BE1009230A6 - Conjugue immunoactif. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un conjugué imunoréactif comprenant un ou plusieurs ligand(s) choisi(s) parmi le groupe constitué par les acides aminés et/ou les dérivés d'acides aminés comprenant un groupe sulfhydryl, ledit ligand étant lié à une protéine porteuse hydrosoluble, d'un poids moléculaire supérieur à 8000 KD par un agent couplant susceptible de se fixer au groupement sulfhydryl desdites ligands.

Description

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   CONJUGUE   IMMUNOREACTIF.   



  ObJet de l'invention. 



   La présente invention concerne un conjugué immunoréactif, les anticorps dirigés contre le conjugué immunoréactif ainsi que les anticorps dirigés contre lesdits anticorps. 



   La présente invention concerne également la trousse de diagnostic ainsi que la composition pharmaceutique comprenant ledit conjugué et/ou les dits anticorps, ainsi que leur utilisation. 



  Arrière-plan technologique à la base de l'invention. 



   De nombreuses maladies ont une étiologie inconnue ou incertaine, où l'intervention d'une composante immunologique n'est pas à exclure. Ainsi, l'arthrite rhumatoide ou le SIDA peuvent présenter une composante infectieuse (d'origine virale ou bactérienne) et/ou une composante immunologique, mais la relation entre ces deux manifestations pathologiques n'est pas élucidée. 



   De même, la migraine pourrait éventuellement être   caractérisée   par une composante immunologique semblable. 



   Cependant, il est à l'heure actuelle impossible de concevoir la possibilité d'existence d'auto-anticorps qui puissent avoir l'effet dévastateur que présente le syndrome d'immunodéficience acquise ou encore engendrer les céphalées 

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 intolérables observées dans certaines migraines ou les atrophies musculaires incapacitantes observées dans l'arthrite rhumatoide et il est également difficile de concevoir comment un agent infectieux peut être l'agent étiologique capable de provoquer une telle synthèse d'autoanticorps. 



   Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) est une conséquence de l'infection par le HIV mais le syndrome apparaît avec un décalage de plusieurs mois ou même plusieurs années après le début de l'infection, sans qu'on sache quel est l'élément causal qui a provoqué ce passage de   l'état   latent vers le syndrome. Une composante auto-immune n'est pas envisagée, et d'ailleurs les méthodes nécessaires pour entreprendre une telle recherche n'existent pas. 



   L'arthrite rhumatoide est expérimentalement provoquée dans l'animal (le rat) par injection de concentrés de mycobactéries sans qu'on sache quel rôle ces produits   mycobactériens   jouent dans l'apparition de cette arthrite expérimentale. Une composante auto-immune est soupçonnée dans l'arthrite rhumatoide humaine parce que la gestation réduit ou supprime, pour la durée de la grossesse, l'évolution de la maladie, mais les méthodes nécessaires pour entreprendre une telle recherche au niveau de l'auto-immunité des malades ne sont pas disponibles et par ailleurs, on ne saurait que chercher. 



   La tuberculose est chronique chez beaucoup de malades, sans qu'on sache quel est le motif de cette persistance mycobactérienne ni la cause du réveil de la maladie. La tuberculose s'accompagne d'une immunodépression chez les patients qui se présentent pour un traitement spécifique mais les auto-anticorps potentiellement débilitants qui pourraient accompagner les phénomènes d'immunosuppression ne sont ni soupçonnés ni, a fortiori, recherchés. 



   La migraine est d'étiologie inconnue, mais la douleur de la migraine est d'origine vasculaire. Aucun modèle 

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 de pathogenèse de la migraine ne se base sur une théorie auto-immune. 



   La démonstration que les indolamines (tryptamine,   sérotonine, méthoxytryptamine, etc. ) présents dans le cerveau   peuvent être rendus immunogènes par leur couplage à des molécules porteuses, que les anticorps induits artificiellement par vaccination peuvent être détectés (Antisera against the Indolealkylamines : tryptophan, 5hydroxytryptophan, 5-hydroxytryptamine, 5-methoxytryptophan and 5-méthoxytryptamine tested by an ELISA method, M. Geffard   et al., J. Neurochemistry, 44,1221-1228 (1985) ) et que la   sérotonine a été impliquée comme médiatrice de la migraine rend plausible l'hypothèse que des auto-anticorps antiindoles peuvent être impliqués chez tous ou du moins une partie des migraineux souffrant de maux de tête. 



   Si la possibilité de créer expérimentalement des anticorps contre la sérotonine, la tryptamine et autres   dérivés   indoliques chez l'animal par injection de conjugués de ces haptènes à de l'albumine et analyse subséquente du sérum par un test ELISA pour la détection des anticorps créés, a été décrite il y a une décennie, les tests diagnostiques suffisamment sensibles pour prouver leur hypothétique existence chez des migraineux souffrant de maux de tête n'existent pas. 



   Cependant, pour arriver   à obtenir artificiellement   des anticorps dirigés contre de tels acides aminés ou des dérivés d'acides aminés, il est nécessaire de préparer un conjugué constitué par ledit acide aminé ou le   dérivé   d'acide aminé couplé à une protéine porteuse telle que la sérumalbumine bovine. 



   Pour obtenir un conjugué   immunoréactif, c'est-à-   dire un   conjugué contre lequel   il est possible d'obtenir une synthèse importante d'anticorps, il est nécessaire d'arriver à obtenir le couplage de nombreux acides aminés ou de dérivés d'acides aminés sur ladite protéine porteuse. 



   Cependant, à ce stade, il n'a pas été possible 

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 d'obtenir un tel conjugué qui soit immunoréactif et qui pourrait être utilisé dans un procédé de détection et/ou de quantification d'anticorps ou utilisé comme une composition pharmaceutique susceptible de garantir une réaction immunitaire humorale et/ou cellulaire. 



   En outre, le concept d'auto-anticorps contre des acides aminés et leurs dérivés, associés à des maladies autoimmunes, n'est pas d'actualité et représente une déviation intolérable qui gouverne ce domaine de la recherche médicale. 



