BE1014949A3 - Procede de detection de stress oxydant et trousse pour sa mise en oeuvre. - Google Patents

Procede de detection de stress oxydant et trousse pour sa mise en oeuvre. Download PDF

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Abstract

Procédé de détection de stress oxydant dans un échantillon sanguin, comprenant une extraction d'ARNm à partir de cellules de l'échantillon sanguin, une rétrotranscription desdits ARNc, avec marquage de ces derniers, une mise en présence de ces ADNc avec une population de plusieurs fragments d'ADN synthétique, sélectionnés de façon à réaliser une hybridation moléculaire entre les ADNc et lesdits fragments d'ADN synthétique, en cas d'expression de stress oxydant dans les cellules, et une révélation simultanée de signaux de ladite hybridation qui correspondent à des gènes exprimés, et trousse pour la mise en oeuvre de ce procédé.

Description


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   PROCEDE DE DETECTION DE STRESS OXYDANT 
ET TROUSSE POUR SA MISE EN OEUVRE 
La présente invention est relative à un procédé de détection de stress oxydant dans un échantillon sanguin et à une trousse pour la mise en oeuvre de ce procédé. 



   L'organisme produit en permanence des espèces oxygénées activées (EOA) susceptibles de provoquer des dégâts cellulaires (stress oxydant) par leur grande réactivité avec les protéines, l'acide désoxyribonucléique (ADN) et les acides gras des membranes. La production physiologique des EOA est régulée par des enzymes et des molécules de bas poids moléculaire à action antioxydante, d'oligo- éléments et de systèmes de réparation. Récemment de nombreux travaux ont montré que les EOA à faibles concentrations jouent aussi un rôle de messagers cellulaires dans la transmission de signaux physiologiques importants comme ceux portés par les cytokines ou certains facteurs de croissance.

   Cette dualité invite donc à distinguer une situation de stress oxydant provoquée par une production excessive de EOA de la signalétique redox intracellulaire dont le message positif ou négatif est porté par ces mêmes espèces, mais à des concentrations plus faibles. 



   Chaque individu ne possède pas le même potentiel antioxydant en fonction de ses habitudes alimentaires, de son mode de vie, de ses caractéristiques génétiques ou de l'environnement dans lequel il vit. 



  Déterminer le statut de stress oxydant (SSO) d'un individu devient actuellement un sujet de priorité en terme de prévention de maladies, car de très nombreuses études démontrent clairement qu'il existe une association étroite entre l'altération des systèmes de défense 

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 antioxydante et l'incidence accrue de maladies cardiovasculaires et de cancers. 



   A l'heure actuelle, il est possible d'établir un bilan sanguin très complet du SSO d'un individu grâce au développement de techniques sensibles et spécifiques pouvant être utilisées en routine (batterie de 20 tests recouvrant la mesure des antioxydants, des oligo-éléments, du métabolisme du fer et des marqueurs de stress oxydant au niveau des lipides, des protéines et de l'ADN). Toutefois, ces tests diagnostiques ne donnent que peu d'informations sur ce qui passe au niveau des cellules, notamment au niveau des lymphocytes. Il n'existe actuellement aucun test diagnostique et spécifique permettant d'obtenir des informations à ce niveau. 



   La présente invention a pour but de développer un test diagnostique qui permette d'évaluer d'une manière simple et rapide le statut de stress oxydant (SSO) au niveau cellulaire. 



   On résout ce problème suivant l'invention par un procédé de détection de stress oxydant dans un échantillon sanguin comprenant une extraction d'ARNm à partir de cellules de l'échantillon sanguin, une rétrotranscription desdits ARNm en ADNc, avec marquage de ces derniers, une mise en présence de ces ADNc avec une population de plusieurs fragments d'ADN synthétique, sélectionnés de façon à réaliser une hybridation moléculaire entre les ADNc et lesdits fragments d'ADN synthétique, en cas d'expression de stress oxydant dans les cellules, et une révélation simultanée de signaux de ladite hybridation qui correspondent à des gènes exprimés. Ce procédé offre l'avantage d'évaluer, en une fois, par la génomique, le SSO recherché d'un patient. 



   Suivant une forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, la mise en présence est réalisée sur une lame de puce ADN qui porte lesdits fragments d'ADN synthétique selon une topographie 

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 spécifique. Le procédé applique ainsi la technologie de la puce ADN (micro-array). 



