BE1015281A5

BE1015281A5 - Recepteurs gaba-b.

Info

Publication number: BE1015281A5
Application number: BE2000/0726A
Authority: BE
Inventors: Klaus Raming; Mario Mezler; Thomas Mueller
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2005-01-11
Also published as: US6794149B1; GB2357768A; GB2357768B; FR2801593A1; CH694428A5; GB0027773D0; US20050136511A1; DE19955408A1; JP2001186893A

Abstract

Procédé de recherche de composés qui modifient les propriétés des polypeptides qui exercent l'activité biologique d'un récepteur de GABA-B, comprenant les étapes suivantes: (a) préparation d'une cellule hôte contenant un acide nucléotidique comprenant une séquence nuvléotidique qui code pour un polypeptide qui comprend une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 70% avec une séquence suivant SEQ ID N°:2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID°: 6 b) culture de la cellule hôte en presence d'un composé chimique ou d'un échantillon qui englobe un certain nombre de composés chimiques, et c) détection des propriétés modifiées. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit acide nucléique consiste en un fragment d'ADNc ou d'ADN génomique. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend une nucléotidique qui correspond à une séquence suivant SEQ ID N°:5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caratérisé en ce que ledit acide nucléique s'hybride dans des conditions rigoureuses à une séquence nucléotidique suivant SEQ ID N°:1, SEQ ID N°:3 ou SEQ ID N°:5.

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Récepteurs GABA-B. 



   L'invention concerne un procédé de recherche de composés qui modifient les propriétés des polypeptides qui exercent l'activité biologique des récepteurs de GABA-B. 



   L'acide gamma-aminobutyrique (GABA) est le neurotransmetteur inhibiteur le plus important du système nerveux des vertébrés et des invertébrés. Les récepteurs de GABA peuvent être divisés en 2 sous- familles, les récepteurs de GABA-A et de GABA-B (également appelés ci-après, récepteurs GABA-A et récepteurs GABA-B, respectivement). Parmi ceux-ci, les récepteurs GABA-A sont des canaux à ions ligand- dépendants, alors que les récepteurs GABA-B sont des récepteurs métabotropes, couplés à une protéine G. Les récepteurs GABA-B influencent la libération de différents neurotransmetteurs ainsi que l'activité des canaux à ions. 



   Les récepteurs GABA-B ont surtout été bien étudiés chez les vertébrés. On en connaît 2 sous-types (GABA-B1 et GABA-B2), qui sont fonctionellement actifs   comme hétérodimère (Jones et coll. 1998 ; et coll., 1998 ; et coll., 1998).   



   Chez les insectes, le GABA est un neurotransmetteur inhibiteur le plus important du 

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 système nerveux central. Ainsi, les récepteurs GABA peuvent être électrophysiologiquement décelés dans des préparations de ganglions centraux d'insectes. Non seulement les récepteurs GABA-A, mais également les récepteurs GABA-B sont le point d'attaque moléculaire de composés insecticides importants naturels et   synthétiques (Sattelle, 1990 ; et coll., 1999).   



   La séquence protéinique d'un certain nombre de récepteurs GABA-A d'insectes est déjà connue. Ainsi par exemple, dans Drosophila melanogaster, les séquences de 3 sous-unités différentes ont été décrites (French- Constant et coll., 1991; Harvey et coll., 1994; Henderson et coll., 1993). 



   Il est de plus, d'une grande importance pratique, par exemple pour la recherche de nouveaux insecticides, de disposer de récepteurs GABA-B d'insectes. 



   La présente invention repose donc en particulier sur l'objectif de modifier des récepteurs GABA-B d'insectes et des systèmes de test édifiés sur ceux-ci avec un débit élevé en composés de test (High Throughput Screening Assays; dosages HTS). 



   L'objectif est atteint par un procédé de recherche de composés qui modifient les propriétés des polypeptides qui exercent au moins une activité biologique d'un récepteur de GABA-B, comprenant les étapes   suivantes :   (a) préparation d'une cellule hôte contenant un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide ayant la séquence des acides aminés, qui présente une identité d'au moins 70%, de préférence une identité d'au moins 80%, de manière 

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 particulièrement préférée une identité d'au moins 90%, de manière tout particulièrement préférée une identité d'au moins 95%, avec une séquence suivant SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:6 ;

   (b) culture de la cellule hôte en présence d'un composé chimique ou d'un échantillon qui englobe un certain nombre de composés chimiques, et (c) détection des propriétés modifiées. 



   Le niveau d'identité de la séquence des acides aminés est déterminée de préférence, au moyen du programme GAP du kit de programme GCG, version 9,1 sous configuration standard (Devereux et coll., 1984). 



   Le terme "polypeptide", tel qu'utilisé ici, se rapporte non seulement à de courtes chaines d'acides aminés, qui sont habituellement caractérisées de peptides, oligopeptides ou oligomères, mais également de chaines plus longues d'acides aminés, qui sont habituellement caractérisées de protéines. Il englobe les chaines d'acides aminés, qui peuvent être modifiées par des processus naturels comme une maturation posttraductionnelle ou par un procédé chimique de l'état de la technique. Ces modifications peuvent se produire en différents endroits et plusieurs fois sur un polypeptide, comme par exemple sur le squelette peptidique, sur les chaines latérales des acides aminés, sur l'extrémité amino et/ou carboxyterminale.

   Elles comprennent par exemple, des acétylations, acylations, ADP-ribosylations, amidations, liaisons covalentes avec des flavines, des fractions hème, des nucléotides ou dérivés de nucléotide, des lipides ou dérivés de lipides ou un phosphatidylinositol, des cyclisations, des formations de pont disulfure, des déméthylations, des 

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 formations de cystine, des formylations, des gamma- carboxylations, des glycosylations, des hydroxylations, des iodations, des méthylations, des myristoylations, des oxydations, des mises en   &num;uvre   protéolytiques, des phosphorylations, des sélénoylations et des additions ARNt-dépendantes d'acides aminés. 



   Les polypeptides décrits dans le cadre de l'invention peuvent se trouver sous la forme de protéines "matures" ou de parties de protéines plus grandes, par exemple comme protéine de fusion. D'autre part, ils peuvent présenter des séquences de tête ou "leader", des proséquences, des séquences qui permettent une purification aisée, comme des restes histidine multiples, ou des acides aminés stabilisants supplémentaires. 



   L'activité biologique des récepteurs GABA-B est atteinte de préférence, par hétérodimérisation du polypeptide décrit dans le cadre de l'invention. Par exemple, les polypeptides en question avec une séquence d'acides aminés suivant SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:4, SEQ ID   NO: 2   et SEQ ID   NO: 6   ou SEQ ID   NO: 4   et SEQ ID   NO: 6,   peuvent atteindre une activité de récepteur par dimérisation. 



   Lesdits polypeptides ne doivent pas représenter un récepteur complet, mais ils peuvent ne consister qu'en des fragments de celui-ci, tant qu'ils présentent au moins encore une activité biologique du récepteur complet. Les polypeptides, qui exercent une activité augmentée ou diminuée de 50% par comparaison aux récepteurs GABA-B, étant des polypeptides avec une séquence d'acides aminés suivant SEQ ID NO: 2 et SEQ ID   NO: 4,   sont encore considérés comme intéressants. Ainsi, 

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 les polypeptides en question ne doivent pas dériver des récepteurs GABA-B de Drosophila melanogaster.

   Dans le cadre de l'invention, on considère également des polypeptides qui correspondent aux récepteurs GABA-B des invertébrés suivants, ou à des fragments de ceux-ci, qui peuvent exercer encore l'activité biologique de ces récepteurs : arthropodes, nématodes, mollusques. 



   Les polypeptides intéressants peuvent présenter, par comparaison au régions correspondantes des récepteurs GABA-B naturels, des délétions ou des substitutions d'acide aminé, tant qu'ils exercent au moins encore une activité biologique du récepteur complet. Les substitutions conservatives sont préférées. 



  Ces substitutions conservatives comprennent les variations où un acide aminé est remplacé par un autre acide aminé du même groupe : 
1. Petit reste aliphatique, non polaire ou peu polaire: Ala, Ser, Thr, Pro et Gly; 
2. Reste polaire, chargé négativement et leur amide : Asp, Asn, Glu et Gln; 
3. Reste polaire, chargé positivement : His, 
Arg et Lys; 
4. Grand reste aliphatique, non polaire : 
Met, Leu, Ile, Val et Cys, et 
5. Reste aromatique : Phe, Tyr et Trp. 



   La liste suivante présente les substitutions conservatives préférées: 
 EMI5.1 
 
<tb> Reste <SEP> initial <SEP> Substitution
<tb> 
<tb> 
<tb> Ala <SEP> Gly, <SEP> Ser
<tb> 
<tb> 
<tb> Arg <SEP> Lys
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
 EMI6.1 
 
<tb> Reste <SEP> initial <SEP> Substitution
<tb> 
<tb> Asn <SEP> Gln, <SEP> His
<tb> 
<tb> Asp <SEP> Glu
<tb> 
<tb> Cys <SEP> Ser
<tb> 
<tb> Gln <SEP> Asn
<tb> 
<tb> Glu <SEP> Asp
<tb> 
<tb> Gly <SEP> Ala, <SEP> Pro
<tb> 
<tb> His <SEP> Asn, <SEP> Gln
<tb> 
<tb> Ile <SEP> Leu, <SEP> Val
<tb> 
<tb> Leu <SEP> Ile, <SEP> Val
<tb> 
<tb> Lys <SEP> Arg, <SEP> Gln, <SEP> Glu
<tb> 
<tb> Met <SEP> Leu, <SEP> Tyr, <SEP> Ile
<tb> 
<tb> Phe <SEP> Met, <SEP> Leu, <SEP> Tyr
<tb> 
<tb> Ser <SEP> Thr
<tb> 
<tb> Thr <SEP> Ser
<tb> 
<tb> Trp <SEP> Tyr
<tb> 
<tb> Tyr <SEP> Trp, <SEP> Phe
<tb> 
<tb> Val <SEP> Ile,

   <SEP> Leu
<tb> 
 
L'expression "activité biologique d'un récepteur GABA-B", telle qu'utilisée ici, signifie une liaison du GABA. 



   Les formes de réalisation préférées du polypeptide suivant l'invention sont représentées par les récepteurs GABA-B de Drosophila melanogaster, qui possèdent la séquence d'acides aminés suivant SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6. 



   La présente invention met en   &num;uvre   une cellule hôte, qui contient un acide nucléique qui code pour les polypeptides définis ci-dessus. 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 



   Les acides nucléiques intéressants consistent en particulier, en des acides désoxyribonucléiques (ADN) simple brin ou double brin ou des acides ribonucléiques (ARN). Les formes de réalisation préférées sont des fragements d'ADN génomique, qui peuvent contenir des introns, et des ADNc. 



   Les formes de réalisations préférées des acides nucléiques en question sont des ADNc qui possèdent une séquence nucléotidique suivant SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. 



   Les acides nucléiques qui s'hybrident dans des conditions rigoureuses aux séquences suivant SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5, intéressent également la présente invention. 



   Le terme "hybrider", tel qu'utilisé ici, décrit un processus dans lequel une molécule d'acide nucléique simple brin réalise un appariement de bases avec un brin complémentaire. De cette manière, partant de l'information de séquences donnée ici, on peut isoler par exemple, des fragments d'ADN d'autres insectes que Drosophila melanogaster, lesquels codent pour un polypeptide avec l'activité biologique des récepteurs GABA-B. 



   Les conditions d'hybridation préférées sont données ci-après: Solution d'hybridation : 6X SSC/formamide à 0%, solution d'hybridation préférée : 6X SSC/formamide à 25%; Température d'hybridation : 34 C, température d'hybridation préférée : 42 C; Première étape de lavage : 2X SSC à 40 C; 

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 Deuxième étape de lavage : 2X SSC à 45 C, deuxième étape de lavage préférée : 0,6X SSC à 55 C, deuxième étape de lavage particulièrement préférée : 0,3X SSC à 65 C. 



   D'autre part, les acides nucléiques en question englobent ceux qui présentent une identité d'au moins 70%, de préférence une identité d'au moins 80%, de manière particulièrement préférée une identité d'au moins 90%, de manière tout particulièrement préférée une identité d'au moins   95%,   avec une séquence suivant SEQ ID NO:1, SEQ ID   NO: 3   ou SEQ ID   NO: 5   sur une longueur d'au moins 20, de préférence au moins 25, de manière particulièrement préférée au moins 30 nucléotides successifs et de manière tout particulièrement préférée sur toute la longueur. 



   Le niveau d'identité de la séquence nucléique est déterminée de préférence au moyen du programme GAP du kit de programmes GCG, version 9. 1, sous configuration standard. 



   Les séquences avec le numéro d'accès de la banque génomique (Acc N ) AC002502, AF145639 et AC004420 sont par référence des constituants de la présente description. 



   Dans le cadre de la présente invention, on fait d'autre part, intervenir des constructions d'ADN qui comprennent un acide nucléique intéressant et un promoteur hétérologue. 



   L'expression "promoteur hétérologue", telle qu'utilisée ici, se rapporte à un promoteur qui présente d'autres propriétés que le promoteur qui contrôle l'expression du gène en question dans l'organisme original. Le terme "promoteur", tel qu'utilisé ici, se 

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 rapporte de manière générale, aux séquences qui contrôlent l'expression. 



   Le choix de promoteurs hétérologues dépend donc de l'utilisation pour l'expression de cellules pro- ou eucaryotes ou de systèmes acellulaires. Des exemples de promoteurs hétérologues sont le promoteur précoce ou ultérieur du SV40, de l'adénovirus ou du cytomégalovirus, du système lac, du système trp, des régions opérateur et promoteur principales du phage lambda, des régions de contrôle des protéines d'enveloppe fd, du promoteur de la 3-phosphoglycérate kinase, du promoteur de la phosphatase acide et du promoteur du facteur de croissance a de la levure. 



   L'invention met en oeuvre des cellules hôtes qui contiennent un acide nucléique du genre décrit plus haut. 



   L'expression "cellule hôte", telle qu'utilisée ici, se rapporte à des cellules qui ne contient pas naturellement les acides nucléiques suivant l'invention. 



   Comme cellules hôtes, conviennent non seulement les cellules procaryotes comme les bactéries des espèces Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, de préférence E. coli, mais également les cellules eucaryotes comme les levures, cellules de mammifères, d'amphibiens, d'insectes ou de végétaux. Les cellules hôtes eucaryotes préférées sont les cellules HEK-293, S2, Sf9 de spodoptère, Kc, CHO, COS1, COS7, HeLa, C127,3T3 ou BHK et en particulier, des oocytes de xénope. 



