BE1013881A6 - Fractions de ldl oxydees, procede d'obtention et utilisation a but diagnostique ou therapeutique. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des compositions constituées d'une ou plusieurs fractions de lipoprotéines de faible densité (LDL, Low density Lipoproteins) obtenues par oxydation in vitro de LDL natives par le peroxyde d'hydrogéne ou le couple glucose/glucose-oxydase, en présence de myéloperoxydase. ces compositions sont obtenues par chromatographie, en particulier par chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) et sont purifiées par immunoaffinité. Des anticorps monoclonaux dirigés contre les fractions B et C/D de LDL oxydées ont été isolés et utilisés dans un but diagnostique par exemple pour le dosage de LDL oxydées ou des autoanticorps correspondants, ou pour l'étude de la sensibilité à l'oxydation des LDL natives chez des patients. Ces anticorps peuvent également être utilisés pour traiter le sang ou des fractions de sang d'un patient et en retirer une fraction de LDL oxydées, par exemple sur une colonne d'immunoabsorption, avant d'être retouné au patient

Description

Fractions de LDL oxydées, procédé d'obtention et utilisation à but diagnostique ou thérapeutique.

La présente invention concerne l'utilisation de myéloperoxydase pour l'obtention de lipoprotéines oxydées et des anticorps monoclonaux correspondants, les nouveaux anticorps monoclonaux ainsi obtenus, les lignées productrices de ces anticorps et l'utilisation de ces anticorps et lignées, un test diagnostique notamment pour la détermination du risque cardio-vasculaire ainsi que des kits d'application diagnostique.

La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme présente dans les neutrophiles et monocytes, apte à catalyser des réactions d'oxydation dans l'espace sous-endothélial. Il est bien connu que cette oxydation fait intervenir, à partir de peroxyde d'hydrogène et de chlorure, l'acide hypochloreux produit en présence de la MPO.

Par ailleurs on sait que les lipoprotéines de faible densité (Low Density Lipoprotein, LDL), sous forme oxydées, sont impliquées dans certaines affections cardiovasculaires, en particulier l'athérosclérose. On a ainsi rapporté la présence de LDL modifiées par l'acide hypochloreux dans des lésions athéromateuses.

Le test basé sur ces lipoprotéines actuellement utilisé pour définir la propension d'un patient donné à développer des maladies cardiovasculaires fait appel à un agent pro-oxydant très puissant et non physiologique, le sulfate de cuivre (CuSCu) . Ce test est toutefois peu précis et se déroule dans des conditions très éloignées des conditions in vivo.

Le document de brevet PCT/BE98/59248 divulgue un procédé d'immuno-détection de LDL oxydée par la malondialdéhyde (MDA) et des anticorps associés. L'oxydation ne simule cependant pas de manière optimale le processus naturel.

Un des buts de la présente invention est de proposer un test diagnostique capable d'identifier des critères permettant une détection plus précise et plus précoce des patients à risque, en se référant à un processus oxydatif des LDL survenant in vivo.

La mise au point de ce test a fait intervenir une myéloperoxydase. On peut en particulier utiliser une myéloperoxydase recombinante humaine aux propriétés identiques à celles de la myéloperoxydase naturelle.

La présente invention propose également des anticorps rnonoclonaux, avec les hybridomes correspondants, capables de reconnaître des fractions spécifiques de lipoprotéines oxydées par la myéloperoxydase, et donc d'être utilisés pour 1'immunodétection et le dosage de ces lipoprotéines oxydées. Pareil dosage peut avantageusement refléter un facteur de risque cardio- vasculaire.

Selon un aspect de l'invention, on propose de manière générale un test pour la détermination du risque cardio-vasculaire d'un patient par la mesure du taux plasmatique de LDL oxydées comprenant les étapes suivantes qui seront explicitées ultérieurement : - fixation d'un anticorps monoclonal anti-fraction B sur une plaque - extraction des LDL oxydées du plasma par adsorption sur l'anticorps monoclonal

- reconnaissance des LDL fixées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-apoB

- révélation par un marqueur qui peut être par exemple un anticorps de détection, p.e. si l'anticorps polyclonal ant.i.apo-B est un anticorps de lapin, un anticorps de chèvre anti-IgG(Fc) de lapin couplé à la phosphatase alcaline - détermination de la concentration en LDLox.

Selon un autre aspect de l'invention, on a constaté que la vitesse d'oxydation des LDL constitue une méthode prometteuse pour définir la propension d'un patient donné à développer des maladies cardiovasculaires. Comme déjà évoqué, un des principaux facteurs intervenant à un stade précoce dans la formation de la lésion d'athéromatose est la peroxydation des LDL. Comme les LDL oxydées (oxLDL) sont très rapidement captées par les macrophages de la paroi artérielle, la mesure de leur concentration seule pourrait n’être pas représentative de leur production in vivo. Par contre, la susceptibilité des LDL, d'un sujet donné à subir des dommages peroxydatifs peut être évaluée par un test in-vitro.

