BE1023915B1 - Nouveaux procedes pour induire une reponse immunitaire - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne des procédés pour induire une réponse immunitaire, en particulier des procédés pour induire une réponse immunitaire contre des infections ou des maladies mycobactériennes comprenant (1) au moins une administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv1196 et au moins une administration d'un adénovirus codant pour un antigène apparenté à Rv1196 ou (ii) au moins une administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 et au moins une administration d'un adénovirus codant pour un antigène apparenté à Rv0125. Des compositions associées, des constructions adénovirales et des séquences polynucléotidiques sont également fournies.

Description

NOUVEAUX PROCEDES POUR INDUIRE; UNE REPONSE IMMUNITAIRE Domaine technique
La présente invention concerne des procédés pour induire une réponse immunitaire, en particulier des procédés pour induire une réponse immunitaire contre des Lu feotions on des maladies mycobactériennes comprenant fl) au moins une administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Ryll96 et au moins une administration d'un adénovirus codant pour un antigène apparenté à Rvll96 ou (il ) au moins une administration d’un antigène polypeptidique: apparenté à Ryôl25 et an moins une administration d’un adénovirus codant pour, un antigène apparenté a RvDIlo, Des compositions associées, des constructions adénovirales et des séquences polynucléot.i.diques sont: également fournies.
Contexte de 1/invention
La vaccination est l'un des procédés les plus efficaces pour la prévention des maladies infectieuses. Toutefois, souvent une seule: administration d'un antigène n'est pas? suffisante pour· conférer une-immunité optimale et/ou uns: réponse durable. Les: approches:: ipour établir une Immunité forte et durable contre des: agents: pathogènes spécifiques comprennent 1'addition dT adjuvants apsy vaccins :ét/ou:: une vaccinâtibn répétée., c' est-à-dire.. la .stimulation drpne: réponse ; mmun.i.taire par 1 ' administrât:i.on d1 une ou de plusieurs autres doses d'anti gène. Ces aut res administrations peuvent être effectuées avec le même vaccin (rappel homologue) ou avec un vaccin di lièrent (rappel hétérol ogue) . la tuberculose IIB) est une maladie infectieuse chronique provoquée par une infection aveu Mycobacterium bub0bçül,ùbis et d'autres especes de Mycobacterîmi. il S'agiif d'une maladie map eure dans lus. pays en; dêveloppeméht, ainsi qu'un problème croissant dans les- régions développées du monde;·'.' ;M:tbl2;f et: M"12 moût dès antigènes à base de ptotéihèo de fusion dérivés des 'protéines Rvl ! 96 et ;Κν0ίί5 de Mÿc0$§£terâ:nm· tubeLcuJ.osis. Mtb7 2i. et H72 (décrits, par exemple, dans les demandes: de brevet international WO 2016:/117140, WO 2012/080469 et WO 2012/06037 0 qui sont; incorporées: ici en référence) ou leurs fragments.· ou dér i vés sont des ant iqènes proteinig', es d’un bénéfice potentiel, pour le traitement: ou la prévention de La tuberculose.
Des recherchés préciiniques et cliniques ont mené à .1.1 admi nist.rat ion de M72 chez des êtres humains conjointement avec les ii arnu η o s 1. imu .1 a n t s monophospho r y.L -lipide Ä: S-O-désaeylé (3D-MUÎ.) et QS21 dans une fdrisulation liposomique: et dans un calendrier de 0,1 mois en ut iii sant .10 pg de polypeptide M7 2, 25 μ g de 3D--MPL et. 25 yg de C)S21 (Leroux-Roels ë;fc al> Vaccine 2013 31 21 36-2206, Montoya et al, 0, Clin, Immune U 201.3 33 P) : lMO-137 8; Thacher EG et al. II03 2014
Itlll} ·: 1769-17:8:1 / Idoko OT et al, Tuberculosis (Edinb) 2014; 94(:61: 564-578 y i©rm-Ni choisi et al. Vaccine f$l:$ 33 (32) t 402:5-4034 doi : 10,1016/j .vaccine. 20.15 . 05 . 088 ) . Un vaccin candidat utilisant l’antigène M72 est actuellement dans un essai en phase i IB (identifiant Cl in i ca iTr ia 1 s „ gov : NC’.î'0'i 755598 ) peur: évaluer l'efficacité protectrice de deux doses de protéine adjuvée contre la ÏB pulmonaire, compa rat i.vemen t à un placebo, cher des adultes âgés de 18 à 50 ans vivant dans: des pays endémiques de lu tuberculose.
Le document WO 2008.107 3 /OiVI. (incorporé ici on référence} décrit l'administration simultanée d'un antigène polypeptidique et d'un udénov.lrus codant pour un antigène polypept i di que. te document WO 2010023260 (i noorporé ici en référence) décrit .1 ' administration simultanée d * un antigène polypeptidique et: d'un vecteur virai codant pour un antigène pclypeptidiqué. T1 y a un besoin constant, de nouvelles .méthodes pour lt immunisatioh equipe dea maladies, notamment -la tuberculose, gui sont; hautement. efficaces, sûres, pratiqués, rentables^ durables et qui induisent un large spectre de réponses: immunitaires. Résumé de l'invention
Il a été à. présent découvert de: façon surprenante que la sensibilisation avec ün antigène .ppiypqptidiquç apparenfé à Rvll96/Rv0125: et lé rappel. avec un. adénovirus simien non humain codant, pour un antigène apparenté â Rvll96/RvQ125ou la sensibilisation avec un adénovirus simien non bupaii): codant pour un antigene apparenté à Rvl.Int/Rv0125 et ορ rappel avec un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96/RvO125 /peuvent fournir des réponses iasmunitaires qui sont sèhsifâfemeftt; àméiipré.es par rapport à d’autres approches potentielles.