   Les acides nucléiques intéressants peuvent être utilisés en particulier pour préparer des 

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 invertébrés transgéniques. Ceux-ci peuvent être utilisés dans des systèmes de test, qui sont basés sur l'expression s'écartant du type sauvage, du polypeptide intervenant dans le cadre de l'invention. En outre, on peut préparer sur base des informations données ici, des invertébrés transgéniques, chez lesquels il se produit un changement de l'expression du polypeptide décrit dans le cadre de l'invention, par la modification d'un autre gène ou promoteur. 



   La préparation d'invertébrés transgéniques se fait par exemple, chez Drosophila melanogaster, par transfert de gène par l'intermédiaire de l'élément P (Hay et coll., 1997) ou chez Caenorhabditis elegans, par transfert de gène par l'intermédiaire d'un transposon (par exemple, par Tel; Plasterk, 1996). 



   De préférence, les invertébrés transgéniques contiennent le polypeptide décrit dans le cadre de l'invention sous une forme qui s'écarte du type sauvage. 



   Pour préparer les polypeptides qui sont codés par les acides nucléiques décrits dans le cadre de l'invention, on peut mettre en culture des cellules hôtes qui contiennent l'un des acides nucléiques suivant l'invention, dans des conditions appropriées. De plus, l'acide nucléique à exprimer peut être adapté aux "habitudes de codon" de la cellule hôte. Les polypeptides souhaités peuvent donc être isolés de manière usuelle des cellules ou du milieu de culture. 



  Les polypeptides peuvent également être préparés dans des systèmes in vitro. 



   Un procédé rapide d'isolement des polypeptides en question, qui sont synthétisés à partir de cellules hôtes en utilisant un acide nucléique décrit 

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 dans le cadre de l'invention, commence par l'expression d'une protéine de fusion, où le partenaire de fusion peut être purifié par affinité de manière aisée. Le partenaire de fusion peut être par exemple, la glutathion S-transférase. La protéine de fusion peut alors être purifiée sur une colonne d'affinité au glutathion. Le partenaire de fusion peut être séparé par clivage protéolytique partiel, par exemple au lieur entre le partenaire de fusion et le polypeptide suivant l'invention à purifier. Le lieur peut se présenter de sorte qu'il renferme un acide aminé visé tel qu'un reste arginine ou lysine, qui définit l'endroit de clivage par la trypsine.

   Pour produire un tel lieur, on peut mettre en   &num;uvre   les procédés standards de clonage en utilisant des oligonucléotides. 



   D'autres procédés possibles de purification sont basés sur l'électrophorèse préparative, la FPLC, la HPLC (par exemple en utilisant des colonnes de filtration sur gel, en phase inverse ou faiblement hydrophobes), la filtration sur gel, la précipitation différentielle, la chromatographie par échange d'ions et la chromatographie d'affinité. 



   Parce que les récepteurs GABA-B sont des protéines de membrane, on réalise de préférence dans le procédé de purification, une extraction par détergent, par exemple en utilisant des détergents qui n'influencent pas ou peu les structures secondaire et tertiaire des polypeptides, comme des détergents non ioniques. 



   La purification des polypeptides décrits dans le cadre de l'invention peut comprendre l'isolement de membranes au départ des cellules hôtes qui expriment 

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 l'acide nucléique également décrit dans le cadre de l'invention. De préférence, ces cellules expriment le polypeptide suivant l'invention en un nombre de copie suffisant pour que la quantité du polypeptide dans une fraction membranaire soit d'au moins 10 fois supérieure à celle que l'on trouve dans des membranes comparatives de cellules qui expriment naturellement les récepteurs GABA-B; on préfère en particulier, des quantités d'au moins 100 fois, de manière particulièrement préférée au moins 1000 fois supérieures. 



   Le terme "isolement ou purification", tel qu'utilisé ici, signifie que les polypeptides en question sont séparés des autres protéines ou autres macromolécules de la cellule ou du tissu. De préférence, une composition contenant lesdits polypeptides, est enrichie en ceux-ci d'au moins 10 fois, et de manière particulièrement préférée d'au moins 100 fois, au niveau de la teneur protéinique par rapport à une préparation de la cellule hôte. 



   Les polypeptides intéressants peuvent également être purifiés par affinité sans partenaire de fusion, à l'aide d'anticorps qui se lient aux polypeptides. 



   Les acides nucléiques qui codent ces polypeptides, peuvent être préparés par les manières usuelles. Par exemple, les molécules d'acide nucléique peuvent être complètement chimiquement synthétisées. On peut également ne synthétiser chimiquement que de courts morceaux des séquences suivant l'invention et marquer ces oligonucléotides, de manière radioactive ou avec un colorant fluorescent. Les oligonucléotides marqués peuvent être utilisés pour rechercher des banques d'ADNc 

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 préparées en partant d'ARNm d'insectes, ou des banques génomiques préparées en partant d'ADN génomique d'insecte. Les clones, sur lesquels les oligonucléotides marqués s'hybrident, sont choisis pour isoler l'ADN considéré. Après la caractérisation de l'ADN isolé, on obtient de manière simple, les acides nucléiques. 



   Les acides nucléiques en question peuvent également être préparés au moyen du procédé ACP (amplification en chaine par polymérase, ou PCR) en utilisant des oligonucléotides chimiquement synthétisés. 



   Le terme "oligonucléotide", tel qu'utilisé ici, signifie une molécule d'ADN, qui consiste en 10 à 50, de préférence 15 à 30 nucléotides. Ils sont synthétisés chimiquement et peuvent être utilisés comme sondes. 



   A l'aide des acides nucléiques ou des polypeptides décrits précédemment, on peut identifier de nouveaux agents actifs pour la protection des végétaux ou des agents actifs pharmaceutiques pour le traitement des hommes et des animaux, comme des composés chimiques tels que des modulateurs, en particulier des agonistes ou antagonistes, qui modifient les propriétés des récepteurs GABA-B suivant l'invention. Pour cela, on introduit une molécule d'ADN recombinée, qui comprend au moins un acide nucléique suivant l'invention, dans une cellule hôte appropriée. La cellule hôte est cultivée en présence d'un composé ou d'un échantillon qui contient un certain nombre de composés, dans des conditions qui permettent l'expression des récepteurs suivant l'invention.

   Une modification des propriétés du récepteur peut par exemple être détectée comme décrit ci-après à l'exemple 2. De cette manière, il est 

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 possible de découvrir par exemple, des substances insecticides. 



   Les récepteurs GABA-B modifient de préférence après activation, la concentration du cAMP intracellulaire par une interaction avec les protéines G. Des modifications des propriétés du récepteur par des composés chimiques peuvent par conséquent, être mesurées après expression hétérologue, par exemple par mesure de la concentration en cAMP intracellulaire, directement au moyen d'un système de dosage ELISA (Biomol, Hambourg, Allemagne) ou d'un système de dosage RIA (NEN, Schwalbach, Allemagne) en format HTS. Une mesure indirecte de la concentration en cAMP est possible à l'aide de gènes reporters (par exemple, la luciférase), dont l'expression dépend du la concentration en cAMP (Stratowa et coll., 1995).

   La coexpression des récepteurs GABA-B avec des protéines G particulières, par exemple   G&alpha;15,   Gal5 ou des protéines G chimères, dans des systèmes hétérologues et la mesure de l'augmentation du calcium, par exemple avec des colorants fluorescents ou l'équorine, est une autre possibilité de criblage (Stables et coll., 1997; Conklin et coll., 1993). 



   D'autre part, la liaison du GTP à la protéine G activée comme système de lecture, peut être prise en considération pour le test de substances. De même, des expériences de liaison avec du GABA marqué peuvent être mises en   &num;uvre   pour le criblage. 



   Le terme "agoniste", tel qu'utilisé ici, se rapporte à une molécule qui active les récepteurs GABA- B. 

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   Le terme "antagoniste", tel qu'utilisé ici, se rapporte à une molécule qui déplace un agoniste de son site de liaison. 



   Le terme "modulateur", tel qu'utilisé ici, est le terme générique de agoniste et antagoniste. Les modulateurs peuvent être de petites molécules organochimiques, des peptides ou des anticorps, qui se lient au polypeptide suivant l'invention. De plus, les modulateurs peuvent être de petites molécules organochimiques, des peptides ou des anticorps, qui se lient à une molécule qui se lie à son tour, au polypeptide suivant l'invention, et ils influencent ainsi son activité biologique. Les modulateurs peuvent être des mimétiques de substrats et ligands naturels. 



   De préférence, les modulateurs consistent en de petits composés organochimiques. 



   La liaison du modulateur au polypeptide suivant l'invention peut modifier le processus cellulaire de sorte que cela conduise à la mort de l'insecte traité. 



   Par conséquent, la présente invention s'étend également à l'utilisation de modulateurs des polypeptides suivant l'invention, comme insecticide. 



   Les acides nucléiques ou polypeptides décrits dans le cadre de l'invention rendent possible également, le recherche de composés qui se lient aux récepteurs suivant l'invention. Ceux-ci peuvent également être employés comme insecticides sur les plantes. Par exemple, on met en contact des cellules hôtes, qui contiennent l'acide nucléique en question et qui expriment les récepteurs ou polypeptides correspondants ou les produits géniques eux-mêmes avec un composé ou un 

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 mélange de composés, dans des conditions qui permettent l'interaction d'au moins un composé avec les cellules hôtes, les récepteurs ou les polypeptides individuels. 



   En utilisant des cellules hôtes ou des invertébrés transgéniques, qui contiennent lesdits acides nucléiques, il est possible également de trouver des substances qui modifient l'expression des récepteurs. 



   Les acides nucléiques, vecteurs et régions de régulation, décrits ci-dessus, peuvent en outre, être utilisés pour découvrir des gènes qui codent pour les polypeptides qui participent à l'élaboration de récepteurs GABA-B fonctionnellement similaires chez les insectes. Par récepteurs fonctionnellement similaires, il convient de comprendre, des récepteurs qui comprennent les polypeptides, qui se différencient en ce qui concerne la séquence des acides aminés, des polypeptides décrits ici, mais qui ont essentiellement, les mêmes fonctions. 



  Explications du protocole de séquence et des figures. 



   Les SEQ ID N :1, SEQ ID   N  :3   et SEQ ID   N :5   présentent les séquences nucléotidiques et d'acides aminés des ADNc de GABA-B isolés. Les SEQ ID N :2, SEQ ID N :4 et SEQ ID N  : 6 montrent en outre, les séquences d'acides aminés des protéines dérivées des séquences d'ADNc de GABA-B. 



   La Fig. 1 présente une courbe de dose- activité du GABA et du 3-APMPA sur les récepteurs GABA-B de drosophile, consistant en les polypeptides comportant les séquences d'acides aminés suivant SEQ ID N :2 et SEQ ID N :4, exprimés dans des oocytes de xénope. 

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   La Fig. 2 montre le couplage fonctionnel des récepteurs D-GABA-B R1/R2 coexprimés, consistant en les polypeptides comportant les séquences d'acides aminés suivant SEQ ID N :2 et SEQ ID N :4 sur le système cAMP intracellulaire. Des cellules HEK293 Luc transfectées par le D-GABA-B R1/R2, stables, (D-GABA Rl/2) et des cellules témoin non transfectées (témoin) sont stimulées avec de la forskoline, de la forskoline et du GABA, mais également avec du GABA seulement et on mesure la concentration intracellulaire en cAMP. Les cellules transfectées par le D-GABA-B Rl/2 présentent une nette réduction de la réponse cAMP induite par la forskoline, alors que les cellules témoin ne réagissent pas. 



  Exemples. 



  Exemple 1. 
 EMI17.1 
 



  Isolement des séquences polynucléotidigues décrites. 



   La manipulation des polynucléotides est réalisée d'après les procédés standard de la technologie de l'ADN recombiné (Sambrook et coll., 1989). Le traitement bioinformatique des séquences nucléotidiques et protéiniques se fait par le kit de programmes GCG, version 9. 1 (GCG Genetics Computer Group, Inc., Madison Wisconsin, USA). 

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  Exemple 2. 



  Génération de la construction d'expression. 



   Au moyen de l'amplification en chaine par polymérase (ACP), on amplifie les domaines de séquence de SEQ ID N :1, SEQ ID N :3 et SEQ ID N :5 et on les clones dans le vecteur pcDNA3.1/Neo (Invitrogen, Groningen). 



  Expression hétérologue. 



   On cultive des cellules HEK293 dans du milieu Eagles modifié par Dulbecco et dans du sérum   f&num;tal   de veau à 10% et CO2 à 5% à 37 C. Pour le transfert de gène, on utilise du MBS (Stratagene, La Jolla, USA) d'après les indications du fabricant. 24 à 48 heures après le transfert génique, on divise les cellules en différentes densités dans des plaques de microtitrage. Les cellules modifiées par technique génétique sont sélectionnées par croissance dans du milieu Eagles modifié par Dulbecco et dans du sérum   f&num;tal   de veau à 10% et généticine 700 pg/ml (G418, Life Technologies, Karlsruhe) comme marqueur de sélection pendant 3 à 4 semaines. Les clones individuels résistants sont analysés comme décrit ci- dessous. 



   L'expression fonctionnelle des récepteurs GABA-B d'insectes est également réalisée dans des oocytes de xénope. Pour cela, on coexprime des canaux à potassium activables par des protéines G (GIRK1 et GIRK4) pour mesurer l'activation des récepteurs GABA-B (White et coll., 1998). 

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  Mesures du cAMP. 



   Pour déterminer la concentration en cAMP, on utilise des souches de cellules HEK293. D'une part, des cellules HEK293 expriment de manière stable, les deux récepteurs D-GABA-B R1 et D-GABA-B R2 (D-GABA-B Rl/2) de Drosophila melanogaster. D'autre part, on introduit dans le test, des cellules témoin non transfectées (témoin). 



  On étale les cellules, chaque fois en une densité de 20 000 cellules par cavité sur des plaques à 96 puits. 



  Les cellules témoin sont incubées dans du milieu de culture (DMEM, FCS 10%, pénicilline et streptomycine, 50 U/ml et 50   jug/ml   (Life Technologies)) et les cellules exprimant le D-GABA-B Rl/2 dans du milieu de sélection (milieu de culture avec généticine à 0,5 mg/ml (G418, Life Technologies)) pendant 48 heures à 37 C jusqu'à une densité cellulaire d'environ 80%. On enlève alors le milieu et on lave une fois les cellules avec du DMEM sans addition. Après une incubation de 30 minutes avec du IBMX (300  M) à 37 C, on réalise une stimulation de 30 minutes avec du GABA (100  M) et/ou de la forskoline (10  M) à 37 C. Toutes les étapes d'incubation sont effectuées dans du DMEM (Life Technologies) sans addition. Ensuite, on élimine le milieu de stimulation et on lyse les cellules avec 50  l de HC1 (0,1 N) par cavité.