  Buts de l'invention. 



   La présente invention vise à obtenir un nouveau conjugué comprenant un ou plusieurs ligands choisis parmi le groupes des acides aminés et/ou les dérivés d'acides aminés couplés à une protéine porteuse, ledit conjugué étant immunoréactif. 



   La présente invention vise également à obtenir les anticorps dirigés contre ledit conjugué immunoréactif. 



   Un autre aspect de la présente invention vise à mettre au point un procédé de détection et/ou de quantification d'anticorps présents dans un fluide corporel d'un patient, comprenant l'utilisation du conjugué et/ou des anticorps selon l'invention. 



   Un but complémentaire de la présente invention vise à obtenir une trousse de diagnostic et/ou une composition pharmaceutique comprenant ledit conjugué e :/ou lesdits anticorps selon la présente invention. 



  Eléments caractéristiques de la présente invention. 



   La présente invention concerne un conjugué immunoréactif comprenant un ou plusieurs ligand (s) choisis parmi le groupe constitué par les acides aminés et/ou les dérivés d'acides aminés comportant un groupe sulfhydryl, ledit ligand étant lié à une protéine porteuse hydrosoluble d'un poids moléculaire supérieur à 8000 KD, par un agent couplant susceptible de se fixer au groupement sulfhydryl desdits ligands. 



   Selon la présente invention, on entend par acide 

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 aminé et dérivé d'acide aminé comportant un groupement sulfhydryl, un acide aminé tel que la cystéine ou un dérivé d'un tel acide aminé tel que la N-acétyl-N-cystéine comprenant de manière native ledit groupement sulfhydryl. 



   Des   dérivés   d'acides aminés comportant un groupe sulfhydryl peuvent être des acides aminés modifiés par des produits réactionnels qui substituent un   groupement-SH   au groupement NH2 selon des méthodes bien connues de l'Homme de   l'Art.   



   Cette substitution peut par exemple être obtenue au moyen du réactif de Traut (2-iminothiolane-HCl) ou encore le   N-succinimidyl   S-acétylthioacétate. L'agent couplant utilisé dans le procédé selon l'invention est donc susceptible de se fixer au groupement-SH desdits ligands. 



   De préférence, le ligand est choisi parmi le groupe constitué par la cystéine, la N-acétyl-L-cystéine, la cystéine-NO ou la   N-acétyl-L-cystéine-NO.   



   Selon l'invention, le ligand peut également être constitué par une   indolamine   telle que le tryptophane, le 5hydroxytryptophane, la 5-hydroxytryptamine, la tryptamine, le 5-méthoxytryptophane, l'acide indoléacétique, le tryptophol, la 6-hydroxytryptamine, la 5-méthoxytryptamine, la 5,   6-dihydroxytryptamine,   la   N-acétylsérotonine,   l'acide   5-méthoxyindoléacetique,   l'acide   5-hydroxYindoléacétique,   la   mélatonine, le 5-méthoxytryptophol ou   le 5hydroxyptryptophol. 



   Les indolamines sont des métabolites présents dans le tissu mammalien issus du métabolisme de la sérotonine et sont le résultat d'actions d'enzymes telles que la monoamine oxydase et la   N-aceyltransférase.   



   Avantageusement, dans le   conjugué immunoréactif   selon la   présente invention,   la protéine porteuse est choisie parmi le groupe constitué par la gélatine, l'histone, l'albumine, la polysérine ou la thyroglobuline. 

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   D'autres protéines bien connues de l'Homme de l'Art susceptibles d'être couplées au ligand pour former le conjugué immunoréactif selon la présente invention peuvent également être utilisées. 



   Avantageusement, dans le conjugué immunoréactif selon la présente invention, l'agent couplant est choisi parmi le groupe constitué par la parabenzoquinone, la Ptoluquinone, la dichloroquinone, la chinhydrone ou la toluquinone. 



   Cependant, d'autres agents couplants capables d'êtres fixés à une protéine et susceptibles de se fixer au   groupement-SH   des ligands peuvent être utilisés. 



   De tels agents couplants peuvent être le N, N'-Ophénylènedimaléimide ou le   N-succinimidyl-3- (2-   pyridyldithio) proprionate, le succinimidyl-4- (N-maléimido-   méthyDcyclohexane-1-carboxylate   ou son sulfo-dérivé. 



   Un autre aspect de la présente invention concerne l'anticorps dirigé contre le conjugué immunoréactif selon la présente invention. 



   En effet, la Demanderesse a démontré qu'il est possible d'obtenir un conjugué immunoréactif, c'est-à-dire qu'il a une structure antigénique et/ou immunogénique, et qu'il est possible d'obtenir une réaction croisée entre ledit conjugué et un anticorps dirigé contre ledit conjugué. 



   La présente invention concerne également l'anticorps dirigé contre ledit anticorps. 



   Un autre aspect de la présente invention concerne la trousse de diagnostic comprenant le   conjugué   et/ou les anticorps selon l'invention. 



   Il est donc possible de réaliser un procédé de détection et/ou de quantification d'anticorps présents dans un fluide corporel d'un patient, lesdits anticorps étant spécifiques d'une pathologie comportant une réponse autoimmune. Selon ce procédé, on prélève le fluide corporel du patient, on fait réagir les anticorps présents dans le fluide corporel avec le conjugué selon l'invention et on détecte 

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 et/ou quantifie la réaction croisée entre ledit conjugué et lesdits anticorps dirigés contre ledit conjugué. 



   La présente invention concerne également la composition pharmaceutique comprenant la conjugué et/ou les anticorps selon l'invention. 



   Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la composition pharmaceutique selon l'invention pour la préparation d'u médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies comportant une réponse auto-immune. 



   On entend par pathologie présentant une réponse auto-immune, les maladies auto-immunes et/ou les maladies caractérisées par une infection entraînant une perturbation du système immunitaire. 



