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Séquence d'ADN codant pour une protéine de canal sodique, sa production et son utilisation
La présente invention concerne d'une façon générale des protéines de canaux sodiques et plus particulièrement une nouvelle séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité a mammalienne d'une protéine de canal sodique de tissu nerveux, dépendant du potentiel, de préférence résistante à la tétrodotoxine. La présente invention concerne en outre sa production par la technique de recombinaison.
L'unité de base d'information transmise d'une partie du système nerveux à une autre est un seul potentiel d'action ou influx nerveux. La "ligne de transmission" pour ces influx est l'axone ou fibre nerveuse. L'excitabilité électrique de la membrane du nerf s'est avérée dépendre du système de perméabilité ionique sensible à la tension de la membrane, qui lui permet d'utiliser l'énergie emmagasinée dans des gradients de concentration ionique. L'activité électrique du nerf est déclenchée par une dépolarisation de la membrane, qui ouvre à travers la membrane des canaux qui sont hautement sélectifs pour les ions sodium, qui sont ensuite entraînés vers l'intérieur par le gradient électrochimique. Parmi les nombreux canaux ioniques, le canal sodique dépendant du potentiel ou sensible au potentiel est l'un des plus étudiés.
Il s'agit
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d'une protéine transmembranaire qui est essentielle pour la production de potentiels d'action dans des cellules excitables. Un excellent article de synthèse sur les canaux ioniques est donné par Catterall, TINS 16(12), 500- 506 (1993) .
Les ADNc pour plusieurs canaux de Na+ ont été clo- nés et séquences. Numa et coll., Annals of the New York Academy of Sciences 479,338-355 (1986), décrivent un ADNc provenant de l'organe électrique de l'anguille et deux ADNc différents provenant du cerveau de rat. Rogart, US-A-5 380 836, décrit un ADNc provenant de tissu car- diaque de rat ; également Rogart et coll., Proc. Natl.
Acad. Sci. 86,8170-8174 (1989). Les séquences de PN1 et de ses orthologues chez l'homme (hNE) et le lapin (Na+) ont été publiées [voir par exemple Klugbauer et coll., EMBO J. 14, 1084-1090 (1995) et Belcher et coll., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 923,11034-11038 (1995)]. La séquence de PN1 de rat clone à partir de ganglions de la racine dorsale (GRD) et son expression de fonction ont été décrites [voir par exemple Sangameswaran et coll., J.
Biol. Chem. 272,14805-14809 (1997) ]. D'autres canaux sodiques clones comprennent les types I et II [Noda et coll., Nature 320,188-192 (1986)], IIa [Auld et coll., Neuron 1,449-461 (1988) ] et III [Kayano et coll., FEBS Lett. 228,187-194 (1988)] de cerveau de rat, les canaux sodiques de muscle squelettique (SkMl) [Trimmer et coll., Neuron 3, 33-49 (1989)], NaCh6 de rat [Schaller et coll., J. Neurosci. 15, 3231-3242 (1995)], le canal sodique type III de nerf périphérique (rPN3) [Sangameswaran et coll., J. Biol. Chem. 271,5953-5956 (1996), également dénommé SNS, Akopian et coll., Nature 379,257-262 (1996) ], le canal atypique de rat [Felipe et coll., J.
Biol. Chem. 269,30125-30131 (1994) ] et le canal sodique glial de rat [Akopian et coll., FEBS Lett. 400,183-187 (1997)].
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Ces études ont montré que la séquence d'aminoacides du canal sodique avait été conservée pendant une longue période d'évolution. Ces études ont également révélé que le canal était un seul polypeptide contenant quatre séquences répétées internes, ou domaines homologues (domaines I-IV) ayant des séquences d'aminoacides simi- laires. Chaque domaine se replie en six segments trans- membranaires hélicoïdaux et prédits: cinq sont des seg- ments hydrophobes et un est un segment hautement chargé, comportant de nombreux résidus lysine et arginine chargés positivement. Ce segment hautement chargé est le quatrième segment transmembranaire dans chaque domaine (le segment S4) et est susceptible d'être impliqué dans l'ac- tivation par le potentiel.
Les chaînes latérales chargées positivement sur le segment S4 sont susceptibles de s'ap- parier avec les chaînes latérales chargées négativement sur les cinq autres segments, de sorte que la dépolarisa- tion de la membrane peut déplacer la position d'une hélice par rapport à l'autre, ce qui ouvre le canal. Des sous- unités accessoires peuvent modifier la fonction du canal.
On a découvert l'utilité thérapeutique de matériels recombinants issus de l'ADN des nombreux canaux sodiques.
Par exemple, US-A-5 132 296 (Cherksey) décrit des canaux sodiques purifiés qui se sont révélés utiles en tant qu'outils diagnostiques et thérapeutiques.
Des isoformes de canaux sodiques sont divisées en "sous-familles". On utilise le terme "isoforme" pour dési- gner des protéines de canaux sodiques distinctes mais étroitement apparentées, c'est-à-dire celles ayant une homologie d'aminoacides d'environ 60-80 %. Ces dernières manifestent également une forte homologie de fonctions. On utilise le terme "sous-familles" pour désigner des canaux sodiques distincts qui ont une homologie d'aminoacides d'environ 80-95 %. On utilise des combinaisons de plu- sieurs facteurs pour déterminer les distinctions au sein
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d'une sous-famille, par exemple, la rapidité d'un canal, la localisation chromosomique, les données d'expression, l'homologie avec d'autres canaux au sein d'une même espèce, et l'homologie avec un canal de la même sous- famille entre des espèces différentes.
Une autre considé- ration est une affinité pour la tétrodotoxine ("TTX"). La TTX est une toxine très puissante provenant du tétrodon, ou poisson-globe, qui bloque la transmission des influx nerveux le long des axones et dans les membranes excitables des fibres nerveuses. La TTX se fixe au canal sodique et arrête le flux des ions sodium.
Des études utilisant la TTX comme sonde ont éclairé beaucoup le mécanisme et la structure des canaux sodiques.
Il existe trois sous-types de canaux sodiques qui sont définis par l'affinité pour la TTX, qui peut être mesurée par les valeurs de la CI 50 : canaux sodiques sensibles à la TTX (CI50 = 1-30 nM), canaux sodiques insensibles à la TTX (Ci 50 = 1-5 M et canaux sodiques résistants à la TTX (Ci 50 50 M).
Les potentiels d'action insensibles à la TTX ont été étudiés d'abord dans le muscle squelettique de rat (Redfern et coll., Acta Physiol. Scand. 82, 70-78 (1971)].
Ces potentiels d'action ont été ensuite décrits dans d'autres tissus mammaliens, y compris le muscle squelet- tique mammalien de nouveau-né, le muscle cardiaque mamma- lien, des cellules de ganglions de la racine dorsale de souris in vitro et en culture, des cellules L6 et de muscle squelettique mammalien en culture [voir Rogart, Ann. Rev. Physiol. 43,711-725 (1980)].
Les neurones des ganglions de la racine dorsale de rat possèdent à la fois des courants de canaux sodiques sensibles à la TTX (CI 50 ¯ 0,3 nM) et des courants de canaux sodiques résistants à la TTX (CI 50 ¯ 100 M), comme décrit par Roy et coll. dans J. Neurosci. 12, 2104-2111 (1992)]. On a également mesuré des courants sodiques
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résistants à la TTX dans des ganglions pétreux et des ganglions plexiformes de rat (voir Ikeda et coll., J. Neuro- physiol. 55, 527-539 (1986) et Stea et coll., Neurosci.
47,727-736 (1992). Les électrophysiologistes pensent qu'un autre canal sodique résistant à la TTX reste à découvrir.
Bien que l'on connaisse des ADNc provenant de cer- veau, de coeur et de muscle squelettique de rat, l'identi- fication et l'isolement d'ADNc à partir de tissu nerveux sensitif périphérique, tel que des ganglions de la racine dorsale, ont été gênés par la difficulté du travail avec un tel tissu.
La présente invention fournit de nouvelles séquences purifiées et isolées d'acide nucléique, codant pour des protéines de canaux sodiques de tissu nerveux, de préférence.résistantes à la TTX, qui sont fortement expri- mées dans des ganglions plexiformes et des ganglions de la racine dorsale de l'adulte, moins fortement exprimées dans le cerveau, la moelle épinière et les ganglions cervicaux supérieurs, et ne sont pas exprimées dans le nerf scia- tique, le coeur ou le muscle squelettique. Sous des formes actuellement préférées, les nouvelles séquences d'ADN com- prennent des séquences d'ADNc codant pour la protéine de canal sodique de tissu nerveux de rat. Un aspect de la présente invention est la sous-unité a de cette protéine de canal sodique.
L'invention a également pour objet l'ADN, l'ADNc et l'ARNm issus des séquences d'acide nucléique de l'inven- tion, et l'ARNc issu de l'ARNm. En particulier, deux séquences d'ADNc ensemble codent pour le canal sodique entier de tissu nerveux de rat.
La présente invention englobe également d'autres formes d'ADN, telles que de l'ADN génomique, de l'ADN pré- paré par synthèse chimique partielle ou totale à partir de nucléotides, et de l'ADN comportant des délétions ou des
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mutations.
Encore un autre aspect de l'invention est la nou- velle protéine de canal sodique de rat, résistante à la TTX, et des fragments de celle-ci, codés par l'ADN de la présente invention.
Un autre aspect de la présente invention consiste en des polynucléotides et oligonucléotides recombinants comprenant une séquence d'acide nucléique issue de la séquence d'ADN de la présente invention.
Un autre aspect de l'invention est un procédé de stabilisation de l'ADNc entier qui code pour la séquence de la protéine de l'invention.
Un autre aspect de l'invention comprend des vec- teurs d'expression comprenant l'ADN de l'invention, des cellules hôtes transformées ou transfectées par ces vec- teurs et-une banque d'ADNc de ces cellules hôtes.
La présente invention englobe également un essai pour la détection d'inhibiteurs de la protéine de canal potassique, comprenant la mise en contact d'un composé, soupçonné être un inhibiteur, avec un canal sodique exprimé, et la mesure de l'activité du canal sodique.
On fournit en outre un procédé d'inhibition de l'activité du canal sodique résistant à la TTX, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un composé ayant une valeur CI50 de 10 M ou moins.
De plus, on fournit des procédés d'utilisation de l'ADN pour la production d'anticorps monoclonaux et d'anticorps polyclonaux, destinés à être utilisés en tant que cibles moléculaires pour la découverte de médicaments, en tant que marqueurs hautement spécifiques d'antigènes spécifiques, comme molécules détectrices, dans des essais diagnostiques, et pour des utilisations thérapeutiques, telles que le soulagement de la douleur, en tant que sonde du canal PN5 dans un autre tissu mammalien, dans la con- ception d'agents thérapeutiques et dans le criblage de
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thérapies.
La présente invention est illustrée à l'aide des dessins ci-annexés. Sur ces dessins:
Les figures 1A-E représentent la séquence native d'ADNc de 5 908 nucléotides codant pour le canal sodique type 5 ("PN5") de rat (SEQ ID n 1), issu de deux clones d'ADNc chevauchants, désignés par 26. 2 et 1.18.
Les figures 2A-F représentent la séquence d'amino- acides déduite de PN5 (SEQ ID n 2, représentée dans le code d'aminoacides à trois lettres). Les figures 2G-H, représentant la séquence d'aminoacides déduite de PN5 dans le code d'aminoacides à une seule lettre, montrent égale- ment les domaines homologues (I-IV); les segments transmembranaires (S1-S6) supposés ; l'aminoacide conférant la résistance à TTX (4); les sites de N-glycosylation (#); le site de phosphorylation à.la protéine kinase A (PKA) dépendant de cAMP (o) et le codon de terminaison (*).
La figure 3A représente une séquence de 856 paires de bases pour le PN5 humain (SEQ ID n 3). La figure 3B représente la comparaison de séquence d'aminoacides du fragment hPN5 avec le PN5 de rat.
La figure 4 représente la séquence de la nouvelle sonde de domaine IV de canal sodique (SEQ ID n 4).
Les figures 5A-E représentent la séquence de 5 334 nucléotides modifiée pour la stabilité et l'expres- sion (SEQ ID n 5). Les nucléotides 24 à 5 518 constituent la région de 5 295 pb codant pour une protéine à 1 765 aminoacides.
La figure 6 représente la carte de clonage de PNS.
La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique purifiée et isolée codant pour une nouvelle protéine de canal sodique mammalienne, de préférence résis- tante à la TTX. L'expression "ADN purifié et isolé" signi- fie de l'ADN qui est essentiellement exempt, c'est-à-dire contient moins d'environ 30 , de préférence moins d'envi-
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ron 10 %, et encore mieux de préférence moins d'environ 1 %, de l'ADN auquel est associé à l'état naturel l'ADN d'intérêt. Les techniques pour déterminer la pureté sont bien connues dans le domaine et comprennent, par exemple, la cartographie de restriction, l'électrophorèse en gel d'agarose et la centrifugation en gradient de CsCl.
Le terme "ADN" est destiné à comprendre l'ADNc, ou ADN complémentaire, qui consiste en séquences d'ADN simple brin ou double brin, produites par transcription inverse d'ARNm isolé à partir d'une cellule donneuse ou par syn- thèse chimique. Par exemple, le traitement d'ARNm par une transcriptase inverse, telle que la transcriptase inverse d'AMV ou la transcriptase inverse de M-MuLV, en présence d'une amorce oligonucléotidique, donnera un duplex ARN-ADN pouvant être traité par de la RNase H, de l'ADN polymérase et de l'ADN ligase, pour donner de l'ADNc double brin. Si on le désire, l'ADNc double brin peut être dénaturé par des techniques classiques, telles qu'un chauffage, pour donner de l'ADNc simple brin.
Le terme "ADNc" comprend de l'ADN qui est une copie complémentaire de l'ARNm existant dans la nature, ainsi que des copies complémentaires de variants de l'ARNm existant dans la nature, qui ont la même activité biologique. Les variants comprennent, par exemple, des insertions, des délétions, des séquences à codons dégénérés et des allèles.
Un "ARNc" correspondant à l'ARNm transcrit à partir d'une séquence d'ADN codant pour la sous-unité a d'une nouvelle protéine de canal sodique, de préférence résis- tante à la TTX, est envisagé par la présente invention.
Le terme "ARNc" désigne un ARN qui est une copie de l'ARNm trancrit par une cellule.
En particulier, l'invention englobe de l'N com- portant les versions natives des séquences nucléotidiques indiquées sur les figures 1A-E (SEQ ID n 1), désigné ici par canal sodique type 5 (PN5). Les figures 1A-E repré-
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sentent le produit de construction d'ADNc à 5 908 nucléo- tides, comprenant un cadre de lecture ouvert de 5 298 bases (y compris le codon d'arrêt) (SEQ ID n 1).
Le résidu nucléotidique 79 représente le site d'initiation et de traduction, et le résidu 5367 représente la fin du codon d'arrêt.
L'invention englobe également des versions modi- fiées de PN5, et en particulier la version représentée sur les figures 5A-E (SEQ ID n 5). Le clone SalI-XbaI de 5 334 nucléotides est dépourvu de la plupart des séquences non traduites, du cadre de lecture ouvert de 5 298 nucléo- tides partant du nucléotide 24 et se terminant au nucléo- tide 5321. Les codons d'initiation et d'arrêt sont souli- gnés, comme le sont les mutations traductionnellement silencieuses au niveau des nucléotides 3932,3935, 3941, 3944 et 3947, qui ont été introduites pour bloquer un réarrangement dans cette région pendant la croissance dans E. coli .
La séquence nucléotidique de SEQ ID n 1 (figures 1A-E) correspond aux ADNc de rat. Une recherche d'homologie a montré que le canal sodique le plus étroite- ment apparenté se trouvait dans le canal cardiaque de rat, avec une homologie de 72,5 %. Les canaux les plus étroite- ment apparentés qui viennent ensuite sont rPNl, avec 72 %, et les types I et III de cerveau de rat, avec 71,8 % et 71,3 %, respectivement. Les homologies avec rPN3a, hPN3, rPN4, rPN4a, le type II de cerveau de rat et le muscle squelettique de rat vont chacune environ de 70 à 71 %.