   On lyse les cellules pendant 20 minutes à température ambiante sous agitation et on détermine la concentration en cAMP du lysat cellulaire en triple avec le kit de dosage immunoenzymatique (EIA) AK-200 (Biomol, Hambourg, Allemagne) en suivant la description du fabricant. 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 



  Mesures des oocvtes. 



    1.   Préparation des oocytes. 



   Les oocytes proviennent d'une grenouille femelle adulte Xenopus laevis (société Horst Kâhler, Hambourg, Allemagne). Les grenouilles sont conservées dans de grands réservoirs avec de l'eau en circulation à une température de l'eau de 20-24 C. Une partie des ovaires de grenouilles sont prélevés sous anesthésie complète par une petite incision dans l'abdomen (environ 1 cm). Ensuite, on traite l'ovaire sous agitation constante pendant environ 140 minutes dans 25 ml de collagénase (type I, C-0130, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne; 355 U/ml, dans une solution de Barth sans calcium, avec en mM: NaCl 88, KC1 1, MgS04 0,82, NaHC03 2,4, Tris/HCl 5, pH 7,4). Les oocytes sont alors lavés par la solution de Barth sans calcium.

   Seuls les oocytes au stade de maturation V (Dumont, 1972) sont choisis pour un autre traitement et placés dans des plaques de microtitrage (plaques Nunc MicroWellTM, cat. 



  N  245128 + 263339 (couvercle), Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Allemagne), remplies de solution de Barth (en mM : NaCl 88, KC1 1, MgS04 0,82,   Ca(N03)2   0,33, CaCl2 0,41, NaHC03 2,4, Tris/HCl 5, pH 7,4) ainsi que de gentamicine (sulfate de gentamicine, G-3632, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne; 100 U/ml). Les oocytes sont alors conservés à 19,2 C dans une étuve d'incubation froide (Type KB 53, WTB Binder Labortechnik GmbH, Tuttlingen, Allemagne). 



  2. Injection des oocytes. 



   On prépare des électrodes d'injection ayant un diamètre de 10-15  m avec un étireur de pipette (type 

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 L/M-3P-A, List-electronic, Darmstadt-Eberstadt, Allemagne). Avant l'injection, on dégèle des aliquotes avec de l'ADN de D-GABA-B ou de l'ADN GIRKl/4 et on dilue avec de l'eau jusqu'à une concentration finale de 10   ng/pl.   Les sondes d'ADN sont centrifugées à 3200 g pendant 120 secondes (type Biofuge 13, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Allemagne). Ensuite, on utilise un tuyau en PE étiré comme tuyau de transfert, pour remplir les pipettes par l'arrière. Les électrodes d'injection sont fixées sur une unité de procédure X,Y,Z (centre de traitement EP1090, isel-automation, Eiterfeld, Allemagne).

   Au moyen d'un ordinateur Macintosh, on accroche les oocytes dans les puits des plaques de microtitrage et on injecte environ 50 ni de la solution d'ADN dans les oocytes par brève application de pression (0,5-0,3 bar, 3-6 secondes). 



  3. Mesures électrophysiologiques. 



   Pour les mesures électrophysiologiques, une pince de tension à deux électrodes est réalisée avec un amplificateur TURBO TEC-10CD (npi electronic GmbH, Tamm, Allemgane). Les micropipettes utilisées pour cela sont étirées à partir de verre en silicate d'aluminium (tube capillaire Art.-n  14 630 29,1=100 mm,   0e   = 1,60 mm,   0i  
1,22 mm, Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Allemagne) en deux séquences (Hamill et coll., 1981). Les électrodes de courant et de tension ont un diamètre de 1-3  m et sont remplies de KC1 1,5 M et acétate de potassium 1,5 M. Les pipettes ont une résistance capacitive de 0,2-0,5 MW. 



  Pour les mesures électrophysiologiques, on fait passer les oocytes dans une petite chambre qui est rincée continuellement d'une solution Rimland normale (en mM: 

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 KC1 90,   MgCl2   3, HEPES 5, pH 7,2). Pour l'application d'une substance, on remplace la solution de perfusion par une solution de la substance avec une composition identique et en plus, la concentration souhaitée de la substance. Pour un potentiel de pince de-60 mV, l'expression satisfaisante de l'ADN D-GABA-B est vérifiée après une semaine. Les oocytes n'ayant pas réagi sont rejetés. Tous les autres sont utilisés pour le test de substance. Les données sont imprimées au moyen d'un stylo YT (stylo YT, modèle BD 111, Kipp & Zonen Delft BV, AM Delft, Pays-Bas).

   Lorsque les substances test sont examinées dans une série de concentration, les mesures sont effectuées sur au moins deux oocytes différents et sur au moins cinq concentrations différentes. Les substances sont testées directement et sans préincubation, en présence de GABA (acide gamma-amino-N-butyrique, A2129, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne) pour leur antagoniste. Les valeurs sont introduites dans Origin (logiciel d'exploitation Microcal Origin, Microcal Software, Inc., Northampton, MA 01060-4410 USA) (Additive GmbH, Friedrichsdorf/Ts, Allemagne). La valeur moyenne, la déviation standard, la valeur CI50 et la courbe CI50 sont calculés par Origin. Ces mesures sont réalisées au moins en double. 



  Littérature. 



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 <Desc/Clms Page number 26> 

 



   PROTOCOLE DE SEQUENCE < 110 > Bayer Aktiengesellschaft < 120 > Récepteurs GABA-B < 130 > Le A 34 074 < 140 > < 141 > < 150 > DE 199 55 408,0 < 151 > 1999-11-18 < 160 > 6 < 170 >   PatentIn   Ver. 2.1 < 210 > 1 < 211 > 2523 < 212 > DNA < 213 > Drosophila melanogaster < 220 > < 221 > CDS < 222 > (1)..(2520)

   < 400 > 1 atg cgc aaa gat atg aca agt gat ggt gct gtt acg ttt tgg ata ttt 48 Met Arg Lys Asp Met Thr Ser Asp Gly Ala Val Thr Phe Trp Ile Phe   1 5 10 15   ttg ctt tgt tta atc gcc tcg ccg cac ctg caa ggg ggc gtg gcc ggg 96 Leu Leu Cys Leu Ile Ala Ser Pro His Leu Gln Gly Gly Val Ala Gly 
20 25 30 agg ccc gat gaa ctg cac atc ggc ggc atc ttt ccg ata gcc ggc aaa 144 Arg Pro Asp Glu Leu His Ile Gly Gly Ile Phe Pro Ile Ala Gly Lys 
35 40 45 gga gga tgg cag ggc ggc cag gcg tgt atg cct gcc aca aga ctg gcg 192 Gly Gly Trp Gln Gly Gly Gln Ala Cys Met Pro Ala Thr Arg Leu Ala 
50 55 60 ttg gat gat gtc aac aag cag ccg aat ctg ctg ccg ggc ttc aag ctc 240 Leu Asp Asp Val Asn Lys Gln Pro Asn Leu Leu Pro Gly Phe Lys Leu 
65 70 75 80 

 <Desc/Clms Page number 27> 

 atc ctg cac agc aac gac agc gag tgt gag ccc ggt ttg ggc gcc agc 288 Ile Leu His Ser Asn Asp Ser Glu Cys Glu Pro Gly 

  Leu Gly Ala Ser 
85 90 95 gtg atg tac aat ctg ctc tat aat aaa ccg caa aag ctg atg ctg ttg 336 Val Met Tyr Asn Leu Leu Tyr Asn Lys Pro Gln Lys Leu Met Leu Leu 
100 105 110 gca gga tgc agc acg gtc tgc acc act gta gcc gag gct gcc aaa atg 384 Ala Gly Cys Ser Thr Val Cys Thr Thr Val Ala Glu Ala Ala Lys Met 
115 120 125 tgg aat cta att gtg ctc tgc tac ggg gcc tcg agt ccg gct ctt tcg 432 Trp Asn Leu Ile Val Leu Cys Tyr Gly Ala Ser Ser Pro Ala Leu Ser 
130 135 140 gat cgc aaa cga ttc ccc act cta ttc cgc acc cat cca tcg gcc acg 480 Asp Arg Lys Arg Phe Pro Thr Leu Phe Arg Thr His Pro Ser Ala Thr 145 150 155 160 gtg cac aat cca acg cgc atc aag ctg atg aag aaa ttc ggc tgg tcc 528 Val His Asn Pro Thr Arg Ile Lys Leu Met Lys Lys Phe Gly Trp Ser 
165 170 175 cgg gtg gcc att ctg cag cag gcg gag gag gtc ttt ata tcg acc gta 576 Arg Val Ala Ile Leu Gln Gln Ala Glu Glu Val Phe Ile Ser Thr Val 
180 185 

  190 gag gat ctc gag aat cga tgc atg gag gct ggc gtt gaa atc gta act 624 Glu Asp Leu Glu Asn Arg Cys Met Glu Ala Gly Val Glu Ile Val Thr 
195 200 205 aga caa tca ttt cta tcc gat cca aca gac gcc gtg cgc aat ttg cga 672 Arg Gln Ser Phe Leu Ser Asp Pro Thr Asp Ala Val Arg Asn Leu Arg 
210 215 220 cgc cag gat gca cgc atc att gtg gga ctc ttc tat gtg gtg gcc gcc 720 Arg Gln Asp Ala Arg Ile Ile Val Gly Leu Phe Tyr Val Val Ala Ala 225 230 235 240 agg agg gtg ctc tgc gaa atg tac aaa cag cag cta tat ggc cga gct 768 Arg Arg Val Leu Cys Glu Met Tyr Lys Gln Gln Leu Tyr Gly Arg Ala 
245 250 255 cat gtg tgg ttc ttt att ggc tgg tac gag gac aac tgg tac gag gtg 816 His Val Trp Phe Phe Ile Gly Trp Tyr Glu Asp Asn Trp Tyr Glu Val 
260 265 270 

 <Desc/Clms Page number 28> 

 aat ctg aaa gca gag ggc atc acc tgc act gtt gaa cag atg cga ata 864 Asn Leu Lys Ala Glu Gly Ile Thr Cys Thr Val Glu Gln Met Arg 

  Ile 
275 280 285 gct gcc gaa gga cat ctg aca acg gaa gcg ctc atg tgg aat cag aac 912 Ala Ala Glu Gly His Leu Thr Thr Glu Ala Leu Met Trp Asn Gln Asn 
290 295 300 aat cag aca act ata tcc gga atg act gca gag gaa ttt cga cat cga 960 Asn Gln Thr Thr Ile Ser Gly Met Thr Ala Glu Glu Phe Arg His Arg 305 310 315 320 ctg aat cag gcg cta atc gag gag ggt tac gac att aac cac gat cgc 1008 Leu Asn Gln Ala Leu Ile Glu Glu Gly Tyr Asp Ile Asn His Asp Arg 
325 330 335 tat ccg gag gga tat cag gag gcg cca ctc gcc tac gat gca gtg tgg 1056 Tyr Pro Glu Gly Tyr Gln Glu Ala Pro Leu Ala Tyr Asp Ala Val Trp 
340 345 350 agt gtg gct ttg gct ttc aac aag acc atg gaa cga ttg aca acc ggg 1104 Ser Val Ala Leu Ala Phe Asn Lys Thr Met Glu Arg Leu Thr Thr Gly 
355 360 365 aag aaa tct ctg agg gat ttt acc tat acg gac aag gag att gcc gat 1152 Lys Lys Ser Leu Arg Asp Phe Thr Tyr Thr Asp Lys Glu Ile Ala Asp 
370 375 380 

  gaa atc tac gct gcc atg aac tcc aca caa ttt ctg ggt gta tcg ggt 1200 Glu Ile Tyr Ala Ala Met Asn Ser Thr Gln Phe Leu Gly Val Ser Gly 385 390 395 400 gtg gtg gca ttc agt tct cag ggc gat cgt att gct ctt aca cag atc 1248 Val Val Ala Phe Ser Ser Gln Gly Asp Arg Ile Ala Leu Thr Gln Ile 
405 410 415 gaa cag atg ata gac ggc aag tac gag aag ttg ggt tac tac gat act 1296 Glu Gln Met Ile Asp Gly Lys Tyr Glu Lys Leu Gly Tyr Tyr Asp Thr 
420 425 430 cag ttg gat aac cta tcc tgg ttg aat act gaa cag tgg att ggt ggc 1344 Gln Leu Asp Asn Leu Ser Trp Leu Asn Thr Glu Gln Trp Ile Gly Gly 
435 440 445 aag gtt cct caa gat cgc aca att gtc acc cat gtt cta cgc acc gtg 1392 Lys Val Pro Gln Asp Arg Thr Ile Val Thr His Val Leu Arg Thr Val 
450 455 460 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 tcc ttg cca tta ttt gtg tgc atg tgc aca ata tcc agt tgt ggc ata 1440 Ser Leu Pro Leu Phe Val Cys Met Cys Thr Ile Ser Ser Cys Gly 

  Ile 465 470 475 480 ttc gtt gcc ttc gcc ttg atc atc ttt aat ata tgg aat aag cat aga 1488 Phe Val Ala Phe Ala Leu Ile Ile Phe Asn Ile Trp Asn Lys His Arg 
485 490 495 aga gta ata caa tcc tcg cat ccc gtt tgc aat acg atc atg tta ttt 1536 Arg Val Ile Gln Ser Ser His Pro Val Cys Asn Thr Ile Met Leu Phe 
500 505 510 ggt gtc atc atc tgt cta ata tct gtc atc tta ctg ggc atc gac gga 1584 Gly Val Ile Ile Cys Leu Ile Ser Val Ile Leu Leu Gly Ile Asp Gly 
515 520 525 cgc ttt gtc agc ccc gag gaa tat cca aag ata tgt caa gcg cgg gct 1632 Arg Phe Val Ser Pro Glu Glu Tyr Pro Lys Ile Cys Gln Ala Arg Ala 
530 535 540 tgg tta cta tcc acc ggt ttt aca cta gca tac ggt gct atg ttc agc 1680 Trp Leu Leu Ser Thr Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Gly Ala Met Phe Ser 545 550 555 560 aag gtc tgg cgt gtg cat cgt ttt aca aca aaa gca aaa act gac cca 1728 Lys Val Trp Arg Val His Arg Phe Thr Thr Lys Ala Lys Thr Asp Pro 
565 570 