Rai conséquent, dans un premier aspect de 1' i.nvent i on, i.i ést fourni, un procédé pour .i.ndu,i re une réponsè imttiüni taire/ cher un sujet comprenant .1 ’ adrainictration d’un antigène polypeptidique apparenté à Rvll9S an sujet, suivie de l’administration d/’un adénoviras simien non huiüaiiï codant pour an antigène apparenté à Rvl 1,96.
Dans un deuxième aspect de l’invention, i 1 est fourni un procédé pour induire une réponse immuni té i re ehe z un sujet comprenant 1’ädffiiÄistration d'un adéhovirus; simien non humain codant pour un antigène apparenté i. Rvll96, suivie de l'administration: d'un antigène polypeptidique apparenté a Rvl.196 au sujet.
De façon appropriée, l'antigène polypeptidique apparenté à |$ν1Γ9β: fô:St fourni dans une composition qui comprend également un adjuvant·, Eventuellement,, l’adjuvant comprend un agpiilsté dés TLR et ./ou une saponipe i.mirtunol oqiquenient aéti ve/. f/' agonis te des TLR pst de: façon appropriée un agoniste du, TLR4.
Df: façon appropriée, l'antigène poiypeptidigue apparenté à Rvlifé est. four ni dans urié; composition 'qui ne comprend pas: un adénovlrus simien non. humain codant pour un antigènè apparenté è Rvl196.
De façon appropriée, 1 ’ adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvl196 est fourni dans une composition qui ne comprend pas un antigène:pplypéptidique apparente à Rvll96.
Dans un troisième aspect de I 1 J. rivent ion, il est fourni un procédé pour induire une réponse: immunitaire chez un sujet Comprenant 1 ’ adra.i nist.ruU.on ci ' un antigène polypeptidique apparenté à RvO12b au sujet, suivie de 1{ administrât ion d'un adé.uoy.i.rus simien non humai..a codant pour un antigène apparenté à RV0125.
Dans un quatrième aspect de 1 ’ 1 rivent 1 on, il est fourni un procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet comprenant 1! adm.i ni. s ira Lion d'un adénovims simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvO.!. 2 5, suivie de l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à EvQ125 an sujet.
De façon appropriée,; lf antigène polypeptidique; apparenté â Rv0125 est fourni dans une composition qui comprend également un adjudant. Eventuellement, l'adjuvant comppènd un agoniste des TLR et/oh nue saponine immu no logiquement active::;. R' agoniste des TLR est de façon appropriée un:agoniste du TLR4.
Do façon appropriée,· 1 ' antigène polypeptidique apparenté à :RvO 1:2S ést.'fourni dans une composition qui ne comprend pas- pli adénovixus simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvO.1.25.
De façon appropriée, 1'adênovifus simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvO125 est fourni dans une composition qui ne comprend pas un antigène apparenté à: îRvOCRS
Brève description des figuren
Figure 1 ~ Pourcentage médian de la réponse des lymphocytes T CSM spécifiques: de M72 à partir de souris CBêFl exprimant tes cytokines ÏFN-qamma et/ou ί£~2 et/ou TNH'-alpîna à V, 14 e t 21 jours après 1 ' immunisation en utilisant le ChMl dans une plaqe de doses.
Figure 2 - Pourcentage médian de la réponse des lymphocytes T CD 4 spécifiques de M72 a partir de souris CB6 i;M exprimant les cytokines IFN·--gamma et/ou LL-2 et / ou TNF-alpha à 7, 14 et 21 jours après l'immunisatien en utilisant le ChAd63 dans une plage de doses.
Figure 3 - Pourcentage médian de la réponse dos lymphocytes T CD8 spécifiques dé M72 à partir de souri s CB6 Fl exprimant les cytokines IFN-gamma et/ou IL-2 et / ou TNF-alpha à 7, 1Ί et. 21 jours après l’immunisation en utilisant le CMdl dans une plage de doses.
Figure 4 - Pourcentage; médian de la.....réponse dos lymphocytes T CD8 spécifiques de M72 à partir de souris C36F1 exprimant les cytokines I FN-gamma et/ou l L- 2 et/ou TNF·-alpha à 7:,; 14 et ·;2:1 jours après 1! immunisarion en utilisant le ChAdÊd dans une; plage de doses.
Figu re 5 e Pourcentage de la réponse des lymphoCptes :T CD4 spécifiques de 137 2 partir du sang total de souris CB6F1 exprimant: les oyfoiklnés: IFN-gamma et/ou IL-2 et/ou" Ipha à 14 PI et 14 Pif en utilisant des stratégies de vaccinations de sensibil:Isation--rappel hétérologues (ChAd/Prot et Prot/GhAdl.
Figure 6 - Pou reent âge de la réponse dos lymphocytes: T CD4 spécifiques de M7 2 à partir du sang total :dè souris CB6.F1 exprimant les pytokines et /ou IL-2 et/ou INF-alpha à 14 PI et li fl'I en utilisant les stratégies de yà cöIhit ions dé sens ibiii sat.i on~rappe 'I homologues (CnAd/ühAd? et en combinaison avec Mlf/ASOIE {mélange du ooadminiStratiôhJ .