Selon encore un autre aspect de l'invention on propose un test basé sur la détection d'auto-anticorps naturels dans le plasma, dirigés contre des LDL oxydées naturellement par la myéloperoxydase

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

L'invention est décrite plus en détail en se référant à des modes particuliers de réalisation décrits ci-après.

Un des buts de l'invention est de proposer des anticorps spécifiquement dirigés contre certaines sous-fractions de LDL oxydées par une myéloperoxydase.

On décrit ci-après l'obtention de myéloperoxydase, l'oxydation de LDL, la séparation des fractions obtenues, la production d'hybridomes et la production d'anticorps spécifiques aux fractions oxydées, ainsi que l'utilisation de ces anticorps pour la détection et le dosage de LDL oxydée dans un but diagnostic.

1, Production de la myéloperoxydase

La myéloperoxydase peut être produite à partir du clone CHO producteur de la myéloperoxydase recombinante MPOr. Le clone qui a été utilisé dans le cadre de la présente invention est le clone 24-1-7-57 et a été mis en culture Opticell (Charles River). Dans ce système les cellules adhèrent à un support de céramique (Opticore) de 4.500 cm2 de surface et le milieu de culture est perfusé en continu. Plusieurs paramètres sont contrôlés en permanence: le pH, la température, la teneur en oxygène, en CO2, et la concentration en glucose.

Chaque jour, les concentrations du milieu en lactate et en glucose sont mesurées ainsi que l'activité peroxydasique due à la myéloperoxydase synthétisée et sécrétée dans le milieu.

La culture peut être maintenue pendant 2 mois. Le maximum de production se situe aux environs de 30 jours. Tous les 3 jours environ, l'entièreté du milieu de culture est récoltée, centrifugée et conservée.

Alternativement, les cellules peuvent être maintenues en culture en « cell factory », le surnageant de culture étant aussi récolté tous les 3 jours, et la culture pouvant être maintenue 2 mois.

Avant chaque purification, il est nécessaire de purifier les surnageants de culture afin d'en éliminer les débris cellulaires. A cette fin, un système de filtration composé d'une pompe péristaltique à haut débit (Watson Marlow 505 s) et d'un filtre tangentiel (Ultrasette, Filtron) ont été utilisés.

Cet appareillage permet la filtration et la concentration simultanées de surnageant de culture avant le dépôt sur la colonne. Après une concentration de 10 fois, le surnageant est dilué environ 2 fois jusqu'à atteindre la résistivité de 4mS/cm, équivalente à celle du tampon d'équilibrage de la colonne. Aucune perte en MPO n'a été détectée dans le filtrat analysé par Western blot, et par contre par ELISA, une perte d'environ 0.7% y a été relevée.

Ce système de filtration tangentielle s'avère donc extrêmement utile et fiable pour le traitement de grands volumes de surnageant de culture à purifier.

A chaque purification, environ 10 1 de surnageant de culture filtrés, concentrés et équilibrés au niveau du pH et de la force ionique sont déposés sur une colonne de Q Sepharose Fast Flow (10 cm x 20 cm, 1570 ml de gel) équilibrée en tampon de phosphate 20 mM pH 7.5. Cette colonne échangeuse d'anions, retenant les contaminants -principalement les protéines sériques, est directement connectée à une colonne de CM-Sepharose (3,5 cm x 15 cm), échangeuse de cations sur laquelle la MPOr est retenue et est éluée à l'aide d'un Gradient de NaCl de 0 à 0.6 M (900 ml). La MPOr est décrochée à la concentration d'environ 0.28 M NaCl et sort sous forme d'un pic protéique unique. L'activité peroxydasique est parfaitement superposable au pic mesuré à 280 nm.

L’analyse de la pureté des fractions éluées a été réalisée par électrophorèse sur gel en conditions non réductrices et en présence de SDS. A la coloration au bleu de Coomassie, 2 bandes de 84 et 94 kDa apparaissent. Cette seconde bande de 94 kDa est immunoréactive comme celle de 84 kDa et correspond à une fraction mineure de la MPO.

Les fractions ont été dosées pour la concentration en protéines (dosage de T.owry) et en activité peroxydasique (o-dianisidine comme substrat), et de chloration (avec le monochlorodimédon comme substrat). La fraction la plus active correspond au sommet du pic d'élution.

Selon les analyses des sucres déjà effectuées, les deux bandes de 84 et 94 kDa correspondent à des formes de proMPO exposant des degrés de glycosylation différents. La bande de 84 kDa correspondrait majoritairement à la protéine exposant des chaînes glysosylées riches en mannose, tandis que la forme de 94 kDa présenterait des chaînes de glycosylation complexe, allant jusqu'à l'acide sialique.

A partir de 80 1 de surnageant de culture, 370 mg de MPO pure ont été obtenus, soit environ 4,5 mg/1. La MPO recombinante apparaît sous forme de 2 bandes de 84 et 94 kDa, ayant la même séquence protéique, mais différant par la nature de leurs glycosylations.