   De préférence, lesdites pathologies comportant une réponse auto-immune sont choisies parmi le groupe constitué par la sclérose en plaque, la sclérose amyotrophique latérale, l'hyperthyroidie, l'arthrite, la cirrhose, les lupus, les syndromes antiphosphatides (accidents thrombotiques, dermatites bulleuses,...), les syndromes néphrotiques, les accidents vasculaires cérébraux, la myasthénie, le cancer et/ou le syndrome   d'immuno-déficience   acquis. 



   Il est également possible d'inclure dans la définition d'une pathologie comportant une réponse autoimmune, la migraine. 



  Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention. 



   L'invention repose sur l'observation, connue depuis longtemps, que les agents infectieux induisant des désordres immunitaires ou des maladies telles que le   syndrome d'immuno-   déficience acquise ou la tuberculose, infectent les 
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 macrophages des personnes infectées et peuvent y résider y resid-- longtemps. 



   Pourtant, la mission principale de ces macrophages est l'élimination de ces agents infectieux. 

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   Il a été également pris en considération que les radicaux libres oxydants, entre autres l'oxyde nitrique   (NO),   synthétisés dans les macrophages en première réponse à une infection, sont très nocifs pour les cellules elle-mêmes et que ces radicaux sont rapidement séquestrés par un acide aminé particulier (la cystéine). 



   La cystéine est le récepteur naturel de l'oxyde nitrique et forme de la cystéine-NO. 



   De façon inattendue, la Demanderesse a découvert qu'il est possible de former des immunoconjugués de cystéine et de cystéine-NO en les couplant à une protéine porteuse telle que de la gélatine, une histone, de l'albumine ou toute autre protéine porteuse bien connue de l'Homme de l'Art, et qu'il était possible qu'un patient souffre d'affections diverses avec des anticorps qui réagissent contre cet immunoconjugué comprenant la cystéine-No ainsi que l'acide aminé naturel cystéine. Ceci a été observé dans un test ELISA où les   puits étaient sensibilisés   par le conjugué selon l'invention. Il est même apparu que les anticorps de ces patients étaient caractérisés par une réaction beaucoup plus efficace avec le conjugué selon l'invention comprenant l'acide aminé naturel (cystéine n'ayant pas fixé l'oxyde nitrique). 



   De manière inattendue, il est donc possible d'obtenir des conjugués immunoréactifs comprenant un ou plusieurs ligands choisis parmi'le groupe constitué par les acides aminés et/ou les dérivés d'acides aminés comprenant un groupe sulfhydryl, ledit ligand étant lié à une protéine porteuse par un agent couplant susceptible de se fixer au   groupement-SH dudit ligand.   



   La fixation des acides aminés ou des   dérivés   d'acides   aminés est particulièrement efficace, c'est-à-dire   qu'il est possible sur une seule protéine porteuse de fixer un grand nombre d'acides aminés ou de dérivés d'acides aminés, lorsqu'on utilise comme agent couplant la parabenzoquinone (PBQ). 

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   La parabenzoquinone est une molécule qui fut proposée comme agent couplant pour la synthèse d'immunoconjugués constitués d'un enzyme et d'un anticorps. 



  L'action couplante de PBQ porte sur une variété de radicaux présents dans les protéines et polysaccharides (groupes aminés,   sulfhydryl,-OH et-H)   mais son usage a été rapidement abandonné en raison de l'inactivation de l'activité enzymatique et immunologique des conjugués obtenus (Coupling of enzymes to antibodies and antigens, Avrameas S. et   al.,   Scand. J. Immunol. Vol 8, Suppl. 7. 7-23 (1978)). 



   L'activation d'acides aminés, entre autre la cystéine, en vue de leur conjugaison avec des protéines ou autres molécules, est réalisée communément par l'intermédiaire : 1) du carbodiimide qui active la fonction carboxylique (-COOH) d'une molécule et réagit ensuite ou en même temps avec une fonction amine (-NH2) d'une autre (ou de la même) molécule, 2) de la glutaraldéhyde qui réagit avec la fonction   - NH   d'une molécule et une   fonction-NH   d'une autre (ou de la même) molécule, ou encore 3) de l'anhydride succinique ou glutarique, maléique etc. qui attaque la   fonction'nez   libre des molécules et la prolonge en une fonction carboxylique, laquelle est ensuite activée par la carbodiimide. 



   Si une activation des fonctions carboxyliques en phase organique est envisagée, ceci est possible par   l'éthylchloroformate.   



   D'autres méthodes de couplage consistent en la substitution des amines primaires de deux molécules par un groupement liant-S-S. Ceci s'effectue   généralement   par un agent   hétérobifonctionel   dont une moitié succinimide s'implante au   niveau des-NH   d'une molécule, habituellement   les-NH de la lysine, suivi   de la libération du groupement thiol (-SH)   constituant l'autre moitié   de l'agent 

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 hétérobifonctionel couplant, par réduction (dithiothréitol ou mercaptoéthanol) d'une fonction S-S cachée, puis réaction du groupement thiol libéré dans cette molécule avec un groupe S-S caché d'une autre molecule activée par le même ou un autre agent hétérobifonctionel de même nature,

   possédant encore une moitié réactionelle S-S cachée non-réduite. 



   Le résultat de cette méthode de couplage, bien connue de l'Homme de l'Art, est la formation intermoléculaire d'un pont S-S couplant les deux molécules activées. L'agent hétérobifonctionel couplant préférentiellement utilisé pour ce type de couplage est le SPDP (N-Succinimidyl 3- (2pyridyldithio) propionate. Si une des molécules destinées à la conjugaison possède déjà une fonction-SH, le processus d'activation et de couplage par le SPDP est simplifié de moitié. 



   Une grande variété de méthodes de couplage existe, soit comme variantes de celles décrites ici, soit comme systèmes différents (par exemple libération des fonctions aldéhydiques des sucres souvent présents dans les protéines, au moyen de   Na104, puits   réaction des aldéhydes libérés avec des fonctions amines des protéines) mais la plupart, sinon toutes les méthodes décrites, incorporent d'une façon ou d'une autre un   groupement-NH,   présent sur une molécule ou l'autre, dans le processus de la conjugaison. Le plus souvent, l'aminé primaire modifiée appartent à la lysine. Même des protéines porteuses (hémocyanine, albumine) activées par une   maléimide   réactive avec des sulfhydryls, portent les fonctions maléimide uniquement greffées sur les résidus lysine de ces protéines porteuses. 