  575 aag aaa aaa gtg gaa cct tgg aag cta tac acc atg gtt tcg ggg cta 1776 Lys Lys Lys Val Glu Pro Trp Lys Leu Tyr Thr Met Val Ser Gly Leu 
580 585 590 tta tca ata gat tta gtg ata tta ctc tca tgg cag atc ttt gat ccg 1824 Leu Ser Ile Asp Leu Val Ile Leu Leu Ser Trp Gln Ile Phe Asp Pro 
595 600 605 ctg cag cgt tat ctc gaa aca ttc cca ctc gaa gat cca gta tct act 1872 Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Thr Phe Pro Leu Glu Asp Pro Val Ser Thr 
610 615 620 act gat gat att aaa ata cgt cca gag ctt gag cat tgt gaa agt caa 1920 Thr Asp Asp Ile Lys Ile Arg Pro Glu Leu Glu His Cys Glu Ser Gln 625 630 635 640 cgc aac tcc atg tgg ttg ggt ctt gta tac ggc ttc aag ggg cta atc 1968 Arg Asn Ser Met Trp Leu Gly Leu Val Tyr Gly Phe Lys Gly Leu Ile 
645 650 655 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 ctg gtg ttt ggc ctc ttt ttg gcg tac gag acg cgc tcc att aaa gtg 2016 Leu Val Phe Gly Leu Phe Leu Ala Tyr Glu Thr Arg Ser Ile 

  Lys Val 
660 665 670 aaa cag atc aac gat tcg cgt tat gtg ggc atg agc atc tat aac gtg 2064 Lys Gln Ile Asn Asp Ser Arg Tyr Val Gly Met Ser Ile Tyr Asn Val 
675 680 685 gtc gtc ctt tgc ctg ata aca gct ccg gtg ggc atg gtc att gca tcg 2112 Val Val Leu Cys Leu Ile Thr Ala Pro Val Gly Met Val Ile Ala Ser 
690 695 700 caa cag gac gcg tcc ttt gcc ttc gtt gct cta gct gtg ata ttc tgt 2160 Gln Gln Asp Ala Ser Phe Ala Phe Val Ala Leu Ala Val Ile Phe Cys 705 710 715 720 tgt ttc cta agc atg ctg ctg ata ttt gtg cca aag gtc att gag gtt 2208 Cys Phe Leu Ser Met Leu Leu Ile Phe Val Pro Lys Val Ile Glu Val 
725 730 735 ata cgt cat ccc aag gat aag gcc gaa tcg aaa tac aat ccc gat tca 2256 Ile Arg His Pro Lys Asp Lys Ala Glu Ser Lys Tyr Asn Pro Asp Ser 
740 745 750 gcc ata tcg aaa gag gac gaa gaa cgc tat cag aaa ctt gtt acc gaa 2304 Ala Ile Ser Lys Glu Asp Glu Glu Arg Tyr Gln Lys Leu Val Thr Glu 
755 

  760 765 aac gag caa ttg caa cga tta ata aca cag aag gag gaa aag att cga 2352 Asn Glu Gln Leu Gln Arg Leu Ile Thr Gln Lys Glu Glu Lys Ile Arg 
770 775 780 gtc ctg cga cag cgt ctg gtg gag cgg ggc gac gcc aag ggc aca gaa 2400 Val Leu Arg Gln Arg Leu Val Glu Arg Gly Asp Ala Lys Gly Thr Glu 785 790 795 800 ctg aat ggt gca aca ggt gtc gcc tcc gcc gcc gtt gca aca act tcg 2448 Leu Asn Gly Ala Thr Gly Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Thr Thr Ser 
805 810 815 cag ccc gct tcc ctc atc aac tca tca gca cat gcc acg ccc gca gcc 2496 Gln Pro Ala Ser Leu Ile Asn Ser Ser Ala His Ala Thr Pro Ala Ala 
820 825 830 aca ctc gca atc aca caa ggt gag tag 2523 Thr Leu Ala Ile Thr Gln Gly Glu 
835 840 

 <Desc/Clms Page number 31> 

 < 210 > 2 < 211 > 840 < 212 > PRT < 213 > Drosophila melanogaster < 400 > 2 Met Arg Lys Asp Met Thr Ser Asp Gly Ala Val Thr Phe Trp Ile Phe   1 5 10 15   Leu Leu Cys 

  Leu Ile Ala Ser Pro His Leu Gin Gly Gly Val Ala Gly
20 25 30 Arg Pro Asp Glu Leu His Ile Gly Gly Ile Phe Pro Ile Ala Gly Lys
35 40 45 Gly Gly Trp Gin Gly Gly Gln Ala Cys Met Pro Ala Thr Arg Leu Ala
50 55 60 Leu Asp Asp Val Asn Lys Gln Pro Asn Leu Leu Pro Gly Phe Lys Leu
65 70 75 80 Ile Leu His Ser Asn Asp Ser Glu Cys Glu Pro Gly Leu Gly Ala Ser
85 90 95 Val Met Tyr Asn Leu Leu Tyr Asn Lys Pro Gin Lys Leu Met Leu Leu
100 105 110 Ala Gly Cys Ser Thr Val Cys Thr Thr Val Ala Glu Ala Ala Lys Met
115 120 125 Trp Asn Leu Ile Val Leu Cys Tyr Gly Ala Ser Ser Pro Ala Leu Ser
130 135 140 Asp Arg Lys Arg Phe Pro Thr Leu Phe Arg Thr His Pro Ser Ala Thr 145 150 155 160 Val His Asn Pro Thr Arg Ile Lys Leu Met Lys Lys Phe Gly Trp Ser
165 170 175 Arg Val Ala Ile Leu Gin Gin Ala Glu Glu Val Phe Ile Ser Thr Val
180 185 190 Glu Asp Leu Glu Asn Arg Cys Met Glu Ala Gly Val Glu Ile Val Thr
195 200 205 

  Arg Gin Ser Phe Leu Ser Asp Pro Thr Asp Ala Val Arg Asn Leu Arg
210 215 220 

 <Desc/Clms Page number 32> 

 Arg Gln Asp Ala Arg Ile Ile Val Gly Leu Phe Tyr Val Val Ala Ala 225 230 235 240 Arg Arg Val Leu Cys Glu Met Tyr Lys Gln Gln Leu Tyr Gly Arg Ala 
245 250 255 His Val Trp Phe Phe Ile Gly Trp Tyr Glu Asp Asn Trp Tyr Glu Val 
260 265 270 Asn Leu Lys Ala Glu Gly Ile Thr Cys Thr Val Glu Gln Met Arg Ile 
275 280 285 Ala Ala Glu Gly His Leu Thr Thr Glu Ala Leu Met Trp Asn Gln Asn 
290 295 300 Asn Gln Thr Thr Ile Ser Gly Met Thr Ala Glu Glu Phe Arg His Arg 305 310 315 320 Leu Asn Gln Ala Leu Ile Glu Glu Gly Tyr Asp Ile Asn His Asp Arg 
325 330 335 Tyr Pro Glu Gly Tyr Gln Glu Ala Pro Leu Ala Tyr Asp Ala Val Trp 
340 345 350 Ser Val Ala Leu Ala Phe Asn Lys Thr Met Glu Arg Leu Thr Thr Gly 
355 360 365 Lys Lys Ser Leu Arg Asp Phe Thr Tyr Thr Asp Lys Glu Ile Ala Asp 
370 375 380 Glu Ile 

  Tyr Ala Ala Met Asn Ser Thr Gln Phe Leu Gly Val Ser Gly 385 390 395 400 Val Val Ala Phe Ser Ser Gln Gly Asp Arg Ile Ala Leu Thr Gln Ile 
405 410 415 Glu Gln Met Ile Asp Gly Lys Tyr Glu Lys Leu Gly Tyr Tyr Asp Thr 
420 425 430 Gln Leu Asp Asn Leu Ser Trp Leu Asn Thr Glu Gln Trp Ile Gly Gly 
435 440 445 Lys Val Pro Gln Asp Arg Thr Ile Val Thr His Val Leu Arg Thr Val 
450 455 460 Ser Leu Pro Leu Phe Val Cys Met Cys Thr Ile Ser Ser Cys Gly Ile 465 470 475 480 

 <Desc/Clms Page number 33> 

 Phe Val Ala Phe Ala Leu Ile Ile Phe Asn Ile Trp Asn Lys His Arg 
485 490 495 Arg Val Ile Gln Ser Ser His Pro Val Cys Asn Thr Ile Met Leu Phe 
500 505 510 Gly Val Ile Ile Cys Leu Ile Ser Val Ile Leu Leu Gly Ile Asp Gly 
515 520 525 Arg Phe Val Ser Pro Glu Glu Tyr Pro Lys Ile Cys Gln Ala Arg Ala 
530 535 540 Trp Leu Leu Ser Thr Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Gly Ala Met Phe Ser 545 550 555 560 Lys Val Trp 

  Arg Val His Arg Phe Thr Thr Lys Ala Lys Thr Asp Pro 
565 570 575 Lys Lys Lys Val Glu Pro Trp Lys Leu Tyr Thr Met Val Ser Gly Leu 
580 585 590 Leu Ser Ile Asp Leu Val Ile Leu Leu Ser Trp Gln Ile Phe Asp Pro 
595 600 605 Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Thr Phe Pro Leu Glu Asp Pro Val Ser Thr 
610 615 620 Thr Asp Asp Ile Lys Ile Arg Pro Glu Leu Glu His Cys Glu Ser Gln 625 630 635 640 Arg Asn Ser Met Trp Leu Gly Leu Val Tyr Gly Phe Lys Gly Leu Ile 
645 650 655 Leu Val Phe Gly Leu Phe Leu Ala Tyr Glu Thr Arg Ser Ile Lys Val 
660 665 670 Lys Gln Ile Asn Asp Ser Arg Tyr Val Gly Met Ser Ile Tyr Asn Val 
675 680 685 Val Val Leu Cys Leu Ile Thr Ala Pro Val Gly Met Val Ile Ala Ser 
690 695 700 Gln Gln Asp Ala Ser Phe Ala Phe Val Ala Leu Ala Val Ile Phe Cys 705 710 715 720 Cys Phe Leu Ser Met Leu Leu Ile Phe Val Pro Lys Val Ile Glu Val 
725 730 735 

 <Desc/Clms Page number 34> 

 Ile Arg His Pro Lys 

  Asp Lys Ala Glu Ser Lys Tyr Asn Pro Asp Ser 
740 745 750 Ala Ile Ser Lys Glu Asp Glu Glu Arg Tyr Gln Lys Leu Val Thr Glu 
755 760 765 Asn Glu Gln Leu Gln Arg Leu Ile Thr Gln Lys Glu Glu Lys Ile Arg 
770 775 780 Val Leu Arg Gln Arg Leu Val Glu Arg Gly Asp Ala Lys Gly Thr Glu 785 790 795 800 Leu Asn Gly Ala Thr Gly Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Thr Thr Ser 
805 810 815 Gln Pro Ala Ser Leu Ile Asn Ser Ser Ala His Ala Thr Pro Ala Ala 
820 825 830 Thr Leu Ala Ile Thr Gln Gly Glu 
835 840 < 210 > 3 < 211 > 3663 < 212 > DNA < 213 > Drosophila melanogaster < 220 > < 221 > CDS < 222 > (1)..(3660)

   < 400 > 3 atg ttc cgg cca agt tgg ttt cca ttc gcc agc ctg ctg ttc ctg ctc 48 Met Phe Arg Pro Ser Trp Phe Pro Phe Ala Ser Leu Leu Phe Leu Leu   1 5 10 15   ctt tgg agc acc gcc tgt ggc agg aca gcc aag aga tcg gac gtc tac 96 Leu Trp Ser Thr Ala Cys Gly Arg Thr Ala Lys Arg Ser Asp Val Tyr 
20 25 30 ata gcg gga ttc ttc ccg tac ggg gat ggc gtg gaa aac tcc tac acc 144 Ile Ala Gly Phe Phe Pro Tyr Gly Asp Gly Val Glu Asn Ser Tyr Thr 
35 40 45 ggt cgg ggc gtt atg ccc agt gta aag ctc gcc ttg ggt cac gtt aat 192 Gly Arg Gly Val Met Pro Ser Val Lys Leu Ala Leu Gly His Val Asn 

 <Desc/Clms Page number 35> 

 
50 55 60 gag cat gga aag ata ctg gcc aac tac agg ctg cac atg tgg tgg aac 240 Glu His Gly Lys Ile Leu Ala Asn Tyr Arg Leu His Met Trp Trp Asn 
65 70 75 80 gac act cag tgc aat gct gct gtg ggc gta aag tcc ttc ttc gat atg 288 Asp Thr Gln Cys Asn Ala Ala Val Gly Val Lys Ser 

  Phe Phe Asp Met 
85 90 95 atg cat tcg ggt ccc aat aaa gtg atg ctc ttc ggc gct gcg tgc acc 336 Met His Ser Gly Pro Asn Lys Val Met Leu Phe Gly Ala Ala Cys Thr 
100 105 110 cat gtg acc gat ccc ata gcc aag gcc agc aag cac tgg cac ctc acc 384 His Val Thr Asp Pro Ile Ala Lys Ala Ser Lys His Trp His Leu Thr 
115 120 125 cag ctc agc tac gcg gac acc cat ccc atg ttc acc aag gat gcg ttt 432 Gln Leu Ser Tyr Ala Asp Thr His Pro Met Phe Thr Lys Asp Ala Phe 
130 135 140 ccg aat ttc ttt cgc gtg gta ccc tcg gag aat gcc ttt aat gcg ccg 480 Pro Asn Phe Phe Arg Val Val Pro Ser Glu Asn Ala Phe Asn Ala Pro 145 150 155 160 cga ctg gcc ttg ctg aag gag ttc aat tgg acc aga gtg ggc act gtc 528 Arg Leu Ala Leu Leu Lys Glu Phe Asn Trp Thr Arg Val Gly Thr Val 
165 170 175 tac cag aat gag cca cgc tat tcg ctg ccc cac aat cac atg gtg gct 576 Tyr Gln Asn Glu Pro Arg Tyr Ser Leu Pro His Asn His Met Val Ala 
180 185 

  190 gac ctg gat gcc atg gag gtc gag gtg gtg gaa acg cag agc ttc gtc 624 Asp Leu Asp Ala Met Glu Val Glu Val Val Glu Thr Gln Ser Phe Val 
195 200 205 aac gat gtg gct gaa tca ttg aag aaa ctg cgc gag aag gac gtg agg 672 Asn Asp Val Ala Glu Ser Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Asp Val Arg 
210 215 220 atc att ctg ggc aac ttt aac gag cac ttt gca cgc aag gca ttc tgt 720 Ile Ile Leu Gly Asn Phe Asn Glu His Phe Ala Arg Lys Ala Phe Cys 225 230 235 240 gag gct tat aaa ttg gat atg tat ggc aga gcc tat caa tgg ctg atc 768 Glu Ala Tyr Lys Leu Asp Met Tyr Gly Arg Ala Tyr Gln Trp Leu Ile 