   La puce ADN de haute densité permet d'évaluer l'expression d'un grand nombre de gènes (par exemple, l'ensemble des gènes contenus dans le génome d'un organisme), alors que la puce ADN de faible densité permet d'évaluer l'expression d'un nombre de gènes plus restreints (souvent ceux associés à une pathologie). Ces puces ADN sont en pleine évolution technologique et elles permettent de déterminer en quelques heures la nature et la quantité de certains acides ribonucléiques messagers (ARNm) contenus dans une cellule. 



  L'utilisation de ces puces ADN est déjà envisagée dans de nombreux domaines en recherche fondamentale, mais aussi dans des domaines appliqués comme, par exemple, dans le suivi de patients atteints d'un cancer, de personnes exposées à des actions toxiques de l'environnement et de résistances à la trithérapie chez des patients infectés par le virus du SIDA. Ces puces ADN connues sont donc destinées à l'analyse d'une pathologie déterminée. 



   La population de fragments d'ADN synthétique peut, dans le procédé suivant l'invention, être composée d'oligonucléotides et polynucléotides d'une taille comprise entre 25 et 100 b, de produits d'une amplification enzymatique in vitro (PCR) ou d'un mélange des deux. 



   Suivant une forme perfectionnée de réalisation de l'invention, la population de fragments d'ADN synthétique comprend au moins des fragments de gènes appartenant à des familles de gènes choisies parmi le groupe constitué par celles codant pour des enzymes à fonctions antioxydantes, des enzymes à fonctions pro-oxydantes, des enzymes de réparation de l'ADN, des enzymes de métabolisme du glutathion, des protéines de stress, des protéines impliquées dans une apoptose, des facteurs de transcription, des cytokines et des chemokines. De préférence, la population des fragments d'ADN synthétique sélectionnés 

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 comprend au moins deux gènes appartenant chacun à une famille distincte parmi les familles précitées.

   D'une manière tout à fait préférentielle, la population de fragments d'ADN synthétique comprend un ou plusieurs fragments de chacune des familles de gènes précitées. 



   Comme enzymes à fonction antioxydante précitées, on peut prévoir par exemple les suivantes : catalase XM006202, superoxyde dismutase à Mn X14322, superoxyde dismutase à Cu/Zn X81859, thiorédoxine-1 XM¯015718, thiorédoxine réductase-1 XM¯015673, peroxyrédoxine-1 XM¯011983, métallothionéine-1 X97261, L-ferritine XM¯016853, H-ferritine XM¯017556, récepteur à la transferrine XM¯002788. 



   Comme enzymes à fonctions pro-oxydantes précitées, on peut prévoir par exemple les suivantes : cyclooxygénase-2 M90100,5- lipooxygénase XM¯005818, c-phospholipase A2 XM 007544, phospholipase A alpha D16234, phospholipase D-1 NM¯002662, myéloperoxydase XM¯008160, oxyde nitrique synthétase-2 XM¯008631. 



   Comme enzymes de réparation de l'ADN précitées, on peut citer par exemple de la 8-oxoguanine humaine ADN glycosylase BC000657. 



   Comme enzymes du métabolisme du glutathion précitées, on peut mentionner par exemple les suivantes : glutathion peroxydase X58295, phospholipide hydroperoxyde non dépendant du sélénium AF090194, gamma-glutamylcystéine synthétase NM¯001498; glucose 6-phosphate déshydrogénase XM¯013149. 



   Comme protéines de stress précitées, on peut indiquer par exemple : heat shock protéine M11717, M15432, hème-oxygénase-1 XM 009946. 



   Comme protéines impliquées dans l'apoptose précitée, on peut mentionner par exemple les suivantes : FasL AF287593, CD95 X89101, récepteur 1 du facteur de nécrose tumorale M32315, Bcl-2 NM¯000633. 

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   Comme facteurs de transcription précités, on peut envisager par exemple les suivants :   IkB-&alpha;   M69043, c-Fos V01512; C-Jun J04111. 



   Comme cytokines et chemokines précitées, on peut prévoir par exemple   11-1, 11-6   et 11-8. 



   Les substances précitées sont toutes connues et certaines ont reçu un numéro d'accès à la PubMed Central, Gene Bank, qui est indiqué ci-dessus. 



   Il faut noter que cette liste n'est pas restrictive mais qu'elle permet, lors de l'application de plusieurs gènes codant pour plusieurs de ces substances, une analyse unique d'un ensemble de pathologies distinctes ayant chacune une incidence qui, selon les cas, peut être importante. 



  Cela augmente donc la finesse de l'analyse et la rend particulièrement sûre, ce qui était impossible jusqu'à présent sur base d'un seul des tests connus. 