   Le mérite d'un couplage par l'intermédiaire de la parabenzoquinone réside d'abord dans le très grand nombre de sites   réactionnels   greffés sur la protéine porteuse, non limités à la fonction epsylon-amine de la lysine ou aux groupes carboxyliques, ensuite dans la simplicité de la méthode, ensuite dans la réalisation que le groupement-SH, soit naturellement présent dans certaines protéines et acides 

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 aminés et dérivés aminés, soit introduit artificiellement dans les molécules destinées au couplage, n'est pas un groupement réactionel parmi d'autres mais bien un groupement réactionel préférentiel du PBQ,

   enfin dans la réalisation que l'attachement de la cystéine ou de la N-acétylcystéine au polymère porteur par l'intermédiaire du groupement thiol n'influe pas ou peu sur les qualités immunologiques de la cystéine ou N-acétylcystéine couplées. Les acides aminés non soufrés, et leurs dérivés possesseurs d'un groupement-NH2, peuvent être utilisés tels quels et greffés au polymère porteur activé par la PBQ par l'intermédiaire de leur fonction amine mais ils peuvent aussi avantageusement être modifiés par des produits réactionels simples qui substituent un   groupement-SH   au   groupement   selon des méthodes bien connues de l'Homme de l'Art, et être ensuite couplés avec une efficacité remarquable à la protéine porteuse par l'intermédiaire de la parabenzoquinone.

   Le SPDP déjà décrit peut être utilisé pour remplacer un   groupement-NH   d'acide aminé par un   groupement-SH mais   des molécules plus simples et d'utilisation plus simple, telles le réactif de Traut (2Iminothiolane-HCl) ou encore le N-succinimidyl SAcétylthioacétate, peuvent également être utilisées, avec une grande simplicité dans la méthode de substitution. De même, outre la benzoquinone, on peut   envisager la p-toluquinone,   la dichlorquinone, la chinhydrone, la toluquinone et autres   dérivés   de la benzoquinone pour remplir le rôle d'agent couplant rempli par la benzoquinone. 



   Différents conjugués immunoréactifs selon la présente invention ont été préparés en activant différentes protéines porteuses telles que de l'albumine bovine délipidée, mais également de l'hémocyanine, des histones, de la poly-lysine ou de la   polysénne,   etc. par de la benzoquinone et en les couplant à de la cystéine, de la Nacétyl-L-cystéine, de la glutamine et de la glycine. 



   Les acides   aminés possèdent   par définition un   groupement aminé qui peut servir à leur greffage   à des 

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 polymères porteurs mais dont la modification en groupement sulfhydryl est couramment pratiquée par l'Homme de l'Art. Les réactifs les plus communément utilisés sont le réactif de Traut (2-Iminothiolane-HCl) ou encore le N-succinimidyl SAcétylthloacétate (SATA). La réaction d'addition d'un groupement sulfhydryl à une amine primaire au moyen d'un de ces deux réactifs se réalise facilement à un pH supérieur à 7. Dans le cas du SATA, la terminaison sulfhydryl est protégée et peut être facilement libérée par traitement avec de l'hydroxylamine. 



   Il est possible de : soit activer l'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé par de la benzoquinone, que cet acide soit modifié ou non par substitution d un groupement sulfhydryl à la place de l'aminé primaire, puis mettre l'acide aminé activé en contact avec le polymère porteur, soit d'activer la protéine porteuse par de la benzoquinone pour ensuite y coupler l'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, que cet acide soit modifié ou non par substitution d'un groupement sulfhydryl à la place de l'amine primaire. 



   Préférentiellement, la substitution des amines primaires d'un acide aminé par un groupement sulfhydryl est   pratiquée systématiquement.   Les deux approches décrites,   l'activation de l'haptène (acide aminé naturel ou dérivé   d'acide aminé naturel) et l'activation de la protéine porteuse, se sont révélées également valables. 



     Préférentiellement,   on activera la protéine porteuse, qui permet par son poids moléculaire élevé une élimination simple et rapide de la PBQ en excès, par filtration, chromatographie ou dialyse. 



   Une activation de la protéine porteuse par la benzoquinone a été décrite (Coupling of enzymes to antibodies and antigens, Avrameas S. et al., Scand. J. Immunol. Vol 8,   Supp1. 7. 7-23 ( : 978)). L'actlvatlon   et couplage préconisés sont : 4 mg de protéine (enzyme) plus 3 à 6 mg de PBQ à pH 

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 6 (tampon phosphate) durant 1 heure, suivi de chromatographie d'exclusion (NaCl 0,9 %), recueil de la solution colorée éluant en tête, ajout de l'anticorps (0,5 à 4 mg), ajustement du pH à 8,1 (NaHC03) ou 9,0 (tampon carbonate-bicarbonate), couplage durant 48 heures à   4  C   suivi de blockage des sites réactionnels par de la lysine à pH 7,0, élimination de la lysine par une dialyse contre un tampon pH 7,0, suivie d'une centrifugation et enfin d'une filtration stérilisante.

   Ces conditions de couplage, telles que décrites, sont inapplicables pour la conjugaison d'acides aminés et leurs dérivés à une protéine porteuse. 



   De   preférence,   la protéine porteuse, telle que l'albumine sérique, humaine ou bovine, est solubilisée à une concentration de 10 mg/ml de solution dans une solution aqueuse tamponnée à un pH acide, préférablement aux environs de pH 6. Le PBQ solubilisé à raison de 5 à 10 mg/ml dans un liquide organique (alcool, acétone ou autre solvant miscible à   l'eau)   est introduit dans la solution de protéine, en proportion variable selon les besoins de la synthèse. Une quantité, en poids, de PBQ égale au 1/50ème à l/200ème du poids de protéine est préférée lorsque la protéine est de l'albumine. La réaction a lieu à une température qui peut varier de 0 à   37  C   ou même plus, à l'obscurité, durant un minimum de 1 heure mais qui peut être prolongée aussi longtemps que désire.