 <Desc/Clms Page number 36> 

 
245 250 255 atg gct acc tat tcc acg gat tgg tgg aat gtc acg cag gac agc gag 816 Met Ala Thr Tyr Ser Thr Asp Trp Trp Asn Val Thr Gln Asp Ser Glu
260 265 270 tgc agt gtg gag gag atc gct aca gcc ttg gaa ggt gcc att cta gtg 864 Cys Ser Val Glu Glu Ile Ala Thr Ala Leu Glu Gly Ala Ile Leu 

  Val
275 280 285 gat ctt ttg ccc ttg tcc acc agt ggt gac atc aca gtg gct ggc att 912 Asp Leu Leu Pro Leu Ser Thr Ser Gly Asp Ile Thr Val Ala Gly Ile
290 295 300 act gct gat gag tat ctt gtg gag tac gac aga ctg cga ggc act gaa 960 Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Val Glu Tyr Asp Arg Leu Arg Gly Thr Glu 305 310 315 320 tat tcc cgc ttt cat ggc tat acc tac gat ggt atc tgg gca gct gcc 1008 Tyr Ser Arg Phe His Gly Tyr Thr Tyr Asp Gly Ile Trp Ala Ala Ala
325 330 335 ctg gcc att cag tat gtg gcc gaa aag cga gag gat ctg cta aca cat 1056 Leu Ala Ile Gln Tyr Val Ala Glu Lys Arg Glu Asp Leu Leu Thr His
340 345 350 ttt gat tat cgc gtg aag gac tgg gag agt gtc ttc ctt gag gct cta 1104 Phe Asp Tyr Arg Val Lys Asp Trp Glu Ser Val Phe Leu Glu Ala Leu
355 360 365 cgt aat aca tcc ttc gag ggt gtg acg gga ccc gtg cgt ttc tac aac 1152 Arg Asn Thr Ser Phe Glu Gly Val Thr Gly Pro Val Arg Phe Tyr Asn
370 375 380 aac 

  gag cgc aag gcc aac atc ctg atc aat cag ttt cag ctg gga caa 1200 Asn Glu Arg Lys Ala Asn Ile Leu Ile Asn Gln Phe Gln Leu Gly Gln 385 390 395 400 atg gaa aag atc ggg gaa tac cac tca cag aag tca cac ttg gat tta 1248 Met Glu Lys Ile Gly Glu Tyr His Ser Gln Lys Ser His Leu Asp Leu
405 410 415 agc ttg gga aaa cca gtc aaa tgg gtg ggg aaa act cct ccc aag gat 1296 Ser Leu Gly Lys Pro Val Lys Trp Val Gly Lys Thr Pro Pro Lys Asp
420 425 430 cgc act ttg atc tac atc gag cac agt cag gtc aat cca acc ata tat 1344 Arg Thr Leu Ile Tyr Ile Glu His Ser Gln Val Asn Pro Thr Ile Tyr 

 <Desc/Clms Page number 37> 

 
435 440 445 att gta tcg gct agt gct tcg gtc att gga gtg att att gcc aca gtt 1392 Ile Val Ser Ala Ser Ala Ser Val Ile Gly Val Ile Ile Ala Thr Val
450 455 460 ttt ctg gcc ttt aac att aag tat cgc aat caa aga tac atc aag atg 1440 Phe Leu Ala Phe Asn Ile Lys Tyr Arg Asn Gln Arg Tyr Ile Lys Met 

  465 470 475 480 tcc agt ccc cat ttg aac aat ctg atc att gtg ggc tgt atg att acc 1488 Ser Ser Pro His Leu Asn Asn Leu Ile Ile Val Gly Cys Met Ile Thr
485 490 495 tat ttg agc atc att ttc ctg ggt ctc gat acc aca tta agt agt gtg 1536 Tyr Leu Ser Ile Ile Phe Leu Gly Leu Asp Thr Thr Leu Ser Ser Val
500 505 510 gca gct ttt ccc tat atc tgc aca gct cga gcc tgg atc ttg atg gct 1584 Ala Ala Phe Pro Tyr Ile Cys Thr Ala Arg Ala Trp Ile Leu Met Ala
515 520 525 gga ttc agt ctc agt ttt gga gcc atg ttc tcg aag acg tgg cgg gtg 1632 Gly Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ala Met Phe Ser Lys Thr Trp Arg Val
530 535 540 cat tcg ata ttc acc gat ctg aag ctc aat aag aag gtg atc aag gac 1680 His Ser Ile Phe Thr Asp Leu Lys Leu Asn Lys Lys Val Ile Lys Asp 545 550 555 560 tat caa ttg ttt atg gtt gtg ggc gtg ctt ttg gcc att gat ata gcc 1728 Tyr Gln Leu Phe Met Val Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Asp Ile Ala
565 570 575 att

  ata acc acc tgg cag att gcc gat ccc ttt tac cgc gaa act aaa 1776 Ile Ile Thr Thr Trp Gln Ile Ala Asp Pro Phe Tyr Arg Glu Thr Lys
580 585 590 cag ttg gaa ccc ttg cat cac gag aat att gat gat gtc ttg gtg atc 1824 Gln Leu Glu Pro Leu His His Glu Asn Ile Asp Asp Val Leu Val Ile
595 600 605 ccc gaa aac gag tac tgc cag tct gag cac atg acc ata ttc gtt agc 1872 Pro Glu Asn Glu Tyr Cys Gln Ser Glu His Met Thr Ile Phe Val Ser
610 615 620 att att tat gcc tac aag gga ctg ttg ttg gtt ttt ggc gcc ttt ttg 1920 Ile Ile Tyr Ala Tyr Lys Gly Leu Leu Leu Val Phe Gly Ala Phe Leu 

 <Desc/Clms Page number 38> 

 625 630 635 640 gcc tgg gaa act cga cat gtt tct ata ccg gct ctg aac gat tcc aag 1968 Ala Trp Glu Thr Arg His Val Ser Ile Pro Ala Leu Asn Asp Ser Lys 
645 650 655 cat att ggt ttc tcc gtt tat aac gtg ttc atc act tgt ctg gcc gga 2016 His Ile Gly Phe Ser Val Tyr Asn Val Phe Ile Thr Cys Leu Ala Gly 

  
660 665 670 gcg gct ata tcc ctg gtg cta tcg gat cga aag gat tta gtt ttt gtc 2064 Ala Ala Ile Ser Leu Val Leu Ser Asp Arg Lys Asp Leu Val Phe Val 
675 680 685 tta ctc tcg ttt ttt atc att ttt tgt acg aca gcc act ttg tgt ttg 2112 Leu Leu Ser Phe Phe Ile Ile Phe Cys Thr Thr Ala Thr Leu Cys Leu 
690 695 700 gtg ttc gta ccg aaa ttg gtg gag ctg aag cgg aat ccc cag ggc gtg 2160 Val Phe Val Pro Lys Leu Val Glu Leu Lys Arg Asn Pro Gln Gly Val 705 710 715 720 gtg gac aaa cgc gtt agg gcc acg ttg aga ccc atg tcc aaa aac gga 2208 Val Asp Lys Arg Val Arg Ala Thr Leu Arg Pro Met Ser Lys Asn Gly 
725 730 735 cgc cgg gat tcc tcg gtg tgc gaa ctg gag caa cga ttg cga gat gta 2256 Arg Arg Asp Ser Ser Val Cys Glu Leu Glu Gln Arg Leu Arg Asp Val 
740 745 750 aag aac aca aac tgc cga ttc cga aag gcg ctg atg gag aag gag aac 2304 Lys Asn Thr Asn Cys Arg Phe Arg Lys Ala Leu Met Glu Lys Glu Asn 
755 760 765 

  gag ctg cag gcc tta atc cgc aag ctg gga ccc gag gca cgc aaa tgg 2352 Glu Leu Gln Ala Leu Ile Arg Lys Leu Gly Pro Glu Ala Arg Lys Trp 
770 775 780 atc gat ggg gtg acc tgc aca ggt ggc tcc aac gtc ggt agc gaa ctg 2400 Ile Asp Gly Val Thr Cys Thr Gly Gly Ser Asn Val Gly Ser Glu Leu 785 790 795 800 gag ccc ata ctg aac gat gac att gtt agg ctc tca gct cca ccg gtg 2448 Glu Pro Ile Leu Asn Asp Asp Ile Val Arg Leu Ser Ala Pro Pro Val 
805 810 815 cgt cga gag atg ccc agc acc aca gtt acc gag atg acg tcc gtg gat 2496 Arg Arg Glu Met Pro Ser Thr Thr Val Thr Glu Met Thr Ser Val Asp 

 <Desc/Clms Page number 39> 

 
820 825 830 agt gtg acc tcg act cat gtg gag atg gat aac tcc ttt gtg tcg gtg 2544 Ser Val Thr Ser Thr His Val Glu Met Asp Asn Ser Phe Val Ser Val
835 840 845 cag tct aca gtg atg gcg cca tcg ctt cct ccc aaa aag aaa aag caa 2592 Gln Ser Thr Val Met Ala Pro Ser Leu Pro Pro Lys Lys Lys Lys 

  Gln
850 855 860 tcg att gta gag cac cac tcg cat gcc cct gct cca act atg atg cag 2640 Ser Ile Val Glu His His Ser His Ala Pro Ala Pro Thr Met Met Gln 865 870 875 880 ccc atc cag cag caa ctg cag cag cac tta cag caa cat cag cag atg 2688 Pro Ile Gln Gln Gln Leu Gln Gln His Leu Gln Gln His Gln Gln Met
885 890 895 cag cag cag cac ctg cag cag cag caa cac cag cag atg caa cag caa 2736 
 EMI39.1 
 Gln Gin Gln His Leu Gln Gln Gin Gln His Gln Gln Met Gin Gin Gln 
900 905 910 cag cag cag cag cag cat cat cat cgc cat ctg gag aag aga aac tcg 2784 Gln Gln Gln Gln Gln His His His Arg His Leu Glu Lys Arg Asn Ser
915 920 925 gtg tcc gct cag acc gat gat aat ata ggc agc atc acc agt acg gcg 2832 Val Ser Ala Gln Thr Asp Asp Asn Ile Gly Ser Ile Thr Ser Thr Ala
930 935 940 ggc aag cgg agc gga gga gac tgc tcc agc atg cgg gag agg cgt caa 2880 Gly Lys Arg Ser Gly Gly Asp Cys Ser Ser Met Arg Glu Arg Arg Gln 945 

  950 955 960 tcg acc gcc tcc agg cac tac gac agt ggc agc cag acg ccc acc gcc 2928 Ser Thr Ala Ser Arg His Tyr Asp Ser Gly Ser Gln Thr Pro Thr Ala
965 970 975 cgg cca aag tac agc agc tcg cac cgg aac tcc tcc acc aac atc tcc 2976 Arg Pro Lys Tyr Ser Ser Ser His Arg Asn Ser Ser Thr Asn Ile Ser
980 985 990 aca tcg caa tcg gag ttg agc aac atg tgt cca cac tca aag ccc agt 3024 Thr Ser Gln Ser Glu Leu Ser Asn Met Cys Pro His Ser Lys Pro Ser
995 1000 1005 act ccg gct gtg att aag act ccc act gcc tcc gac cat cgc cgc acc 3072 Thr Pro Ala Val Ile Lys Thr Pro Thr Ala Ser Asp His Arg Arg Thr 

 <Desc/Clms Page number 40> 

 
1010 1015 1020 agc atg ggc tcc gct ctg aag tcc aat ttc gtg gtt tca cag agt gac 3120 Ser Met Gly Ser Ala Leu Lys Ser Asn Phe Val Val Ser Gln Ser Asp 1025 1030 1035 1040 ctc tgg gac acg cac acg ctg tcg cac gcc aag cag cgc cag tcg ccg 3168 Leu Trp Asp Thr His Thr Leu Ser His Ala 

  Lys Gln Arg Gln Ser Pro 
1045 1050 1055 cgg aac tac gcc agt ccg cag cgc tgt gcg gaa cat cat ggc ggc cac 3216 Arg Asn Tyr Ala Ser Pro Gln Arg Cys Ala Glu His His Gly Gly His 
1060 1065 1070 ggg atg acc tat gac ccg aac acc acc tcg ccc atc cag cgg tcc gtc 3264 Gly Met Thr Tyr Asp Pro Asn Thr Thr Ser Pro Ile Gln Arg Ser Val 
1075 1080 1085 tcc gag aag aac cgc aac aaa cat cgg cca aaa ccg caa aag ggc acc 3312 Ser Glu Lys Asn Arg Asn Lys His Arg Pro Lys Pro Gln Lys Gly Thr 
1090 1095 1100 gtt tgc cag agc gag acg gac agc gaa cgg gaa cga gat ccg ccg ccc 3360 Val Cys Gln Ser Glu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Arg Asp Pro Pro Pro 1105 1110 1115 1120 aac agt cag ccg tgc gtc cag ccg cgt aag gtc agc cgg agc tct aac 3408 Asn Ser Gln Pro Cys Val Gln Pro Arg Lys Val Ser Arg Ser Ser Asn 
1125 1130 1135 atc cag cac gcc gcc cac cac cac agt tcg ccc aat gtg gcg ccc gat 3456 Ile Gln His Ala Ala His His His Ser 

  Ser Pro Asn Val Ala Pro Asp 
1140 1145 1150 aag cag cgg agc agg cag cgc ggc aag cag gat agc agc atc tac ggc 3504 Lys Gln Arg Ser Arg Gln Arg Gly Lys Gln Asp Ser Ser Ile Tyr Gly 
1155 1160 1165 gcc agc agc gag acg gaa ctg ctc gag ggc gag acg gca att ttg ccc 3552 Ala Ser Ser Glu Thr Glu Leu Leu Glu Gly Glu Thr Ala Ile Leu Pro 
1170 1175 1180 atc ttc cgg aaa ctc ctc acc gag aag agt ccc aac tat cgg ggc cgc 3600 Ile Phe Arg Lys Leu Leu Thr Glu Lys Ser Pro Asn Tyr Arg Gly Arg 1185 1190 1195 1200 agt gcc gtg ggc cag agc tgt ccg aat ata tcc atc aaa tgc gat atc 3648 Ser Ala Val Gly Gln Ser Cys Pro Asn Ile Ser Ile Lys Cys Asp Ile 