Figure 7 - Pourcentage de la réponse des lymphocytes Ψ ci.>8 spécifiques de M72 a partir du sang total de pour i.s CB6F1. expr i ruant les cytokines I FN-gamma et/ou IJ,-2 cl;/ou TNF-alpha à 14 PI et 14 PII en ùtl lisant: des stratégies de vaccina t. ions de serisIbliisatiQn-rappsl hétérologues (ChAd/Prot et Prot/ChAd).
Figure 8 - Pourcentage de la réponse; des lymphocytès T CD8 spécifiques de M72 a partir du sang total de souris CB6Fl exprimant: les cytokines l. FN-gamma et/ou IL-2 et/ou TNF-alpha à 14 PI et .14 PII on
Utilisant des stratégies dé vaccinations de sensibil.i sa t ion “rappel, homologues (ChAd/ChAd) et en combi raison avec Mll/ASOli (mélange on CQadministration:;ii ,
Figure 9 - .Pourcentage: do la réponse de lymphocytes f :(204 spécifiques de M?2 a partir du tissu, pulmonaire de souris CBhFl. exprimant les eytohines XFN-ganraa et/ou ïn~2 et /ou INF-alpha à 14 PII.
Figure 10 - Pourcentage: de la réponse; de lymphocytes T: CD8 spécifiques de M7.2 à partir du ilsôù pulmonaire de souris; #B.6FI exprimant les cytokines IFN-gamma et/ou ,1:1-2· et/ou TN|’-alpha à 14 FII.
Bighre: 11 - Profil des cytokines de ; a réponse: des lymphocytes T OD4 spécifiques de M72 dans Ie sang tdfcdl (VfËL0| à: 141 PI ehëd dés souris CB6F1 immunisée«*· .Figure 12 ~ Tableau présentant les valeurs des données du profil: dés cytokines: de la réponse des lymphocytes T 0D4 spécifiques de M72 dans Ie sang total i W3L0) à ::1,:4: Pincher des souris:: CB6F1 Immunisées. 'Figure 13': - profil de«·: icytokines de la réponse de lymphocytes ï:: 0D4 spécifiques de Mil dans le sang total :{1BL0) à li FI chez des souris: CBfePI. iiumunlisées f
Fi gure 14; - Tableau présentant les valeurs dés données du profil des cytokines de la réponse des lymphocytes T: 7004:. syécif i que s de $172 dans' le sang total :|:WBLO) à 14 Pli chez des souris CBSfl immunisées.
Figure Ί 5 Profil dés; cytokines de la réponse des lymphocytes T ODi spéclfIgues de Mit dans le poumon à 14: PII cfcdz des souris CB6Fl immunisées.
Figure 16 - Tableau présentant les valeurs des données du profil des cytokines de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques: de M72 dans lé poumon à 14: FIT chez den souris CB6F i immunisées.
Fiaura 17 - profil des cytokines de la réponse des lymphocytes I CD8 spécifiques de; M72 dans le Pang total ( WBLO 5 à: 14 tl: cher des sou r is CB 6 Fl Immunisées.
Figure 18; - Tableau présentant: les valeurs dès données du profil des cytOklnes: de la réponse des lymphocytes T CD8 Spécifiques de 17¾ dans le sang total ( WBLO ) a 14 Pl chez des, souris: CBiFl iifununlsées,
Figure 19 e Profil dés cytokines de la réponse: .des lymphocytes T CD8 spécifiques de M72 dans le sang total ( 14Bi.O) a 14 Pli chez des souris: 086Fl Immunisées.
Figure 20 - Tableau: présentant les valeurs des données du profil des cytokines de 1 a réponse des lymphocytes T CD8 spécifique:® dpi M72 dans le sang total {WR.! :0 ) à 14 EU citez de s souris CBêF'i .
Figuré 21 - Profil des cytokines de la réponse des lymphocytes T COB spécifiques: de M72 dans lo poumon. à 14 Elf ehe7. des Souris CSBF'i immunisées.
Figure 22 -- Tableau: 'présentant lés valeurs des données du profil des cytokines de: la réponse des. lymphocytes:; T ÇDB spécifiques de M72 dans le poumon à 14 Eli cher des souris CB6Fl immunisées:.
Figure 23 - Sérologie dèa· dg· totales an;fci-M7.:.ï à 13 g EU.
Figure il - Représentai ion .schématique dé ï ' a :·· rangement do la construction M72:-C:h:Âd3 .
Figure: 25 - Répréséhtat.ion schématique de 1'arrangement de: la construction. M72-ChAd63.