   Normalement la réaction est poursuivie durant 2 heures a température ambiante, après quoi la teinte rose acquise par la solution ne s'accentue plus. 



   Après activation de la protéine porteuse par le PBQ ou par un autre constituant de la famille des quinones, le pH de la solution est rendu basique, soit par filtration, soit par dialyse soit par chromatographie d'exclusion, ce qui   élimine également le PBQ qui n'aurait   pas réagi, soit par addition d'une base.

   Le pH est amené vers 8 à   li,   5, dépendant de la constante de dissociation des groupements   réactionnels   de l'haptène destiné au couplage, pour ensuite procéder au couplage des acides aminés et de leurs   dérivés,   soit par leur 

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 fonction-NH (pH de couplage compris préférentiellement entre 9, 5 et 12) soit par la fonction-SH des acides sulfhydrylés ou de leurs dérivés sulfhydrylés   (pH   de couplage compris préférentiellement entre 8 et 10,5). 



   Les haptènes sulfhydrylés sont préférés. Les haptènes sulfhydrylés sont introduits dans la solution de polymère activé dans une proportion variable selon le couplage désiré, en fonction du poids moléculaire de l'acide aminé sulfhydrylé ou de son dérivé, par rapport au nombre de molécules de PBQ introduites sur la protéine. Un excès de molécules d'haptène est souhaitable par rapport au nombre de molécules d'agent couplant, préférablement le PBQ, introduites. Normalement, le poids de l'acide aminé ou de ses dérivés excède 4 à 5 fois le poids de PBQ introduit. La réaction de couplage est instantanée, et la coloration rose de la solution disparaît à l'ajout du dérivé sulfhydrylé. 



   L'excès de molécules hapténiques est éliminé par dialyse, chromatographie ou filtration et le conjugué est stocké   à -20 Oc Jusqu'à   son utilisation pour développer des trousses diagnostiques, développer un système d'isolation d'anticorps spécifiques par chromatographie d'affinité ou encore développer des vaccins. 



  1. Synthèse de Nocystéine et de NO-N-acétyl-L-cystéine. 



   La cystéine et la N-acétyl-L-cystéine, couplées ou non à la protéine porteuse, sont associés au-NO de la façon suivante : les produits sont acidifiés, normalement par 0,5 N ou 1 N HC1 (pour la cystéine), mais une solution de KH2P04 ou une solution d'acide succinique ou tout autre acide, peuvent également ccnvenlr pour la   N-acétyl-L-cystéine,   qui n'est pas   précipitée   par ces acides. Le nitrite de   sodi,-, m (NaNO,)   est pesé et dissous dans la solution contenant les molécules possédant un groupement sulfhydryl. Normalement, un excès de facteur 3 à 4 de molécules de nitrite est ajouté aux molécules de cystéine ou de   dérivés   de cystéine porteurs d'un groupement sulfhydryl, présents dans la solution.

   La solution acide est placée à   37'C durant   au moins 30 minutes, 

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 préferentiellement 60 minutes, pour que la liaison avec le NO puisse avoir lieu. Le pH de la solution est ensuite ramené vers la neutralité par addition d'un tampon pH 7,0 Tris ou phosphate concentré. 



  2. Sensibilisation des plaques de microtitration. 



   Les puits de plaques de microtitration, préférentiellement NUNC maxisorb, sont couverts par une solution (100 pl/puits) de NaCl 0,9 % tamponnée à pH 7,2 contenant entre 2 et 40 pg de protéine conjuguée, préférentiellement de l'albumine conjuguée durant 24 heures à 4    C.   Un tampon pH 9,6 est également adéquat, ou tout autre milieu de sensibilisation qui favorise l'adsorption de la protéine conjuguée sur le plastique des puits. Après 24 heures ou plus d'incubation, les puits sont lavés par une solution 0,   9   de NaCl ou par toute autre solution de lavage, et ensuite stockés à   4  C   avant leur utilisation dans un test ELISA de détection d'anticorps anti-haptènes. 



  3. Chromatographie d'affinité. 



   Du sépharose activé par du CNBr ou par tout autre 
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 agent couplant est disponible commercialement (Pharmacia, Uppsala, Suède). Le procédé de couplage de protéines porteuses telles que de l'albumine à cette suspension de gel de sépharose activé est connue de l'Homme de l'Art : le gel est lavé par une solution acide sur un filtre en céramique ou verre fritté, le pH de la solution de suspension du gel est   baslflé,   généralement amené à pH 7,2 ou 8. La protéine porteuse d'haptènes destinée au couplage est mélangée au gel et la réaction de couplage a lieu durant 24 heures à température ambiante. Le gel est ensuite lavé et utilisé pour l'adsorption d'anticorps   anti-haptènes   ou antigènes fixés de façon covalente sur le gel par l'intermédiaire de la protéine porteuse.

   La   reaction immunologique d'adscrption   des anticorps sur les haptènes liés au gel se fait soit en batch soit sur une colonne, à pH neutre en milieu normalement 0,9 % NaCl. L'elution des anticorps spécifiques s'effectue soit par des chactropes, soit par des solutions acides   (glycine-HCl   

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 pH 2) soit par de l'eau distillée basifiée par NH40H à pH 12. 



  Ces méthodes sont toutes bien connues de l'Homme de l'Art. 



  4. Vaccination. 



   Des oiseaux et des mammifères peuvent être vaccinés par une solution d'albumine originaire de la même espèce, à laquelle a été couplé un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé. La solution vaccinante peut être complétée par des adjuvants qui amplifieront la réaction immunologique de production d'anticorps induite par le vaccin. 