En outre, un clone de 856 paires de bases (SEQ ID n 3), tel que représenté sur la figure 3A, a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de ganglions de la racine dor- sale (GRD) humains, et est étroitement apparenté à la séquence d'aminoacides de PN5 de rat, avec une identité de 79 % et une homologie de 86 %. La séquence de PN5 humain couvre la région entre IIIS1 et l'interdomaine III/IV, qui
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inclut la vanne d'inactivation rapide (à savoir IFM) qui est localisée dans l'interdomaine III/IV.
Le terme "banque d'ADNc" désigne une collection de clones, habituellement dans un bactériophage ou, moins communément, dans des plasmides bactériens, contenant des copies d'ADNc de séquences d'ARNm issues d'une cellule donneuse ou d'un tissu donneur.
On pense que les homologues supplémentaires du nou- veau canal sodique de rat, résistant à la TTX, décrit ici, sont également exprimés dans un autre tissu mammalien.
L'analyse northern blot (exemple 5) indique que PN5 est codé par un transcrit de - 6,5 kb.
La séquence d'aminoacides déduite de PN5, représen- tée sur les figures 2A-F (SEQ ID n 2), manifeste les caractéristiques structurales primaires d'une sous-unité a d'un canal sodique dépendant du potentiel, résistant à la TTX. Les figures 2G-H représentent les domaines homologues (I-IV); les segments transmembranaires (S1-S6) supposés ; l'aminoacide conférant la résistance à la TTX (#) ; les sites de N-glycosylation (#) ; et les sites de phosphoryla- tion à la PKA cAMP-dépendants (o). Des séquences d'ADN codant pour les polypeptides de protéine de canal sodique identiques, analogues ou variants allèles du système ner- veux, par utilisation, au moins en partie, de codons dégé- nérés, sont également envisagées par la présente invention.
Une caractéristique intéressante de cette séquence d'aminoacides déduite est que l'aminoacide qui est le plus responsable de la sensibilité à la TTX est localisé à la position 355 et n'est pas aromatique. Dans les canaux sodiques de type du cerveau humain et de rat, dans le canal du muscle squelettique et dans PN1 et PN4, cet aminoacide est la tyrosine ou la phénylalanine, et ces canaux sont tous sensibles à la TTX. Dans PN3 et PN5, l'aminoacide est la sérine. Etant donné que PN3 est très résistant à la TTX, l'implication est que PN5 est égale-
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ment un canal résistant à la TTX. Le canal cardiaque com- porte un résidu cystéine à cette position et est "insensible" à la TTX.
Bien que PN5 contienne toutes les caractéristiques distinctives d'un canal sodique dépendant du potentiel, il a des caractéristiques structurales spécifiques qui le distinguent des autres canaux sodiques. Par exemple, DIIS4 comporte 5 aminoacides basiques conservés dans tous les canaux sodiques qui pourraient jouer un rôle significatif dans les aspects de détection de potentiel de la fonction de canal. Dans PN5, le premier aminoacide basique est rem- placé par un résidu alanine. De même, dans DIIIS4, PN5 comporte 5 aminoacides basiques au lieu des six qui sont présents dans d'autres séquences de canaux sodiques, le dernier résidu arginine étant remplacé par un résidu glu- tamine. Dans DIIIS3, le segment transmembranaire ne con- tient que 18 aminoacides, par opposition à 22 aminoacides dans les autres canaux.
En outre, la courte boucle de liaison (4 aminoacides) entre S3 et S4 dans DIII est même plus courte, en raison d'une délétion de 3 aminoacides. Ce raccourcissement de S3 et de la boucle de liaison a été confirmé par la conception d'amorces dans la région appro- priée de la séquence pour un essai de RT-PCR (réaction d'amplification en chaîne par polymérase-transcription inverse) à partir de GRD de rat, et séquençage du fragment d'ADN amplifié. Un tel essai a été effectué pour confirmer la séquence d'une autre région de PN5, dans la boucle DIVS5-S6, où il y avait une délétion d'un peptide de 8 aminoacides.
On a effectué une analyse de distribution tissu- laire d'ARN, par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase-transcription inverse (RT-PCR amorcée par oligonucléotide), à partir des systèmes nerveux périphé- rique et central de rat, en particulier à partir de GRD de rat. On a étudié huit types de tissus principaux quant à
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l'expression des gènes PN5 spécifiques correspondants aux positions 5651-5903 de SEQ ID n 1 (figures 1A-E). L'ARNm de PN5 était présent dans cinq des tissus étudiés: le cer- veau, la moelle épinière, GRD, les ganglions plexiformes et les ganglions cervicaux supérieurs. PN5 n'était pas présent dans les tissus restants étudiés: le tissu de nerf sciatique, le tissu de muscle squelettique ou cardiaque.
PN5 s'est révélé être le plus fort dans GRD et les gan- glions plexiformes, ce qui a conduit les demandeurs à penser que le GRD était enrichi en PN5. PN5 présente des dif- férences considérables d'abondance parmi un ensemble de tissus. PN5 a un gradient d'expression avec une forte expression dans les GRD. PN5 a un gradient d'expression comme les autres canaux, mais une distribution plus limi- tée.
L'invention comprend non seulement la protéine entière exprimée par les séquences d'ADNc de SEQ ID n 1, 2 et 3, mais comprend également des fragments de pro- téines. Ces fragments peuvent être obtenus par coupure des protéines entières ou par l'utilisation de plus courtes séquences d'ADN ou de plus courts polynucléotides, pour exprimer le fragment recherché.
Tel qu'utilisé ici, le terme "polynucléotide" désigne une forme polymère de nucléotides de longueur quelconque, qu'il s'agisse de ribonucléotides ou de désoxyribonucléotides. Ce terme désigne seulement la structure primaire de la molécule. Ainsi, ce terme com- prend de l'ADN simple brin et de l'ADN double brin, ainsi que de l'ARN double brin et de l'ARN simple brin. Il com- prend également des formes modifiées, par exemple par méthylation et/ou par coiffage, et des formes non modi- fiées du polynucléotide.
En outre, le terme "polynucléotide" et destiné à comprendre un polynucléotide recombinant qui est d'origine génomique, d'ADNc, semi-synthétique ou synthétique, qui,
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en vertu de son origine ou d'une manipulation, n'est pas associé à la totalité ou une partie du polynucléotide auquel il est associé dans la nature et/ou est lié à un polynucléotide autre que celui auquel il est lié dans la nature.
En conséquence, l'invention comprend également des polynucléotides qui peuvent être utilisés pour produire des polypeptides ayant une longueur d'environ 10 à 1 500, de préférence de 10 à 100 aminoacides. L'isolement et la purification de tels polypeptides recombinants peuvent être effectués par des techniques qui sont bien connues dans le domaine, par exemple des séparations chromatogra- phiques préparatives ou la chromatographie d'affinité.
En outre, des polypeptides peuvent également être produits par des moyens synthétiques qui sont bien connus dans la technique.--
L'invention permet la manipulation de matériels génétiques par des techniques de recombinaison, pour pro- duire des polypeptides qui possèdent les caractéristiques structurales et fonctionnelles de la nouvelle sous-unité a de canal sodique dépendant du potentiel, résistante à la TTX, rencontrée dans des nerf sensitifs. On peut utiliser la mutagénèse dirigée sur site pour obtenir de tels poly- peptides recombinants. Par exemple, on peut insérer spéci- fiquement des oligonucléotides synthétiques, ou les mettre spécifiquement à la place d'oligonucléotides existants, dans le segment du gène d'intérêt, pour produire des gènes codant pour et exprimant un mutant spécifique.
On peut également insérer des oligonucléotides dégénérés au hasard et on peut utiliser des techniques de visualisation de phages pour identifier et isoler des polypeptides ayant une propriété fonctionnelle d'intérêt.
En outre, la présente invention envisage des poly- nucléotides recombinants ayant une longueur d'environ 15 à 20 kb, de préférence de 10 à 15 kb, comprenant une
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séquence d'acide nucléique issue de l'ADN de l'invention.
Le terme "issu" d'une séquence désignée se réfère à une séquence d'acide nucléique qui est composée d'une séquence d'environ au moins 6 à 8 nucléotides, de préfé- rence d'au moins 10 à 12 nucléotides et en particulier d'au moins 15 à 20 nucléotides qui correspondent à une région de la séquence désignée, c'est-à-dire sont homo- logues ou complémentaires de celle-ci. La séquence dérivée n'est pas nécessairement dérivée physiquement de la séquence nucléotidique indiquée, mais peut être issue d'une autre manière, y compris, par exemple, la synthèse chimique ou la réplication d'ADN ou la transcription inverse, techniques qui sont basées sur l'information fournie par les séquences de base dans la ou les régions desquelles est issu le polynucléotide.
Un test d'expression néonatal a été effectué avec Fil, une lignée de cellules de fusion conçue à partir de GRD de rat nouveau-né, soudée à une lignée cellulaire de souris, N18TG, provenant de Massachusetts General Hospi- tal. Fil répond à des agents trophiques, tels que le NGF (facteur de croissance des neurones), par extension de dendrites. On a constaté que PN5 était présent à la fois dans Fil native et Fil traitée par NGF, ce qui a conduit les demandeurs à penser que le canal sodique était exprimé à l'état natif dans Fil.
Une hybridation in situ d'ARNm de PN5 avec un tissu de GRD de rat donne une localisation principalement dans les petits neurones et les neurones moyens, avec une absence dans les neurones de grande taille.
On a également cartographié PN5 jusqu'à sa locali- sation cytogénétique sur des préparations de chromosomes de souris. PN5 est localisé sur le même chromosome que le canal cardiaque et PN3.
En général, les canaux sodiques comprennent une sous-unité a et deux sous-unités . Les sous-unités (3
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peuvent moduler la fonction du canal. Toutefois, étant donné que la sous-unité a est tout ce qui est requis pour que le canal soit totalement fonctionnel, l'expression de l'ADNc dans SEQ ID n 1 (figures 1A-E) donnera une pro- téine totalement fonctionnelle. Le gène codant pour la sous-unité ss1 dans le tissu de nerf périphérique s'est révélé être identique à celui rencontré dans le coeur, le cerveau et le muscle squelettique de rat. L'ADNc de la sous-unité 1 n'est pas décrit ici, puisqu'il est bien connu dans la technique [voir Isom et coll., Neuron 12, 1183-1194 (1994) ].
Toutefois, il doit être entendu qu'en combinant la séquence connue codant pour la sous-unité /3 avec la séquence de la sous-unité a décrite ici, il est possible d'obtenir un canal sodique PN5 complet, dépendant du potentiel, de préférence résistant à la TTX.
La présente invention comprend également des vec- teurs d'expression comprenant l'ADN ou l'ADNc décrit plus haut, des cellules hôtes transformées par ces vecteurs d'expression, capables de produire le canal sodique de l'invention, ainsi que des banques d'ADNc comprenant de telles cellules hôtes.
Le terme "vecteur d'expression" signifie tout élé- ment génétique, par exemple un plasmide, un chromosome, un virus, se comportant comme une unité autonome d'expression de polynucléotide dans une cellule ou étant rendu capable de réplication par insertion dans un chromosome d'une cel- lule hôte, et auquel est attaché un autre segment poly- nucléotidique, de manière à provoquer la réplication et/ou l'expression du segment attaché. Des vecteurs appropriés comprennent, mais sans se limiter à ceux-ci, des plas- mides, des bactériophages et des cosmides. Les vecteurs contiendront les séquences polynucléotidiques qui sont nécessaires pour effectuer la ligature ou l'insertion du vecteur dans une cellule hôte désirée et pour effectuer l'expression du segment attaché.
De telles séquences dif-
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fèrent en fonction de l'organisme hôte ou comprendront des séquences de promoteurs pour effectuer la transcription, des séquences d'activateurs pour accroître la transcription, des séquences de sites de liaison au ribosome et des séquences de terminaison de transcription et de tra- duction.
L'expression "cellule hôte" se réfère en général à des organismes procaryotes ou eucaryotes et comprend tout organisme apte à la transformation ou à la transfection, qui est capable d'exprimer une protéine et peut être, ou a été, utilisé en tant que receveur de vecteurs d'expression ou d'autre ADN transféré. On peut également contraindre des cellules hôtes à exprimer une protéine par injection directe d'ARNc exogène, pouvant être traduit en la pro- téine d'intérêt. Une cellule hôte préférée est l'ovocyte de Xenopus.
Le terme "transformé" se réfère à toute méthode connue pour l'insertion de séquences d'ADN ou d'ARN étran- ger dans une cellule hôte procaryote. Le terme "trans- fecté" se réfère à toute méthode connue pour l'insertion de séquences d'ADN ou d'ARN étranger dans une cellule hôte eucaryote. De telles cellules transformées ou transfectées comprennent des cellules transformées ou transfectées de façon stable, dans lesquelles l'ADN inséré est rendu capable de réplication dans la cellule hôte. Elles com- prennent également des cellules exprimant temporairement, qui expriment pendant des durées limitées l'ADN ou l'ARN inséré. La technique de transformation ou de transfection dépend de la cellule hôte qui est transformée.
Elle peut comprendre l'encapsidation du polynucléotide dans un virus ainsi que l'introduction directe du polynucléotide, comme par exemple par lipofection ou micro-injection. La trans- formation ou la transfection peut entraîner l'incorpora- tion de l'ADN inséré dans le génome de la cellule hôte ou le maintien de l'ADN inséré dans la cellule hôte, sous
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forme de plasmide. Des méthodes de transformation sont bien connues dans la technique et comprennent, mais sans se limiter à celles-ci, l'infection virale, l'électropora- tion, la lipofection et l'introduction directe provoquée par le phosphate de calcium.
Il doit être entendu que la présente invention est destinée à inclure d'autres formes de vecteurs d'expres- sion, de cellules hôtes et de techniques de transformation servant à des fonctions équivalentes et bien connues dans la technique.
L'invention concerne également un essai d'inhibi- teurs de la nouvelle protéine de canal sodique résistante à la TTX, comprenant la mise en contact d'un composé, sou- pçonné être un inhibiteur, avec un canal sodique exprimé, et la mesure de l'activité du canal sodique. Le composé -peut être un composé pratiquement pur d'origine synthé- tique, mis en contact dans un milieu aqueux, ou le composé peut être une substance existant dans la nature, de sorte que le milieu d'essai est un extrait d'origine biologique, comme par exemple un extrait de cellules végétales, ani- males ou microbiennes.
L'activité PN5 peut être mesurée par des méthodes telles que l'électrophysiologie (mise sous tension à l'aide de deux électrodes ou mise sous ten- sion par patch clamp de cellules entières à l'aide d'une seule électrode), essais de flux d'ions guanidinium et essais de liaison à des toxines. Un "inhibiteur" est défini en général par la quantité entraînant une diminu- tion de plus de 50 % de l'activité PNS, de préférence une diminution de plus de 70 % de l'activité PN5, encore mieux une diminution de plus de 90 % de l'activité PN5.
Il existe de nombreuses utilisations de l'inven- tion, dont quelques unes sont décrites ci-dessous: 1. Sonde pour canaux mammaliens
Comme mentionné plus haut, on pense que des homo- logues supplémentaires du nouveau canal sodique de rat
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résistant à la TTX, décrit ici, sont également exprimés dans un tissu mammalien, en particulier dans un tissu humain. On peut utiliser comme sonde les ADNc entiers de canaux sodiques PN5 de rat de la présente invention pour découvrir s'il existe dans le tissu humain de nouveaux canaux sodiques supplémentaires, dépendants du potentiel, de préférence résistants à la TTX, et, s'ils existent, pour faciliter l'isolement des ADNc codant pour la pro- téine humaine.
