 et VP2) du parvovirus. Préférentiellement, le vecteur viral est également dépourvu
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du promoteur P38 et des gènes codant pour les protéines non structurelles NSI et NSII du Parvovirus.
L'expression"assurant la destruction ou la normalisation des cellules"signifie que lors d'une infection ou à l'occasion d'un cancer, l'expression du gène effecteur dans la cellule hôte permet soit de tuer celle-ci, soit de la rendre sensible à un agent exogène toxique ou soit de la rendre capable d'inhiber l'action du cancer ou de l'agent infectieux.
Le terme"gène effecteur"se rapporte à une séquence nucléotidique qui, lorsqu'elle s'exprime (par l'action de facteurs de transactivation spécifique sur la séquence régulatrice), permet de détruire ou de normaliser les cellules traitées.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le gène effecteur code soit pour une protéine cytotoxique, préférentiellement le fragment A de la toxine diphtérique (DTA) ; soit pour une enzyme conférant à la cellule transfectée une sensibilité à un agent toxique, l'enzyme sera préférentiellement la thymidine kinase de l'Herpès simplex virus type 1 (HSV-TK).
Parmi les différentes protéines cytotoxiques disponibles (DT-A, RicinA, Gelonine, Toxine de Pseudomonas aeruginosa) le choix de la DT-A semble approprié. En effet, comme la majorité de la population a été vaccinée contre la toxine diphtérique, tout éventuel relargage de DT-A par les cellules mortes sera annihilé par le système immunitaire. En outre, comme la DT-A est dépourvue de site de liaison à un récepteur cellulaire, elle ne pourra pas entrer dans d'autres cellules.
La production de DT-A dans les cellules de mammifères résulte en l'inhibition de toute synthèse protéique ultérieure (par ADP ribozylation du facteur d'élongation-2) et par conséquent mène à la mort cellulaire. Comme la DTA agit de façon catalytique et non stoechiométrique, quelques molécules de DTA sont suffisantes pour tuer une cellule.
Le fragment A libéré dans les cellules infectées par HIV non seulement entraîne la mort cellulaire, mais
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bloque également toute synthèse protéique y compris la synthèse des protéines virales et de ce fait bloque la réinfection des cellules voisines.
Avantageusement, le gène effecteur peut être modifié par exemple par une mutagénèse dirigée afin d'atténuer la cytotoxicité de la protéine produite.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence nucléotidique comprend également au moins une séquence régulatrice transactivable par des facteurs de transactivation spécifique de l'affection traitée ou du tissu cellulaire affecté, et apte à cisactiver le gène effecteur.
Le terme"séquence régulatrice transactivable"se rapporte à une séquence nucléotidique qui est capable de répondre à un facteur de transactivation spécifique et d'activer en réponse la transcription de gènes situé en cis.
Selon une autre forme d'exécution de l'invention, la séquence régulatrice comporte tout ou partie de la séquence régulatrice LTR (Long terminal Repeat) des virus HIV ou HTLV comprenant la séquence TAR (TAT responsive élément).
Préférentiellement, la séquence LTR est dépourvue de la séquence enhancer Kappa B transactivable par des facteurs cellulaires et/ou de la séquence NRE transactivable par le facteur viral NEF.
La suppression de ces séquences au sein de la séquence LTR réduisent de manière surprenante l'expression de la séquence nucléotidique de l'invention dans les cellules n'exprimant pas la protéine TAT sans diminuer l'expression de la séquence nucléotidique de l'invention dans les cellules exprimant la protéine TAT.
Avantageusement, la séquence nucléotidique comporte également une séquence régulatrice constituée de tout ou partie de la séquence RRE (Rev-Responsive Element) et de la séquence adjacente CRS des virus HIV et HTLV (Rosen, P. N. A. S., vol. 85, p. 2071-2075 (1988)) et de sites adjacents d'épissages.
Les séquences TAR (situées dans le LTR des virus HIV et HTLV et transactivables par les protéines virales TAT
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du HIV et TAX du HTLV) et RRE (situées dans la séquence ENV des virus HIV et HTLV et répondant aux protéines REV du HIV et REX du HTLV) et des sites adjacents d'épissages sont par exemple des séquences utilisables pour le traitement des infections par ces rétrovirus (Rosen G., Editorial Review, Aids 1990,4, 499-509).
Le grand degré de conservation de ces séquences permet de traiter les cellules infectées par les différentes souches de HIV à l'aide de la même construction nucléotidique.