  5. Détection d'anticorps de classe IgG et de classe IgM antiN-acétyl-L-cystéine. 



   100 mg d'albumine bovine délipidée ont été mis en solution dans 5 ml d'eau contenant 5 mg de KH2P04. 5 mg de PBQ ont été mis en solution dans 1 ml de méthanol, dont 0,25 ml (1,25 mg) ont été ajoutés à la solution de protéine. 



  Après 1 heure à température ambiante et à l'obscurité, 2 ml de la solution (40 mg) ont été dilués par 2 ml d'une solution contenant 4   mg 1 ml   de KH2P04. 3H20 et 2,5 mg de N- 
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 acétyl-L-cystéine Après 30 minutes d'attente, la solution d'immunoconjugué a été amenée à pH 7, 2 par addition d'un tampon phosphate concentré. Une deuxième préparation d'immunoconjugué, constituée également de 4 ml contenant 40 mg de protéine, a été complétée par 12,5 mg de nitrite de soude et par 13 mg d'acide succinique. Après dissolution des   ingrédients ajoutés,   la solution d'immunoconjugué a été placée à   37  C   durant 1 heure.

   La solution a été ensuite ramenée vers la neutralité par addition de 110 mg de KH2P04.   3H20.   Une solution d'albumine traitée de façon identique mais avec de la glutamine au lieu d'acétylcystéine, a également été préparée. Une solution d'albumine sans haptène traitée de la même façon que les immunoconjugués a également été préparée. 



   Les immunoconjugués ont servi à fabriquer des plaques de microtitration pour la détermination de la présence d'anticorps dans un échantillon : 20 ug d'immunoconjugué par ml de solution de sensibilisation ont 

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 été préparés dans un milieu de sensibilisation constitué de NaCl 0,   dz   amené à pH 7,2 par un tampon phosphate 0,05 M. Après 18 heures d'incubation dans des puits de plaques de microtitration Maxisorb de Nunc, les puits ont été lavés par 0,9      NaCl puis incubés durant 60 minutes à 37 Oc par 100   ul   de divers sérums humains dilués au centième dans une solution NaCl 0,9   @   pH 7,2 contenant 0,2 % de tween 20.

   Après lavage par une solution tamponnée de NaCl contenant 0,1% de tween, les puits ont été recouverts durant 30 minutes par trois anticorps anti-IgG, IgA et IgM humains, marqués à la peroxydase. Après lavage, la présence éventuelle de peroxydase, proportionnelle à la présence d'anticorps spécifiques pour les haptènes ou pour l'albumine sensibilisant les puits, a été   déterminée   par une réaction enzymatique colorée basée sur le peroxyde d'hydrogène en présence de tétraméthylbenzidine. La réaction enzymatique produit une coloration bleue qui vire au jaune après addition d'une solution d'arrêt acide (0,5   NHSO).   L'absorbance obtenue est mesurée à 450 nm. Les résultats sont donnés dans le tableau 1, pour cinq sérums numérotés de 1 à 5. 



   Tableau 1 
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<tb> 
<tb> Albumine <SEP> NO-N-acétyl-N-acétyl-Lcystéine <SEP> cystéine
<tb> IgG <SEP> IgM <SEP> IgA <SEP> IgG <SEP> IgM <SEP> IgA <SEP> IgG <SEP> IgM <SEP> IgA
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0,56 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0,28 <SEP> 0, <SEP> 45
<tb> 2 <SEP> 0,57 <SEP> 0,42 <SEP> 0,46 <SEP> 0,49 <SEP> 0,31 <SEP> 0,44 <SEP> 0,36 <SEP> 0,30 <SEP> 0,44
<tb> 3 <SEP> 0,78 <SEP> 0,33 <SEP> 0,45 <SEP> 0,77 <SEP> 0,31 <SEP> 0,40 <SEP> 0,70 <SEP> 0,30 <SEP> 0,40
<tb> 4 <SEP> 0,30 <SEP> 0,23 <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> l, <SEP> 51 <SEP> 0,25 <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> l, <SEP> 44 <SEP> 0,24 <SEP> 0, <SEP> 48
<tb> 5 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 0,48 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 1, <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 1, <SEP> 33 <SEP> 0,

   <SEP> 31
<tb> 
 
Les résultats obtenus avec le contrôle glutamine étaient similaires au contrôle albumine et ne sont pas donnés ici, par souci de clarté. On voit que le serum 4 est positif en IgG pour la N-acétyl-L-cystéine (NAC), légèrement plus positif en présence de NAC-NO, tandis que le sérum 5 est positif en IgM, peur les mêmes haptènes. 

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   6. Mesure de la   spécificité   de la réaction immunologique. 



   Une vérification de la spécificité de la réaction immunologique a été effectuée par une réaction de compétition. Le sérum 4, réagissant immunologiquement avec la N-acetyl-L-cystéine immobilisée mais pas avec l'albumine, a été mis en contact en solution avec le même haptène couplé à de l'albumine, en concentrations décroissantes. La concentration de l'immunoconjugué, basé sur le poids de l'albumine porteuse, a été variée de 100   ug/ml   à zéro, par dilutions de moitié, puis diluées de moitié avec une solution contenant l'anticorps anti-N-acetyl-cystéine. Les mélanges 
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 réactionnels ont été placés à 37  C. Après 30 minutes d'incubation à 37  C, les différents échantillons de sérum adsorbé ont été analysés pour la présence d'anticorps anti-Nacétyl-cystéine résiduels.

   Les résultats sont assemblés dans le tableau 2. 



   Tableau 2 
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<tb> 
<tb> Immunoconjugué <SEP> Absorbance
<tb> (ng/ml) <SEP> 450 <SEP> nm
<tb> 50 <SEP> 0,42
<tb> 25 <SEP> 0,68
<tb> 12,5 <SEP> 0,98
<tb> 6,75 <SEP> 1,22
<tb> 3,375 <SEP> 1,42
<tb> 1, <SEP> 65 <SEP> 1, <SEP> 55
<tb> 0,825 <SEP> 1, <SEP> 60
<tb> 0 <SEP> 1, <SEP> 75
<tb> 
 
On voit que l'incubation du serum 4 en présence d'haptène durant 30 minutes à 37 OC avant l'analyse ELISA, réduit considérablement l'adsorbance obtenue, et ce de façon proportlonelle à la concentration de l'immunoconjugué en solution, indiquant une inhibition spécifique de la réaction immunologique par l'NAC en solution. 