Les homologues humains des canaux PN5 de rat, résistants à la TTX, peuvent être clones à l'aide d'une banque d'ADNc de GRD humain. Les GRD humains sont obtenus lors d'une autopsie. On homogénéise le tissu congelé et on extrait l'ARN avec de l'isothiocyanate de guanidine [Chirgwin et coll., Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)].
L'ARN est fractionné en fonction de la taille sur un gra- dient de saccharose, pour l'enrichissement en ARNm de grande taille, car les sous-unités a du canal sodique sont codées par des transcrits de grande taille (7-11 kb). On prépare de l'ADNc double brin en utilisant le nécessaire d'ADNc SuperScript Choice (GIBCO BRL) avec de l'oligo(dT) ou des amorces hexamères au hasard. On ligature les se- gments de liaison EcoRI sur l'ADNc double brin, qui est ensuite phosphorylé. On construit la banque d'ADNc par ligature de l'ADNc double brin dans le vecteur bactério- phage X ZAP II (Stratagene), suivie d'encapsidation dans des particules phagiques.
On étale les phages sur des plaques de 150 mm, sur un tapis de bactéries XLI-Blue MRF' (Stratagene) et on fait des répliques des plages sur des membranes en Nylon Hybond N (Amersham). Les filtres sont hybridés avec des sondes d'ADNc de PN5 de rat, par des techniques clas- siques, et détectés par autoradiographie ou chimilumines- cence. Le signal produit par les sondes PN5 de rat s'hy- bridant avec des clones humains positifs, à une forte
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stringence, devrait être plus fort que ceux obtenus avec des sondes de canal sodique de cerveau de rat s'hybridant avec ces clones. Les plages positives sont purifiées davantage par dilution limitante et criblées à nouveau par hybridation ou PCR.
La cartographie de restriction et la réaction d'amplification en chaîne par polymérase identi- fieront des clones chevauchants qui peuvent être assemblés par des techniques classiques en l'homologue humain com- plet de PNS de rat. Le clone humain peut être exprimé par injection d'ARNc trancrit in vitro à partir du clone d'ADNc complet dans des ovocytes de Xenopus, ou par trans- fection d'une lignée cellulaire mammalienne avec un vec- teur contenant l'ADNc lié à un promoteur approprié.
2. Anticorps contre PN5
Les polypeptides de l'invention sont très utiles pour la production d'anticorps dirigés contre PNS. Ces anticorps peuvent être utilisés dans une chromatographie d'affinité pour purifier des protéines recombinantes ou des polypeptides recombinants de canaux sodiques, ou ils peuvent être utilisés en tant qu'outil de recherche. Par exemple, des anticorps fixés à une molécule rapporteuse peuvent être utilisés dans des techniques de coloration histochimique, pour identifier d'autres tissus et d'autres types cellulaires dans lesquels les PN5 sont présents, ou ils peuvent être utilisés pour identifier des régions fonctionnelles ou d'épitopes de la protéine de canal sodique de l'invention.
Les anticorps peuvent être monoclonaux ou poly- clonaux et peuvent être produits par des techniques qui sont bien connues dans le domaine. Des anticorps poly- clonaux sont produits comme suit : utilise un conjugué immunogène, comprenant PN5 ou un fragment de celui-ci, éventuellement lié à une protéine porteuse, pour immuniser un mammifère choisi, tel que la souris, le rat, la chèvre, etc. On recueille et traite selon des techniques connues
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du sérum provenant du mammifère immunisé, pour séparer la fraction d'immunoglobuline.
Des anticorps monoclonaux sont produits par la technique classique d'hybridomes, basée sur celle rapportée par Kohler et Milstein dans Nature 256,495-497 (1975). Des cellules spléniques sont obtenues à partir d'un animal hôte immunisé avec la protéine PN5 ou un frag- ment de celle-ci, éventuellement liées à une substance porteuse. Des cellules hybrides sont formées par fusion de ces cellules spléniques avec une lignée de myélome appro- priée, et cultivées. Les anticorps produits par les cel- lules hybrides sont criblés en fonction de leur aptitude à se lier à des protéines PN5 exprimées.
On peut utiliser un certain nombre de techniques de criblage bien connues dans le domaine, comme par exemple des méthodes de criblage par essai immunoenzymatique direct ou indirect utilisant un corps adsorbé. On soumet ensuite les cellules hybrides produisant de tels anticorps à un reclonage ou à des conditions de forte dilution, afin de sélectionner une cellule hybride sécrétant une popula- tion homogène d'anticorps spécifiques de l'une ou l'autre protéine de PN5.
En outre, des anticorps peuvent être suscités par clonage et expression de séquences nucléotidiques ou de versions mutées de celles-ci, codant au moins pour les séquences d'aminoacides requises pour la fixation spéci- fique d'anticorps naturels, et ces protéines exprimées peuvent être utilisées en tant qu'immunogènes. Les anti- corps peuvent comprendre l'immunoglobuline complète ou un fragment de celle-ci. Les anticorps peuvent être liés à un groupe rapporteur, comme décrit plus haut à propos des polynucléotides.
L'exemple 10 illustre la mise en pratique de la production d'un anticorps.
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3. Cibles thérapeutiques pour des composés pour le traite- ment de troubles et essais de ceux-ci
La présente invention englobe également l'utilisa- tion de la nouvelle sous-unité a de canal sodique dépen- dant du potentiel, de préférence résistante à la TTX, en tant que cible thérapeutique pour des composés destinés au traitement de troubles du système nerneux, sur la base des données de localisation de RT-PCR. Les troubles com- prennent, mais sans se limiter à ceux-ci, l'épilepsie, une lésion due à une attaque cérébrale, une lésion cérébrale, la neuropathie diabétique, une lésion traumatique, la dou- leur neuropathique chronique et la neuropathie associée au SIDA.
4. Conception d'agents thérapeutiques à base de PN5 inhi- biteur et essais de ceux-ci
La présente invention est également orientée vers l'inhibition de l'activité de PN5 dans des tissus du cer- veau, de la moelle épinière, de ganglions de la racine dorsale, de ganglions plexiformes et de ganglions cervi- caux supérieurs. Toutefois, il doit être entendu que des études ultérieures peuvent révéler que PN5 est présent dans d'autres tissus, et, en tant que tels, ces tissus peuvent également être des zones cibles. Par exemple, la détection d'ARNm de PN5 dans des ganglions plexiformes suggère que PN5 peut conduire des courants de sodium résistants à la TTX dans ces ganglions et d'autres gan- glions sensitifs du système nerveux.
En outre, il s'est avéré que des protéines qui ne sont pas normalement exprimées dans certains tissus sont exprimées dans un état pathologique. En conséquence, la présente invention est destinée à englober l'inhibition de PN5 dans des tissus et des types cellulaires dans lesquels la protéine est normalement exprimée, et dans des tissus et des types cellulaires dans lesquels la protéine n'est exprimée qu'au cours d'un état pathologique.
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Par exemple, on pense que des canaux sodiques résistants à la TTX jouent un rôle clé dans la transmis- sion d'influx nerveux en relation avec des signaux senso- riels tels que la douleur et la pression. Cette informa- tion facilitera la conception d'agents thérapeutiques qui peuvent être ciblés vers une zone déterminée, telle qu'un tissu nerveux périphérique.
La protéine recombinante de la présente invention peut être utilisée pour l'essai d'agents thérapeutiques potentiels ayant l'aptitude à inhiber le canal sodique d'intérêt. En particulier, elle serait utile pour inhiber sélectivement la fonction de canaux sodiques dans des tis- sus nerveux périphériques responsables de la transmission de signaux de douleur et de pression sans affecter en même temps la fonction de canaux sodiques dans d'autres tissus, tels que le coeur et le muscle. Une telle sélectivité per- mettrait le traitement de la douleur sans provoquer d'ef- fets secondaires dus à des complications cardiaques ou neuromusculaires. En conséquence, il serait utile d'avoir des séquences d'ADN codant pour des canaux sodiques expri- mées sélectivement dans un tissu nerveux périphérique.
5. Analgésique
Les canaux sodiques dans le tissu nerveux périphé- rique jouent un rôle important dans la transmission d'in- flux nerveux, et sont par conséquent un outil pour com- prendre la transmission de la douleur neuropathique. La douleur neuropathique se répartit en deux composantes: l'allodynie, dans laquelle un stimulus normalement non douloureux le devient, et l'hyperalgésie, dans laquelle un stimulus habituellement normalement douloureux devient extrêmement douloureux.
Dans des études de localisation tissulaire, l'ARNm de PN5 se trouve dans les petits neurones et les neurones moyens de GRD. L'ARNm de PN5 est également présent dans le cerveau et la moelle épinière. L'inhibition de ses activi-
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tés peut faciliter la prévention de troubles tels que les maux de tête et les migraines. La possibilité d'inhiber l'activité de ces canaux sodiques, c'est-à-dire de réduire la conduction d'influx nerveux, affectera l'aptitude du nerf à transmettre les influx douloureux. L'inhibition sélective des canaux sodiques dans des neurones sensitifs tels que GRD permettra l'arrêt d'influx douloureux sans effets secondaires indésirables provoqués par l'inhibition des canaux sodiques dans d'autres tissus tels que le cer- veau et le coeur.
En outre, certaines maladies sont provo- quées par des canaux sodiques qui produisent des influx à une fréquence extrêmement élevée. La possibilité de réduire l'activité du canal peut alors éliminer ou atté- nuer la maladie. En conséquence, on peut cribler des com- posés thérapeutiques potentiels par des méthodes bien con- nues dans la technique, pour découvrir s'ils peuvent inhi- ber l'activité du canal sodique recombinant de l'invention [Barram M. et coll., Naun-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 347, 125-132 (1993), et McNeal E.T. et coll., J. Med. Chem. 28, 381-388 (1985)]. Pour des études simi- laires avec le récepteur d'acétylcholine, voir Claudio et coll., Science 238, 1688-1694 (1987).
Par exemple, on peut soulager la douleur par inhi- bition de l'activité du nouveau canal sodique, de préfé- rence résistant à la TTX, par administration d'une quan- tité thérapeutiquement efficace d'un composé ayant une ci 50 d'environ 10 M ou moins, de préférence 1 M. Des composés thérapeutiques potentiels sont identifiés sur la base de leur aptitude à inhiber l'activité de PN5. En con- séquence, l'essai mentionné plus haut peut être utilisé pour identifier des composés ayant une CI 50 thérapeutique- ment efficace.
Le terme "CI50"désigne la concentration d'un com- posé qui est requise pour inhiber à 50 % l'activité de PN5 exprimée, lorsque l'activité est mesurée par électro-
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physiologie, essais de flux et essais de liaison à des toxines, comme mentionné plus haut.
6. Essais de diagnostic
Les techniques de biologie moléculaire de base uti- lisées dans la mise en oeuvre de la présente invention, telles que l'isolement d'ARN, d'ADN et de plasmides, la digestion par des enzymes de restriction, la construction et le sondage d'une banque d'ADNc, le séquençage de clones, la construction de vecteurs d'expression, la transformation de cellules, le maintien et le développe- ment de cultures cellulaires et d'autres techniques géné- rales, sont bien connues dans le domaine, et on peut trou- ver les descriptions de ces techniques dans des manuels généraux de laboratoire, tels que Molecular Cloning: A Laboratory Hanual par Sambrook et coll. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2c édition, 1989).
Par exemple, les polynucléotides de l'invention peuvent être liés à une "molécule rapporteuse", pour la formation d'une sonde polynucléotidique utile pour des analyses northern et Southern blot et des hybridations in situ.
L'expression "molécule rapporteuse" désigne une entité chimique pouvant être détectée par un moyen de détection approprié, comprenant, mais sans se limiter à ceux-ci, des moyens spectrophotométriques, chimilumines- cents, immunochimiques ou radiochimiques. Les polynucléo- tides de la présente invention peuvent être conjugués à une molécule rapporteuse par des techniques bien connues dans le domaine. Normalement, la molécule rapporteuse con- tient un groupe fonctionnel approprié à l'attachement au polynucléotide ou à l'incorporation dans celui-ci. Les groupes fonctionnels appropriés à l'attachement du groupe rapporteur sont habituellement des esters activés ou des agents d'alkylation. Des détails techniques pour l'atta- chement de groupes rapporteurs sont bien connus dans le
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domaine ; voir par exemple Matthews J.
A., Batki A., Hynds C. et Kricka L.J., Anal. Biochem. 151, 205-209 (1985) et Engelhardt et coll., EP-A-0 302 175.
La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après.
Abréviations
Les abréviations suivantes sont utilisées dans les exemples et ont les significations données ci-dessous.
ASB : albumine de sérum bovin EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique, sel tétra- sodique GRD : ganglions de la racine dorsale MEN : MOPS 20 mM, EDTA 1 mM, acétate de sodium 5 mM, pH 7,0 MOPS : acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (Sigma
Chemical Company) PN5 : canal sodique 5 de nerf périphérique SDS : dodécylsulfate de sodium SNP : système nerveux périphérique Solution de Denhardt : 0,02% d'ASB, 0,02 % de polyvinyl- pyrrolidone, 0,02 % de Ficoll (0,1 g d'ASB, 0,1 g de
Ficoll, 0,1 g de polyvinylpyrrolidone pour 500 ml) SSC : NaCl 150 mM, citrate de sodium 15 mM, pH 7,0 SSPE :
NaCl 80 mM, phosphate de sodium 10 mM, éthylènediaminetétraacétate 1 mM, pH 8,0 TEV : pince de tension à deux électrodes TTX : tétrodotoxine (Sigma Chemical Company).
EXEMPLES
Les exemples ci-après illustrent la mise en pra- tique de l'invention.
Matériels
Le plasmide pBK-CMV a été obtenu auprès de Stratagene (La Jolla, CA, USA); le plasmide pBSTA est décrit par Goldin et coll. dans Hethods in Enzymology (Rudy & Iverson éditeurs) 207, 279-297; le plasmide pCInéo
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a été obtenu auprès de Promega (Madison, WI, USA); et le plasmide pCRII a été obtenu auprès d'Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) .
Le plasmide vecteur d'expression dans des ovocytes pBSTAcIIr a été construit à partir de pBSTA par insertion d'un lieur oligonucléotidique synthétique ; le plasmide pKK232-8 a été obtenu auprès de Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA); le plasmide pCRII a été obtenu auprès d'Invitrogen (San Diego, CA, USA). Les lignées cel- lulaires de E. coli compétentes STBL2TM et SURE' ont été obtenues auprès de Gibco/BRL et Stratagene, respective- ment.
EXEMPLE 1 Obtention d'ARN à partir de GRD, de cerveau et de moelle épinière de rat
Sous un microscope à dissection, on a prélevé les GRD lombaires n 4 et n 5 (L4 et L5), le cerveau et la moelle épinière de rats Sprague-Dawley mâles adultes anes- thésiés. Les tissus ont été congelés dans de la glace car- bonique et homogénéisés à l'aide d'un homogénéisateur Polytron; on a extrait l'ARN par la méthode à l'isothio- cyanate de guanidine [voir Chomczynksi et coll., Anal.
Biochemistry 162, 156-159 (1987)]. On a dissous l'ARN total (5 g de chaque échantillon) dans du tampon MEN con- tenant 50 % de formamide, 6,6 % de formaldéhyde et déna- turé à 65 C pendant 5-10 minutes. On a soumis l'ARN à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8 % contenant 8,3 % de formaldéhyde, dans du tampon MEN. Le tampon d'électrode était du tampon MEN contenant 3,7 % de formal- déhyde ; on a fait fonctionner le gel à 50 V pendant 12- 18 heures.
On a soumis à l'électrophorèse dans des colonnes parallèles du gel des marqueurs de taille moléculaire, comprenant les ARN ribosomiques 18S et 28S et des mar- queurs d'ARN (GIBCO BRL). Leurs positions ont été détermi-
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nées par coloration au bromure d'éthidium (0,5 gg/ml) de la colonne excisée, suivie d'une photographie sous lumière UV.