Bréye description des identificateurs de séquences OFQ ID NO : 1, - Séquence polypeptidique de Rvi 196 de Mycotacfériuin taper cul osls H37Rv SEQ ï© NO : - Séquence polypeptidique: de R vil 9 6 de ctetiy®; tuberculoses Fil SEQ ID ;NQ : 3: - Ééquenoe polypeptidique de RvO 12.5 delM^cobactMrium tuberculosrs H3'fKy {séquence mature) SEQ 10 NO i:· 1 ~ Séquencç; polypeptidique de .M7;:2 2 "hi s SEQ: IDrNO t 5 ~ Eolynucléotide de ::M72 '2d:his SEQ 10: NO r §; ~ Séquence polypeptidique de : M72 sans h is SEQ î i) MO : 7 ~ Nelynuciéoticte de M72 sané b i s SEC) '10 NO.....: 8 - Pqlynuçléobide humain optimisé de N72 sans: his SEQ ID 10 9 - Po l.ynuoléo !.. i de de ChAdl SEQ; ID NO : 10 - Séquence polypeptidique du pentoh de i:b.Ad3 SEQ ID NO : 11 ~ Séquence polypeptidique de 1!hexon de ChAd3 SEQ XD NO : 12 - Séquence po 1 ypeptidique de 1 a libre de Ch Ad 3 SEQ ID 10 : 13 ·- ADN de la construction M72-ChAd3 SEQ ÏD NO : 14 - Po 1 ynuc léo11 de de Ch.Adb 3 SEQ 5 D NO : 15 - Séquence polypeptidique du perd.on de Chi\d63 SEQ 113: NO ; 10; - Séquence polypeptidique de 11 hexon de OhAd63 SEQ ID MO î; 17 - Séquence polypeptidique de la f ihre de Ch Adel SEQ: ID NO : 18 --· ADN de ί&: construction N72~ChAd:63
SEQ ID NO : 19 - Eblynucléotide de ChAdloS SEQ ID NO : 20 - Séquexïce polypeptidique: du pent on do ChAd ]35 SEQ ID NO : 21 - Séquence polypeptidique de 1 ' hexon de Ch Ad 1.55 SEQ:; 10 NO : 22 ~ Séquence polypeptidique de la il bre de Ch Ad 15 5
Description détaillée
La tubérculpsé: (TB) est; une maladie Infectieuse chronique provoquée p;ar: une infection: avec
Mycobacterium bnbexculosis ët d'autres especes de Mycoba et er Mm, ί 1 s'agit d ' une mai adie majeure dans les pays en développement, ainsi qu'un problème croissant dans les régions développées du monde» On pense qu'environ un tiers de la population mondiale est infecté de façon latente par les bacilles: de la TB, avec environ: 9 roi liions de nouveaux cas de TB active et 1,5 million de décès tous les ans. Environ: 10 % de ces personnes infectées par les bacil les de la TB développeront une TB active, chaque personne atteinte d'une TB active infectant en moyenne de 10 à 15 autres personnes par an. (World Health Organisation Tuberculosis Facts 2011]
Mymb&cterium tube reu losis infecte .1 os individus par: la voie respiratoire, tes macrophages: alvéolaires englouflBSënt la bactérie:, mais: elle est capable de survivre et: de: proliférer en inhibant la fusion des: phagosomes avec les lysosomes acides. Une réponse: iïïroiuhitaire complexe impliquant.: lés lymphocytes T: CD44 et CP8 : s'ensuit, produisent finalement la iormatiqn d'un granulome. Au cœur do la réussite dé Mycobacterimm tuhexaiilosiss en tant qu'.agent: pathogène, il y a île fait que la bactérie isolée, pale· pas éradiquée.:, peut persister pendant de longues::: périodes, laissant un individu vulnérable au développement ultérieur: d'une TB active.
Moins de 5 % des: individus infectés dëvelDppéht une TB: active au coups des premières années après 1’infaction. fe granulome peut ^persister pendant des décennies et dn pepsé: qu'il contient ie MycobacterÈnm tube rcuiosln vivant: dams un état de dormance, privé d'oxygène et de nutriments,: Toutefois, il a été suggéré tpe la majorité dess bactéries dahs l'état de dormance sént localisées data des types cellulaires non macrophagiques disséminés: dans bout le corps (tocht et al., Expert Opin. Biol, Tiier. ®-0:7 7(11): 1665-1677):. te développement d'mre TB active survient lorsque l'équilibre entre 1. ' immunité naturelle de 1 ' hôte et 1'agent pathogène change, par exemple comme résultat d'un événement xmmunosüpprésseùr: {Anderson P Trends In Microbiology 2007 15 (1): 7-:13 ;: Ehlers S Infection 2009 37(2); 87-95).
Une hypothèse dynamique décrivant 1/* équilibré entre la TB latente et la TB active a été également proposée (Cardona P-J Jnf tammstion & Allergy - Druq Targets 2006 6:: 27'-39 ; Cardona P-J Infection 2009 33 {:2)1: 8 0-:66), bien qu'une infection puisse être asymptomatique pfendénc une période de temps considérable, la maladie active sè manifeste le plus couramment sous la forme d’une inflammation aiguë des poumons, entraînant un état de fatigué, une perte de poids, de la fièvre et une toux persistante. Si elle n'est pas traitée, des complications sérieuses et le décos en découlent, généralement,
La tuberculose peut être généralement contrôlée en utilisant un traitement antibiotique étendu, bien que ce traitement ne soit pas suffisant pour prévenir la propagation dm la maladie. Les individus infectés de façon active peuvent être grandement asymptomatiques, mais contagieux, pendant un certain temps. En outre, bien que l'obëërvânce du régime th.ér:apeutique (qui dure géuérsleBiént 6 mois ©q plus); soit essentielle, le comportement; des patients est difficile à surveiller. Certain© patients ne tepndneni pas le cours du traitement;, ce qui peut: mener à un traitement inefficace et SP développement d ' me résistance pêdi came n t e u se v
La TB multirésistante (TB-KR) est. une forme gui ne répond pas: aux médicaments de première intention, il; est estimé que &8;0 0:150 personnes ont développé une TB---MR en tôld, La TB-MR pou;: être traitée en utilisant des; médicaments; de seconde: intention.: Toutefois, les Options: de traitement de secondé intention font limitées et les médicaments recommandés ne sont pas toujours disponibles. La chimiothérapie étendue requise (jusqu’à deux ans de traitement) est coûteuse et peut produire dés réaptlohs Indésirables; sévères aux médicaiïïénts obéi lès (patients·.