 <Desc/Clms Page number 41> 

 
1205 1210 1215 gtc gag tac ttg tag 3663 Val Glu Tyr Leu
1220 < 210 > 4 < 211 > 1220 < 212 > PRT < 213 > Drosophila melanogaster < 400 > 4 Met Phe Arg Pro Ser Trp Phe Pro Phe Ala Ser Leu Leu Phe Leu Leu   1 5 10 

  15   Leu Trp Ser Thr Ala Cys Gly Arg Thr Ala Lys Arg Ser Asp Val Tyr
20 25 30 Ile Ala Gly Phe Phe Pro Tyr Gly Asp Gly Val Glu Asn Ser Tyr Thr
35 40 45 Gly Arg Gly Val Met Pro Ser Val Lys Leu Ala Leu Gly His Val Asn
50 55 60 Glu His Gly Lys Ile Leu Ala Asn Tyr Arg Leu His Met Trp Trp Asn
65 70 75 80 Asp Thr Gln Cys Asn Ala Ala Val Gly Val Lys Ser Phe Phe Asp Met
85 90 95 Met His Ser Gly Pro Asn Lys Val Met Leu Phe Gly Ala Ala Cys Thr
100 105 110 His Val Thr Asp Pro Ile Ala Lys Ala Ser Lys His Trp His Leu Thr
115 120 125 Gln Leu Ser Tyr Ala Asp Thr His Pro Met Phe Thr Lys Asp Ala Phe
130 135 140 Pro Asn Phe Phe Arg Val Val Pro Ser Glu Asn Ala Phe Asn Ala Pro 145 150 155 160 Arg Leu Ala Leu Leu Lys Glu Phe Asn Trp Thr Arg Val Gly Thr Val
165 170 175 Tyr Gln Asn Glu Pro Arg Tyr Ser Leu Pro His Asn His Met Val Ala
180 185 190 

 <Desc/Clms Page number 42> 

 Asp Leu Asp Ala Met 

  Glu Val Glu Val Val Glu Thr Gln Ser Phe Val 
195 200 205 Asn Asp Val Ala Glu Ser Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Asp Val Arg 
210 215 220 Ile Ile Leu Gly Asn Phe Asn Glu His Phe Ala Arg Lys Ala Phe Cys 225 230 235 240 Glu Ala Tyr Lys Leu Asp Met Tyr Gly Arg Ala Tyr Gln Trp Leu Ile 
245 250 255 Met Ala Thr Tyr Ser Thr Asp Trp Trp Asn Val Thr Gln Asp Ser Glu 
260 265 270 Cys Ser Val Glu Glu Ile Ala Thr Ala Leu Glu Gly Ala Ile Leu Val 
275 280 285 Asp Leu Leu Pro Leu Ser Thr Ser Gly Asp Ile Thr Val Ala Gly Ile 
290 295 300 Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Val Glu Tyr Asp Arg Leu Arg Gly Thr Glu 305 310 315 320 Tyr Ser Arg Phe His Gly Tyr Thr Tyr Asp Gly Ile Trp Ala Ala Ala 
325 330 335 Leu Ala Ile Gln Tyr Val Ala Glu Lys Arg Glu Asp Leu Leu Thr His 
340 345 350 Phe Asp Tyr Arg Val Lys Asp Trp Glu Ser Val Phe Leu Glu Ala Leu 
355 360 365 Arg Asn Thr Ser Phe Glu Gly Val Thr Gly Pro Val Arg Phe Tyr 

  Asn 
370 375 380 Asn Glu Arg Lys Ala Asn Ile Leu Ile Asn Gln Phe Gln Leu Gly Gln 385 390 395 400 Met Glu Lys Ile Gly Glu Tyr His Ser Gln Lys Ser His Leu Asp Leu 
405 410 415 Ser Leu Gly Lys Pro Val Lys Trp Val Gly Lys Thr Pro Pro Lys Asp 
420 425 430 Arg Thr Leu Ile Tyr Ile Glu His Ser Gln Val Asn Pro Thr Ile Tyr 
435 440 445 

 <Desc/Clms Page number 43> 

 Ile Val Ser Ala Ser Ala Ser Val Ile Gly Val Ile Ile Ala Thr Val 
450 455 460 Phe Leu Ala Phe Asn Ile Lys Tyr Arg Asn Gln Arg Tyr Ile Lys Met 465 470 475 480 Ser Ser Pro His Leu Asn Asn Leu Ile Ile Val Gly Cys Met Ile Thr 
485 490 495 Tyr Leu Ser Ile Ile Phe Leu Gly Leu Asp Thr Thr Leu Ser Ser Val 
500 505 510 Ala Ala Phe Pro Tyr Ile Cys Thr Ala Arg Ala Trp Ile Leu Met Ala 
515 520 525 Gly Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ala Met Phe Ser Lys Thr Trp Arg Val 
530 535 540 His Ser Ile Phe Thr Asp Leu Lys Leu Asn Lys Lys Val Ile Lys Asp 545 

  550 555 560 Tyr Gln Leu Phe Met Val Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Asp Ile Ala 
565 570 575 Ile Ile Thr Thr Trp Gln Ile Ala Asp Pro Phe Tyr Arg Glu Thr Lys 
580 585 590 Gln Leu Glu Pro Leu His His Glu Asn Ile Asp Asp Val Leu Val Ile 
595 600 605 Pro Glu Asn Glu Tyr Cys Gln Ser Glu His Met Thr Ile Phe Val Ser 
610 615 620 Ile Ile Tyr Ala Tyr Lys Gly Leu Leu Leu Val Phe Gly Ala Phe Leu 625 630 635 640 Ala Trp Glu Thr Arg His Val Ser Ile Pro Ala Leu Asn Asp Ser Lys 
645 650 655 His Ile Gly Phe Ser Val Tyr Asn Val Phe Ile Thr Cys Leu Ala Gly 
660 665 670 Ala Ala Ile Ser Leu Val Leu Ser Asp Arg Lys Asp Leu Val Phe Val 
675 680 685 Leu Leu Ser Phe Phe Ile Ile Phe Cys Thr Thr Ala Thr Leu Cys Leu 
690 695 700 

 <Desc/Clms Page number 44> 

 Val Phe Val Pro Lys Leu Val Glu Leu Lys Arg Asn Pro Gln Gly Val 705 710 715 720 Val Asp Lys Arg Val Arg Ala Thr Leu Arg Pro Met Ser Lys Asn Gly 
725 730 

  735 Arg Arg Asp Ser Ser Val Cys Glu Leu Glu Gln Arg Leu Arg Asp Val 
740 745 750 Lys Asn Thr Asn Cys Arg Phe Arg Lys Ala Leu Met Glu Lys Glu Asn 
755 760 765 Glu Leu Gln Ala Leu Ile Arg Lys Leu Gly Pro Glu Ala Arg Lys Trp 
770 775 780 Ile Asp Gly Val Thr Cys Thr Gly Gly Ser Asn Val Gly Ser Glu Leu 785 790 795 800 Glu Pro Ile Leu Asn Asp Asp Ile Val Arg Leu Ser Ala Pro Pro Val 
805 810 815 Arg Arg Glu Met Pro Ser Thr Thr Val Thr Glu Met Thr Ser Val Asp 
820 825 830 Ser Val Thr Ser Thr His Val Glu Met Asp Asn Ser Phe Val Ser Val 
835 840 845 Gln Ser Thr Val Met Ala Pro Ser Leu Pro Pro Lys Lys Lys Lys Gln 
850 855 860 Ser Ile Val Glu His His Ser His Ala Pro Ala Pro Thr Met Met Gln 865 870 875 880 Pro Ile Gln Gln Gln Leu Gln Gln His Leu Gln Gln His Gln Gln Met 
885 890 895 Gln Gln Gln His Leu Gln Gln Gln Gln His Gln Gln Met Gln Gln Gln 
900 905 910 Gln Gln Gln Gln Gln His His His Arg 

  His Leu Glu Lys Arg Asn Ser 
915 920 925 Val Ser Ala Gln Thr Asp Asp Asn Ile Gly Ser Ile Thr Ser Thr Ala 
930 935 940 Gly Lys Arg Ser Gly Gly Asp Cys Ser Ser Met Arg Glu Arg Arg Gln 945 950 955 960 

 <Desc/Clms Page number 45> 

 Ser Thr Ala Ser Arg His Tyr Asp Ser Gly Ser Gln Thr Pro Thr Ala 
965 970 975 Arg Pro Lys Tyr Ser Ser Ser His Arg Asn Ser Ser Thr Asn Ile Ser 
980 985 990 Thr Ser Gln Ser Glu Leu Ser Asn Met Cys Pro His Ser Lys Pro Ser 
995 1000 1005 Thr Pro Ala Val Ile Lys Thr Pro Thr Ala Ser Asp His Arg Arg Thr 
1010 1015 1020 Ser Met Gly Ser Ala Leu Lys Ser Asn Phe Val Val Ser Gln Ser Asp 025 1030 1035 1040 Leu Trp Asp Thr His Thr Leu Ser His Ala Lys Gln Arg Gln Ser Pro 
1045 1050 1055 Arg Asn Tyr Ala Ser Pro Gln Arg Cys Ala Glu His His Gly Gly His 
1060 1065 1070 Gly Met Thr Tyr Asp Pro Asn Thr Thr Ser Pro Ile Gln Arg Ser Val 
1075 1080 1085 Ser Glu Lys Asn Arg Asn Lys 

  His Arg Pro Lys Pro Gln Lys Gly Thr 
1090 1095 1100 Val Cys Gln Ser Glu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Arg Asp Pro Pro Pro 105 1110 1115 1120 Asn Ser Gln Pro Cys Val Gln Pro Arg Lys Val Ser Arg Ser Ser Asn 
1125 1130 1135 Ile Gln His Ala Ala His His His Ser Ser Pro Asn Val Ala Pro Asp 
1140 1145 1150 Lys Gln Arg Ser Arg Gln Arg Gly Lys Gln Asp Ser Ser Ile Tyr Gly 
1155 1160 1165 Ala Ser Ser Glu Thr Glu Leu Leu Glu Gly Glu Thr Ala Ile Leu Pro 
1170 1175 1180 Ile Phe Arg Lys Leu Leu Thr Glu Lys Ser Pro Asn Tyr Arg Gly Arg 185 1190 1195 1200 Ser Ala Val Gly Gln Ser Cys Pro Asn Ile Ser Ile Lys Cys Asp Ile 
1205 1210 1215 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 Val Glu Tyr Leu
1220 < 210 > 5 < 211 > 3918 < 212 > DNA < 213 > Drosophila melanogaster < 220 > < 221 > CDS < 222 > (1)..(3915)

   < 400 > 5 atg cgc ata att caa ccg gtc caa ggg acc aga tac ggt cca tgg ccg 48 Met Arg Ile Ile Gln Pro Val Gln Gly Thr Arg Tyr Gly Pro Trp Pro   1 5 10 15   gcc gtg gga ctg agg cta gtc ctg gcc ctt gcc tgg gca acg tcg gca 96 Ala Val Gly Leu Arg Leu Val Leu Ala Leu Ala Trp Ala Thr Ser Ala
20 25 30 gcg gct gcc atg gag tca tca gcc gag ctg cag gcc ctg ggc cac gag 144 Ala Ala Ala Met Glu Ser Ser Ala Glu Leu Gln Ala Leu Gly His Glu
35 40 45 gca att agg cca ggt gct gcc tca att agc aca tcc agc cca tcc agc 192 Ala Ile Arg Pro Gly Ala Ala Ser Ile Ser Thr Ser Ser Pro Ser Ser
50 55 60 tcg cca ccc gga gaa tcg gca tcg act gtg act gca ggg ggg act ccg 240 Ser Pro Pro Gly Glu Ser Ala Ser Thr Val Thr Ala Gly Gly Thr Pro
65 70 75 80 att cca ccg cgc tcc gat tgg aag tac aaa cgg acg aaa gtc aaa cgc 288 Ile Pro Pro Arg Ser Asp Trp Lys Tyr Lys Arg Thr Lys Val Lys Arg
85 90 95 cgg cag cag 

  cgc ctc aat tcg cac agc aat ctg ccc gga agc acc aat 336 Arg Gln Gln Arg Leu Asn Ser His Ser Asn Leu Pro Gly Ser Thr Asn
100 105 110 gcc tcc cac gct cac cac ctc ctc aat ctg ccc ccc agg cag cga tac 384 Ala Ser His Ala His His Leu Leu Asn Leu Pro Pro Arg Gln Arg Tyr
115 120 125 