On place également la séquence du gène effecteur sous le contrôle de la protéine Rev de HIV, car en l'absence de Rev, tout mRNA qui contient la séquence RRE est bloqué dans le spliceosome nucléaire et ne peut être exporté dans le cytoplasme vers les ribosomes.
Selon une autre forme d'exécution de l'invention, la séquence régulatrice est constituée d'une séquence promo-
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teur ""enhancer" spécifique du cytomégalovirus et le gène effecteur est un ribozyme clivant spécifiquement l'ARN messa- ger codant pour la protéine a du cytomégalovirus (Griffiths P., Biochem J., 241, p. 313-324 (1987)).
Selon une autre forme d'exécution de l'invention, les séquences régulatrices sont constituées de promoteurs et/ou d'enhancers transactivables dans certains tissus spécifiques, choisis parmi : - la séquence d'ADN contrôlant l'expression du gène codant pour l'a foetoprotéine (AFP), cette région n'étant transac- tivée que dans les cellules d'hépatomes, de choriocarcinome et dans de rares cellules hépatiques (Sakai M., The Journal
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of Biological Chemistry, vol. 260, n 8, p. 5055-5060 et Nakabayashi H., vol. 264, n 1, p. 266-271) ;
- la séquence contrôlant l'expression de la protéine placen- taire humaine 11 (PP11). La PP11 n'est exprimée que dans le placenta (syncytiotrophoblaste) et on ne la trouve dans aucun tissu adulte normal, mais par immunohistochimie on la détecte dans 47% des cancers du sein, dans 67% des carcinomes ovariens, et dans 38% des cancers testiculaires et gastriques étudiés (Grundmann U., DNA and Cell Biology,
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vol. nO 9, nO 4, 1990, p. 243-250) ;
- la séquence contrôlant l'expression de l'antigène CO-029 qui est détectée dans des carcinomes de l'estomac, du côlon, du rectum et du pancréas mais n'est pas détecté dans les tissus normaux (Szala S., PNAS, vol. 87, p. 6833-6837 (1990)) ; - la séquence contrôlant l'expression de l'antigène H23 (breast-cancer-associated antigen) détecté chez l'humain dans 90% des cancers du sein (Tsarfaty I., Gène, 93, (1990) p. 313 à 318) ; - la séquence contrôlant l'expression prostatique de la protéine sécrétoire prostatique PSP94 ; dans les cancers de la prostate à un stade avancé, après prostatectomie, le seul tissu de l'organisme synthétisant la PSP94 est le tissu tumoral prostatique (Linard c., Gene, 73 (1988), p.
479-487) ; - la séquence contrôlant l'expression de la protéine pHGR11 associée au mélanome, au cancer ovarien, à l'adénocarcinome du côlon et de la prostate ; les seules cellules normales où pHGR11 est exprimé, sont les cellules de la granulosa de l'ovaire (Rapp G., DNA and cell Biology, vol. 9, nO 7, p. 479-485) ; - la séquence contrôlant l'expression de la protéine pHGR74, exprimée dans les testicules, la prostate, la vésicule séminale et la granulosa de l'ovaire ; - ainsi que les séquences contrôlant l'expression de protéi- nes spécifiques de l'épithélium mammaire, de l'épithélium utérin ; - la séquence contrôlant l'expression de la tyrosinase, exprimée dans les mélanocytes et le mélanome malin (Kwon B., PNAS, vol. 84, p. 7473-7477) ;
- les séquences contrôlant l'expression de l'élastase, expri- mée uniquement dans le pancréas exocrine (Cell, vol. 9,
435-443 (1987) ; - la séquence contrôlant l'expression hypophysaire de la prolactine (Peers B., Molecular and Cellular Biology, sept.
1990, p. 4690-4700).
L'invention concerne également une composition
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pharmaceutique pour le traitement de cellules cancéreuses ou infectées par des agents viraux comprenant une ou plusieurs de ces séquences et un véhicule pharmaceutique adéquats.
Selon une forme préférentielle de l'invention, cette composition pharmaceutique contient également un ou plusieurs agents viraux sauvages appartenant au groupe des parvovirus.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de ces compositions pharmaceutiques pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cancers ou d'infections.
Les exemples ci-après sont donnés à titre purement indicatif et permettent d'illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention par un virus.
Exemple I : Traitement de l'infection à H. I. V.