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  7. Interférence immunologique due à la cystéine libre. 



   Une analyse de la spécificité de la réaction immunologique de l'anticorps IgG anti-N-acétyl-L-cystéine a été effectuée avec de la cystéine libre, en suivant le même protocole que dans l'exemple 2. Les résultats sont assemblés dans le tableau 3. 



   Tableau 3 
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<tb> 
<tb> Cystéine <SEP> libre <SEP> Absorbance
<tb> (ug/ml) <SEP> 450 <SEP> nm
<tb> 10 <SEP> 1,51
<tb> 5 <SEP> l, <SEP> 59
<tb> 2,5 <SEP> 1,65
<tb> 1,25 <SEP> 1,68
<tb> 0,625 <SEP> 1,72
<tb> 0,312 <SEP> 1,73
<tb> 0, <SEP> 156 <SEP> 1, <SEP> 76
<tb> a <SEP> 1, <SEP> 77
<tb> 
 
On voit que le même phénomène d'inhibition de la réaction immunologique de l'anticorps avec l'haptène Nacétyl-L-cystéine fixé sur les plaques observé dans l'exemple 2 avec des serums incubés en présence d'NAC-albumine libre, s'observe également lorsque l'anticorps est incubé préalablement durant 30 minutes à 37   Oc en   présence de cystéine libre. La relation directe observée entre la dose de cystéine et   l'Lnhibition   provoquée plaide fortement en faveur d'une inhibition spécifique.

   L'inhibition observée est beaucoup moins prononcée que celle obtenue avec la N-acétylL-cystéine couplee à l'albumine, indiquant que les anticorps sont plus spécifiques pour la   N-acétyl-L-cystéine mais   présentent une interférence avec la cystéine. L'isolation et la   purification de ces anticorps devraient permettre   un traitement different de sujets souffrant de syndromes   d'immunodéflclence.   

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 8. Analyse de la spécificité des anticorps IgG et IgM envers la cystéine et le-NO. 



   Il est connu que les gammaglobulines peuvent être dégradées par la cystéine à pH basique. Il est également connu que non seulement des agents réducteurs tels la cystéine mais également des oxydants dégradent les gammaglobulines. Il reste à exclure la possibilité que la cystéine et le NO interfèrent avec la réaction immunologique. 



  Une analyse a été effectuée sur un sérum IgG et un serum IgM trouvés positifs dans un test ELISA pour le N-acétyl-Lcystéine-NO couplé à de l'albumine ainsi que sur un serum IgG positif pour un antigène tuberculeux. L'analyse sur un anticorps antituberculeux permet de vérifier de façon indépendante les possibles interférences dues à l'utilisation d'agents réducteurs (cystéine et NAC) et oxydants   (NO).   Le contrôle interne de la spécificité de la réaction immunologique a été   réalisé   en testant la réaction immunologique en présence de cystine (forme réduite de la cystéine) et de   NAIN02   activé à pH acide de la même façon que la cystéine et le N-acétyl-cystéine (NAC) mais en l'absence de ces récepteurs.

   Une deuxième expérience a été ensuite effectuée pour confirmer et compléter les observations interessantes acquises lors de la première analyse. Les deux analyses ont été conduites comme dans les exemples 2 et 3, c'est-à-dire que des haptènes libres presents dans une solution à des concentrations décroissantes ont été mis en contact avec des sérums trouvés positifs (en IgG ou en IgM) dans un test sérologique ELISA pour l'haptène NAC ou pour un antigène tuberculeux. Les haptènes compétitifs mis en contact en solution avec les anticorps IgG et IgM 
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 anti-N-acétyl-cystéine et IgG anti-tuberculeux étaient la cysine, le NaNO acidifié puis ramené à pH neutre, la cystéine, la cystéine-NO, l'acétyl-cystéine, l'acétylcystéine-NO, et   l'acétyl-cystélne-NO   couplé à de l'albumine.

   Après 30 minutes d'incubation à 37    C,   les solutions contenant les haptènes libres et les anticorps ont été 

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 analysés pour la présence résiduelle d'anticorps anti-NAC ou anti-tuberculeux. Les résultats de ces deux analyses sont donnés dans le tableau 4. 



   Tableau 4 
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<tb> 
<tb> Concentration <SEP> finale <SEP> (ug/ml) <SEP> en <SEP> haptènes <SEP> et <SEP> en <SEP> NACalbumine <SEP> compétitifs <SEP> libres
<tb> 50 <SEP> 25 <SEP> 12,5 <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> Sérum <SEP> positif <SEP> IgG
<tb> lèse <SEP> expérience
<tb> L-cystine <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 0,88 <SEP> 0,83 <SEP> 0,87 <SEP> 0,84
<tb> HNO2 <SEP> 0,77 <SEP> 0,85 <SEP> 0,84 <SEP> 0,86 <SEP> 0,84
<tb> L-cystine <SEP> 0,65 <SEP> 0,68 <SEP> 0,70 <SEP> 0,84 <SEP> 0,84
<tb> L-cystéine-NO <SEP> 0,84 <SEP> 0,84 <SEP> 0,85 <SEP> 0,86 <SEP> 0,84
<tb> NAC <SEP> 0,27 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0,27 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 0,84
<tb> NAC-albumine <SEP> 0,36 <SEP> 0,40 <SEP> 0,69 <SEP> 0,65 <SEP> 0,84
<tb> 2eme <SEP> expérience
<tb> NAC <SEP> 0,23 <SEP> 0,38 <SEP> 1, <SEP> 15
<tb> NAC-NO <SEP> 0,22 <SEP> 0,37 <SEP> 1,07
<tb> Cystine <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP> 1,12 <SEP> 1,