Après l'électrophorèse, on a rincé le gel dans SSC 2x et on a transféré l'ARN sur une membrane de Duralose (Stratagene) avec SSC 20x, par action capillaire; la mem- brane a été chauffée sous vide pendant 1 heure à 80 C.
EXEMPLE 2 Sonde provenant de IIA de cerveau de rat
On a synthétisé in vitro une sonde d'ARNc marquée au 32P, complémentaire des nucléotides 4637-5868 de la séquence de sous-unité a de canal sodique IIA de cerveau de rat, avec de l'ARN polymérase de T7 (Pharmacia), en utilisant de l'ADN matrice de pEAF8 (Noda et coll., Nature 320,188-192 (1986) ] qui avait été linéarisé à l'aide de BstEII.
On peut trouver des protocoles pour chaque tech- nique mentionnée ci-dessus dans Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual par Sambrook et coll. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2e édition, 1989).
EXEMPLE 3 Hybridation d'ARN avec la sonde provenant de IIA de cer- veau de rat
La membrane de l'exemple 1 a été préhybridée pen- dant 16 heures à 42 C dans 50 % de formamide, SSC 5x, phosphate de sodium 50 mM, pH 7,1, solution de Denhardt lx, 0,5 % de SDS et 1 mg/ml d'ADN de spermatozoïdes de saumon cisaillé, dénaturé par la chaleur. La membrane a été hybridée pendant 18 heures à 42 C dans 50 % de forma- mide, SSC 5x, phosphate de sodium 50 mM, pH 7,1, solution de Denhardt lx, 0,5 % de SDS et 200 gg/ml d'ADN de sperma- tozoides de saumon cisaillé, dénaturé par la chaleur, avec la sonde d'ARNc marquée au 32P (environ 1-3x10 6 cpm/ml) décrite dans l'exemple 2.
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On a rincé la membrane pendant 20 minutes avec SSC 2x, 0,1 % de SDS, à la température ambiante, et on l'a ensuite lavée successivement avec SSC 2x, 0,1 % de SDS à 55 C pendant 30 minutes ; 0,2x, 0,1 % de SDS à 65 C pendant 30 minutes ; SSC 0,2x, 0,1 % de SDS à 70 C pendant 30 minutes et SSC 0,2x, 0,1 % de SDS, 0,1 % de pyro- phosphate de sodium à 70 C pendant 20 minutes. Le filtre a été exposé contre un film Kodak X-omat AR à -80 C, avec des écrans amplificateurs, pendant jusqu'à 2 semaines.
La sonde de pEAF8 s'est hybridée avec les ARNm dans l'échantillon de GRD, avec des tailles de 11 kb, 9,5 kb, 7,3 kb et 6,5 kb, estimées sur la base de leurs positions par rapport aux étalons.
EXEMPLE 4 Nouvelle sonde de domaine IV de canal sodique La sonde a été obtenue comme suit : a effectué une RT-PCR sur de l'ARN isolé à partir de GRD de rat, en utilisant des amorces oligonucléotides dégénérées qui étaient conçues sur la base des homologies entre les canaux sodiques connus dans le domaine IV. Les produits de domaine IV ont été clonés dans un vecteur plasmidique, transformés dans E. coli, et on a isolé des colonies indi- viduelles. Les produits de PCR spécifiques du domaine IV, obtenus à partir de plusieurs de ces colonies, ont été séquences individuellement.
La nouvelle séquence de domaine IV clonée était la suivante (SEQ ID n 4): 1 CTCAACATGG TTACGATGAT GGTGGAGACC GACGAGCAGG GCGAGGAGAA 51 GACGAAGGTT CTGGGCAGAA TCAACCAGTT CTTTGTGGCC GTCTTCACGG 101 GCGAGTGTGT GATGAAGATG TTCGCCCTGC GACAGTACTA TTTCACCAAC 151 GGCTGGAACG TGTTCGACTT CATAGTGGTG ATCCTGTCCA TTGGGAGTCT 201 GCTGTTTCT GCAATCCTTA AGTCACTGGA AAACTACTTC TCCCCGACGC 251 TCTTCCGGGT CATCCGTCTG GCCAGGATCG GCCGCATCCT CAGGCTGATC 301 CGAGCAGCCA AGGGGATTCG CACGCTGCTC TTCGCCCTCA TGATGTCCCT 351 GCCCGCCCTC TTCAACATCG GCCTCCTCCT CTTCCTCGTC ATGTTCATCT 401 ACTCCATCTT CGGCATGGCC AGCTTCGCTA ACGTCGTGGA CGAGGCCGGC
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451 ATCGACGACA TGTTCAACTT CAAGACCTTT GGCAACAGCA TGCTGTGCC1 501 GTTCCAGATC ACCACCTCGG CCGGCTGGGA CGGCCTCCTC AGCCCCATCC 551 TCAACACGGG GCCTCCCTAC TGCGACCCCA ACCTGCCCAA CAGCAACGGC 601
TCCCGGGGGA ACTGCGGGAG CCCGGCGGTG GGCATCATCT TCTTCACCAC 651 CTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT CAACATGTAT ATCGCAGTCA 701 TC Cette séquence a été marquée au 32P par amorçage au hasard.
EXEMPLE 5 Hybridation d'ARN avec la nouvelle sonde 3'-UTR de canal sodique
On a préparé une empreinte northern blot avec 10 g d'ARN total provenant de cerveau, de moelle épinière et de GRD de rats. L'empreinte a été hybridée avec une sonde d'ARNc provenant de la région non traduite en 3' (3'-UTR).
La 3'-UTR a été clonée dans le vecteur pSP73, et l'ARNc a été transcrit à l'aide d'un nécessaire Trans Probe T (Pharmacia Biotech) et de [32P]-UTP. L'empreinte a été préhybridée pendant 2 heures à 65 C dans une solution con- tenant SSC 5x, solution de Denhardt lx, 0,5 % de SDS, phosphate de sodium 50 mM, pH 7,1,1 mg/ml d'ADN de sper- matozoides de saumon et 50 % de formamide. L'hybridation a été effectuée à 45 C pendant 18 heures dans la solution ci-dessus, mis à part que l'ADN de spermatozoïdes de sau- mon a été inclus à une concentration de 200 g/ml et qu'on a ajouté la sonde marquée au 32P à raison de 7,5x10 cpm/ml de solution.
L'empreinte a été ensuite lavée trois fois avec SSC 2x et 0,1 % de SDS à la tempéra- ture ambiante, une fois avec SCC 0,2x et 0,1 % de SDS à 65 C pendant 20 minutes, et une fois avec SSC 0,2x, 0,1 % de SDS et 0,1 % de pyrophosphate de sodium à 65 C pendant 20 minutes. L'empreinte a été analysée sur un appareil Phospholmager (BioRad), après une exposition de 2 jours.
Les résultats ont indiqué qu'il y avait un signal de bande de - 6,5 kb, présent dans le cerveau, seulement dans la
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colonne contenant de l'ARN provenant de GRD. En raison de la faible abondance d'ARN de PN5, comme l'a montré l'essai de RT-PCR, la bande de 6,5 kb n'était pas décelable dans le cerveau ni la moelle épinière.
EXEMPLE 6 Construction et criblage d'une banque d'ADNc provenant de GRD de rat
On a préparé une banque d'ADNc adaptée à EcoRI à partir d'ARN poly(A)+ de GRD de rat Sprague-Dawley mâle adulte normal, en utilisant le système SuperScript Choice (GIBCO BRL). L'ADNc ( > 4 kb) a été sélectionné par frac- tionnement en gradient de saccharose, comme décrit par Kieffer, Gene 109, 115-119 (1991). L'ADNc a été ensuite ligaturé dans le vecteur Zap Express (Stratagene) et enca- psidé à l'aide de l'extrait d'encapsidation dans X Gigapack II XL (Stratagene). De même, on a synthétisé une banque d'ADNc de GRD de > 2 kb.
Les phages (3,5x10 ) ont été criblés par hybrida- tion sur filtre avec une sonde marquée au 32P [rBIIa, bases 4637-5868 comme suit, d'Auld et coll., Neuron 1, 449-461 (1988)]. Les filtres ont été hybridés dans 50 % de formamide, SSPE5x, solution de Denhardt 5x, 0,5 % de SDS, 250 gg/ml d'ADN de spermatozoïdes de saumon cisaillé, dénaturé, et phosphate de sodium 50 mM, à 42 C, et lavés dans SSC 0,5x/0,l % de SDS, à 50 C.
Des empreintes Southern blot de plasmides digérés par EcoRI ont été hybridées avec la sonde d'ADN marquée au 32P (SEQ ID n 4). Les filtres ont été ensuite hybridés à 42 C dans 50 % de formamide, SSC 6x, solution de Denhardt 5x, 0,5 % de SDS et 100 gg/ml d'ADN de spermatozoïdes de saumon cisaillé, dénaturé, et ont été lavés dans SSC 0, 1#/0,1 % de SDS, à 65 C.
On a excisé des clones positifs in vivo dans pBK- CMV, en utilisant le système ExAssist/XLOLR (Stratagene).
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EXEMPLE 7 Clones et analyse des nucléotides
On a isolé des clones d'ADNc, 26.2 et 25. 1, à par- tir de la banque d'ADNc, et on a isolé le clone 1. 18 à partir de la banque d'ADNc de GRD de > 2 kb. Par analyse de la séquence, 26. 2 est apparu comme étant un ADNc com- plet codant pour un nouveau canal sodique, et 25. 1 s'éten- dait du domaine II à la 3'-UTR. Toutefois, chacun compor- tait une délétion qui tronquait la région codante. Le clone 1. 18 comportait la région non traduite en 3', en plus de l'extrémité C-terminale de la séquence d'amino- acides déduite de PN5. Le produit de construction dans le vecteur d'expression pBSTACIIr consistait en séquences provenant de 26.2 et 1.18.
On a obtenu l'homologie de PN5 avec les autres canaux sodiques connus en utilisant le programme GAP/Best Fit (GCG):
EMI31.1
<tb> Canal <SEP> % <SEP> de <SEP> similarité <SEP> % <SEP> d'identité <SEP>
<tb>
<tb> PN3a <SEP> 71 <SEP> 54
<tb>
<tb> hPN3 <SEP> 71 <SEP> 55
<tb>
<tb> PN4 <SEP> 71 <SEP> 53
<tb>
<tb> PN4a <SEP> 71 <SEP> 53
<tb>
<tb> PN1 <SEP> 72 <SEP> 55
<tb>
<tb> Type <SEP> I <SEP> de <SEP> cerveau <SEP> de <SEP> rat <SEP> 72 <SEP> 55
<tb>
<tb> Type <SEP> II <SEP> de <SEP> cerveau <SEP> de <SEP> rat <SEP> 71 <SEP> 54
<tb>
<tb> Type <SEP> III <SEP> de <SEP> cerveau <SEP> de <SEP> rat <SEP> 71 <SEP> 54
<tb>
<tb> Canal <SEP> cardiaque <SEP> de <SEP> rat <SEP> 73 <SEP> 56
<tb>
<tb> Canal <SEP> de <SEP> muscle <SEP> squelet-
<tb>
<tb> tique <SEP> de <SEP> rat <SEP> 71 <SEP> 53
<tb>
Stabilisation de l'ADN complet de PN5 A.
Milieux, lignées cellulaires de E. coli et conditions de culture
La culture de fragments de PN5 a pu être réalisée dans des conditions classiques, mais la culture de plas- mides contenant des produits de construction complets de
<Desc/Clms Page number 32>
PN5 (dans pCInéo, pBSTAcIIr et d'autres vecteurs) ne pou- vait pas être effectuée sans utilisation de milieux de culture spéciaux, de conditions particulières et de souches spéciales de E. coli.
Les conditions suivantes se sont révélées être optimales : utilisation de E. coli STBL2 pour la transformation primaire après des réactions de ligature et pour une culture à grande échelle; (2) le milieu solide était FM 0,5x (voir ci-dessous) + LB lx (1 % de tryptone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % de NaCl) + 15 g/1 de gélose, ou FM lx + LB 0,5x; (3) le milieu liquide était de façon optimale FM lx + LB 0,5x; (4) on a utilisé 100 g/ml de carbénicilline pour tous les milieux, étant donné qu'elle était moins rapidement métabolisée que l'ampicilline;
(5) la température pour la croissance ne devait pas être supérieure à 30 C, normalement de 24-26 C; cela demandait de plus longues durées de culture que celles normalement utilisées, allant de 24 à 72 heures.
EMI32.1
<tb>
Milieu <SEP> de <SEP> congélation <SEP> 2x <SEP> (FM <SEP> 2x):
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 12,6 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Citrate <SEP> trisodique <SEP> 0,9 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgS04.7H20 <SEP> 0,18 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (NH4)2S04 <SEP> 1,8 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 3,6 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glycérol <SEP> 88 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> H20 <SEP> complément <SEP> à <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
FM 2x et les composants restants du milieu sont préparés séparément, stérilisés par passage à l'autoclave, refroi- dis jusqu'à au moins 60 C, et ajoutés ensemble pour la formation du milieu final. La carbénicilline est préparée à raison de 25 mg/ml de H20 et stérilisée par filtration.
FM 2x a été décrit en premier lieu pour la préparation de suspensions, de base congelées de cellules bactériennes [Practical Methods in Molecular Biology, Schleif R.F.et Wensing P.C., Springer-Verlag, New York (1981), p. 201- 202] .
<Desc/Clms Page number 33>
B. Vecteurs d'expression
Afin d'obtenir une stabilité accrue de l'ADNc com- plet, on a modifié le vecteur d'expression pBSTAcIIr d'ovocytes pour réduire le nombre de copies de plasmides lors de la culture dans E. coli et pour réduire la pour- suite de la transcription à partir de séquences du vec- teur, qui pourrait conduire à une expression cryptique toxique de la protéine PN5 [Brosius J., Gène 27, 151-160 (1984)]. On a fait digérer pBSTAcIIr par PvuII. Le frag- ment de 755 pb, contenant le promoteur de T7, la 5'-UTR de ss-globine, le site de clonage multiple, la 3'-UTR de ±-globine et le promoteur de T3, a été ligaturé avec le fragment de 3,6 kb contenant l'origine de réplication, le gène de résistance à l'ampicilline,
les terminateurs de transcription rrnBT et rrnBT1T2 de pKK232-8, qui avait été digéré complètement par SmaI et digéré partiellement par PvuII et traité par de la phosphatase intestinale de crevette pour empêcher l'autoligature. Le plasmide résul- tant, dans lequel l'orientation du fragment pBSTA était telle que le promoteur de T7 était le plus rapproché du terminateur rrnBT , a été identifié par cartographie de restriction, est dénommé pHQ8.
Comme dans le cas de pBSTA, le sens de la transcription du gène de résistance à l'am- picilline et de l'origine de réplication de pHQ8 est opposé à celui de la cassette d'expression du gène, et la présence du terminateur rrnBTl devrait réduire toute poursuite de lecture restante à partir du vecteur, dans la cassette d'expression conduite par le promoteur de T7.
C. Assemblage d'ADNc complet pour l'expression
Etant donné que pBK-CMV.26.2 comporte une délétion de 58 pb (correspondant aux pb 4346 à 4403 de SEQ ID n 1) et que la séquence de pBK-CMV.1.18 commence au niveau de la pb 4180 de SEQ ID n 1, pBK-CMV. 1.18 pouvait être uti- lisé pour "réparer" pBK-CMV.26.2. On a mis au point une stratégie pour assembler un ADNc complet provenant des
<Desc/Clms Page number 34>
clones pBK-CMV.26.2 et pBK-CMV.1.18 en trois segments, en tronquant la 5'-UTR et la 3'-UTR et en introduisant des sites de restriction uniques aux extrémités 5' et 3' dans le processus. L'extrémité 5' a été engendrée par PCR à partir de 26. 2, en tronquant la 5'-UTR, par incorporation d'un site SalI juste en amont du codon d'initiation. Le segment central était un fragment de restriction provenant de 26.2.