Les séquences virales utilisées sont d'une part la séquence LTR 5'du HIV modifié de façon à être contrôlé par la protéine TAT du HIV et à échapper au contrôle de facteurs de transactivation cellulaire, et d'autre part, la séquence RRE placée sous le contrôle de la protéine Rev du HIV et liée à la séquence CRS adjacente. Le gène effecteur placé entre ces deux séquences est le gène codant pour le fragment A de la toxine diphtérique. Ces deux séquences imposent une double sécurité à l'expression du fragment A qui ne pourra se faire que dans les cellules infectées par le HIV qui produisent (même à bas bruit comme dans les infections latentes) à la fois les protéines TAT et REV.
La séquence TAR (contrôlée par TAT) et la séquence RRE (REV Responsive Element) de HIV-1 répondent aux protéines TAT et REV de HIV-1 et HIV-2 ainsi qu'aux protéines TAX et REX de HTL-V-1. Le grand degré de conservation de ces séquences permet de traiter les cellules infectées par les différentes souches de HIV à l'aide de la même construction. L'avantage du parvovirus sur les autres vecteurs de transfection est qu'il n'y a pas intégration de son matériel génétique qui reste sous forme épisomiale et ne risque pas d'inactiver un gène oncosuppresseur ou d'activer un protooncogène.
L'innocuité et l'efficacité d'un tel traitement
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devraient permettre son administration également aux patients séropositifs en phase d'infection latente asymptomatique. Le fragment A libéré dans les cellules infectées par HIV non seulement entraîne la mort cellulaire mais bloque également toute synthèse protéique y compris la synthèse des protéines virales et de ce fait bloque la réinfection des cellules voisines.
Procédé d'obtention de la construction vectorielle : 1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable - Amplification par PCR du fragment (-85, +78) du LTR de
HIV-I et insertion aux sites SmaI (715 Blunt) et Hind
III (689) (compatible avec +78 = site Hind III) du plasmide p Bluescript SK +/-.
La séquence LTR de HIV est ainsi dépourvu des sites NF-
KB mais conserve 3 sites SP1, la TATA Box et le TAR (TAT Responsive Element).
2. Isolation et intégration du gène effecteur cisactivable - Amplification par PCR du fragment DTA placé entre les nucléotides (79) et (653) - formation de l'oligomère Hind III-ATG- (79)-DTA dont l'amorce a la séquence :
AAGCTTATGGCTGATGATGTTGTTGATTCT et de l'oligomère DTA- (653)-TAG-KPnI dont l'amorce a la séquence :
ACACGTCCTTTAGCACAGTCCGCATCCCATGG - Insertion du Hind III ATG- (79)-DTA- (653) TAG-
KPnI aux sites Hind III (689) et KPnI (657) du plasmide p Bluescript SK +/-LTR HIV.
- Isolation du fragment (2668 bp) : KPnI (6346)-CRS-
RRE-KpnI (9014) du HIV-I.
- Insertion au site KPnI (657) du plasmide p Bluescript
SK +/-LTR-DTA (insertion dans les deux orientations).
- Isolation du fragment
BamH I (Bluescript 719)-BamH I (HIV 8474) ayant la bonne orientation (2865 pb) et un autre fragment mal orienté (1277 pb).
3. Intégration du gène effecteur et de séquence régulatrice
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dans le vecteur parvoviral Digestion du vecteur PMM984 (vecteur MVM) par NCO 1 (259) et Xba I ('4335)
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"\ ajouter polylinker Bgl II insérer fragment BamH I-LTR-DTA CRS-RRE-BamH I et sélectionner les clones ayant la bonne orientation.
4. Clonage du vecteur dans E. coli
Les clones ayant la bonne orientation sont sélectionnés et les plasmides isolés.
(Le pMM 984 a tendance lorsqu'il est propagé dans E. Coli de perdre 40 ou 97 paires de base dans le palindrome droit, ce qui n'est pas le cas dans Epicurian Coli sure (Stratagène).
5. Production de virions
Pour encapsider le génome parvoviral recombinant, un plasmide helper (soit le pMM 984 soit un pMM 984 présen- tant une déletion dans le palindrome droit) est cotrans- fecté avec le plasmide recombinant sélectionné dans des cellules tumorales.
Après 2 jours de culture, les surnageants (2 jours par transfection) sont récoltés. Les cellules sont congelées et décongelées et les virions récoltés et isolés sur gradient de chlorure de césium.
De même, on peut aussi utiliser dans le procédé susmen- tionné des cellules"emballeuses"produisant de façon constitutive ou inducible VP1 et VP2.
Exemple 2 : Traitement du cancer du sein Procédé d'obtention de la construction vectorielle 1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable - Amplification par PCR du fragment
GAG Hind III-H23 Ag (280)-H23 Ag (784)-EcoR I-
GAG de 584 paires de bases de la 5'flanking sequence de H23. Ag (ATG en 785) à partir de l'ADN génomique de la lignée (T47D) du cancer mammaire humain.