Production de sous-fractions de LDL oxydées par la myéloperoxydase

Les altérations oxydatives pouvant survenir au niveau des LDL sont principalement de deux types, d'une part la peroxydation des lipides et d'autre part des modifications oxydatives au niveau de l'apoB. L'un des modèles utilisé le plus couramment pour déclencher une oxydation des LDL in vitro est basé sur l'utilisation du cuivre (Cu++) comme agent oxydant (Esterbauer et al.). Ce modèle évalue au cours du temps l'augmentation des produits de dégradation des composants lipidiques des LDL et renseigne principalement sur le statut en antioxydant de ces lipoprotéines. Cependant, 1'utilisation du Cu++ comme agent pro-oxydant reste très controversée étant donné que son implication au niveau des pathologies cardiovasculaires n'a pas été démontrée de façon formelle. Par contre, d'autres agents oxydants tels que l'acide hypochloreux, généré par la MPO, semble bien figurer parmi les principaux initiateurs de la formation des cellules spumeuses et donc dans le développement de plaques d'athérome. En effet, l'implication de la MPO dans l'oxydation in vivo et dans la pathogénie des maladies cardio-vasculaires est fortement suggérée par la présence de MPO et de dérivés oxydés de la tyrosine, notamment la dityrosine ou encore la 3-chlorotyrosine, dans les lésions athéromateuses. La MPO utilise en fait le peroxyde d'hydrogène (H202) comme substrat pour oxyder les halogènes tels que le chlore, permettant ainsi la formation d'acide hypochloreux, agent très toxique et microbicide. Il est important de noter que, contrairement au cas des ions métalliques, les dégâts oxydatifs engendrés par la MPO concernent principalement les protéines et particulièrement 1'apoprotéine B dans le cas des LDL.

2. Conditions d'oxydation des LDL

Afin d'illustrer l'aspect de l'invention basé sur des altérations de LDL engendrées par la MPO, l'apport du substrat peroxyde d'hydrogène a été effectuée suivant deux voies : production progressive de peroxyde d'hydrogène dérivant de la transformation du glucose par la glucose-oxydase d'une part, ajout direct de peroxyde d'hydrogène dans le milieu d'oxydation d'autre part.

Les conditions d'oxydation à la MPO sont les suivantes :

- Système MPO/Glucose-oxydase 27 8 mg p-rot. LDL

40 U MPO (unités peroxidasiques, avec 1'o-dianisine comme substrat)

4U glucose-oxydase 90 min à 30°C

- Système MP0/H202 1,6 mg prot. LDL

8 U MPO 1 mM H202 5 min à 37°C

La séparation des sous-fractions de LDL oxydées peut être effectuée en utilisant une chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q. Les différentes sous-fractions de l'oxydation présentent en effet des charges électronégatives en fonction de leur degré d'altération.

On a constaté que des fractions (A, B, C ... ) peuvent ainsi être éluées de la colonne en utilisant des tampons contenant des concentrations croissantes en NaCl.

Après optimalisation des conditions d'élution, les coefficients de variation obtenus pour les différentes fractions de LDL oxydées ont montré une bonne reproductibilité de la technique utilisée (CV<5 % pour des pics majoritaires).

La Fig. 1 illustre l'excellente séparation des fractions oxydées B, C et D obtenues avec allongement des plateaux salins correspondant au passage des fractions.

Les résultats de FPLC montrent clairement que les dégâts oxydatifs liés à la MPO surviennent dans les 5 premières minutes quelque que soit le système oxydatif (glucose/ glucose oxydase ou H202) .

Les Figs. 2a et 2b illustrent la cinétique d'apparition des fractions oxydées avec le peroxyde d'hydrogène (MP0/H202) pour des concentrations d'H202 respectivement de 179 et 40 μΜ.

Caractérisation des sous-fractions de LDL oxydées Electrophorèse sur gel

Les électrophorèses pratiquées après un stress oxydatif montrent que les dégâts causés par le système MPO/Glucose-oxydase consistent surtout dans des fragmentations de la protéine apoB alors que le système MP0/H202 donne principalement lieu à des agrégations.

Dans le système MPO / glucose-oxydase, on constate une diminution de la proportion en acides gras polyinsaturés au niveau des phospholipides de la fraction D par rapport à la fraction native.

Altération de la composition en acides gras

Les fractions oxydées obtenues par le système MPO/H202 ne montrent, quant à elles, aucune modification significative de la composition en acides gras. Ces résultats indiquent que l'oxydation induite par la glucose-oxydase cause des dégâts peroxydatifs au niveau des acides gras polyinsaturés des LDL, ce qui n'est pas le cas pour le système MPO/H202.

On ne note pas de différences de composition au niveau des esters de cholestérol, ni des triglycérides dans les 2 systèmes d'oxydation.