   La présente invention concerne également un procédé comprenant en outre, avant ladite extraction d'ARNm, une exposition in vitro de cellules de l'échantillon sanguin à des facteurs générateurs de stress oxydant, ce qui permet l'évaluation de l'efficacité des fragments d'ADN synthétique sélectionnés avant leur mise en oeuvre dans un test diagnostique. 



   L'invention concerne aussi une évaluation globale du SSO par la réalisation en parallèle du test génomique unique suivant l'invention d'une quantification de marqueurs sanguins de stress oxydant dans l'échantillon examiné. 



   L'invention concerne enfin aussi une trousse de détection de stress oxydant comprenant au moins une puce ADN qui porte ladite population de fragments d'ADN synthétique. Avantageusement, cette trousse comprendra en outre un milieu d'hybridation adapté à la puce ADN mise en oeuvre, ainsi qu'éventuellement une solution de lavage adaptée. A titre de témoin, on pourra prévoir au moins un gène ayant un 

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 niveau d'expression constant dans toute situation de stress oxydant, par exemple de la cyclophilline, du GAPDH, de la bêta-actine et de   l'ARN   ribosomique.

   De préférence, cette trousse présentera aussi un protocole de toutes les étapes nécessaires pour réaliser une hybridation et procéder à une révélation de signaux d'hybridation obtenus, ainsi qu'un tableau de valeurs de référence de niveaux d'expression des fragments d'ADN déposés sur ladite au moins une puce ADN, ces niveaux correspondant à la positivité d'un stress oxydant. 



   D'autres modes et formes de réalisation de l'invention sont indiqués dans les revendications annexées. 



   On peut prévoir la mise au point d'un test de détection de stress oxydant suivant l'invention de la manière suivante, laquelle est uniquement donnée à titre exemplatif, et non limitatif. 



  A. Conditions expérimentales de stress oxydant et extraction de l'ARN messager, permettant d'évaluer la sensibilité de la méthode Du sang complet anticoagulé (1 ml) ou des lymphocytes (107 cellules/ml) isolés à partir d'échantillons sanguins (kit Nycomed Lymphoprep, In VitroGen) sont mis en contact à 37 C en présence de plusieurs systèmes de production d'un stress oxydant : i) peroxyde d'hydrogène dans une gamme de concentration allant de 10-4 à 10-6M, ii) xanthine oxydase 0,4   U/ml/hypoxanthine   2mM, iii) hydrochlorure de 2,2'-azobis(2- amidinipropane) à une concentration de 50 mM. Le temps d'incubation peut varier entre 30 minutes et 3 heures.

   A l'issue du temps d'incubation, l'extraction de l'ARN messager est effectuée à partir du sang complet ou des lymphocytes en utilisant le kit commercial   "uMACS   mRNA isolation kit, Miltenyi Biotec Germany". 



  B. Développement de puces ADN de faible densité SSO 

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 Les puces ADN SSO sont créées en utilisant à la fois des produits PCR générés par des oligonucléotides spécifiques des séquences de gènes candidats choisis par exemple parmi ceux indiqués plus haut, ainsi que des oligonucléotides et des polynucléotides représentant des fragments de ces gènes. La taille des produits PCR sera dans cet exemple comprise entre 80 et 600 paires de bases et celle des oligonucléotides et polynucléotides entre 25 et 100 bases. Le système utilisé pour le dépôt des produits sur lame de verre est l'EuroGridder SDDC-2   (ESI/Virtek).   



  C. Préparation des sondes fluorescentes (ADN complémentaires) et hybridation des puces AD SSO Les ARN messagers extraits sont transformés en ADN complémentaires par rétrotranscription. La transcriptase inverse est la SuperScript II commercialisée par INVITROGEN/Life Technology. Le protocole de transcription inverse est celui fourni avec l'enzyme. Les ADN complémentaires sont alors amplifiés par PCR en utilisant les oligonucléotides spécifiques des gènes sélectionnés et la polymérase SilverStar (Eurogentec) suivant le protocole fourni avec l'enzyme. Le marquage se fait lors de l'amplification par incorporation de dCTP couplés soit au CY3 soit au CY5 (Amersham/Pharmacia).

   Les ADN complémentaires sont alors rassemblés et dilués dans une solution d'hybridation "Dig Easy Hybridization solution" fournie par Roche- Boehringer et déposés sur les puces ADN (20  l par lame, recouverts par coverslip de 24 x 32 mm). Les lames sont alors placées individuellement dans des chambres d'hybridation fournies par Corning et incubées pendant 5 à 16 heures à 42 C. 