Les amorces utilisées sont pour : - GAG Hind III-H23 Ag (280-300) 5'GAGAAGCTTTATCCAGCCCTCTTATTCTC 3'
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- H23 Ag (764-784) - EcoR l - GAG.
GGGTGGGTAAAGTCCTGGTGG-CTTAAGCTC - Digestion par Hind III et EcoR I et insertion aux sites Hind III (689) et EcoR I (7Q1) du plasmide p Bluescript SK +/-.
2. Isolation et intégration du gène effecteur cisactivable - Amplification par PCR du fragment
GAG EcoR I-ATG Diphteria Toxin DTA (79-653) TAG-Xba
I-GAC fragment codant pour la portion toxique de la toxine diphtérique dépourvue de la séquence"hydrophobic leader signal séquence" dont l'amorce GAG EcoR I ATG-DTA (79-100) a la séquence :
GAGGAATTCATGGCTGATGATGTTGTTGATTCT dont l'amorce DTA (631-653)-TAG-Xba I-GAG a la séquence :
ACACGTCCTTTAGCACAGTCCGCATCAGATCTCTC
Digestion par EcoR I et Xba I et insertion du fragment
DTA aux sites EcoR 1 (701) et Xba 1 (731) du plasmide p Bluescript SK +/-contenant le fragment H23 Ag.
3. Intégration du gène effecteur et de sa séquence régula- trice dans le vecteur parvoviral :
Le site Hind III du plasmide PBR 322 dans PMM 984 est détruit en enlevant le fragment Cla I-Nhe I du PBR 322 et en rendant"blunt"les extrémités 5'protrudentes en présence du fragment de Klenow de la DNA polymérase d'E. Coli.
Le PMM 984 (Hind III PBR 322-) est alors recircularisé.
- Digestion par Hind III et Xba I et insertion du frag- ment H23-ATG-DTA TAG aux sites Hind III (2650) et
Xba 1 (4339) du plasmide (dépourvu du site Hind III du
PBR 322) PMM 984 en remplacement des séquences codant pour les protéines VP1 et VP2 du MVMp.
On obtient donc la séquence suivante du MVMp modifié :
Palindrome, Promoteur P4, NSI, NSII, promoteur P38 région promoteur enhancer H23-ATG-DTA-TAG-sites de polydénylation du MVM, Palindrome.
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4. Cotransfection avec du DNA plasmidique de parvovirus sauvage (ou virus avec palindrome 5'non-fonctionnel) pour fournir les capsides virales (VP1 et VP2) dans les cellu- les productrices de virions.
Exemple 3 : Construction vectorielle à utiliser pour le trai- tement et le diagnostic de cancer (cancer du sein) 1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable
L'amplification par PCR du fragment
GAG Hind III-H23 Ag (280)"H23 Ag (784) - EcoR l - GAG et son insertion aux sites Hind III (689) et EcoR 1 (701) du plasmide p Bluescript SK +/-se fait comme précédemment.
2. Isolation et intégration du gène effecteur cisactivable - Amplification par PCR du fragment
GAG EcoR l - ATG - HSV-1 Thymidine kinase (59 à 1189)
TGA Xba l - GAG dont les primers sont pour :
GAG-EcoR I--ATG-Tk (59-80) :
GAGGAATTCATGGCTTCGTACCCCGGCCAT et pour Tk (1168-1189) Xba I-GAG :
CTCTACCCCCTCCGATTGACTAGATCTCTC - Insertion aux sites EcoR 1 (701) et Xba 1 (731) du plasmide p Bluescript SK +/-contenant le fragment
H23 Ag.
3. Intégration du gène effecteur et de sa séquence régula- trice dans le vecteur parvoviral
Insertion du fragment H23-Tk aux sites Hind III (2650) et Xba 1 (4339) du plasmide PMM 984.
Synthèse d'iodovinyldeoxyuridine marquée à l'iode 123 pour le traitement et la détection par gammacaméra de cellules cancéreuses exprimant l'HSV-I Tk après infection par le vecteur décrit ci-dessus (Samuel J. et al, Int. J. Appl.
Radiat. Isot., vol. 35., n 11, p. 1049-1052 (1984)).