On a constaté que les fractions issues de l'oxydation par le système MPO/ Glucose-oxydase sont le résultat d'une attaque de la MPO suivie de diverses réactions radiculaires tandis que les fractions dérivant de l'oxydation par le système MPO/H202, semblent être tout-à-fait spécifiques d'une attaque par la MPO.

Ce dernier système sera donc préféré pour la réalisation de 1'invention.

3. Production des anticorps monoclonaux

Les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps monoclonaux de la présente invention sont constitués par les différentes fractions oxydées des LDL, plus particulièrement cependant contre la fraction B.

Les LDL de patients semblant s'oxyder plus rapidement que celles de sujets normaux, un des buts de l'invention est de pouvoir différencier les fractions très oxydées (fractions C et D) de fractions pas ou peu oxydées (fractions A et B) afin de pouvoir déterminer quantitativement la présence de la fraction B.

L'invention concerne également les hybridomes utilisables pour la production des anticorps.

Les hybridomes sont obtenus par exemple par fusion de cellules de myélome non sécrétrices P3 x 3Ag8.653 (ATCC CRL-1S80) avec les cellules spléniques de la souris immunisées, en présence de polyéthylène glycol 4.000.

Les cellules fusionnées sont réparties dans des boîtes de 96 puits préincubées avec des macrophages péritonéaux de souris en présence d'un milieu de sélection contenant de 1'hypoxantine, aminoptérine et thymidine. Le milieu est remplacé au jour 7 par un milieu non sélectif. Deux semaines après la fusion, les surnageants des clones sont criblés pour la présence d'anticorps spécifiques sur chacune des fractions A à D de LDL oxydées, ainsi que sur la MPO.

Dans ce test, l'antigène purifié (fraction de LDL oxydée) est fixé sur la plaque et le surnageant, seul ou en compétition avec une fraction purifiée, est déposé sur la plaque. L'anticorps fixé est ensuite révélé par un 2ème anticorps dirigé contre les IG de souris et couplé à la phosphatase alcaline.

On a ainsi pu obtenir deux anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement des LDL altérées par la MPO. L'un reconnaît la sous-fraction B, l'autre reconnaît la sous-fraction C et la sous-fraction D.

Au vu de la caractérisation des fractions obtenues par les deux systèmes d’oxydation ( H2O2, glucose oxydase), les deux anticorps reconnaissent des épitopes différents.

En effet, l'anticorps anti-fraction B reconnaîtrait une altération précoce engendrée principalement par 1’HOCl alors que l’anticorps anti-fraction C/D serait dirigé contre des dégâts engendrés non seulement par l'HOCl mais aussi par d'autres réactions et/ou réarrangements radicalaires obtenus par l'oxydation due au système MPO-glucose oxydase. Avec le système MPO/H2C>2 on n'observe pas de fraction D.

Production d’anticorps monoclonaux de spécificité anti-fraction B

Un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope peu oxydé des LDL (fraction B) a été caractérisé. Les souris ont été immunisées selon le même protocole que précédemment, à la différence que l'antigène B a été injecté en présence d'hydroxyde d'aluminium. Cette fraction B a été oxydée à l'aide de MPO en présence d'H202. Quatre hybridomes AG9, AE2, EB2 et EF2 sécréteurs d'anticorps monoclonaux dirigés contre la fraction B des LDL ont été obtenus.

Les surnageants des sous-clones de AE2, AG9, EB2 et EF2 ont été testés non seulement pour leur spécificité antigénique contre les différentes fractions mais aussi pour leur appartenance aux différentes classes et sous-classes d'immunoglobulines. Ces clones sont de classe IgG et de sous-classe IgGl, la chaîne légère est de type K. Ces hybridomes sécrètent des anticorps monoclonaux de spécificité dirigée contre la fraction B oxydée par la rMPO. Trois hybridomes sécréteurs ont été adaptés progressivement à la culture sans sérum en milieu hybridoma SFM (Life Technologies).

Les surnageants de ces 3 hybridomes sécréteurs ont été purifiés par passage sur une colonne de Protéine A-Sepharose CL-4B conditionnée en PBS à pH 8. L'élution a été réalisée en acide citrique 0,1M à différents pH, (6,5 IgGl - 4,5 IgG2a - 3 IgG2b).

Production des IgG monoclonales spécifiques de la fraction B

c^one mg totaux AG948F4A2 Fraction 1 1, 3 mg

Fraction 2 2,6 mg EB2E9G62IH2 4,53 mg EB2G3G2 2,6 mg

La reconnaissance de l'antigène fraction B oxydée par les 3 anticorps monoclonaux est très semblable et est illustrée à la FIG. 3 (antigène Box)

Le tableau suivant présente les caractéristiques de quelques anticorps monoclonaux isolés dans le cadre de la présente invention.

4. Test ELISA des LDL naturellement oxydées circulantes dan^ le plasma

Des tests ELISA mesurant les LDL oxydées par la MPO dans la circulation ont ainsi été développés dans le cadre de la présente invention.