  D. Lavages des puces ADN. détection et analyse des signaux d'hybridation 

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 Après hybridation, les puces ADN sont lavées deux fois 5 minutes successivement dans les solutions 0,2 x SSC-0,1 % SDS et 0,2 x SSC a (1 x SSC = 0,15 M NaCI - 0,015 M citrate de sodium, pH : 7,5). Les signaux d'hybridation sont mesurés par le scanner GenePix 4000A et les résultats sont traités par le GenePix software 3. 0 (Axon Instruments). 



  E. Validation des tests sur puces ADN de faible densité SSO Pour chaque gène testé, des valeurs de référence sont établies à partir d'un échantillonnage de prélèvements obtenus chez 50 sujets en bonne santé. La quantification de l'expression des gènes se fera par rapport à l'expression basique de gènes comme la cyclophilline, le GAPDH, la bêta-actine et l'ARN ribosomique. Ces valeurs sont comparées à celles obtenues sur des échantillons sanguins soumis à un stress oxydant in vitro ainsi que décrit plus haut. 



   L'efficacité des puces ADN SSO a également de préférence été testée sur des sujets chez qui un stress oxydant aura été mis en évidence et cela sur base de dosages sanguins classiques. 



   Une fois l'efficacité des puces ADN observée, celles-ci peuvent être directement appliquées pour diagnostiquer une situation de stress oxydant sur des patients pouvant éventuellement souffrir d'une telle situation. 



   Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux modes et formes de réalisation décrits ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.

Claims (14)

  1. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de stress oxydant dans un échantillon sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend une extraction d'ARNm à partir de cellules de l'échantillon sanguin, une rétrotranscription desdits ARNm en ADNc, avec marquage de ces derniers, une mise en présence de ces ADNc avec une population de plusieurs fragments d'ADN synthétique, sélectionnés de façon à réaliser une hybridation moléculaire entre les ADNc et lesdits fragments d'ADN synthétique, en cas d'expression de stress oxydant dans les cellules, et une révélation simultanée de signaux de ladite hybridation qui correspondent à des gènes exprimés.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en présence est réalisée sur une lame de puce ADN qui porte lesdits fragments d'ADN synthétique selon une topographie spécifique.
  3. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la population de fragments d'ADN synthétique est composée d'oligonucléotides et polynucléotides d'une taille comprise entre 25 et 100 b.
  4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la population de fragments d'ADN synthétique est composée de produits d'une amplification enzymatique in vitro (PCR).
  5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la population de fragments d'ADN synthétique est composée d'oligonucléotides et polynucléotides d'une taille comprise entre 25 et 100 b et de produits d'une amplification enzymatique in vitro (PCR). <Desc/Clms Page number 10>
  6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la population de fragments d'ADN synthétique comprend au moins des fragments de gènes appartenant à des familles de gènes choisies parmi le groupe constitué par celles codant pour : des enzymes à fonctions antioxydantes, des enzymes à fonctions pro-oxydantes, des enzymes de réparation de l'ADN, des enzymes de métabolisme du glutathion, des protéines de stress, des protéines impliquées dans une apoptose, des facteurs de transcription, des cytokines et des chemokines.
  7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la population des fragments d'ADN synthétique sélectionnés comprend au moins deux gènes appartenant chacun à une famille distincte parmi les familles précitées.
  8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, avant ladite extraction d'ARNm, une exposition in vitro de cellules de l'échantillon sanguin à des facteurs générateurs de stress oxydant.
  9. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en parallèle une quantification de marqueurs sanguins de stress oxydant.
  10. 10. Trousse de détection de stress oxydant pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une puce ADN qui porte ladite population de fragments d'ADN synthétique.
  11. 11. Trousse selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un milieu d'hybridation adapté pour être utilisé sur ladite au moins une puce ADN. <Desc/Clms Page number 11>
  12. 12. Trousse selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une solution de lavage adaptée pour être utilisée après hybridation sur ladite au moins une puce ADN.
  13. 13. Trousse selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite au moins une puce ADN porte en outre, à titre de témoin, au moins un gène ayant un niveau d'expression constant dans toute situation de stress oxydant.
  14. 14. Trousse selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un protocole de toutes les étapes nécessaires pour réaliser une hybridation et procéder à une révélation de signaux d'hybridation obtenus, ainsi que un tableau de valeurs de référence de niveaux d'expression des fragments d'ADN déposés sur ladite au moins une puce ADN, ces niveaux correspondant à la positivité d'un stress oxydant.
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