Une TB ultraréSïistante ÎTB-ÜR) survient lorsqu'une résistance: aux; médicaments; de second© intention se développe en plus de la résistance; aux médicaments de première intention. On estimé qu'environ 9,0 i des pas de ?B~MR souffraient d! a ru.; TiB-üR: (World Health
Organisation Tuberculosis Facts 201-)) . Même; si un cours complet de traitement antibiotique; est complété, ; ' infection avec JT, tuberöälosds peut ne pas être éradiquée :de l'individu infecté et peut demeurer sous la forme d’une infection latente qui peut être réactivée. Bar conséquent,: ;ûn diagnostic précis et; précoce de la maladie est d’une importance capitale,
Actuellement, une vaccination ave.o des; bactéries vivantes atténuées· représente le procédé: lé plas largement utilise· pour induire une immunité protectrice,: lie MyaoDÎ:!CÎerium le plus courant employé pour cet objectif: est lé: bacille de faimette-Guérin (SCG) , Une souche avirulente: de M, bovin pui a été développée pour la 'première: fois il gh a plus de 6(1 ans. Il est administré à la naissance dans1: les régions: endémiques de la IB. Toutefois, ilinnocuité et 1Jefficacité du BCG sont une source de controverse - tout en protégeant contre uné manifestation: sévère de: la maladie chez les enfants, :1:|efficacité du BCG contre la maladie chez les acuités est variable. En outre, certains pays, pomme les -Etats-Unis., ne vaccinent 'pas lé grand public avec cet: agent , 1:1 a été montré: que plusieurs: dos protéines qui sont fortement exprimées durant: les s lades précoces de 1'infection par Mycobaaterium fournissent une efficacité protectrice dans des modèles de vaccination animale. Toutefois, la vaccination: avec des antigènes qui sont hautement exprimés: durant 1 es stades précoces de i ' infect .ion peut le pas fournir une réponse immunitaire: optimale pour faire face aux stades ultérieurs de 11 Infection. Un contrôle adéquat durant une infection latente peut nécess.i fer des lymphocytes T gui sont spécifiques des antigènes particuliers qui sont exprimés à ce moment-là. Des vaccins après exposition qui ciblent directement les bactéries per si starités dormantes peuvent aider dans la protection contre la réactivation de la TB, ampli fiant de cette façon le contrôle de la TB, voire meme permettant l'élimination de l'infection. Un Vaccin ed.b.'l ant une TB latente pou irait par GônsëgUènt réduire1 signifibativèmènt et économiquement les taux g.lobaux d'infection de Tΰ.
Des vaccins; sou s-unitaires à base d1 a ni. i gènes des stades tardifs pourraient être également utilisés en combinaison avec des antigènes des stades précoces pour fournir un vaccin multiphase. En variante, des antigènes des stades précoces et/ou tardifs pourraient être utilisés pour complémenter et améliorer la vaccinai.ion par le R CG (soit en stimulant la réponse au idS: soif par le développement de souches recombinantes avancées: du B CG) .
Mtbl2f et. M7 2 sont des antigènes i base de protéines de fusion: d'un bénéfice potentiel pour le traitement ou là prévention de la tübercul ose. Mtb72f et K72 sont dérivés: des protéines de Myc&baatörium tmb&raMlosis RvtiM et RyOlid, les: deux: gènes étant présents dans lés louches à la fois virulentes et avirulentes: du complexe de Mÿwba®Éfê£MitÊ tMh&rcul&§dsn et dans ie BCG.
Rvll96 (décrit, par exemple, sons le: :nom do Mtb39a dans Di IJ on et ai, Infection and Immunify 1929 β 7 ( 6} : .2¾41-29101 est hautement conserve, avec 100 f: d'identité de séquence parmi 1 es souches :H37R% C, Haarlèm, CDC1551,: 94cî«f241A, 9:8~R6ÖHNH-RIF-EM, K2N60S, R:Zfî:14:35:, K2N4207, KtMRSOt, la souche Fil comportant une seule mutation poncttieile Q3QK (la plupart des autxès isolats cliniques présentent plus de 90 % d'identité avec H37Rv). Un abénovirus codant pour un antigène appa r «nté à Rv.1.196 est décrit dans Lcwinsohn et a 1. Ain J Kospir Crit Care Med 2002 116: 843-8¾.
RvO'i25 (décrit, par exemple, son» io nom de Mtb32a dans dke.iky et a./.. Infection and J.mmunity 1999 67 (8) : 3998-4007} est également hautement conservé, avec I 00 % d'identité de sé^uèïïc-e parmi de aoitibreuses souches, On adénoviru s (Ad 5 humain.) codant pour un antigène apparenté à: Rv0125 est décrit dans h hang et ai- Human Va cc i nés & Therapeut! es 2013 Ί .1 ( 7} : 1803-131 3 d oi : 19.10 8022164 5 SIS .2015-1042193. Le RvO 12 5 pleine longueur comprend une séquence signai R-terminal© gui est clive« pour fournir la. protéine mature.