Ces tests ne faisant pas appel à un oxydation ex vivo des LDL (constituant une phase très délicate), il est envisageable de réaliser ce test en routine.

Un des tests selon une mise en oeuvre de l'invention peut se résumer de la façon suivante : - fixation de l'anticorps monoclonal anti-fraction B sur la plaque - extraction des LDL oxydées du plasma par adsorption sur l'anticorps monoclonal

- reconnaissance des LDL fixées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-apoB

- révélation par un anticorps de détection - détermination de la concentration en LDLox dans l'échantillon grâce à une gamme standard de la fraction B de LDL oxydées par la MPO et isolées par FPLC (fraction Box )

Pour confirmer la faisabilité du test selon l'invention, le standard de la fraction (Box) de LDL oxydées a été appliqué à des concentrations croissantes (de 0 à 24 pg de protéine par puits). Les 3 anticorps monoclonaux (EB2E9G621H2, EB2-g3g2 et AG948F4A2) reconnaissant la fraction B oxydée ont été testés.

Les résultats montrent une bonne réponse des 3 anticorps vis-à-vis des concentrations croissantes de standards, linéaire dans une première phase et atteignant un plafond pour les concentrations plus élevées. Ce plateau peut être expliqué par la limite supérieure de détection du test et/ou par une perturbation due à la présence de NaCl dans la fraction Box (plus importante lorsque la concentration en Box augmente). Chaque courbe a été reproduite plusieurs fois avec la même fraction Box et montre une bonne reproductibilité.

Cependant, des fractions Box dérivant de deux oxydations différentes ne génèrent pas des courbes standards identiques. En fait, la séparation par FPLC permet une séparation en fonction de la charge électrique, mais ne renseigne pas sur la nature chimique de l'épitope. Afin

O

d'obtenir un standard pur de fraction Box reconnue spécifiquement par les monoclonaux, selon l'invention, on propose une purification de la fraction Box par immunoaffinité (colonne composée du monoclonal couplé à une matrice telle que le Sepharose CL-6B activé).

Par ailleurs, la conservation des fractions peut être favorablement effectuée en présence de glycérol ou de sucrose.

La courbe dose-réponse de LDL natives (à concentration plasmatique) a également été testée en parallèle avec le plasma correspondant . Comme attendu, des concentrations croissantes de LDL natives engendrent une augmentation proportionnelle du signal. Cependant, la réponse obtenue pour le plasma est nulle ou nettement inférieure à celle des LDL natives. Ceci indique qu'un (ou plusieurs) composant(s) du plasma peu(ven)t inhiber la reconnaissance des LDLox par les monoclonaux.

Parmi les composants plasmatiques susceptibles d'influencer la liaison de LDLox avec le monoclonal, on peut distinguer deux grandes catégories : -les lipoprotéines, et notamment les particules contenant de 1'apoB (LDL natives et VLDL) -les protéines

On a confirmé la fiabilité du test, en vérifiant que 1'apoB non modifiée par la MPO, et présente sur les LDL ainsi que sur les VLDL, ne pouvait entrer en compétition avec 1'apoB modifiée, au niveau de l'anticorps monoclonal.

La courbe dose-réponse pour les LDL natives montrent un signal qui pourrait correspondre à la présence d’une petite proportion de LDL oxydées dans ces LDL natives.

On a également vérifié que l'albumine n'interfère pas au niveau de la liaison anticorps-antigène.

Plusieurs solutions sont proposées pour éliminer ou minimiser les interférences observées dans le plasma.

Tout d'abord, l'échantillon peut être pré-purifié en utilisant des membranes semi-perméables permettant d'éliminer des molécules jusqu'à 100.000 Da. D'autre part, les IgG peuvent être écartées par des techniques d'immunoprécipitation.

On a cependant observé que les interférences peuvent être limitées par la dilution de l'échantillon. En effet, il a été observé une augmentation de 1'interférence pour de faibles dilutions du plasma, alors que des dilutions plus importantes tendent à limiter ces perturbations. D'autre part, en parallèle avec une dilution de l'échantillon, différentes techniques connues en soi permettent d'amplifier le signal.

A titre d'exemple une variante préférée du test de mesure directe de LDLs naturellement oxydées circulantes est décrite ci-après :

Test ELISA sandwich - coating de plaques F 96 maxisorb (nunc immuno plate No 4 4 2304) avec les anticorps monoclonaux (100 μΐ/puits) plaque no 1 Mab AG 948 F4 A2 (anti B) à 5,3 ng/puits plaque no 2 Mab EB 2 A 9 G 6 21 H2 (anti B), à 5,3 ng/puits plaque no 3 Mab EB2 G3 G2 (anti B) à 5,3 ng/puits dans le tampon 50 mM carbonate/bicarbonate, pH 9,6 - Saturation des plaques en caséine 0,1% après lavage en TBS Tween, 60 min à 37 deg - disposition des échantillons: plasma dilué 10 fois dans du PBS pH 7,5 (H20 HPLC) , 60 min à 37 deg, puis lavage par TBS Tween. Idéalement un témoin négatif et un standard B oxydé sont également disposés sur la plaque.