L'extrémité 3' a été préparée par PCR de chevau- chement à partir de 26. 2 et 1. 18, et incorporation d'un site XbaI juste en aval du codon d'arrêt. On a fait digé- rer ces segments au niveau de sites uniques de restric- tion, et on les a assemblés dans pBSTAcIIr. Ce produit de construction semblait avoir une séquence correcte, mais, après reclonage en tant que fragment SalI-XbaI dans pCInéo, on a trouvé deux types d'isolats, un comportant une délétion et un comportant une insertion de 8 pb. Un nouvel examen du clone pBSTAcIIr a montré que la séquence était "mixte" dans cette région, de sorte que le clone devait avoir été réarrangé. On a découvert que l'insertion de 8 pb était une répétition de l'un des membres d'une duplication de 8 pb dans la séquence native, formant une triple répétition de 8 pb dans l'isolat réarrangé.
De nom- breuses tentatives de clonage ont inévitablement donné naissance à ce réarrangement. On a utilisé la PCR de che- vauchement pour introduire des mutations silencieuses dans l'une des répétitions de 8 pb, et un fragment contenant cette région a été inclus lorsque la région codant pour PN5 a été assemblée dans HQ8, la version à faible nombre de copies de pBSTAcIIr, pour donner le plasmide HR-1.
Cette séquence s'est avérée être stable (voir figures 5A-E, SEQ ID n 5) .
On a préparé le fragment de l'extrémité 5' par PCR, en utilisant comme matrice l'ADN de pBK-CMV. 26.2 et les amorces 4999 (CTTGGTCGACTCTAGATCAGGGTGAAGATGGAGGAG; site sali souligné, homologie avec PN5 en italiques, correspon-
<Desc/Clms Page number 35>
dant aux pb 58-77 de SEQ ID n 1; codon d'initiation en gras) et 4927 (GTCTTCTAGATGAGGGTTCAGTCATTGTG, correspondan aux pb 1067 à 1047 de SEQ ID N 1), suivie de purification e gel, digestion par SalI et KpnI (site KpnI au niveau des pb 1003-1008, SEQ ID n 1) et purification en gel.
Le fragment central de 3,1 kb a été préparé par digestion de l'ADN de pBK-CMV. 26.2 par KpnI et AatII (site AatII à 4133-4138), suivie d'une purification en gel.
Le fragment de l'extrémité 3' a été préparé comme suit : la PCR à l'aide des amorces 4837 (TCTGGGAAGTTTGGAAG, correspondant aux pb 3613 à 3629 de SEQ ID n 1) et 4931 (GACCACGAAGGCTATGTTGAGG, correspondant aux pb 4239 à 4218 de SEQ ID n 1) sur l'ADN de pBK-CMV. 26.2 en tant que matrice a donné un fragment de 0,6kb. La PCR, à l'aide des amorces 4930 (CCTCAACATAGCCTTCGTGGTC, correspondant aux pb 4218 à 4239 de SEQ ID n 1) et 4929 (GTCTTCTAGATGAGGGTTCAGTCATTGTG, site XbaI souligné, homo- logie avec PNR en italiques, correspondant aux pb 5386 à 5365 de SEQ ID n 1, codon d'arrêt en gras) sur l'ADN de pBK-CMV.1.18 en tant que matrice, a donné un fragment de 1,2 kb, introduisant un site XbaI à 7 pb du codon d'arrêt.
L'extrémité 3' du fragment 4837-4931 complète donc exacte- ment l'extrémité 5' du fragment 4930-4929. Ces deux frag- ments ont été purifiés en gel, et une fraction de chaque a été réunie en tant que matrice dans une réaction PCR, à l'aide des amorces 4928 (CAAGCCTTTGTGTTCGAC, correspondant aux pb 4084 à 4101 de SEQ ID n 1) et 4929, pour donner un fragment de 1,3 kb. Ce fragment a été purifié en gel, digéré par AatII et XbaI, et le fragment de 1,2 kb a été purifié en gel.
Le fragment de l'extrémité 3' a été cloné dans pBSTAcIIr digéré par AatII et XbaI. Un isolat a été digéré par SalI et KpnI et ligaturé avec le fragment de l'extré- mité 5'. Le plasmide résultant, après vérification de la séquence, a été digéré par KpnI et AatII et ligaturé avec
<Desc/Clms Page number 36>
le fragment central de 3,1 kb, pour donner pBSTAcIIr.PNS (clone 21). pBSTAcIIr.PNS (clone 21) a été digéré par sali et XbaI, pour libérer le fragment PN5 de 5,3 kb, qui a été clone dans pCInéoII digéré par SalI et XbaI. On a trouvé de multiples isolats, dont GPII-1, qui a été séquence com- plètement, était caractéristique et contenait un insert de 8 pb.
Cet insert CAGAAGAA, après la pb 3994 de SEQ ID n 1, convertissait la répétition directe de cette séquence en cet emplacement en une triple répétition directe, provoquant un déplacement dans le cadre de lec- ture. Dans une tentative pour réparer ce défaut, on a fait digérer pBSTAcIIr.PN5 (clone 21) par NheI (pb 2538-2543, SEQ ID n 1) et XhoI (pb 4828-4833, SEQ ID n 1), pour obtenir un fragment de 6,2 kb, et avec AatII et XhoI, pour obtenir un fragment de 0,7 kb qui a été ligaturé avec le fragment de 1,6 kb résultant de la digestion de pBK-CMV. 26.2 par AatII et NheI. Bien qu'on n'ait trouvé aucun isolat totalement correct, un isolat, HA-4, compor- tait seulement un seul changement de base, une délétion de la C à la pb 4827 (SEQ ID n 1), adjacente au site XhoI.
Afin d'éviter que se produise le réarrangement par insertion de 8 pb, on a introduit trois mutations silen- cieuses dans la répétition en 5', et deux mutations sup- plémentaires dans une série de T seraient également intro- duites, comme indiqué ci-dessous (pb 3982 à 4014, SEQ ID n 1; sites de mutation soulignés, répétitions de 8 pb dans la séquence native en italiques):
séquence native GAC ATT TTT ATG ACA GAA GAA CAG AAG AAA TA
Asp Ile Phe Met Thr Glu Glu Gln Lys Lys Ty séquence mutante GAC ATC TTC ATG ACT GAG GAG CAG AAG AAA T
Etant donné que l'isolat HA-4 comportait la séquence répétée directe native [par opposition à, par exemple, pBSTAcIIr.PNS (clone 21) ] et que la région voi- sine du défaut du site XhoI n'était pas impliquée, on l'a utilisé comme ADN matrice pour les réactions PCR sui-
<Desc/Clms Page number 37>
vantes. L'amorce P5-3716S (CCGAAGCCAATGTAACATTAGTAATTACTCGTG, correspondant aux pb 3684 à 3716, SEQ ID n 1) a été appariée avec l'amorce P5-3969AS (GCTCCTCAGTCATGAAGATGTCTTGGCCACCTAAC, correspon- dant aux pb 4003 à 3969, SEQ ID n 1, les bases mutées sont soulignées), pour donner un produit de 320 pb.
L'amorce P5-4017S (GGCCAAGACATCTTCATGACTGAGGAGCAGAAGAAATATTAC, correspondant aux pb 3976 à 4017, SEQ ID n 1; les bases mutées sont soulignées) a été appariée avec l'amorce P5-4247AS (CTCAAAGCAAAGACTTTGATGAGACACTCTATGG, correspondant aux pb 4280 à 4247, SEQ ID n 1), pour donner un produit de 305 pb. L'extrémité 3' du fragment de 320 pb avait donc un segment de 28 pb correspondant exactement à l'extrémité 5' du fragment de 305 pb. Les deux bandes ont été purifiées en gel, et une fraction de chaque a été réunie, dans une nouvelle réaction PCR, avec les amorces P5-3716S et P5-4247AS, pour donner un produit de 597 pb, qui a été clone T/A dans le vecteur pCRII. On a trouvé l'isolat HO-7, qui avait la séquence recherchée.
On a effectué une quadruple ligature pour assembler le PN5 modifié complet:
On a fait digérer par SalI et XbaI le vecteur d'ex- pression HQ-8 dans des ovocytes, pour obtenir un fragment vecteur de 4,4 kb, GPII-1; on a fait digérer GPII-1 par SalI et MluI, pour obtenir un fragment de 3,8 kb contenant la moitié 5' de PN5; on a fait digérer HO-7 par MluI (pb 3866 à 3871, SEQ ID n 1) et AatII, pour obtenir un frag- ment de 0,3 kb contenant la région répétée de 8 pb mutante de PN5; on a fait digérer GPII-1 par AatII et XbaI, pour obtenir le segment 3' restant de 1,3kb de PNS. Une partie du mélange réactionnel de ligature a été transformé dans des cellules Stable 2 de E. coli.
Parmi les isolats de 9,6 kb contenant tous les quatre fragments, HR-1 a été séquence et s'est révélé comporter la séquence de 5,4 kb recherchée. Ces isolats se développaient bien et ne mani-
<Desc/Clms Page number 38>
festaient pas de tendance au réarrangement. La séquence de cette version construite de PN5 est représentée sur les figures 5A-E (SEQ ID n 5) .
EXEMPLE 8 PNR humain
On a isolé un clone de 856 pb (figure 3A, SEQ ID n 3) à partir d'une banque d'ADNc de ganglions de la racine dorsale (GRD) humains, qui est très étroitement apparenté à PN5 de rat, avec une identité de 79 % en ce qui concerne la séquence d'aminoacides. La séquence de PN5 humain couvre la région entre IIIS1 et l'interdomaine III/IV, qui comprend la vanne d'inactivation rapide (à savoir IFM), qui est localisée dans l'interdomaine III/IV.
On a construit la banque d'ADNc de GRD à partir d'ARN total de GRD 4 et 5 lombaires qui était amorcé au hasard. L'ADNc du premier brin a été synthétisé à l'aide de transcriptase inverse SuperScript II (GIBCO BRL), et la synthèse du second brin a été effectuée à l'aide d'ADN polymérase de T4. Des segments de raccord EcoRI ont été ligaturés avec les extrémités des ADNc double brin, et les fragments ont été clonés dans le vecteur ZAP II (Stratagene). La banque a été criblée à l'aide de PN3 de rat marqué à la digoxigénine, PNl de rat et des sondes hHl de coeur humain. Les clones positifs ont été séquences et comparés à des séquences connues de canaux sodiques humains et de rat. Seul le clone précité a été identifié en tant que séquence de PN5 humain.
EMI38.1
<tb>
Canal <SEP> % <SEP> de <SEP> similarité <SEP> % <SEP> d'identité
<tb>
<tb> Cerveau <SEP> humain <SEP> (HBA) <SEP> 76 <SEP> 69
<tb>
<tb> Coeur <SEP> humain <SEP> (hHl) <SEP> 81 <SEP> 74
<tb>
<tb> Coeur <SEP> atypique <SEP> humain <SEP> 60 <SEP> 52
<tb>
<tb> Muscle <SEP> squelettique <SEP> humain <SEP> 80 <SEP> 71
<tb>
<tb> Neuroendocrine <SEP> humaine <SEP> 78 <SEP> 71
<tb>
<tb> PN3 <SEP> humain <SEP> 77 <SEP> 70
<tb>
<tb> PN1 <SEP> de <SEP> rat <SEP> 79 <SEP> 72
<tb>
<Desc/Clms Page number 39>
EMI39.1
<tb> Canal <SEP> % <SEP> de <SEP> similarité <SEP> % <SEP> d'identité
<tb>
<tb> PN3 <SEP> de <SEP> rat <SEP> 78 <SEP> 71
<tb>
<tb> PN4 <SEP> de <SEP> rat <SEP> 78 <SEP> 70
<tb>
<tb> PN5 <SEP> de <SEP> rat <SEP> 86 <SEP> 79
<tb>
La figure 3B compare la séquence d'aminoacides du fragment hPN5 avec la séquence d'aminoacides de PN5 de rat,
dans la région appropriée.
EXEMPLE 9 Distribution tissulaire par RT-PCR
On a isolé à partir de rats Sprague-Dawley mâles adultes normaux, anesthésiés, des tissus de cerveau, de moelle épinière, de GRD, de ganglions plexiformes, de gan- glions cervicaux supérieurs, de nerf sciatique, de coeur et de muscle squelettique, et on les a conservés à -80 C.
On a isolé l'ARN de chaque tissu à l'aide de RNAzol (Tel- Test Inc.). L'ADNc amorcé au hasard a été transcrit par transcription inverse à partir de 500 mg d'ARN provenant de chaque tissu. L'amorce directe (CAGATTGTGTTCTCAGTACATTCC) et l'amorce inverse (CCAGGTGTCTAACGAATAAATAGG) ont été conçues à partir de la région non traduite en 3', pour donner un fragment de 252 paires de bases. Les paramètres de cycle étaient 94 C/2 minutes (dénaturation), 94 C/30 s, 65 C/30 s et 72 C/1 min (35 cycles) et 72 C/4 min. Les produits de réaction ont été analysés sur un gel d'agarose à 4 %.
Un témoin positif et un témoin sans matrice ont été également inclus. On a également amplifié par pCR de l'ADNc provenant de chaque tissu, en utilisant des amorces spécifiques de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogé- nase, pour montrer la viabilité de la matrice, comme décrit par Tso et coll., Nucleic. Acid Res. 13,2485-2502 (1985) .
Le profil de distribution tissulaire de rPN5 par analyse par RT-PCR d'ARN provenant de tissus choisis de rat, était le suivant :
<Desc/Clms Page number 40>
EMI40.1
<tb> Tissu <SEP> RT-PCR <SEP> (35 <SEP> cycles)
<tb> Cerveau <SEP> +
<tb>
<tb> Moelle <SEP> épinière <SEP> +
<tb>
<tb> GRD <SEP> +++
<tb>
<tb> Ganglions <SEP> plexiformes <SEP> +++
<tb>
<tb> Ganglions <SEP> cervicaux <SEP> supérieurs <SEP> +
<tb>
<tb> Nerf <SEP> sciatique-
<tb>
<tb> Coeur-
<tb>
<tb> Muscle <SEP> squelettique-
<tb>
<tb> Fil <SEP> non <SEP> traité <SEP> +
<tb>
<tb> Fil <SEP> traité <SEP> +
<tb>
PN5 a été également détecté après seulement 25 cycles (24 + 1) dans les mêmes cinq tissus que ci- dessus, en la même abondance relative.
EXEMPLE 10 Anticorps
Un peptide synthétique (26 aminoacides dans les interdomaines II et III - résidus 977 à 1002) a été conju- gué avec KLH et l'anticorps a été suscité chez des lapins.
L'antisérum a été ensuite purifié par affinité. PN5 con- stitue une sous-famille de nouveaux gènes de canaux sodiques ; ces gènes sont différents de ceux détectables avec d'autres sondes (par exemple les sondes PEAF8 et PN3) .
Il doit être bien entendu que la description qui précède n'a été donnée qu'à titre illustratif et non limi- tatif et que toutes variantes ou modifications peuvent y être apportées sans sortir pour autant du cadre général de présente invention, tel que défini dans les revendications ci-annexées.