Il: a été montré: que Mtfo72f fournit une protection; dans un certain nombre dés: modèles animaux (voir, par exemple : Brandt: et a J, Infect .: Immun. 2004 72 (11) : 6622-6632 ; Skeiky et ai. J. Immunol. 2&M. 172: 761:8:-7 628 1 T s end va: et al. Infect. Immun. 2 0 0 6 74(4): 2392— 24 01 ) . MtM721: a également fait l’objet dè recherchés cliniques (Von Eschen bt ai, 2009 Human Vaccines 5{7;H 475-432) , M72 est œi antigène amélioré: qui in-eorpopë une seule mutation de: sérine en alanine par rapport au Mtb72fj:: entraînant:: une améliorât ion des caractéristiques de stabilité:. Il a été également montré que les antigènes apparentés au :1972 sont utiles dans un modèle de TB latente (demande de brevet. International W0 2006/1 .17240, incorporée ici on référence): *. ©es recherches préo.l iniques et cliniques ont été menées sur M72 administré chez des êtres humains conjointement avec les immunostimulants uiionophosphoryl-iipi.de Ä i-O-désqyLé dSD-MPL) et QS21 dans une formulation liposomique et dans un calendrier de 0,1 mois; en utilisant 10 pg de polypeptide M72.:, 25; pg de ID-MPL e& 25 ug d.ë QB21 (voir,, par exemple, Ler oux-Roe.1.s et a.’. Vaccine 2013 31 2196-2206, Moncoya et al, dt Clin. Iiamunol. 2013 33 (8): 136Q-137 5 7 Thacher SG et al. Aï DS 2014 2 8 {J .2 ) : 17 69--1781 f lu g ho O T et ai, Tuberculosis (Edinb) 2014 S* 4 {6) : 564-578 ; P e η n - N i oh ο1sοn A, et al. Vaccine 2 015 33 (32}: 4023-4034 doi:10.1016/j.vaccine.2015.05.088),
On vaccin candidat utilisant; .Ί 'antigene Vu2 est actuellement dans un essai en phase Il B (identifiant (Il inicaiTria ls . qov : NCT01'/35598 ) pou r évaluer 1'efficacité protectrice de: deux doses de protéine adjuvée contre la TB pulmonaire, Comparativement à un placebo, chez des sujets âges de 1B à 50 ans vivant dans des pays endémiques de la TB. néanmoins, il demeure un bésdin d1 'améliorer. les approches lie v a ce i n a t i on,
Dans un premier aspect de i::I;inven:td.on/ il; est fourni un procédé; pour induire; Une réponse immunitaire; chez un sujet comprenant 1.1 administrât!on d'un antigène; polypeptidique apparenté à K v 1. i 9 6 au sujet, suivie de l'administration d' un aolénovirus simien non humain codant pou r un antigène apparenté à RvllD6.
Sans un deuxième aspect de l'invention, il est fourni un procédé pour induire une réponse: immunitaire chez un sujet comprenant l'administration; d’un adenovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 au sujet,; suivie de 1 ' adrn.i nistration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv1196.
Dans un troisième aspect de i'invention, il est fourni Un procédé pour induire une réponse immunitaire
Chez un sujet comprenant 1.’administration d-uil antigène1 pölypeptidiqua: apparenté à JRviÔlËS au sujet, saima ae 1adïïdrd s t ration: d ' une eomposit ion IrmnSnogèné: comprenant Un adéngvirus simien non humain codant pour an antigène apparenté à Rv0125.
Dans un quatrième: aspect de lila tent ion, il est fourni un procédé pour induire une; réponse iromunitaire chez un sujet comprenant 1iadrainistration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvûl 21, suivie de 1''admihialratiph d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 au sujet,
TeI qu ’ ut lit sé ici, l’admihiat r alien, d'une première composition « suivie: de »: 1 ' administration d'une seconde composition indique qu'un intervalle de temps s’est écoulé entre l'administration de ta prémière compositiöh et l'administration de la seconde composition. De façon appropriée, 11 intervalle de temps entre les adminisipatiGns: est d'une semaine à deux ans, en particulier deux semaines à dix-huit mois, généralement trois: semaines à quinze mois, comme trois semaines à Six: mois, par exemple trois semaines à deux mois, spécial ement trois semaines à six semaines comme environ quatre semaines,
Il est également fourni un antigène polypeptidique apparenté à Rvl196, pour une utilisation dans .1 ' induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où 1'antigène polypeptidique apparenté à Rvl196 est administré au suj et;, suivi de l'administration d’un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvl196,
De façon similaire, il est fourni, un adéxiovirus vS.imi.en non humain codant pour un antigène apparenté à Rvl.l 96, pour une utilisation dans .1. ’ ixvJuetion d'une réponse immunitaire chez un sujet où un antigène polypeptidique apparenté à RyJ.196 est admini.s tré ai sujet, sui vi de 11 administration de 1. 1 adenovirus simien non humain codani. pour un antigène apparenté à Rvl 196.
En outré, il est f ourni .1 ’ utilisation d ' un antigène polypeptidique apparenté à Rvl 196, dans la 1abricasion d'un médicament pour Induire une réponse immunitaire chez un s u j et. où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvl 15)6 est administré au sujet, suivi do .1! a dmi n i s t r a t.1 ο 11 d'un adenovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à R v119fe.
En outré:, il. est fourni 1 ’ utilisation d ' un âMéhovirus: simien non humain codant: pour un antigène apparenté a EV1196, dans la fabrication d'un médicament pour Induire une répons®:: immunitaire cher un sujet où: un antigène polypeptidique apparenté à Rvl196 est administré au su j et, suivi de 1 ' acimini s t ration: de 1’adénovirus: simien non humain codant .pour, un anticène apparenté à Rvll96.
Il est également fourni un antigène polypeptidique apparenté à Rvl196, pou r une utilisation dans I ' induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où un adénovirus; simien non humain: codant pour un antigène apparenté: à Rv 11 S)6 est administré au sujet, suivi de 1 'administration de ;1.·'antigène polypeptidique: apparenté à Rv.1.1 9 6 .
De façon similaire, i 1 est fourni un adenovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à
Rvll96;, peur une utilisation dans l'induction d’uns réponse Immünitaire chez un sujet où i1 adénovi rus simien noix humain codant pour un antigène apparenté à Rvl196 est; administré au sujet, sûivi de .11 administrât ion d’un antigène polypeptidique apparenté à Rvl .19h.