- fixation du 2ème anticorps : anticorps polyclonal de souris anti apolipoprotéine B 100 à 1 pg/ml, 60 min à 37 °C

- fixation de l'anticorps couplé : anticorps de chèvre anti IgG(Fc) de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Proméga, cat no S3731), dilué 7500 fois dans le tampon de caséine.

- révélation : à l'aide du substrat de la phosphatase alcaline : para nitrophényl phosphate à 1 mg/ml dans le tampon diéthanolamine pH 9.8.

On constate que les 3 anticorps fournissent des résultats comparables.

Un exemple de résultats est repris à la FIG. 4 pour 13 patients et un témoin négatif (50 min de révélation) en utilisant l'anticorps EB 2 A 9 G 6 21 H2 .

En reproduisant le test avec des échantillons de plasma dilués 50 x les résultats sont identiques.

Conclusion : L'invention démontre donc la faisabilité et les avantages du dosage de LDI, modifiées par l'action de la MPO dans la circulation.

5. Test de type ELISA de mesure de sensibilité à l’oxydation ex-vivo des LDL

Selon l’invention, les caractéristiques cinétiques de l’oxydation des LDL par la myéloperoxydase sont également avantageusement exploitées dans un but de diagnostic.

On a ainsi réalisé une oxydation du LDL sur microplaque afin de mettre au point un des tests selon l’invention basé sur la cinétique de l’oxydation.

Ce test comprend h étapes :

1) Fixation des LDL du plasma sur un anticorps polyclonal anti-apo B

2) Oxydation des LDL par le système MPO / peroxyde d'hydrogène. 12,5 mU MPO ont été utilisés en présence de 40μΜ H202 par puits, ces conditions ayant été ensuite modifiées pour ralentir l'oxydation, en réduisant de 5 fois la quantité d'agents pro-oxydants et en utilisant 2,5 mU MPO et 8μΜ H202 par puits.

3) Reconnaissance d'un épitope spécifique de LDL oxydées par un anticorps monoclonal selon l'invention 4) Reconnaissance de l'anticorps monoclonal par des IgG couplées à la phosphatase alcaline, anti IgG de souris.

Afin d'optimiser les conditions d'oxydation discriminant les patients des personnes saines, on a utilisé les deux anticorps monoclonaux obtenus (anti fraction B et anti fraction C/D) à notre disposition.

La procédure du dosage est illustrée à la FIG. 5 .

Plusieurs séries d'oxydation ont été réalisées sur des plasma provenant de volontaires sains et de patients. L'oxydation des LDL a été suivie au cours du temps par l'apparition des épitopes B et C. Il est apparu rapidement nécessaire de déterminer une valeur seuil d'oxydation définissant une oxydation normale ou pathologique. A cet effet, la mesure d'un rapport C/B peut constituer un standard interne de la réaction.

Vingt-cinq échantillons provenant de volontaires sains ont été testés afin de déterminer une valeur moyenne «normale » du rapport C/B, la moyenne obtenue correspond à un rapport C/B de 1.26 et l'écart-type est de 0,16. La gamme « normale » établie correspond donc à un rapport C/B allant de 0,94 à 1,58 (moyenne ± 2 SD).

Les plasmas de 33 patients ont été testés et ont été comparés à la gamme «normale » établie sur des plasmas de personnes « saines ». Onze d'entre eux se distinguaient de la «normale» (FIG. 6). Parmi les patients présentant une sensibilité à l'oxydation supérieure à la « normale », il était particulièrement intéressant de noter que certains ne présentaient pas de facteurs de risque classiques tels que cholestérol et/ou triglycérides élevés, ou plus récents comme les LDL petites et denses ou la Lp(a), et que cependant il présentaient une coronaropathie sévère (angor instable, infarctus, ... ).

Ce test s'est donc révélé d'un grand intérêt en prévention primaire en mettant en évidence un risque potentiel alors que les autres paramètres utilisés couramment s'avèrent négatifs.

La FIG. 6 illustre ainsi une comparaison de la sensibilité à l'oxydation des LDL de 33 patients par rapport à une population contrôle, les résultats étant exprimés en pourcentage par rapport au contrôle.

La reproductibilité intra essai, testée par la réalisation de plusieurs cinétiques sur une même plaque, est tout à fait acceptable. Par contre, la reproductibilité inter-essais, testés par comparaison des résultats obtenus pour un même échantillon sur des plaques différentes, est médiocre. On introduira donc un échantillon contrôle sur chaque plaque pour pouvoir interpréter les résultats obtenus sur différentes plaques.