 <Desc/Clms Page number 47> 

 ttg aag gtc aac cag gtg ttc gaa agc gaa cgc cgc atg tcg ccg gcc 432 Leu Lys Val Asn Gln Val Phe Glu Ser Glu Arg Arg Met Ser Pro Ala 
130 135 140 gaa atg cag cgc .aat cat ggc aaa atc gtg ctg ctc gga ctc ttt gag 480 Glu Met Gln Arg Asn His Gly Lys Ile Val Leu Leu Gly Leu Phe Glu 145 150 155 160 ctg tcc aca tcg cgg gga cca cgt ccg gat ggt ctg agc gaa ttg gga 528 Leu Ser Thr Ser Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Leu Ser Glu Leu Gly 
165 170 175 gct gcc acc atg gcc gtg gaa cac atc aac cgc aag cgc ctg ctg ccg 576 Ala Ala Thr Met Ala Val Glu His Ile Asn Arg Lys Arg Leu Leu Pro 
180 185 190 

  ggc tac acc ctc gag ctc gtg acc aac gat act cag tgt gat cct gga 624 Gly Tyr Thr Leu Glu Leu Val Thr Asn Asp Thr Gln Cys Asp Pro Gly 
195 200 205 gtg ggc gtg gat cgc ttc ttc cac gcc atc tac aca cag ccc tcg acg 672 Val Gly Val Asp Arg Phe Phe His Ala Ile Tyr Thr Gln Pro Ser Thr 
210 215 220 agg atg gtg atg ctg ctg gga tcg gcc tgc tcg gag gtc acc gag agc 720 Arg Met Val Met Leu Leu Gly Ser Ala Cys Ser Glu Val Thr Glu Ser 225 230 235 240 ctg gcg aag gtg gtg ccc tac tgg aac atc gtg cag gta tcc ttc ggt 768 Leu Ala Lys Val Val Pro Tyr Trp Asn Ile Val Gln Val Ser Phe Gly 
245 250 255 tcc aca tcg ccg gcg ttg agc gac agg cgg gag ttc ccc tac ttc tac 816 Ser Thr Ser Pro Ala Leu Ser Asp Arg Arg Glu Phe Pro Tyr Phe Tyr 
260 265 270 agg aca gtg gcc ccg gac tcc tca cac aat ccg gcg cgc atc gct ttc 864 Arg Thr Val Ala Pro Asp Ser Ser His Asn Pro Ala Arg Ile Ala Phe 
275 280 285 att cgg aag ttt ggc 

  tgg ggc acg gtg acc act ttc tcg cag aac gag 912 Ile Arg Lys Phe Gly Trp Gly Thr Val Thr Thr Phe Ser Gln Asn Glu 
290 295 300 gag gtt cac tcg ctg gcg gtg aac aac ctg gtc acc gaa ctg gag gcg 960 Glu Val His Ser Leu Ala Val Asn Asn Leu Val Thr Glu Leu Glu Ala 305 310 315 320 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 gcc aac ata tcc tgt gcc gcc acc atc acc ttt gcg gcc acc gac ttc 1008 Ala Asn Ile Ser Cys Ala Ala Thr Ile Thr Phe Ala Ala Thr Asp Phe
325 330 335 aag gag cag ctg ctg cta ctt agg gag acg gac acg cgc atc atc atc 1056 Lys Glu Gln Leu Leu Leu Leu Arg Glu Thr Asp Thr Arg Ile Ile Ile
340 345 350 ggc agc ttc tcg cag gag ctg gcc ccc cag atc ctg tgc gag gcc tac 1104 Gly Ser Phe Ser Gln Glu Leu Ala Pro Gln Ile Leu Cys Glu Ala Tyr
355 360 365 agg ctt cga atg ttc ggg gcg gac tac gcc tgg atc ctc cac gag agc 1152 Arg Leu Arg Met Phe Gly Ala Asp Tyr Ala Trp Ile Leu His Glu Ser
370 375 380 atg ggg 

  gct ccg tgg tgg ccg gac cag cgc acc gcc tgc tct aac cac 1200 Met Gly Ala Pro Trp Trp Pro Asp Gln Arg Thr Ala Cys Ser Asn His 385 390 395 400 gaa ctg cag ctg gcc gtc gag aac ctc atc gtg gtc tca acg cac aac 1248 Glu Leu Gln Leu Ala Val Glu Asn Leu Ile Val Val Ser Thr His Asn
405 410 415 agc atc gtt gga aat aac gtc agc tat agt gga ctg aac aat cac atg 1296 Ser Ile Val Gly Asn Asn Val Ser Tyr Ser Gly Leu Asn Asn His Met
420 425 430 ttc aac tcc cag ctg cgc aag caa tcc gcc cag ttc cac ggc cag gat 1344 Phe Asn Ser Gln Leu Arg Lys Gln Ser Ala Gln Phe His Gly Gln Asp
435 440 445 gga ttt ggc tcc ggt tat ggt ccc agg atc agt atc gct gca acg caa 1392 Gly Phe Gly Ser Gly Tyr Gly Pro Arg Ile Ser Ile Ala Ala Thr Gln
450 455 460 tct gac tct cgt cgg cgg agg aga agg ggc gtg gta ggc acc agc gga 1440 Ser Asp Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Val Val Gly Thr Ser Gly 465 470 475 480 ggg cac ctc ttt ccg gag 

  gcg atc tcg cag tac gcg ccg caa acc tac 1488 Gly His Leu Phe Pro Glu Ala Ile Ser Gln Tyr Ala Pro Gln Thr Tyr
485 490 495 gac gcc gtg tgg gcc atc gcc ctg gcc ttg aga gcc gct gag gag cac 1536 Asp Ala Val Trp Ala Ile Ala Leu Ala Leu Arg Ala Ala Glu Glu His
500 505 510 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 tgg cgg cgg aac gag gag cag tcg aag ctg gac gga ttc gat tac acc 1584 Trp Arg Arg Asn Glu Glu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Thr 
515 520 525 cgc agc gac atg gcc tgg gag ttc ctg cag caa atg ggc aag ctc cac 1632 Arg Ser Asp Met Ala Trp Glu Phe Leu Gln Gln Met Gly Lys Leu His 
530 535 540 ttc ctg gga gtg tcg ggc ccc gtt tcc ttc agc ggc cca gat cgc gtt 1680 Phe Leu Gly Val Ser Gly Pro Val Ser Phe Ser Gly Pro Asp Arg Val 545 550 555 560 ggc acc act gcc ttc tat caa atc cag cgc ggt ttg ctg gaa ccg gtg 1728 Gly Thr Thr Ala Phe Tyr Gln Ile Gln Arg Gly Leu Leu Glu Pro Val 
565 570 575 gcc ctc 

  tac tat ccg gcc acg gat gcc ctg gac ttc cgg tgt ccc cgc 1776 Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Thr Asp Ala Leu Asp Phe Arg Cys Pro Arg 
580 585 590 tgc cgg ccg gtg aag tgg cac agc ggg cag gta ccc atc gcc aag cgg 1824 Cys Arg Pro Val Lys Trp His Ser Gly Gln Val Pro Ile Ala Lys Arg 
595 600 605 gtg ttc aag ctg cgg gtg gcg acc atc gct cca ctg gcc ttc tac acc 1872 Val Phe Lys Leu Arg Val Ala Thr Ile Ala Pro Leu Ala Phe Tyr Thr 
610 615 620 atc gcc acc ctc tcc agc gtg gga atc gct ctg gcc atc acc ttc ctg 1920 Ile Ala Thr Leu Ser Ser Val Gly Ile Ala Leu Ala Ile Thr Phe Leu 625 630 635 640 gcg ttc aat ctg cac ttt cgg aag ctg aag gca att aaa ctt tcc agc 1968 Ala Phe Asn Leu His Phe Arg Lys Leu Lys Ala Ile Lys Leu Ser Ser 
645 650 655 ccg aag ctg agc aac atc acc gca gtg ggc tgc atc ttt gtg tac gcc 2016 Pro Lys Leu Ser Asn Ile Thr Ala Val Gly Cys Ile Phe Val Tyr Ala 
660 665 670 acc gtc atc ctt ttg ggc 

  ttg gac cac tcg acg ctg ccc tcg gcg gag 2064 Thr Val Ile Leu Leu Gly Leu Asp His Ser Thr Leu Pro Ser Ala Glu 
675 680 685 gac tct ttc gca acg gtc tgc acg gcc cgc gtc tat ctg ctc tcc gcc 2112 Asp Ser Phe Ala Thr Val Cys Thr Ala Arg Val Tyr Leu Leu Ser Ala 
690 695 700 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 gga ttc tcg ttg gcc ttt gga tcg atg ttt gcc aag acc tac aga gtg 2160 Gly Phe Ser Leu Ala Phe Gly Ser Met Phe Ala Lys Thr Tyr Arg Val 705 710 715 720 cat cgg ata ttc act cgt acc ggc agc gtt ttc aag gac aag atg ctg 2208 His Arg Ile Phe Thr Arg Thr Gly Ser Val Phe Lys Asp Lys Met Leu 
725 730 735 cag gac att caa ctg atc ttg ctc gtc ggc gga ttg ctt ctg gtg gat 2256 Gln Asp Ile Gln Leu Ile Leu Leu Val Gly Gly Leu Leu Leu Val Asp . 



   740 745 750 gcg ctg ctc gta acc ctt tgg gtg gtc acc gat cca atg gag cgc cat 2304 Ala Leu Leu Val Thr Leu Trp Val Val Thr Asp Pro Met Glu Arg His 
755 760 765 ctt cac aac ctg acg ctc gag atc agt gcg act gat aga agt gtc gtt 2352 Leu His Asn Leu Thr Leu Glu Ile Ser Ala Thr Asp Arg Ser Val Val 
770 775 780 tac cag cct cag gtt gaa gtt tgc cgt tcg cag cac acg caa acg tgg 2400 Tyr Gln Pro Gln Val Glu Val Cys Arg Ser Gln His Thr Gln Thr Trp 785 790 795 800 ttg agt gtc ctg tac gcc tac aaa ggc ctt ctt ctt gtg gtg ggt gtc 2448 Leu Ser Val Leu Tyr Ala Tyr Lys Gly Leu Leu Leu Val Val Gly Val 
805 810 815 tat atg gcc tgg gag acg cgc cac gta aaa ata cct gct ctc aat gac 2496 Tyr Met Ala Trp Glu Thr Arg His Val Lys Ile Pro Ala Leu Asn Asp 
820 825 830 tcg cag tac atc gga gtg tct gta tac agt gtg gtc atc acc agc gcc 2544 Ser Gln Tyr Ile Gly Val Ser Val Tyr Ser Val Val Ile Thr Ser Ala 
835 840 845 

  atc gtc gtg gtg ctg gcc aac ttg att tcg gag cga gtc acc ctg gcc 2592 Ile Val Val Val Leu Ala Asn Leu Ile Ser Glu Arg Val Thr Leu Ala 
850 855 860 ttc atc aca atc aca gct ctg att tta acc agc acc act gca acc ctt 2640 Phe Ile Thr Ile Thr Ala Leu Ile Leu Thr Ser Thr Thr Ala Thr Leu 865 870 875 880 tgt ctg ctt ttc atc cca aaa ctc cat gat att tgg gca aga aac gat 2688 Cys Leu Leu Phe Ile Pro Lys Leu His Asp Ile Trp Ala Arg Asn Asp 
885 890 895 

 <Desc/Clms Page number 51> 

 att atc gat ccg gtt atc cac agt atg ggc ctt aag atg gag tgc aac 2736 Ile Ile Asp Pro Val Ile His Ser Met Gly Leu Lys Met Glu Cys Asn 
900 905 910 aca cgc cga ttc gtg gtc gat gat cgc cga gaa ctg cag tat cga gtg 2784 Thr Arg Arg Phe Val Val Asp Asp Arg Arg Glu Leu Gln Tyr Arg Val 
915 920 925 gag gtg caa aac agg gtc tat aag aag gaa atc cag gct ctg gac gcc 2832 Glu Val Gln Asn Arg Val Tyr Lys Lys Glu Ile Gln Ala Leu Asp 

  Ala 
930 935 940 gag att cga aag ctg gag agg cta ctc gag tcg gga cta acc acc acc 2880 Glu Ile Arg Lys Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ser Gly Leu Thr Thr Thr 945 950 955 960 tcc acc aca act tcg tcg tcc aca tca ctc tta act ggg gga ggt cat 2928 Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ser Thr Ser Leu Leu Thr Gly Gly Gly His 
965 970 975 cta aag cca gaa ctg acg gta acc agt ggc atc tcg cag act ccg gct 2976 Leu Lys Pro Glu Leu Thr Val Thr Ser Gly Ile Ser Gln Thr Pro Ala 
980 985 990 gca agt aaa aac aga act cca agt atc tcg gga ata ctg ccc aat ctc 3024 Ala Ser Lys Asn Arg Thr Pro Ser Ile Ser Gly Ile Leu Pro Asn Leu 
995 1000 1005 ctg ctt tcc gtg ctg cct cct gtg att cca cgg gcc agt tgg ccg tca 3072 Leu Leu Ser Val Leu Pro Pro Val Ile Pro Arg Ala Ser Trp Pro Ser 
1010 1015 1020 gca gag tac atg cag atc ccg atg agg cgt tct gtt acc ttt gcc tcc 3120 Ala Glu Tyr Met Gln Ile Pro Met Arg Arg Ser Val Thr Phe Ala Ser 1025 

  1030 1035 1040 cag ccc caa tta gag gag gcc tgc ctg cct gca cag gac ttg att aac 3168 Gln Pro Gln Leu Glu Glu Ala Cys Leu Pro Ala Gln Asp Leu Ile Asn 
1045 1050 1055 ctc cgt tta gcc cac cag cag gcc acg gag gct aag acg ggc ttg ata 3216 Leu Arg Leu Ala His Gln Gln Ala Thr Glu Ala Lys Thr Gly Leu Ile 
1060 1065 1070 aac cga tta cga ggg ata ttt tct cgc acc act tcg age aac aag gga 3264 Asn Arg Leu Arg Gly Ile Phe Ser Arg Thr Thr Ser Ser Asn Lys Gly 
1075 1080 1085 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 tcc acc gcc agc ttg gcg gac caa aag ggt ctg aag gcg gcc ttt aaa 3312 Ser Thr Ala Ser Leu Ala Asp Gln Lys Gly Leu Lys Ala Ala Phe Lys 
1090 1095 1100 tcg cac atg gga ctg ttc acc cgc ctg att ccc tcc tct caa acg gcg 3360 Ser His Met Gly Leu Phe Thr Arg Leu Ile Pro Ser Ser Gln Thr Ala 1105 1110 1115 1120 tcc tgc aat gcc ata tac aat aat cca aat cag gat tcc att ccc tca 3408 Ser Cys Asn Ala Ile Tyr Asn 

  Asn Pro Asn Gln Asp Ser Ile Pro Ser 
1125 1130 1135 gag gcg tcc tcc cac ccg aat ggt aac cac cta aag ccc atc cat agg 3456 Glu Ala Ser Ser His Pro Asn Gly Asn His Leu Lys Pro Ile His Arg 
1140 1145 1150 ggt tca ttg acc aaa agc ggt act cac ctg gat cac ctt ace aag gat 3504 Gly Ser Leu Thr Lys Ser Gly Thr His Leu Asp His Leu Thr Lys Asp 
1155 1160 1165 ccg aat ttc ctg cct atc ccc act att tct ggc ggt gaa cag ggg gac 3552 Pro Asn Phe Leu Pro Ile Pro Thr Ile Ser Gly Gly Glu Gln Gly Asp 
1170 1175 1180 caa acg ttg ggt gga aag tat gtg aaa ctg ctg gag acc aag gtg aac 3600 Gln Thr Leu Gly Gly Lys Tyr Val Lys Leu Leu Glu Thr Lys Val Asn 1185 1190 1195 1200 ttc caa ttg ccc agc aac cgg aga cet tcg gtg gtg cag cag cca ccc 3648 Phe Gln Leu Pro Ser Asn Arg Arg Pro Ser Val Val Gln Gln Pro Pro 
1205 1210 1215 agt tta agg gaa agg gta agg ggt tcg cca cgc ttt cca cac cgc atc 3696 Ser Leu Arg Glu Arg Val 