En nuire, .1i est fourni l’utilisât ion d’un antigène polypeptidique apparenté à Rvl .196, dans la fabrication d'un médicament; pour induire une réponse immunitaire chez un sujet où un adénovirus s i mien non huma in codant pour un antigène apparenté a Rvl. 196 est administré an sujet, suivi dé l'administration de .1 ' anti gène polypept idiqno apparenté à Rvl 1 96 . ïl est également fourni 1'utilination d’un adénovirus: simien non humain codant spour.....un antigène apparenté à Rvl 196, dans la faix ri cation d’un médicament püar induite: une réponse immunitaire chez un sujet où i1adénovirus simien non: humain codant pour un antigène apparenté à Rvl196 est administré: an sujet, suivi de il’aGtffiinistration d’ uns antigène polypeptidigpe apparenté I; Rvl 19 6. 11 est; également fourni vffî antigène polypeptidique apparenté a Rv0125, pour une utilisation dans si’induction d'une répons©; immunitaire eher un sujet ou l'antigène :::p;olypept idique apparenté a ;Rv0125 est administré au sujet, suivi de 1’admini strat ion d ' un adénovirus sind.en non humain codant: pour un antigène a p p a r ent é à RvQ12 5.
De façon similaire, il est fourni un adénovirus simien non humain: codant pour im antigène apparenté à Rv0125, pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire chez «e sujet s h "üu antigène:: polypeptidique apparenté; a RvÖlii est administré au. sujet, suivi de X ' administration de l'adénovirits simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvOitS,
En outre, il est fourni:· .l^utilisufcion 'd’un antigène poXypèptidigue apparente à Rv0125, dans la fabrication d ' un médicament pour induire une réponse immunitaire eher un sujet où l'antigène polypeptidique apparenté à RvO 12f3 est administré: au sujet, suivi de 1'administrâtion: d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté a RVÉIRS.
En outre, il: est fourni 1 ’ uti 11‘nation d ’ un adénovirus: -simien, non humain codant pour un antigène apparenté à RvOlZS;, dans la fabrication d'un médicament pour induire une réponse: immunitaire chez un sujet où un antigène: polypeptidique apparenté | Rvül25 est administré au sujet, suivi de 1 ' admirui stration do 1'adénovirus simien non humain codant pour un: antigène apparenté à RvO12b. 11 est également fourni un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125, pour: Une utilisation; dans ]. ' induction d' une réponse immuriltaire chez un suj et: où un adénovirus- simien non humain codant pour1 un antigèné: apparenté ;|: RvOlgB: est administré: ;aù sujety suivi de l'administration dp l'antigène: polypeptidique apparéhté; a RvO125.
De façon: similaire;,: il est fourni un adenovirus simieh. non humain codant pour un antigène apparenté à RvUÎRS, pour: une Utilisation dans l'induction d'une réponse: immunitaire.-. chez an sujet oit a ' adénovi rus simien non Humain codant pour un antigène apparenté à
RvO'MS est administré au sujet,: suivi dp: 11 a<lftinis trat ion ; d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125.
En outre, il est fourni l'utilisation d'un antigène: polypeptidique apparenté à Rvi)125, dans la fabrication dlnn médicament :p©ur induire: une réponse immunitaire ehez un ptijet où un adênpvirus simien non huma i 11 codant pour uh antigène apparenté I Rv0125 est: administré: au sujet, saisi dp 1 ’ administration de l'antigène: poXypeptidigué: apparenté |;à Rv0125, II est également fourni 1’utilisation d'un adénovirus simien· non humain codant pour un ant igène apparenté à Rv01;|h>· dans: la fabrication d'uh: médicament: ppup induire une réponse immunitaire chez un sujet où i. ' adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de I'ad&amp;ihistratiön d'un antigène polypeptidique apparenté à P.vG.125.
De f açon appropriée, 1 ' ant i gène poiypopt.i di que apparenté à RV1196 est fourni dans une composition qui comprend également un adjuvant. Eventuellement, l'adjuvant comprend un agoniste: des TBR et/ou une sapon i ne immunologiquement active. L'agoniste des TLR est de façon appropriée: un agoniste du TLR4.
De façon: appropriée, l'antigène polypeptidique: apparenté à lv0125 est fourni dans une:: composition qui comprend également un adjuvant. Event uelleitiphf:/ Hadjuvant comprend un agoniste: des TLR set/ou une ssponine immunoiogigueißenf active, h 'agoniste des: TLR est de façon appropriée un agoniste du TLR4.
De façon appropriée, 1 'antigène polypeptidique; apparenté à Ryii96 est fourni dans une composition qui est sensiblement dépourvue d;':un adenovirus Simien non humain codant pour un antigene; apparenté à MwllB.6.,. de telle f açon qu ' elle ne comprend: pas un adenovirus simiéil non humais codant pour un: antigène apparenté à iRvill&amp;v Par exempté/: elle est sensiblement dépourvue de ou ne comprend pas un aciénovirué simien rien humain codant: pour sun antigène mycobactérien (de teile façon qui elle est sensiblement dépourvue de ou né; comprend aucun adénovirus simien non humain} en particulier elle est sensiblement dépourvue de ou ne comprend aucun adénovifus codant pour un antigène mycobactérien (de telle façon qu'elle est sensiblement dépourvue de ou no Comprend aucun adenovirus) t>: Dans certains modes de réalisation, 1'antigène polypeptidique apparenté à Ëvlllh est fourni dans; une composition qui est sensiblement dépourvue de ou ne comprend aucun adénovirus codant pour un antigène mycobactérien.