Les cinétiques obtenues montrent qu'avec l'anticorps anti-fraction B, les résultats sont très reproductibles alors que ceux obtenus avec l'anti C/D présentent des variations. Il a en effet été vérifié qu'un même individu pris à différent moments donnait des résultats comparables, en effectuant 3 prises de sang à plusieurs jours d'intervalle chez un même volontaire.

On peut donc conclure que la mesure de la cinétique d'oxydation des LDL peut être effectuée dans de bonnes conditions en utilisant l'anticorps anti-fraction B.

6. Test Elisa de mesure d'autoanticorps circulants dirigés contre les LDL oxydées (fraction B)

Selon encore un autre aspect de l'invention on propose un test basé sur la détection d'autoanticorps naturels dans le plasma, dirigés contre des LDL oxydées par la myéloperoxydase.

On a en effet observé que le plasma contient des autoanticorps dirigés spécifiquement contre les fractions de LDL oxydées par la myéloperoxydase en présence de H202, et non contre les fractions obtenues par oxydation avec d'autres agents tels que le sulfate de cuivre, l'AAPH ou un azoinitiateur.

Le taux d'autoanticorps reconnaissants ces LDL oxydées est un reflet du statut oxydatif dans la mesure où la modification des LDL résulte en l'apparition de nouveaux épitopes rendant les lipoprotéines plus antigéniques. Ce dosage permet également d'évaluer la capacité du système immunitaire à répondre à l'apparition de ces LDL modifiées.

Selon l'invention on propose donc un test de type ELISA permettant de déterminer quantitativement la présence d'autoanticorps contre des sous-fractions spécifiques chez des malades présentant une pathologie cardio-vasculaire.

Le tableau suivant indique les réponses observées pour 5 patients, sous la forme des rapports entre le signal obtenu avec des LDL oxydées et celui du blanc correspondant, c'est à dire pour les LDL natives. Un rapport de 1 (ou <1) signifie que l'échantillon ne contient pas d'autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées. A l'inverse, on peut postuler qu'un rapport > 2 traduit la présence d'autoanticorps.

Sur 3 des 5 sujets, on observe la présence d'autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées par la MPO, alors qu'aucun sujet ne paraît contenir d'autoanticorps contre les LDL oxydées par le cuivre ou l'AAPH.

7, Immunoadsorption spécifique

Selon un autre aspect de l'invention on propose une méthode de traitement iiranunothérapeutique consistant à traiter le sang d'un patient pour en retirer les antigènes (fractions LDL de oxydées, en particulier fraction B). Cette méthode consiste à faire passer le sang , ou une fraction de sang, d'un patient dans un système ou il entrera en contact avec des anticorps anti-fraction B de LDL oxydées immobilisés, par exemple sur une colonne d'immunoadsorption, avant d'être retourné au patient, le sang ou la fraction de sang étant débarrassé desdits antigènes athérogènes.

Claims (11)

1. Composition constituée d'une fraction oxydée de LDL obtenue par oxydation in vitro de LDL par le peroxyde d'hydrogène ou le couple glucose/glucose-oxydase en présence de myéloperoxydase.

2 Composition selon la revendication 1 purifiée par chromatographie.

3. Composition selon la revendication précédente obtenue en utilisant une séparation par chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC).

4. Composition selon la revendication précédente obtenue en utilisant des tampons de concentrations croissantes en sels .

5. Composition selon n'importe laquelle des revendications précédentes qui a également été purifiée par immunoaf f inité.

6. Composition selon la revendication précédente purifiée par immunoaffinité en utilisant une colonne composée d'un anticorps monoclonal couplé à une matrice et dirigé contre ladite fraction.

7. Composition selon la revendication précédente dans laquelle la colonne est une colonne de Sepharose activé.

8. Composition selon n'importe laquelle des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle constitue la sous-fraction B, sous-fraction des LDL oxydées la plus proche des LDL natives en chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.

9. Composition selon n'importe laquelle des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle constitue la sous-fraction C, sous-fraction des LDL oxydées qui suit la sous-fraction B en chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.

10. Composition constituée d'une fraction oxydée de LDL obtenue par oxydation in vitro de LDL par le couple glucose/glucose oxydase en présence de myéloperoxydase caractérisée en ce qu'elle comprend la sous-fraction D, sous-fraction des LDL oxydées la plus éloignée des LDL natives en chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.

11. Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un mélange des sous-fractions C et D.

12. Composition selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle la myéloperoxydase utilisée est une myéloperoxydase recombinante humaine.

13. Anticorps monoclonal dirigé contre une composition selon n’importe laquelle des revendications 1 à 12.

14. Procédé d'obtention de fractions oxydées de LDL caractérisé en ce que les LDL sont oxydées par addition de peroxyde d'hydrogène en présence de myéloperoxydase et la fraction oxydée résultante est séparée puis fractionnée par chromatographie de type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en utilisant des tampons de concentrations croissantes en sels.