  Arg Gly Ser Pro Arg Phe Pro His Arg Ile 
1220 1225 1230 ctg ccg ccc act tgc agt ctc agc gcc ctg gcc gaa tcc gag gac cgt 3744 Leu Pro Pro Thr Cys Ser Leu Ser Ala Leu Ala Glu Ser Glu Asp Arg 
1235 1240 1245 ccc gga gat agc acc tct atc ttg ggc agc tgc aag tcc ata cct cgc 3792 Pro Gly Asp Ser Thr Ser Ile Leu Gly Ser Cys Lys Ser Ile Pro Arg 
1250 1255 1260 att tcg ctg cag cag gtc acc agt gga ggc acc tgg aaa tcg atg gaa 3840 Ile Ser Leu Gln Gln Val Thr Ser Gly Gly Thr Trp Lys Ser Met Glu 1265 1270 1275 1280 

 <Desc/Clms Page number 53> 

 aca gtg ggc aag tcg agg ctt tcc ctc ggc gat tcc cag gaa gag gag 3888 Thr Val Gly Lys Ser Arg Leu Ser Leu Gly Asp Ser Gln Glu Glu Glu
1285 1290 1295 cag cag gcg cet gcg aat ggc acc gaa taa 3918 Gln Gln Ala Pro Ala Asn Gly Thr Glu
1300 1305 < 210 > 6 < 211 > 1305 < 212 > PRT < 213 > Drosophila melanogaster < 400 > 6 Met Arg Ile Ile Gln Pro Val Gln Gly 

  Thr Arg Tyr Gly Pro Trp Pro
1 5 10 15 Ala Val Gly Leu Arg Leu Val Leu Ala Leu Ala Trp Ala Thr Ser Ala
20 25 30 Ala Ala Ala Met Glu Ser Ser Ala Glu Leu Gln Ala Leu Gly His Glu
35 40 45 Ala Ile Arg Pro Gly Ala Ala Ser Ile Ser Thr Ser Ser Pro Ser Ser
50 55 60 Ser Pro Pro Gly Glu Ser Ala Ser Thr Val Thr Ala Gly Gly Thr Pro
65 70 75 80 Ile Pro Pro Arg Ser Asp Trp Lys Tyr Lys Arg Thr Lys Val Lys Arg
85 90 95 Arg Gln Gln Arg Leu Asn Ser His Ser Asn Leu Pro Gly Ser Thr Asn
100 105 110 Ala Ser His Ala His His Leu Leu Asn Leu Pro Pro Arg Gln Arg Tyr
115 120 125 Leu Lys Val Asn Gln Val Phe Glu Ser Glu Arg Arg Met Ser Pro Ala
130 135 140 Glu Met Gln Arg Asn His Gly Lys Ile Val Leu Leu Gly Leu Phe Glu 145 150 155 160 Leu Ser Thr Ser Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Leu Ser Glu Leu Gly
165 170 175 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 Ala Ala Thr Met Ala Val Glu His Ile Asn Arg Lys Arg Leu Leu Pro 
180 

  185 190 Gly Tyr Thr Leu Glu Leu Val Thr Asn Asp Thr Gln Cys Asp Pro Gly 
195 200 205 Val Gly Val Asp Arg Phe Phe His Ala Ile Tyr Thr Gln Pro Ser Thr 
210 215 220 Arg Met Val Met Leu Leu Gly Ser Ala Cys Ser Glu Val Thr Glu Ser 225 230 235 240 Leu Ala Lys Val Val Pro Tyr Trp Asn Ile Val Gln Val Ser Phe Gly 
245 250 255 Ser Thr Ser Pro Ala Leu Ser Asp Arg Arg Glu Phe Pro Tyr Phe Tyr 
260 265 270 Arg Thr Val Ala Pro Asp Ser Ser His Asn Pro Ala Arg Ile Ala Phe 
275 280 285 Ile Arg Lys Phe Gly Trp Gly Thr Val Thr Thr Phe Ser Gln Asn Glu 
290 295 300 Glu Val His Ser Leu Ala Val Asn Asn Leu Val Thr Glu Leu Glu Ala 305 310 315 320 Ala Asn Ile Ser Cys Ala Ala Thr Ile Thr Phe Ala Ala Thr Asp Phe 
325 330 335 Lys Glu Gln Leu Leu Leu Leu Arg Glu Thr Asp Thr Arg Ile Ile Ile 
340 345 350 Gly Ser Phe Ser Gln Glu Leu Ala Pro Gln Ile Leu Cys Glu Ala Tyr 
355 360 365 Arg Leu Arg Met Phe Gly Ala Asp

  Tyr Ala Trp Ile Leu His Glu Ser 
370 375 380 Met Gly Ala Pro Trp Trp Pro Asp Gln Arg Thr Ala Cys Ser Asn His 385 390 395 400 Glu Leu Gln Leu Ala Val Glu Asn Leu Ile Val Val Ser Thr His Asn 
405 410 415 Ser Ile Val Gly Asn Asn Val Ser Tyr Ser Gly Leu Asn Asn His Met 
420 425 430 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 Phe Asn Ser Gln Leu Arg Lys Gln Ser Ala Gln Phe His Gly Gln Asp 
435 440 445 Gly Phe Gly Ser Gly Tyr Gly Pro Arg Ile Ser Ile Ala Ala Thr Gln 
450 455 460 Ser Asp Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Val Val Gly Thr Ser Gly 465 470 475 480 Gly His Leu Phe Pro Glu Ala Ile Ser Gln Tyr Ala Pro Gln Thr Tyr 
485 490 495 Asp Ala Val Trp Ala Ile Ala Leu Ala Leu Arg Ala Ala Glu Glu His 
500 505 510 Trp Arg Arg Asn Glu Glu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Thr 
515 520 525 Arg Ser Asp Met Ala Trp Glu Phe Leu Gln Gln Met Gly Lys Leu His 
530 535 540 Phe Leu Gly Val Ser Gly Pro Val Ser Phe 

  Ser Gly Pro Asp Arg Val 545 550 555 560 Gly Thr Thr Ala Phe Tyr Gln Ile Gln Arg Gly Leu Leu Glu Pro Val 
565 570 575 Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Thr Asp Ala Leu Asp Phe Arg Cys Pro Arg 
580 585 590 Cys Arg Pro Val Lys Trp His Ser Gly Gln Val Pro Ile Ala Lys Arg 
595 600 605 Val Phe Lys Leu Arg Val Ala Thr Ile Ala Pro Leu Ala Phe Tyr Thr 
610 615 620 Ile Ala Thr Leu Ser Ser Val Gly Ile Ala Leu Ala Ile Thr Phe Leu 625 630 635 640 Ala Phe Asn Leu His Phe Arg Lys Leu Lys Ala Ile Lys Leu Ser Ser 
645 650 655 Pro Lys Leu Ser Asn Ile Thr Ala Val Gly Cys Ile Phe Val Tyr Ala 
660 665 670 Thr Val Ile Leu Leu Gly Leu Asp His Ser Thr Leu Pro Ser Ala Glu 
675 680 685 

 <Desc/Clms Page number 56> 

 Asp Ser Phe Ala Thr Val Cys Thr Ala Arg Val Tyr Leu Leu Ser Ala 
690 695 700 Gly Phe Ser Leu Ala Phe Gly Ser Met Phe Ala Lys Thr Tyr Arg Val 705 710 715 720 His Arg Ile Phe Thr Arg Thr Gly Ser Val Phe 

  Lys Asp Lys Met Leu 
725 730 735 Gln Asp Ile Gln Leu Ile Leu Leu Val Gly Gly Leu Leu Leu Val Asp 
740 745 750 Ala Leu Leu Val Thr Leu Trp Val Val Thr Asp Pro Met Glu Arg His 
755 760 765 Leu His Asn Leu Thr Leu Glu Ile Ser Ala Thr Asp Arg Ser Val Val 
770 775 780 Tyr Gln Pro Gln Val Glu Val Cys Arg Ser Gln His Thr Gln Thr Trp 785 790 795 800 Leu Ser Val Leu Tyr Ala Tyr Lys Gly Leu Leu Leu Val Val Gly Val 
805 810 815 Tyr Met Ala Trp Glu Thr Arg His Val Lys Ile Pro Ala Leu Asn Asp 
820 825 830 Ser Gln Tyr Ile Gly Val Ser Val Tyr Ser Val Val Ile Thr Ser Ala 
835 840 845 Ile Val Val Val Leu Ala Asn Leu Ile Ser Glu Arg Val Thr Leu Ala 
850 855 860 Phe Ile Thr Ile Thr Ala Leu Ile Leu Thr Ser Thr Thr Ala Thr Leu 865 870 875 880 Cys Leu Leu Phe Ile Pro Lys Leu His Asp Ile Trp Ala Arg Asn Asp 
885 890 895 Ile Ile Asp Pro Val Ile His Ser Met Gly Leu Lys Met Glu Cys Asn 
900 905 910 Thr Arg 

  Arg Phe Val Val Asp Asp Arg Arg Glu Leu Gln Tyr Arg Val 
915 920 925 Glu Val Gln Asn Arg Val Tyr Lys Lys Glu Ile Gln Ala Leu Asp Ala 
930 935 940 

 <Desc/Clms Page number 57> 

 Glu Ile Arg Lys Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ser Gly Leu Thr Thr Thr 945 950 955 960 Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ser Thr Ser Leu Leu Thr Gly Gly Gly His 
965 970 975 Leu Lys Pro Glu Leu Thr Val Thr Ser Gly Ile Ser Gln Thr Pro Ala 
980 985 990 Ala Ser Lys Asn Arg Thr Pro Ser Ile Ser Gly Ile Leu Pro Asn Leu 
995 1000 1005 Leu Leu Ser Val Leu Pro Pro Val Ile Pro Arg Ala Ser Trp Pro Ser 
1010 1015 1020 Ala Glu Tyr Met Gln Ile Pro Met Arg Arg Ser Val Thr Phe Ala Ser 025 1030 1035 1040 Gln Pro Gln Leu Glu Glu Ala Cys Leu Pro Ala Gln Asp Leu Ile Asn 
1045 1050 1055 Leu Arg Leu Ala His Gln Gln Ala Thr Glu Ala Lys Thr Gly Leu Ile 
1060 1065 1070 Asn Arg Leu Arg Gly Ile Phe Ser Arg Thr Thr Ser Ser Asn Lys Gly 
1075 1080 1085 

  Ser Thr Ala Ser Leu Ala Asp Gln Lys Gly Leu Lys Ala Ala Phe Lys 
1090 1095 1100 Ser His Met Gly Leu Phe Thr Arg Leu Ile Pro Ser Ser Gln Thr Ala 105 1110 1115 1120 Ser Cys Asn Ala Ile Tyr Asn Asn Pro Asn Gln Asp Ser Ile Pro Ser 
1125 1130 1135 Glu Ala Ser Ser His Pro Asn Gly Asn His Leu Lys Pro Ile His Arg 
1140 1145 1150 Gly Ser Leu Thr Lys Ser Gly Thr His Leu Asp His Leu Thr Lys Asp 
1155 1160 1165 Pro Asn Phe Leu Pro Ile Pro Thr Ile Ser Gly Gly Glu Gln Gly Asp 
1170 1175 1180 Gln Thr Leu Gly Gly Lys Tyr Val Lys Leu Leu Glu Thr Lys Val Asn 185 1190 1195 1200 

 <Desc/Clms Page number 58> 

 Phe Gln Leu Pro Ser Asn Arg Arg Pro Ser Val Val Gln Gln Pro Pro
1205 1210 1215 Ser Leu Arg Glu Arg Val Arg Gly Ser Pro Arg Phe Pro His Arg Ile
1220 1225 1230 Leu Pro Pro Thr Cys Ser Leu Ser Ala Leu Ala Glu Ser Glu Asp Arg
1235 1240 1245 Pro Gly Asp Ser Thr Ser Ile Leu Gly Ser Cys Lys Ser Ile 

  Pro Arg
1250 1255 1260 Ile Ser Leu Gln Gln Val Thr Ser Gly Gly Thr Trp Lys Ser Met Glu 265 1270 1275 1280 Thr Val Gly Lys Ser Arg Leu Ser Leu Gly Asp Ser Gln Glu Glu Glu
1285 1290 1295 Gln Gln Ala Pro Ala Asn Gly Thr Glu
1300 1305

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de recherche de composés qui modifient les propriétés des polypeptides qui exercent l'activité biologique d'un récepteur de GABA-B, comprenant les étapes suivantes : (a) préparation d'une cellule hôte contenant un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide qui comprend une séquence d'acides aminés qui présente une identité d'au moins 70% avec une séquence suivant SEQ ID N : 2, SEQ ID N : 4 ou SEQ ID N : 6 (b) culture de la cellule hôte en présence d'un composé chimique ou d'un échantillon qui englobe un certain nombre de composés chimiques, et (c) détection des propriétés modifiées.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit acide nucléique consiste en un fragment d'ADNc ou d'ADN génomique.
3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend une nucléotidique qui correspond à une séquence suivant SEQ ID N : 1, SEQ ID N : 3 ou SEQ ID N : 5.
4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit acide nucléique s'hybride dans des conditions rigoureuses à une séquence nucléotidique suivant SEQ ID N : 1, SEQ ID N : 3 ou SEQ ID N : 5.
5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite cellule hôte consiste en une cellule eucaryote, en particulier une cellule de mammifère ou d'insecte. <Desc/Clms Page number 60>

NOTE D'OBSERVATIONS Le document DATABASE EMBL du 18 juin 1999 GM. Rubin et al. "Drosophila melanogaster clone GH07312 BcDNA.GH07312 mRNA complete cds" est mentionné dans le rapport de recherche comme étant de catégorie X.

En raison de ce document les revendications ont été modifiées comme suit : la nouvelle revendication 1 est une combinaison des revendications primitives 21 et 1 la nouvelle revendication 2 correspond à l'ancienne revendication 5 la nouvelle revendication 3 correspond à l'ancienne revendication 6 la nouvelle revendication 4 correspond à l'ancienne revendication 7 la nouvelle revendication 5 correspond à l'ancienne revendication 13 Toutes les autres anciennes revendications et en particulier la revendication 25 pour laquelle aucune protection n'est plus demandée, sont supprimées.

La séquence des acides aminés décrite dans le document mentionné ci-dessus est un homologue de la séquence SEQ IDN N :4.Comparée à cette dernière, la séquence antérieurement connue a quatre séries de plusieurs aminoacides en moins. De plus, et c'est très important, la séquence antérieurement connue n'a pas été commentée, aucune fonction n'a été attribuée à un polypeptide possédant une telle séquence d'acides aminés.

Le présente invention est basée sur la découverte que les polypeptides qui y sont décrits ont une activité biologique de récepteur de GABA-B et constituent des cibles potentielles pour des composés insecticides.

C'est la raison pour laquelle les revendications concernent à présent un procédé de recherche de nouveaux composés, en particulier insecticides, en utilisant ces polypeptides et les acides nucléiques qui les codent respectivement.