Exemple 4 : Construction vectorielle à utiliser pour le traii tement de l'hépatome ou du choriocarninome
1. Isolation de la séquence régulatrice transactivable
Amplification par PCR du fragment
GAG Hind III-AFP enhancer (-736, +44) - EcoR l - GAG
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dont l'amorce pour GAG Hind III-AFP enhancer (-736, - 716) est :
GAGAAGCTTAATGATGCACCTGACCCACTT et dont l'amorce pour AFP enhancer (+24, +44) EcoR I GAG est :
TATTGTTTTATTGATCGTTGGCTTAAGCTC et insertion aux sites Hind III (689) et EcoR 1 (701) du plasmide p Bluescript SK +/-.
2. Isolation et intégration du gène effecteur sisactivable
Amplification par PCR du fragment GAG EcoR I-ATG-DTA (79-653) TAG-Xba I-GAG et insertion aux sites EcoR I (701) et Xba 1 (731) du plasmide p Bluescript SK +/- contenant l'AFP enhancer.
3. Insertion du gène effecteur et de sa séquence régulatrice dans le vecteur parvoviral insertion du fragment AFP enhancer ATG DTA TAG aux sites
Hind III (2650) et Xba 1 (4339) du plasmide PMM 984 Exemple 5 : Traitement de l'infection à cytomegalovirus survenant chez les immunodéprimés
Chez les sujets à immunité normale, l'infection virale est combattue par des lymphocytes T cytotoxiques qui reconnaissent des peptides provenant de protéines virales ayant été dégradées après synthèse endogène par les cellules infectées. Ces peptides sont reconnus en association avec les molécules du MHC classe I (Major Histocompatibility Complex). La destruction des cellules infectées empêche la propagation des virus aux autres cellules en inhibant leur réplication.
Les défenses de l'organisme comprennent aussi la production intracellulaire d'interféron et la production d'anticorps spécifiques. En l'absence de médicaments antiviraux spécifiques et tenant compte de l'efficacité limitée de l'immunothérapie passive, l'on propose dans l'invention de traiter les immunodéprimés atteint d'affection virale à l'aide de parvovirus modifiés en remplaçant les séquences codant pour NS-1, NS-2, P38, VP-1 et VP-2 par une séquence promoteur"enhancer" contrôlée par des facteurs de transactivation spécifiques du virus infectant. Cette séquence contrôle l'expression d'un gène effecteur permettant aux cellules transfectées soit de
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résister à l'infection soit d'être éliminées.
Bien que l'infection à cytomégalovirus soit asymptomatique chez les individus ayant un système immunitaire normal, elle devient une cause majeure de décès et de morbidité chez les patients à immunité soit immature (foetus, nouveau-né) soit compromise (receveurs d'allogreffes, patients atteints du SIDA). Les infections intra-utérines à CMV sont la seconde cause d'arriération mentale après le syndrome de down. (Griffiths and al., Biochem. J. (1987), 241, p. 313-324)
La pneumonie à CMV est la principale cause de mort après transplantation de moelle osseuse et l'infection discriminée à CMV est la cause majeure de morbidité et de mortalité chez les greffés rénaux ou chez les patients atteints de SIDA.
Après l'infection de la cellule susceptible par le CMV, l'expression temporelle du génome du virus est étroitement contrôlée sous forme d'une synthèse en cascade d'ARN messager et de protéines. L'on distingue les gènes a (ou précoces immédiats), P (ou précoces retardés) et y (ou
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tardifs). Les produits des gènes a sont requis par le virus pour prendre le contrôle des synthèses de la cellule hôte, les produits ss contrôlent la production de virions tandis que les produits y forment les composants de structure du virion.
Les protéines a permettent la synthèse d'ARN messager P et les protéines ss permettent la réplication de l'ADN qui est suivie par la synthèse de l'ARN messager y.
Les gènes a et P sont transcrits par l'ARN polymérase II cellulaire. Leur expression est contrôlée par des séquences proximales par rapport au promoteur qui sont activées en trans par une protéine structurale du virion.
Selon l'invention, ces séquences sont insérées à la suite du promoteur P4 du parvovirus et sont suivies d'une
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séquence codant pour un ARN ribozymial clivant spécifiquement l'ARN messager codant pour la protéine a la plus importante (Spaete and Mocarski, 1985, J. virol., 56,135-143 ; Sternberg et al, 1984, J. virol., 49,190-199). Les cellules
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transfectées par le parvovirus modifié de la sorte sont protégées de l'infection par le CMV. En effet, lors de l'infection, l'enlèvement de l'enveloppe virale donne naissance à la protéine structurale qui transactivera la séquence inclue dans le parvovirus et initiera la production de ribozymes anti mRNA de la protéine a.