15. Utilisation des fractions d'oxydation obtenues selon la revendication précédente pour l'obtention d'anticorps monoclonaux.

16. Antigène constitué par une fraction d'oxydation isolée selon le procédé de la revendication 14.

17. Antigène selon la revendication précédente constituée par la fraction B.

18. Antigène selon la revendication 16 constitué par la fraction C ou la fraction B, ou un mélange de ces fractions d'oxydation de LDL.

19. Anticorps monoclonal dirigé contre un des antigènes des revendications 16 à 18.

20. Utilisation d'un anticorps selon les revendications 13 ou 19 pour un test d'oxydation ex vivo de LDL d'un patient.

21. Utilisation d'un anticorps selon une des revendications 13 à 19 pour un test de mesure de LDLox circulantes.

22. Utilisation d'une fraction de LDL oxydée isolée comme standard pour la détermination d'autoanticorps antifraction oxydée chez un patient.

23. Utilisation selon la revendication 22 dans laquelle la fraction oxydée est la fraction B.

24. Test , notamment pour la détermination du risque cardio-vasculaire d'un patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - fixation d'un anticorps monoclonal anti-fraction B sur un substrat solide - extraction des LDL oxydées du plasma par adsorption sur l'anticorps monoclonal - reconnaissance des LDL fixées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-apoB - révélation quantitative de l'anti-corps polyclonal - détermination de la concentration en LDLox.

25. Test selon la revendication 24 dans laquelle la révélation quantitative se fait par action de la phosphatase alcaline couplé à un anticorps dirigé contre l'anticorps polyclonal anti-apo B.

26. Tests selon la revendication précédente dans lequel l’anticorps polyclonal anti-apo B est un anticorps de lapin et l'anticorps couplé à la phosphatase alcaline est un anticorps de chèvre anti-IgG(Fc) de lapin.

27 Test selon la revendication 24 dans lequel l'anticorps polyclonal anti-apoB est couplé à une peroxydase.

28. Test selon la revendication 24 dans lequel la concentration de LDLox dans l'échantillon est déterminée par comparaison avec un échantillon ou une gamme standard de la fraction B de LDL oxydée par la MPO et isolée par FPLC (fraction Box).

29. Test selon la revendication 28 dans lequel le plasma est préalablement dilué entre 5 et plus de 40 fois.

30. Test selon la revendication 28 dans lequel les IgG du plasma sont éliminées par des techniques d'immunoprécipitation.

31. Procédé de détermination du taux circulant de LDL oxydées caractérisé en ce qu'il utilise des anticorps monoclonaux obtenus à partir d'au moins une fraction des LDL oxydées ex-vivo par la myéloperoxydase.

32. Procédé de détermination du taux d'auto-anticorps dirigés contre les LDL oxydées caractérisé en ce qu’il utilise des fractions de LDL oxydées par la myéloperoxydase ex-vivo.

33. Procédé de détermination de la sensibilité à l'oxydation par la MPO des LDL présentes dans le plasma caractérisé en ce qu'il utilise des anticorps monoclonaux obtenus à partir d'une fraction de LDL oxydées par la myéloperoxydase ex-vivo.

34. Procédé selon n’importe laquelle des trois revendications précédentes caractérisé en ce que la fraction est la fraction B.

35. Procédé de diagnostic pour la prévention des accidents cardiovaseulaires faisant intervenir au moins une des trois procédés des revendications 31 à 33.

36. Procédé de diagnostic pour apprécier la sévérité d'un risque cardio-vasculaire d'un patient caractérisé en ce qu'il est basé sur les trois paramètres suivants : - taux circulant de LDL oxydées par la myéloperoxydase - taux d'autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées par la MPO - sensibilité à l'oxydation par la MPO des LDL présentes dans le plasma du patient.

37. Standard pur de la fraction B oxydée par la myéloperoxydase caractérisée en ce qu'il est obtenu à partir de ladite fraction par passage sur une colonne d'immunoaffinité comprenant un anticorps monoclonal anti-fraction B.

38. Kit d'application diagnostique comprenant au moins - un anticorps monoclonal contre la fraction B de LDL oxydées par la myéloperoxydase.

39. Kit selon la revendication 35 comprenant également un standard ou une gamme de standards consistant en des compositions selon les revendications 1 à 9.

40. Test , notamment pour la détermination du risque cardio-vasculaire d'un patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : ~ fixation de LDL oxydées sur un substrat solide fixation d'un anticorps monoclonal· anti-fraction B à ladite LDL oxydée fixée association des LDL oxydées du plasma audit anticorps et libération de l'anticorps monoclonal - détermination de l'anticorps monoclonal restant fixé - détermination de la concentration en LDLox.

11. Procédé de traitement consistant à traiter le sang ou des fractions de sang d'un patient pour en retirer la fraction B de LDL oxydées par contact avec des anticorps anti-fraction B de LDL oxydée immobilisés, par exemple sur une colonne d'immunoabsorption, avant d'être retourné au patient.