<Desc/Clms Page number 41>
LISTE DES SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (I) DEMANDERESSE : (A) NOM : HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) RUE : 124 (C) VILLE: Bâle (D) ETAT : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : (G) TELEPHONE : (H) TELECOPIEUR : 061-6881395(I) TELEX : 962292/965542 hlr ch (II) TITRE DE L'INVENTION : d'ADN codant pour une protéine de canal sodique, sa production et son utilisation (III) NOMBRE DES SEQUENCES : (IV) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disquesouple (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION : (D) LOGICIEL: PatentIn Release n 1. 0, version
1. 30 (2) INFORMATIONS POUR SEQ ID n 1 :
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:' (A) LONGUEUR : 908 paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) TYPE DE BRIN : (D) TOPOLOGIE : linéaire(II) TYPE DE MOLECULE: ADNc (III) HYPOTHETIQUE : (IV) ANTISENS : (VI) SOURCE D'ORIGINE: (A) ORGANISME : (B) TYPE DE TISSU : de la racine dor- sale
<Desc/Clms Page number 42>
(C) TYPE DE CELLULE : périphérique (XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
ID n 1 :
1 GAAGTCACAG GAGTGTCTGT CAGCGAGAGG AAGAAGGGAG AGTTTACTGA
51 GTGTCTTCTG CCCCTCCTCA GGGTGAAGAT GGAGGAGAGG TACTACCCGG
101 TGATCTTCCC GGACGAGCGG AATTTCCGCC CCTTCACTTC CGACTCTCTG
151 GCTGCCATAG AGAAGCGGAT TGCTATCCAA AAGGAGAGGA AGAAGTCCAA
201 AGACAAGGCG GCAGCTGAGC CCCAGCCTCG GCCTCAGCTT GACCTAAAGG
251 CCTCCAGGAA GTTACCTAAG CTTTATGGTG ACATTCCCCC TGAGCTTGTA
301 GCGAAGCCTC TGGAAGACCT GGACCCATTC TACAAAGACC ATAAGACATT
351 CATGGTGTTG AACAAGAAGA GAACAATTTA TCGCTTCAGC GCCAAGCGGG
401 CCTTGTTCAT TCTGGGGCCT TTTAATCCCC TCAGAAGCTT AATGATTCGT
451 ATCTCTGTCC ATTCAGTCTT TAGCATGTTC ATCATCTGCA CGGTGATCAT
501 CAACTGTATG TTCATGGCGA ATTCTATGGA GAGAAGTTTC GACAACGACA
551 TTCCCGAATA CGTCTTCATT GGGATTTATA TTTTAGAAGC TGTGATTAAA
601 ATATTGGCAA GAGGCTTCAT TGTGGATGAG TTTTCCTTCC TCCGAGATCC
651 GTGGAACTGG CTGGACTTCA TTGTCATTGG AACAGCGATC
GCAACTTGTT 701 TTCCGGGCAG CCAAGTCAAT CTTTCAGCTC TTCGTACCTT CCGAGTGTTC 751 AGAGCTCTGA AGGCGATTTC AGTTATCTCA GGTCTGAAGG TCATCGTAGG
801 TGCCCTGCTG CGCTCGGTGA AGAAGCTGGT AGACGTGATG GTCCTCACTC
851 TCTTCTGCCT CAGCATCTTT GCCCTGGTCG GTCAGCAGCT GTTCATGGGA
901 ATTCTGAACC AGAAGTGTAT TAAGCACAAC TGTGGCCCCA ACCCTGCATC
951 CAACAAGGAT TGCTTTGAAA AGGAAAAAGA TAGCGAAGAC TTCATAATGT 1001 GTGGTACCTG GCTCGGCAGC AGACCCTGTC CCAATGGTTC TACGTGCGAT 1051 AAAACCACAT TGAACCCAGA CAATAATTAT ACAAAGTTTG ACAACTTTGG 1101 CTGGTCCTTT CTCGCCATGT TCCGGGTTAT GACTCAAGAC TCCTGGGAGA 1151 GGCTTTACCG ACAGATCCTG CGGACCTCTG GGATCTACTT TGTCTTCTTC
<Desc/Clms Page number 43>
1201 TTCGTGGTGG TCATCTTCCT GGGCTCCTTC TACCTGCTTA ACCTAACCCT 1251 GGCTGTTGTC ACCATGGCTT ATGAAGAACA GAACAGAAAT GTAGCTGCTG 1301 AGACAGAGGC
CAAGGAGAAA ATGTTTCAGG AAGCCCAGCA GCTGTTAAGG 1351 GAGGAGAAGG AGGCTCTGGT TGCCATGGGA ATTGACAGAA GTTCCCTTAA 1401 TTCCCTTCAA GCTTCATCCT TTTCCCCGAA GAAGAGGAAG TTTTTCGGTA 1451 GTAAGACAAG AAAGTCCTTC TTTATGAGAG GGTCCAAGAC GGCCCAAGCC 1501 TCAGCGTCTG ATTCAGAGGA CGATGCCTCT AAAAATCCAC AGCTCCTTGA 1551 GCAGACCAAA CGACTGTCCC AGAACTTGCC AGTGGATCTC TTTGATGAGC 1601 ACGTGGACCC CCTCCACAGG CAGAGAGCGC TGAGCGCTGT CAGTATCTTA 1651 ACCATCACCA TGCAGGAACA AGAAAAATTC CAGGAGCCTT GTTTCCCATG 1701 TGGGAAAAAT TTGGCCTCTA AGTACCTGGT GTGGGACTGT AGCCCTCAGT 1751 GGCTGTGCAT AAAGAAGGTC CTGCGGACCA TCATGACGGA TCCCTTTACT 1801 GAGCTGGCCA TCACCATCTG CATCATCATC AATACCGTTT TCTTAGCCGT 1851 GGAGCACCAC AACATGGATG ACAACTTAAA GACCATACTG AAAATAGGAA 1901 ACTGGGTTTT CACGGGAATT TTCATAGCGG AAATGTGTCT CAAGATCATC 1951 GCGCTCGACC CTTACCACTA CTTCCGGCAC GGCTGGAATG TTTTTGACAG 2001 CATCGTGGCC CTCCTGAGTC TCGCTGATGT GCTCTACAAC
ACACTGTCTG 2051 ATAACAATAG GTCTTTCTTG GCTTCCCTCA GAGTGCTGAG GGTCTTCAAG 2101 TTAGCCAAAT CCTGGCCCAC GTTAAACACT CTCATTAAGA TCATCGGCCA 2151 CTCCGTGGGC GCGCTTGGAA ACCTGACTGT GGTCCTGACT ATCGTGGTCT 2201 TCATCTTTTC TGTGGTGGGC ATGCGGCTCT TCGGCACCAA GTTTAACAAG 2251 ACCGCCTACG CCACCCAGGA GCGGCCCAGG CGGCGCTGGC ACATGGATAA
2301 TTTCTACCAC TCCTTCCTGG TGGTGTTCCG CATCCTCTGT GGGGAATGGA
2351 TCGAGAACAT GTGGGGCTGC ATGCAGGATA TGGACGGCTC CCCGTTGTGC
2401 ATCATTGTCT TTGTCCTGAT AATGGTGATC GGGAAGCTTG TGGTGCTTAA 2451 CCTCTTCATT GCCTTGCTGC TCAATTCCTT CAGCAATGAG GAGAAGGATG
<Desc/Clms Page number 44>
2501 GGAGCCTGGA AGGAGAGACC AGGAAAACCA AAGTGCAGCT AGCCCTGGAT 2551 CGGTTCCGCC GGGCCTTCTC CTTCATGCTG CACGCTCTTC AGAGTTTTTG 2601 TTGCAAGAAA TGCAGGAGGA AAAACTCGCC AAAGCCAAAA GAGACAACAG 2651 AAAGCTTTGC
TGGTGAGAAT AAAGACTCAA TCCTCCCGGA TGCGAGGCCC 2701 TGGAAGGAGT ATGATACAGA CATGGCTTTG TACACTGGAC AGGCCGGGGC 2751 TCCGCTGGCC CCACTCGCAG AGGTAGAGGA CGATGTGGAA TATTGTGGTG 2801 AAGGCGGTGC CCTACCCACC TCACAACATA GTGCTGGAGT TCAGGCCGGT 2851 GACCTCCCTC CAGAGACCAA GCAGCTCACT AGCCCGGATG ACCAAGGGGT 2901 TGAAATGGAA GTATTTTCTG AAGAAGATCT GCATTTAAGC ATACAGAGTC 2951 CTCGAAAGAA GTCTGACGCA GTGAGCATGC TCTCGGAATG CAGCACAATT 3001 GACCTGAATG ATATCTTTAG AAATTTACAG AAAACAGTTT CCCCCAAAAA 3051 GCAGCCAGAT AGATGCTTTC CCAAGGGCCT TAGTTGTCAC TTTCTATGCC 3101 ACAAAACAGA CAAGAGAAAG TCCCCCTGGG TCCTGTGGTG GAACATTCGG 3151 AAAACCTGCT ACCAAATCGT GAAGCACAGC TGGTTTGAGA GTTTCATAAT 3201 CTTTGTTATT CTGCTGAGCA GTGGAGCGCT GATATTTGAA GATGTCAATC 3251 TCCCCAGCCG GCCCCAAGTT GAGAAATTAC TAAGGTGTAC CGATAATATT 3301 TTCACATTTA TTTTCCTCCT GGAAATGATC CTGAAGTGGG TGGCCTTTGG 3351 ATTCCGGAGG TATTTCACCA GTGCCTGGTG CTGGCTTGAT TTCCTCATTG 3401
TGGTGGTGTC TGTGCTCAGT CTCATGAATC TACCAAGCTT GAAGTCCTTC
3451 CGGACTCTGC GGGCCCTGAG ACCTCTGCGG GCGCTGTCCC AGTTTGAAGG
3501 AATGAAGGTT GTCGTCTACG CCCTGATCAG CGCCATACCT GCCATTCTCA
3551 ATGTCTTGCT GGTCTGCCTC ATTTTCTGGC TCGTATTTTG TATCTTGGGA
3601 GTAAATTTAT TTTCTGGGAA GTTTGGAAGG TGCATTAACG GGACAGACAT
3651 AAATATGTAT TTGGATTTTA CCGAAGTTCC GAACCGAAGC CAATGTAACA
3701 TTAGTAATTA CTCGTGGAAG GTCCCGCAGG TCAACTTTGA CAACGTGGGG
3751 AATGCCTATC TCGCCCTGCT GCAAGTGGCA ACCTATAAGG GCTGGCTGGA
<Desc/Clms Page number 45>
3801 AATCATGAAT GCTGCTGTCG ATTCCAGAGA GAAAGACGAG CAGCCGGACT 3851 TTGAGGCGAA CCTCTACGCG TATCTCTACT TTGTGGTTTT TATCATCTTC 3901 GGCTCCTTCT TTACCCTGAA CCTCTTTATC GGTGTTATTA TTGACAACTT 3951 CAATCAGCAG CAGAAAAAGT TAGGTGGCCA AGACATTTTT ATGACAGAAG 4001 AACAGAAGAA ATATTACAAT GCAATGAAAA AGTTAGGAAC
CAAGAAACCT 4051 CAAAAGCCCA TCCCAAGGCC CCTGAACAAA TGTCAAGCCT TTGTGTTCGA 4101 CCTGGTCACA AGCCAGGTCT TTGACGTCAT CATTCTGGGT CTTATTGTCT 4151 TAAATATGAT TATCATGATG GCTGAATCTG CCGACCAGCC CAAAGATGTG 4201 AAGAAAACCT TTGATATCCT CAACATAGCC TTCGTGGTCA TCTTTACCAT 4251 AGAGTGTCTC ATCAAAGTCT TTGCTTTGAG GCAACACTAC TTCACCAATG 4301 GCTGGAACTT ATTTGATTGT GTGGTCGTGG TTCTTTCTAT CATTAGTACC 4351 CTGGTTTCCC GCTTGGAGGA CAGTGACATT TCTTTCCCGC CCACGCTCTT 4401 CAGAGTCGTC CGCTTGGCTC GGATTGGTCG AATCCTCAGG CTGGTCCGGG 4451 CTGCCCGGGG AATCAGGACC CTCCTCTTTG CTTTGATGAT GTCTCTCCCC 4501 TCTCTCTTCA ACATCGGTCT GCTGCTCTTC CTGGTGATGT'TCATTTACGC 4551 CATCTTTGGG ATGAGCTGGT TTTCCAAAGT GAAGAAGGGC TCCGGGATCG 4601 ACGACATCTT CAACTTCGAG ACCTTTACGG GCAGCATGCT GTGCCTCTTC 4651 CAGATAACCA CTTCGGCTGG CTGGGATACC CTCCTCAACC CCATGCTGGA 4701 GGCAAAAGAA CACTGCAACT CCTCCTCCCA AGACAGCTGT CAGCAGCCGC 4751 AGATAGCCGT CGTCTACTTC GTCAGTTACA
TCATCATCTC CTTCCTCATC 4801 GTGGTCAACA TGTACATCGC TGTGATCCTC GAGAACTTCA ACACAGCCAC 4851 GGAGGAGAGC GAGGACCCTC TGGGAGAGGA CGACTTTGAA ATCTTCTATG 4901 AGGTCTGGGA GAAGTTTGAC CCCGAGGCGT CGCAGTTCAT CCAGTATTCG 4951 GCCCTCTCTG ACTTTGCGGA CGCCCTGCCG GAGCCGTTGC GTGTGGCCAA 5001 GCCGAATAAG TTTCAGTTTC TAGTGATGGA CTTGCCCATG GTGATGGGCG 5051 ACCGCCTCCA TTGCATGGAT GTTCTCTTTG CTTTCACTAC CAGGGTCCTC
<Desc/Clms Page number 46>
5101 GGGGACTCCA GCGGCTTGGA TACCATGAAA ACCATGATGG AGGAGAAGTT 5151 TATGGAGGCC AACCCTTTTA AGAAGCTCTA CGAGCCCATA GTCACCACCA 5201 CCAAGAGGAA GGAGGAGGAG CAAGGCGCCG CCGTCATCCA GAGGGCCTAC 5251 CGGAAACACA TGGAGAAGAT GGTCAAACTG AGGCTGAAGG ACAGGTCAAG 5301 TTCATCGCAC CAGGTGTTTT GCAATGGAGA CTTGTCCAGC TTGGATGTGG 5351 CCAAGGTCAA GGTTCACAAT GACTGAACCC TCATCTCCAC CCCTACCTCA 5401 CTGCCTCACA GCTTAGCCTC CAGCCTCTGG CGAGCAGGCG
GCAGACTCAC 5451 TGAACACAGG CCGTTCGATC TGTGTTTTTG GCTGAACGAG GTGACAGGTT 5501 GGCGTCCATT TTTAAATGAC TCTTGGAAAG ATTTCATGTA GAGAGATGTT 5551 AGAAGGGACT GCAAAGGACA CCGACCATAA CGGAAGGCCT GGAGGACAGT 5601 CCAACTTACA TAAAGATGAG AAACAAGAAG GAAAGATCCC AGGAAAACTT 5651 CAGATTGTGT TCTCAGTACA TCCCCCAATG TGTCTGTTCG GTGTTTTGAG 5701 TATGTGACCT GCCACATGTA GCTCTTTTTT GCATGTACGT CAAAACCCTG 5751 CAGTAAGTTG ATAGCTTGCT ACGGGTGTTC CTACCAGCAT CACAGAATTG 5801 GGTGTATGAC TCAAACCTAA AAGCATGACT CTGACTTGTC AGTCAGCACC 5851 CCGACTTTCA GACGCTCCAA TCTCTGTCCC AGGTGTCTAA CGAATAAATA @ 5901 GGTAAAAG (3) INFORMATIONS POUR SEQ ID n 2 :
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 765 aminoacides (B) TYPE : (C) TYPE DE BRIN : - (D) TOPOLOGIE : sansrapport (II) TYPE DE MOLECULE : protéine(III) HYPOTHETIQUE: oui (VI) SOURCE D'ORIGINE: (A) ORGANISME: rat (B) TYPE DE TISSU : de la racine dor- sale (C) TYPE DE CELLULE: nerf périphérique
<Desc/Clms Page number 47>
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
ID n 2 :
Met Glu Glu Arg Tyr Tyr Pro Val Ile Phe Pro Asp Glu Arg Asn Phe
1 5' 10 15
Arg Pro Phe Thr Ser Asp Ser Leu Ala Ala Ile Glu Lys Arg Ile Ala
20 25 30
Ile Gln Lys Glu Arg Lys Lys Ser Lys Asp Lys Ala Ala Ala Glu Pro
35 40 45
Gln Pro Arg Pro Gln Leu Asp Leu Lys Ala Ser Arg Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Leu Tyr Gly Asp Ile Pro Pro Glu Leu Val Ala Lys Pro Leu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Asp Pro Phe Tyr Lys Asp His Lys Thr Phe Met Val Leu Asn Lys