  29
<tb> Cystine-NO <SEP> 1,22 <SEP> 1,21 <SEP> 1,29
<tb> Sérum <SEP> positif <SEP> IgM
<tb> lyre <SEP> expérience
<tb> L-cystine <SEP> 1, <SEP> 49 <SEP> 1, <SEP> 52-1, <SEP> 44 <SEP> 1,61
<tb> HAN02 <SEP> 1,55 <SEP> 1,45 <SEP> 1, <SEP> 49 <SEP> 1,51 <SEP> 1, <SEP> 50
<tb> L-cystine <SEP> 1,45 <SEP> 1,43 <SEP> 1, <SEP> 42-1, <SEP> 37
<tb> L-cystine-NO <SEP> 1, <SEP> 54 <SEP> 1,55 <SEP> 1,50 <SEP> 1,48 <SEP> 1, <SEP> 59
<tb> NAC <SEP> 1,46 <SEP> 1,44 <SEP> 1,40 <SEP> 1,52 <SEP> 1,52
<tb> NAC-albumine <SEP> 1,45 <SEP> 1,47 <SEP> 1,50 <SEP> 1, <SEP> 55 <SEP> 1,50
<tb> 2"'expérience
<tb> NAC <SEP> 1,61 <SEP> 1,76 <SEP> 1,88
<tb> NAC-NO <SEP> 1,51 <SEP> 1,77 <SEP> 1,89
<tb> Cystine <SEP> 1,53 <SEP> 1,58 <SEP> 1,84
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 22> 

 
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<tb> 
<tb> Cystine-NO <SEP> 1, <SEP> 70 <SEP> 1, <SEP> 74 <SEP> tl,

   <SEP> 83
<tb> Sérum <SEP> positif <SEP> IgG <SEP> TUB
<tb> L-cystine <SEP> 1, <SEP> 12 <SEP> 1,07
<tb> HAN02 <SEP> 1, <SEP> 04 <SEP> 1,04
<tb> L-cystine <SEP> 1,07 <SEP> 1, <SEP> 02
<tb> L-cystine-NO <SEP> 1,07 <SEP> 1,02
<tb> NAC <SEP> 1, <SEP> 11 <SEP> 1, <SEP> 00
<tb> NAC-albumine <SEP> 1,06 <SEP> 1, <SEP> 00
<tb> 
 
Cette analyse apporte plusieurs informations, entre autres : ni la cystine, ni le   HAN02   dans les conditions d'applications de l'analyse immunologique n'influent sur le résultat. Le NAC attaché à l'albumine est un inhibiteur efficace, compte tenu de sa concentration réduite, par rapport à la molécule NAC utilisée libre. L'anticorps IgG est plus susceptible à l'inhibition que l'anticorps IgM. 



  L'inhibition provoquée par la molécule NAC libre est plus efficace que celle due à la molécule cystéine libre. Le NO réduit l'inhibition due à la cystéine mais n'atteint pas celle due à la NAC. 



  9. Analyse des   IaM   d'une population de malades souffrant de sclérose en plaques (SEP). 



   Une analyse des IgM de personnes ne souffrant pas de maladies (tests de grossesse, accidents de la route, etc) versus malades souffrant de sclérose en plaque est donnée dans l'histogramme 1. Les absorbances observées pour la Nacétyl-L-cystéine sont normalisées versus les adsorbances observées dans la trousse contrôle (albumine-glutamine). On voit qu'un seul sujet sain possède des anticorps légèrement au dessus de la norme, que la moyenne (0, 3 ; obtenue pour la population saine est significativement différente de la moyenne établie chez les SEP (0,5), avec un malade spectaculairement positif.

Claims (11)

REVENDICATIONS.

1. Conjugué imunoréactif comprenant un ou plusieurs ligand (s) choisi (s) parmi le groupe constitué par les acides aminés et/ou les dérivés d'acides aminés comprenant un groupe sulfhydryl, ledit ligand étant lié à une protéine porteuse hydrosoluble, d'un poids moléculaire supérieur à 8000 KD par un agent couplant susceptible de se fixer au groupement sulfhydryl desdits ligands.

2. Conjugué immunoréactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est contitué par la cystéine, la N-actéyl-L-cystéine, la cystéine-NO ou la Nacétyl-L-cystéine-NO.

3. Conjugué immunoréactif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine porteuse est choisie parmi le groupe constitué par la gélatine, l'histone, l'albumine, la polysérine ou la thyroglobuline.

4. Conjugué immunoréactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent couplant est choisi parmi le groupe constitué par la parabenzoquinone, la P-toluquinone, la dichloroquinone, la chinhydrone ou la toluquinone.

5. Anticorps dirigé contre le conjugué immunoréactif selon l'une quelconque des revendications précédentes.

6. Anticorps dirigé contre l'anticorps selon la revendication 5.

7. Trousse de diagnostic comprenant le conjugué selon l'une quelconque des revendications l à 4 et/ou un anticorps selon la revendication 5 et/ou 6.

8. Composition pharmaceutique comprenant le conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou un anticorps selon la revendication 5 et/ou 6.

9. Procedé de détection et/ou de quantification d'anticorps spécifiques d'une pathologie comportant une réponse auto-immune, présent dans un fluide corporel d'un patient, caractérisé en ce que l'on prélève le fluide <Desc/Clms Page number 24> corporel du patient, en ce que l'on fait réagir les anticorps présents dans ce fluide corporel avec le conjugué immunoréactif selon les revendications 1 à 4 et en ce que l'on détecte et/ou quantifie la réaction croisée entre lesdits anticorps et le conjugué.

10. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 8 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de pathologies comportant une réponse auto-immune.

11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que les pathologies comportant une réponse auto-immune sont choisies parmi le groupe constitué par la sclérose en plaque, la sclérose amyotrophique latérale, l'hyperthyroidie, l'arthrite, la cirrhose, les lupus, les syndrômes antiphosphatides, les syndrômes néphrotiques, la myasthénie, le cancer et le syndrôme d'immuno-déficience acquis.