85 90 95
Lys Arg Thr Ile Tyr Arg Phe Ser Ala Lys Arg Ala Leu Phe lie Leu
100 105 110
Gly Pro Phe Asn Pro Leu Arg Ser Leu Met Ile Arg Ile Ser Val His
115 120 125
Ser Val Phe Ser Met Phe Ile Ile Cys Thr Val Ile Ile Asn Cys Met
130 135 140
Phe Met Ala Asn Ser Met Glu Arg Ser Phe Asp Asn Asp Ile Pro Glu
145 150 155 160
Tyr Val Phe Ile
Gly Ile Tyr Ile Leu Glu Ala Val Ile Lys Ile Leu
165 170 175
Ala Arg Gly Phe Ile Val Asp Glu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Pro Trp
180 185 190
Asn Trp Leu Asp Phe Ile Val Ile Gly Thr Ala Ile Ala Thr Cys Phe
195 200 205
Pro Gly Ser Gln Val Asn Leu Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Phe
210 215 220
Arg Ala Leu Lys Ala Ile Ser Val Ile Ser Gly Leu Lys Val Ile Val
225 230 235 240
Gly Ala Leu Leu Arg Ser Val Lys Lys Leu Val Asp Val Met Val Leu
245 250 255
Thr Leu Phe Cys Leu Ser Ile Phe Ala Leu Val Gly Gln Gln Leu Phe
260 265 270
<Desc/Clms Page number 48>
Met Gly Ile Leu Asn Gln Lys Cys Ile Lys His Asn Cys Gly Pro Asn
275 280 285
Pro Ala Ser Asn Lys Asp Cys Phe Glu Lys Glu Lys Asp Ser Glu Asp
290 295 300
Phe Ile Met Cys Gly Thr Trp Leu Gly Ser Arg Pro Cys Pro Asn Gly
305 310 315 320
Ser Thr Cys Asp Lys Thr Thr Leu Asn Pro Asp
Asn Asn Tyr Thr Lys
325 330 335
Phe Asp Asn Phe Gly Trp Ser Phe Leu Ala Met Phe Arg Val Met Thr
340 345 350
Gin Asp Ser Trp Glu Arg Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Arg Thr Ser Gly
355 360 365
Ile Tyr Phe Val Phe Phe Phe Val Val Val Ile Phe Leu Gly Ser Phe
370 375 380
Tyr Leu Leu Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Thr Met Ala Tyr Glu Glu
385 390 395 400
Gln Asn Arg Asn Val Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Lys Met Phe
405 410 415
Gln Glu Ala Gln Gln Leu Leu Arg Glu Glu Lys Glu Ala Leu Val Ala
420 425 430
Met Gly Ile Asp Arg Ser Ser Leu Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ser Phe
435 440 445
Ser Pro Lys Lys Arg Lys Phe Phe Gly Ser Lys Thr Arg Lys Ser Phe
450 455 460
Phe Met Arg Gly Ser Lys Thr Ala Gln Ala Ser Ala Ser Asp Ser Glu
465 470 475 480
Asp Asp Ala Ser Lys Asn Pro Gln Leu Leu Glu Gln Thr Lys Arg Leu
485 490 495
Ser Gin Asn Leu Pro Val Asp Leu Phe Asp Glu His Val Asp Pro Leu
500 505
510
His Arg Gln Arg Ala Leu Ser Ala Val Ser Ile Leu Thr Ile Thr Met
515 520 525
Gln Glu Gln Glu Lys Phe Gln Glu Pro Cys Phe Pro Cys Gly Lys Asn
530 535 540
<Desc/Clms Page number 49>
Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Val Trp Asp Cys Ser Pro Gln Trp Leu Cys 545 550 555 560 Ile Lys Lys Val Leu Arg Thr Ile Met Thr Asp Pro Phe Thr Glu Leu
565 570 575 Ala Ile Thr Ile Cys Ile Ile Ile Asn Thr Val Phe Leu Ala Val Glu
580 585 590 His His Asn Met Asp Asp Asn Leu Lys Thr Ile Leu Lys Ile Gly Asn
595 600 605 Trp Val Phe Thr Gly Ile Phe Ile Ala Glu Met Cys Leu Lys Ile Ile
610 615 620 Ala Leu Asp Pro Tyr His Tyr Phe Arg His Gly Trp Asn Val Phe Asp 625 630 635 640 Ser
Ile Val Ala Leu Leu Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Asn Thr Leu
645 650 655 Ser Asp Asn Asn Arg Ser Phe Leu Ala Ser Leu Arg Val Leu Arg Val
660 665 670 Phe Lys Leu Ala Lys Ser Trp Pro Thr Leu Asn Thr Leu Ile Lys Ile
675 680 685 Ile Gly His Ser Val Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Val Val Leu Thr
690 695 700 Ile Val Val Phe Ile Phe Ser Val Val Gly Met Arg Leu Phe Gly Thr 705 710 715 720 Lys Phe Asn Lys Thr Ala Tyr Ala Thr Gln Glu Arg Pro Arg Arg Arg
725 730 735 Trp His Met Asp Asn Phe Tyr His Ser Phe Leu Val Val Phe Arg Ile
740 745 750 Leu Cys Gly Glu Trp Ile Glu Asn Met Trp Gly Cys Met Gin Asp Met
755 760 765 Asp Gly Ser Pro Leu Cys Ile Ile Val Phe Val Leu !le blet Val Ile
770 775 780 Gly Lys Leu Val Val Leu
Asn Leu Phe lie Ala Leu Leu Leu Asn Ser 785 790 795 800 Phe Ser Asn Glu Glu Lys Asp Gly Ser Leu Glu Gly Glu Thr Arg Lys
805 810 815
<Desc/Clms Page number 50>
Thr Lys Val Gln Leu Ala Leu Asp Arg Phe Arg Arg Ala Phe Ser Phe
820 825 830 Met Leu His Ala Leu Gln Ser Phe Cys Cys Lys Lys Cys Arg Arg Lys
835 840 845 Asn Ser Pro Lys Pro Lys Glu Thr Thr Glu Ser Phe Ala Gly Glu Asn
850 855 860 Lys Asp Ser Ile Leu Pro Asp Ala Arg Pro Trp Lys Glu Tyr Asp Thr 865 870 875 880 Asp Met Ala Leu Tyr Thr Gly Gln Ala Gly Ala Pro Leu Ala Pro Leu
885 890 895 Ala.Glu Val Glu Asp Asp Val Glu Tyr Cys Gly Glu Gly Gly Ala Leu
900 905 910 Pro Thr Ser Gln His Ser Ala Gly Val Gln Ala Gly Asp Leu Pro Pro
915 920 925 Glu Thr Lys Gln Leu Thr Ser Pro Asp Asp Gln Gly Val Glu Met Glu
930 935 940 Val Phe Ser Glu Glu Asp Leu His Leu Ser Ile Gln Ser Pro Arg Lys
945 950 955 960 Lys Ser Asp Ala Val Ser Met Leu Ser Glu Cys Ser Thr Ile Asp Leu @
965 970 975 Asn Asp Ile Phe Arg Asn Leu Gln Lys Thr Val Ser Pro Lys Lys Gin
980 985 990 Pro Asp Arg Cys Phe Pro Lys Gly Leu Ser Cys His Phe Leu Cys His
995 1000 1005 Lys Thr Asp Lys Arg Lys Ser Pro Trp Val Leu Trp Trp Asn Ile Arg
1010 1015 1020 Lys Thr Cys Tyr Gln Ile Val Lys His Ser Trp Phe Glu Ser Phe Ile 1025 1030 1035 1040 !le Phe Val Ile Leu Leu Ser Ser Gly Ala Leu Ile Phe Glu Asp Val
1045 1050 1055 Asn Leu Pro Ser Arg Pro Gin Val Glu Lys Leu Leu Arg Cys Thr Asp
1060 1065 1070 Asn Ile Phe Thr Phe Ile Phe Leu Leu Glu Met Ile Leu Lys Trp Val
1075 1080 1085
<Desc/Clms Page number 51>
Ala Phe Gly Phe--Arg Arg Tyr Phe Thr Ser Ala Trp Cys Trp Leu Asp
1090 1095 1100 Phe Leu Ile Val Val Val Ser Val Leu
Ser Leu Met Asn Leu Pro Ser 1105 1110 1115 1120 Leu Lys Ser Phe Arg Thr Leu Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu
1125 1130 1135 Ser Gln Phe Glu Gly Met Lys Val Val Val Tyr Ala Leu Ile Ser Ala
1140 1145 1150 Ile Pro Ala Ile Leu Asn Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Phe Trp Leu
1155 1160 1165 Val Phe Cys Ile Leu Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Lys Phe Gly Arg
1170 1175 1180 Cys Ile Asn Gly Thr Asp Ile Asn Met Tyr Leu Asp Phe Thr Glu Val 1185 1190 1195 1200 Pro Asn Arg Ser Gln Cys Asn Ile Ser Asn Tyr Ser Trp Lys Val Pro
1205 1210 1215 Gln Val Asn Phe Asp Asn Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Leu Gln
1220 1225 1230 Val Ala Thr Tyr Lys Gly Trp Leu Glu Ile Met Asn Ala Ala Val Asp
1235 1240 1245 Ser Arg Glu Lys Asp Glu Gln Pro Asp Phe Glu Ala Asn Leu Tyr Ala
1250 1255 1260 Tyr Leu Tyr Phe Val Val Phe Ile Ile Phe Gly Ser Phe Phe Thr Leu 1265 1270 1275 1280 Asn Leu Phe Ile Gly Val Ile Ile Asp
Asn Phe Asn Gln Gln Gln Lys
1285 1290 1295 Lys Leu Gly Gly Gln Asp Ile Phe Met Thr Glu Glu Gln Lys Lys Tyr
1300 1305 1310 Tyr Asn Ala Met Lys Lys Leu Gly Thr Lys Lys Pro Gln Lys Pro Ile
1315 1320 1325 Pro Arg Pro Leu Asn Lys Cys Gln Ala Phe Val Phe Asp Leu Val Thr
1330 1335 1340 Ser Gln Val Phe Asp Val Ile Ile Leu Gly Leu Ile Val Leu Asn Met 1345 1350 1355 1360
<Desc/Clms Page number 52>
Ile Ile Met MétAla Glu Ser Ala Asp Gln Pro Lys Asp Val Lys Lys
1365 1370 1375 Thr Phe Asp Ile Leu Asn Ile Ala Phe Val Val Ile Phe Thr Ile Glu
1380 1385 1390 Cys Leu Ile Lys Val Phe Ala Leu Arg Gln His Tyr Phe Thr Asn Gly
1395 1400 1405 Trp Asn Leu Phe Asp Cys Val Val Val Val Leu Ser Ile Ile Ser Thr
1410 1415 1420 Leu Val Ser Arg Leu Glu Asp Ser Asp Ile Ser Phe Pro Pro Thr Leu 1425 1430 1435 1440 Phe Arg Val Val Arg Leu Ala Arg Ile Gly Arg Ile Leu Arg Leu Val
1445 1450 1455
Arg Ala Ala Arg Gly Ile Arg Thr Leu Leu Phe Ala Leu Met Met Ser
1460 1465 1470 Leu Pro Ser Leu Phe Asn Ile Gly Leu Leu Leu Phe Leu Val Met Phe
1475 1480 1485 Ile Tyr Ala Ile Phe Gly Met Ser Trp Phe Ser Lys Val Lys Lys Gly
1490 1495 1500 Ser Gly Ile Asp Asp Ile Phe Asn Phe Glu Thr Phe Thr Gly Ser Met 1505 1510 1515 1520 Leu Cys Leu Phe Gln Ile Thr Thr Ser Ala Gly Trp Asp Thr Leu Leu
1525 1530 1535 Asn Pro Met Leu Glu Ala Lys Glu His Cys Asn Ser Ser Ser Gln Asp
1540 1545 1550 Ser Cys Gln Gln Pro Gln Ile Ala Val Val Tyr Phe Val Ser Tyr Ile
1555 1560 1565 Ile Ile Ser Phe Leu Ile Val Val Asn Met Tyr Ile Ala Val Ile Leu
1570 1575 1580 Glu Asn Phe Asn Thr Ala Thr Glu Glu Ser Glu Asp Pro Leu Gly Glu 1585 1590 1595 1600 Asp Asp Phe Glu Ile Phe Tyr Glu Val Trp Glu Lys Phe Asp Pro Glu
1605 1610 1615 Ala Ser Gln Phe Ile Gln Tyr Ser Ala Leu Ser Asp Phe Ala Asp Ala
1620 1625 1630 Leu Pro Glu Pro Leu Arg Val Ala Lys Pro Asn Lys Phe Gln Phe Leu
<Desc/Clms Page number 53>
1635 1640 1645
Val Met Asp Leu Pro Met Val Met Gly Asp Arg Leu His Cys Met Asp
1650 1655 1660
Val Leu Phe Ala Phe Thr Thr Arg Val Leu Gly Asp Ser Ser Gly Leu
1665 1670 1675 1680
Asp Thr Met Lys Thr Met Met Glu Glu Lys Phe Met Glu Ala Asn Pro
1685 1690 1695
Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Pro Ile Val Thr Thr Thr Lys Arg Lys Glu
1700 1705 1710
Glu Glu Gin Gly Ala Ala Val Ile Gln Arg Ala Tyr Arg Lys His Met
1715 1720 1725
Glu Lys Met Val Lys Leu Arg Leu Lys Asp Arg Ser Ser Ser Ser His
1730 1735 1740
Gin Val Phe Cys Asn Gly Asp Leu Ser Ser Leu Asp Val Ala Lys Val
1745 1750 1755 1760
Lys Val His Asn Asp
1765 (4) INFORMATIONS POUR SEQ ID n 3 :
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) TYPE DE BRIN : (D) TOPOLOGIE : (II) TYPE DE MOLECULE: ADNc (III) HYPOTHETIQUE : (IV) ANTISENS : (VI) SOURCE D'ORIGINE: (A) ORGANISME: humain (B) TYPE DE TISSU : de la racine dor- sale (C) TYPE DE CELLULE : nerfpériphérique (XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
ID n 3 : GCTGAGCAGT GGGGCACTGA TATTTGAAGA TGTTCACCTT GAGAACCAAC
<Desc/Clms Page number 54>
51 CCAAAATCCA AGAATTACTA AATTGTACTG ACATTATTTT TACACATATT
101 TTTATCCTGG AGATGGTACT AAAATGGGTA GCCTTCGGAT TTGGAAAGTA
151 TTTCACCAGT GCCTGGTGCT GCCTTGATTT CATCATTGTG ATTGTCTCTG
201 TGACCACCCT CATTAACTTA ATGGAATTGA AGTCCTTCCG GACTCTACGA
251 GCACTGAGGC CTCTTCGTGC GCTGTCCCAG TTTGAAGGAA TGAAGGTGGT
301 GGTCAATGCT CTCATAGGTG CCATACCTGC CATTCTGAAT GTTTTGCTTG
351 TCTGCCTCAT TTTCTGGCTC GTATTTTGTA TTCTGGGAGT ATACTTCTTT
401 TCTGGAAAAT TTGGGAAATG CATTAATGGA ACAGACTCAG TTATAAATTA
451 TACCATCATT ACAAATAAAA GTCAATGTGA AAGTGGCAAT TTCTCTTGGA
501 TCAACCAGAA AGTCAACTTT GACAATGTGG GAAATGCTTA CCTCGCTCTG
551 CTGCAAGTGG CAACATTTAA GGGCTGGATG GATATTATAT ATGCAGCTGT
601 TGATTCCACA GAGAAAGAAC AACAGCCAGA GTTTGAGAGC AATTCACTCG
651 GTTACATTTA CTTCGTAGTC TTTATCATCT
TTGGCTCATT CTTCACTCTG 701 AATCTCTTCA TTGGCGTTAT CATTGACAAC TTCAACCAAC AGCAGAAAAA 751 GTTAGGTGGC CAAGACATTT TTATGACAGA AGAACAGAAG AAATACTATA
801 ATGCAATGAA AAAATTAGGA TCCAAAAAAC CTCAAAAACC CATTCCACGG
851 CCCGTT (5) INFORMATIONS POUR SEQ ID n 4 : (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) TYPE DE BRIN : (D) TOPOLOGIE : (II) TYPE DE MOLECULE : (A) DESCRIPTION : = "sonde d'ADN/ domaine IV" (III) HYPOTHETIQUE: non
<Desc/Clms Page number 55>
(IV) ANTISENS : (VI) SOURCE D'ORIGINE: (A) ORGANISME: rat (B) TYPE DE TISSU : de la racine dor- sale (C) TYPE DE CELLULE : périphérique (XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
ID n 4 : 1 CTCAACATGG TTACGATGAT GGTGGAGACC GACGAGCAGG' GCGAGGAGAA 51 GACGAAGGTT CTGGGCAGAA TCAACCAGTT CTTTGTGGCC GTCTTCACGG 101 GCGAGTGTGT GATGAAGATG TTCGCCCTGC GACAGTACTA TTTCACCAAC 151 GGCTGGAACG TGTTCGACTT CATAGTGGTG ATCCTGTCCA TTGGGAGTCT 201 GCTGTTTCT GCAATCCTTA AGTCACTGGA AAACTACTTC TCCCCGACGC 251 TCTTCCGGGT CATCCGTCTG GCCAGGATCG GCCGCATCCT CAGGCTGATC 301 CGAGCAGCCA AGGGGATTCG CACGCTGCTC TTCGCCCTCA TGATGTCCCT 351 GCCCGCCCTC TTCAACATCG GCCTCCTCCT CTTCCTCGTC ATGTTCATCT 401 ACTCCATCTT CGGCATGGCC AGCTTCGCTA ACGTCGTGGA CGAGGCCGGC 451 ATCGACGACA TGTTCAACTT CAAGACCTTT GGCAACAGCA TGCTGTGCCT 501 GTTCCAGATC ACCACCTCGG CCGGCTGGGA CGGCCTCCTC AGCCCCATCC 551 TCAACACGGG GCCTCCCTAC TGCGACCCCA ACCTGCCCAA CAGCAACGGC 601 TCCCGGGGGA ACTGCGGGAG CCCGGCGGTG GGCATCATCT TCTTCACCAC 651 CTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT CAACATGTAT ATCGCAGTCA 701 TC (6)
INFORMATIONS POUR SEQ ID n 5 : (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 334 paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) TYPE DE BRIN : (D) TOPOLOGIE : (II) TYPE DE MOLECULE : (A) DESCRIPTION: ADNc (III) HYPOTHETIQUE : (IV) ANTISENS : (VI) SOURCE D'ORIGINE: (A) ORGANISME:
<Desc/Clms Page number 56>
(B) TYPE DE TISSU: (C) TYPE DE CELLULE: (XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
ID n 5 :
1 GTCGACTCTA GATCAGGGTG AAGATGGAGG AGAGGTACTA CCCGGTGATC
51 TTCCCGGACG AGCGGAATTT CCGCCCCTTC ACTTCCGACT CTCTGGCTGC 101 CATAGAGAAG CGGATTGCTA TCCAAAAGGA GAGGAAGAAG TCCAAAGACA 151 AGGCGGCAGC TGAGCCCCAG CCTCGGCCTC AGCTTGACCT AAAGGCCTCC 201 AGGAAGTTAC CTAAGCTTTA TGGTGACATT CCCCCTGAGC TTGTAGCGAA 251 GCCTCTGGAA GACCTGGACC CATTCTACAA AGACCATAAG ACATTCATGG 301 TGTTGAACAA GAAGAGAACA ATTTATCGCT TCAGCGCCAA GCGGGCCTTG 351 TTCATTCTGG GGCCTTTTAA TCCCCTCAGA AGCTTAATGA TTCGTATCTC 401 TGTCCATTCA GTCTTTAGCA TGTTCATCAT CTGCACGGTG ATCATCAACT 451 GTATGTTCAT GGCGAATTCT ATGGAGAGAA GTTTCGACAA CGACATTCCC 501 GAATACGTCT TCATTGGGAT TTATATTTTA GAAGCTGTGA TTAAAATATT 551 GGCAAGAGGC TTCATTGTGG ATGAGTTTTC CTTCCTCCGA GATCCGTGGA 601 ACTGGCTGGA CTTCATTGTC ATTGGAACAG CGATCGCAAC TTGTTTTCCG 651 GGCAGCCAAG TCAATCTTTC AGCTCTTCGT ACCTTCCGAG TGTTCAGAGC 701
TCTGAAGGCG ATTTCAGTTA TCTCAGGTCT GAAGGTCATC GTAGGTGCCC 751 TGCTGCGCTC GGTGAAGAAG CTGGTAGACG TGATGGTCCT CACTCTCTTC 801 TGCCTCAGCA TCTTTGCCCT GGTCGGTCAG CAGCTGTTCA TGGGAATTCT 851 GAACCAGAAG TGTATTAAGC ACAACTGTGG CCCCAACCCT GCATCCAACA 901 AGGATTGCTT TGAAAAGGAA AAAGATAGCG AAGACTTCAT AATGTGTGGT 951 ACCTGGCTCG GCAGCAGACC CTGTCCCAAT GGTTCTACGT GCGATAAAAC
<Desc/Clms Page number 57>
1001 CACATTGAAC CCAGACAATA ATTATACAAA GTTTGACAAC TTTGGCTGGT 1051 CCTTTCTCGC CATGTTCCGG GTTATGACTC AAGACTCCTG GGAGAGGCTT 1101 TACCGACAGA TCCTGCGGAC CTCTGGGATC TACTTTGTCT TCTTCTTCGT 1151 GGTGGTCATC TTCCTGGGCT CCTTCTACCT GCTTAACCTA ACCCTGGCTG 1201 TTGTCACCAT GGCTTATGAA GAACAGAACA GAAATGTAGC TGCTGAGACA 1251 GAGGCCAAGG AGAAAATGTT TCAGGAAGCC CAGCAGCTGT TAAGGGAGGA 1301 GAAGGAGGCT CTGGTTGCCA TGGGAATTGA
CAGAAGTTCC CTTAATTCCC 1351 TTCAAGCTTC ATCCTTTTCC CCGAAGAAGA GGAAGTTTTT CGGTAGTAAG 1401 ACAAGAAAGT CCTTCTTTAT GAGAGGGTCC AAGACGGCCC AAGCCTCAGC 1451 GTCTGATTCA GAGGACGATG CCTCTAAAAA TCCACAGCTC CTTGAGCAGA 1501 CCAAACGACT GTCCCAGAAC TTGCCAGTGG ATCTCTTTGA TGAGCACGTG 1551 GACCCCCTCC ACAGGCAGAG AGCGCTGAGC GCTGTCAGTA TCTTAACCAT 1601 CACCATGCAG GAACAAGAAA AATTCCAGGA GCCTTGTTTC CCATGTGGGA 1651 AAAATTTGGC CTCTAAGTAC CTGGTGTGGG ACTGTAGCCC TCAGTGGCTG 1701 TGCATAAAGA AGGTCCTGCG GACCATCATG ACGGATCCCT TTACTGAGCT 1751 GGCCATCACC ATCTGCATCA TCATCAATAC CGTTTTCTTA GCCGTGGAGC 1801 ACCACAACAT GGATGACAAC TTAAAGACCA TACTGAAAAT AGGAAACTGG 1851 GTTTTCACGG GAATTTTCAT AGCGGAAATG TGTCTCAAGA TCATCGCGCT 1901 CGACCCTTAC CACTACTTCC GGCACGGCTG GAATGTTTTT GACAGCATCG 1951 TGGCCCTCCT GAGTCTCGCT GATGTGCTCT ACAACACACT GTCTGATAAC 2001 AATAGGTCTT TCTTGGCTTC CCTCAGAGTG CTGAGGGTCT TCAAGTTAGC 2051 CAAATCCTGG CCCACGTTAA
ACACTCTCAT TAAGATCATC GGCCACTCCG 2101 TGGGCGCGCT TGGAAACCTG ACTGTGGTCC TGACTATCGT GGTCTTCATC 2151 TTTTCTGTGG TGGGCATGCG GCTCTTCGGC ACCAAGTTTA ACAAGACCGC 2201 CTACGCCACC CAGGAGCGGC CCAGGCGGCG CTGGCACATG GATAATTTCT 2251 ACCACTCCTT CCTGGTGGTG TTCCGCATCC TCTGTGGGGA ATGGATCGAG 2301 AACATGTGGG GCTGCATGCA GGATATGGAC GGCTCCCCGT TGTGCATCAT 2351 TGTCTTTGTC CTGATAATGG TGATCGGGAA GCTTGTGGTG CTTAACCTCT
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2401 TCATTGCCTT GCTGCTCAAT TCCTTCAGCA ATGAGGAGAA GGATGGGAGC 2451 CTGGAAGGAG AGACCAGGAA AACCAAAGTG CAGCTAGCCC TGGATCGGTT 2501 CCGCCGGGCC TTCTCCTTCA TGCTGCACGC TCTTCAGAGT TTTTGTTGCA 2551 AGAAATGCAG GAGGAAAAAC TCGCCAAAGC CAAAAGAGAC AACAGAAAGC 2601 TTTGCTGGTG AGAATAAAGA CTCAATCCTC CCGGATGCGA GGCCCTGGAA 2651 GGAGTATGAT ACAGACATGG CTTTGTACAC TGGACAGGCC GGGGCTCCGC 2701 TGGCCCCACT CGCAGAGGTA GAGGACGATG TGGAATATTG TGGTGAAGGC 2751
GGTGCCCTAC CCACCTCACA ACATAGTGCT GGAGTTCAGG CCGGTGACCT 2801 CCCTCCAGAG ACCAAGCAGC TCACTAGCCC GGATGACCAA GGGGTTGAAA 2851 TGGAAGTATT TTCTGAAGAA GATCTGCATT TAAGCATACA GAGTCCTCGA 2901 AAGAAGTCTG ACGCAGTGAG CATGCTCTCG GAATGCAGCA CAATTGACCT 2951 GAATGATATC TTTAGAAATT TACAGAAAAC AGTTTCCCCC AAAAAGCAGC 3001 CAGATAGATG CTTTCCCAAG GGCCTTAGTT GTCACTTTCT ATGCCACAAA 3051 ACAGACAAGA GAAAGTCCCC CTGGGTCCTG TGGTGGAACA TTCGGAAAAC 3101 CTGCTACCAA ATCGTGAAGC ACAGCTGGTT TGAGAGTTTC ATAATCTTTG 3151 TTATTCTGCT GAGCAGTGGA GCGCTGATAT TTGAAGATGT CAATCTCCCC 3201 AGCCGGCCCC AAGTTGAGAA ATTACTAAGG TGTACCGATA ATATTTTCAC 3251 ATTTATTTTC CTCCTGGAAA TGATCCTGAA GTGGGTGGCC TTTGGATTCC 3301 GGAGGTATTT CACCAGTGCC TGGTGCTGGC TTGATTTCCT CATTGTGGTG 2251 GTGTCTGTGC TCAGTCTCAT GAATCTACCA AGCTTGAAGT CCTTCCGGAC 3401 TCTGCGGGCC CTGAGACCTC TGCGGGCGCT GTCCCAGTTT GAAGGAATGA 3451 AGGTTGTCGT CTACGCCCTG ATCAGCGCCA
TACCTGCCAT TCTCAATGTC 3501 TTGCTGGTCT GCCTCATTTT CTGGCTCGTA TTTTGTATCT TGGGAGTAAA 3551 TTTATTTTCT GGGAAGTTTG GAAGGTGCAT TAACGGGACA GACATAAATA 3601 TGTATTTGGA TTTTACCGAA GTTCCGAACC GAAGCCAATG TAACATTAGT 3651 AATTACTCGT GGAAGGTCCC GCAGGTCAAC TTTGACAACG TGGGGAATGC 3701 CTATCTCGCC CTGCTGCAAG TGGCAACCTA TAAGGGCTGG CTGGAAATCA 3751 TGAATGCTGC TGTCGATTCC AGAGAGAAAG ACGAGCAGCC GGACTTTGAG
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3801 GCGAACCTCT ACGCGTATCT CTACTTTGTG GTTTTTATCA TCTTCGGCTC 3851 CTTCTTTACC CTGAACCTCT TTATCGGTGT TATTATTGAC AACTTCAATC 3901 AGCAGCAGÀA ÀAAGTTAGGT GGCCAAGACA TCTTCATGAC TGAGGAGCAG 3951 AAGAAATATT ACAATGCAAT GAAAAAGTTA GGAACCAAGA AACCTCAAAA 4001 GCCCATCCCA AGGCCCCTGA ACAAATGTCA AGCCTTTGTG TTCGACCTGG 4051 TCACAAGCCA
GGTCTTTGAC GTCATCATTC TGGGTCTTAT TGTCTTAAAT 4101 ATGATTATCA TGATGGCTGA ATCTGCCGAC CAGCCCAAAG ATGTGAAGAA 4151 AACCTTTGAT ATCCTCAACA TAGCCTTCGT GGTCATCTTT ACCATAGAGT 4201 GTCTCATCAA AGTCTTTGCT TTGAGGCAAC ACTACTTCAC CAATGGCTGG 4251 AACTTATTTG ATTGTGTGGT CGTGGTTCTT TCTATCATTA GTACCCTGGT 4301 TTCCCGCTTG GAGGACAGTG ACATTTCTTT CCCGCCCACG CTCTTCAGAG 4351 TCGTCCGCTT GGCTCGGATT GGTCGAATCC TCAGGCTGGT CCGGGCTGCC 4401 CGGGGAATCA GGACCCTCCT CTTTGCTTTG ATGATGTCTC TCCCCTCTCT 4451 CTTCAACATC GGTCTGCTGC TCTTCCTGGT GATGTTCATT TACGCCATCT 4501 TTGGGATGAG CTGGTTTTCC AAAGTGAAGA AGGGCTCCGG GATCGACGAC 4551 ATCTTCAACT TCGAGACCTT TACGGGCAGC ATGCTGTGCC TCTTCCAGAT 4601 AACCACTTCG GCTGGCTGGG ATACCCTCCT CAACCCCATG CTGGAGGCAA 4651 AAGAACACTG CAACTCCTCC TCCCAAGACA GCTGTCAGCA GCCGCAGATA 4701 GCCGTCGTCT ACTTCGTCAG TTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT 4751 CAACATGTAC ATCGCTGTGA TCCTCGAGAA CTTCAACACA
GCCACGGAGG 4801 AGAGCGAGGA CCCTCTGGGA GAGGACGACT TTGAAATCTT CTATGAGGTC 4851 TGGGAGAAGT TTGACCCCGA GGCGTCGCAG TTCATCCAGT ATTCGGCCCT 4901 CTCTGACTTT GCGGACGCCC TGCCGGAGCC GTTGCGTGTG GCCAAGCCGA 4951 ATAAGTTTCA GTTTCTAGTG ATGGACTTGC CCATGGTGAT GGGCGACCGC 5001 CTCCATTGCA TGGATGTTCT CTTTGCTTTC ACTACCAGGG TCCTCGGGGA 5051 CTCCAGCGGC TTGGATACCA TGAAAACCAT GATGGAGGAG AAGTTTATGG 5101 AGGCCAACCC TTTTAAGAAG CTCTACGAGC CCATAGTCAC CACCACCAAG 5151 AGGAAGGAGG AGGAGCAAGG CGCCGCCGTC ATCCAGAGGG CCTACCGGAA
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5201 ACACATGGAG AAGATGGTCA AACTGAGGCT GAAGGACAGG TCAAGTTCAT 5251 CGCACCAGGT GTTTTGCAAT GGAGACTTGT CCAGCTTGGA TGTGGCCAAG 5301 GTCAAGGTTC ACAATGACIG AACCCTCATC TAGA