En outre, de façon appropriée, (l'antigène polypeptidique apparenté à Rvil96 n'est pas administré au sein d'une période d'un jour; (comme deux, trois ou six jours} d'un adenovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté: à RV1196, comme un adénovirus simien non humain codant pour un. antigène apparenté; à Ρν|Ι36> Rar exemple, un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien (tel qu'un adénovirus simien non humain quelconque) en. particulier un adénovirus quelconque codant pour un antigène mycobactérien (tel qu'un adénovirus quelconque) . Do façon:: appropriée, l'antigène polypeptidique Apparenté à Rvi 196 n ’ est pas a dm i nistré an sein oPure: période d'un jour (comme délix:, trois /pu six jour.s) dlun, adénovirus quelconque codant pour un antigène mycohaci orien ,
Do f açon;:: appropriée, 1'(adénovirus simien· non humain codant pou r un antigène: apparenté à Rvl i S) 6 est fourni dans iine coxaposi tion qui est sen.ni Internent dépourvue de ou ne comprend pas mîi. antigène polypeptidique apparenté à RV1196. Par exemple, elle est sensiblement dépourvue de ou ne comprend pas un antigène mycohac 1 érien polypeptidique (de tel.le façon qu’elle est sensiblement dépourvue de ou ne comprend aucun antre antigène), Dans certains modes de réalisation, 1’adenovirus simien non humain codant pour urt antiginé apparenté;: à Rvl 196' est fourni dans une composition qui eist sensiblement dépourvue de ou né comprend pas un antigène mycobactérien polypeptidique.
Su oatre, de façon appropriée, 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvllié n'esti pas; administré au, sel.π d'une période d'un jour (pomme deux, trois ou six jours) ci tun antigène polypeptidique apparenté à Rvl'196, Pat exemple, ug antigène mycobactérien, polypeptidique (comme tout autre antigène): »: De façon appropriée, l ‘ adénovirus simien non humain codani pour un antigène apparenté s% RV1196 n'èst pas: administré au sein d'une période;, d1 un jour {comme deux:, trois ou six -ours) d'un antigène mycobactérien palypept idi que,
De façon appropriée, 1'antigène polypeptidique apparenté a RvO.125 est fourni dans une composition qui es t sensiblement dépourvue d ' un adénovirus simien non huma ίn codant pour un antigène apparenté. a RvOlid# de -telle façon qu'elfe ne comprend: pad un adénevirns simien non humain codant pour un antigène: apparenté a RV012 5:. Par exemple,: elle est sensiblement: dépourvue dé ou: ne Comprend pas un adénovipus simien non humain codant: pour un antigène mycobactérien :{de telle >ë&amp;gon qu'tel lë : esc sensiblement dépourvue dé ou ne comprend aucun adénovirus; simien non 'humain} en particulier elle est sensiblement: dépourvue dé ou ssne comprend aucun adénovirus codant pour un antigèné mycobactérien Ide telle façon gu‘elle est sensiblement dépourvue de du ne comprend aucun adénovirus). Dans certains mode? s de réalisation. .11 antigène polypeptinique apparenté à
Bvêlf 5 ést fourni dans une -composition gui est sensiblement dépourvue de ou ne comprend aucun adénovirus codant pour un ant.i.gène mycobactérien. Ëh outre, do lacon appropriée, 1'antigène polypeptidique apparenté à Rvü 12b n'est pas administré au sein d':Une période d' mt jour {comme doux, trois ou six jours) d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvO12 5, comme un adenovirus simien non humain: codant pour un a ni: i gène apparenté à RvO125. Par exemple, un adénovirus simien non humain codant pour ttn antigène mycobactérien {tel qu'un adénovirus simien non humain quelconque) en particulier un adénovi rus que.].conque codant pour un antigène my c ob a t ; t é r i e n (tel qu'un adenovirus quelconque). Do façon appropriée, liantlgène polypeptidique apparenté à RvO]21 n'est pas administré au sein d'une période d'un jour (comme deux, trois ou six jours;) d;;'un adidovirus quelconque codant pour un arhigene mycobactérien. Bè: façon appropriée., 11 sdénovirus simien non fouiftiài#. codait pour un antigène apparenté à RvQl'25 est fourni dama une composition qui. est sensiblement dépourvue de ou ne Comprend pas un antigène polypeptidique apparenté â: RvÔllS. Par exemple;, elle est sensiblement dépourvu©: de du ne comprend pas un anfeiqène: mycobactérien. polypeptidique (de telle façon qu’elle est sensiblement1 dépourvue de oh né: comprend aucun autre antigène). Dans certains modes de réalisation,: 1 ’ udéncvirus simien non humain Pédant pour un antigène apparenté à RvölSS est fourni dans une composition qui est sensiblement dépourvue de ou fie comprend pas: un antigène mycobactérien polypeptidique:«
En outré/: de façon approppléé.,: 1 ’ adénovirns s i mien non. 'humain... codant: pour un ant igène apparenté· à ..Rv:0::i25 n'est: pas administré: au sein d’ une përiçdo d'un jour {comme deux, trois ou six jours) d ' un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125. Par exemple, un antigène mycobactérien polypeptidique {Comme tout autre antigène) . Bq façon appropriée,· l'adenovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à :Rv0125 n'est pas administré au sein d’une période i'uh jour (comme deux;, trois ou six jours) d'un antigène mycobactérien polypeptidique,
De façon appropriée, le sujet est un mammifère,: tel qu’un bovin ou un être humain. En particulier, le sujet est un être humain.
Par sensiblement dépourvu de, dans le contexte cl' un adenovirus, il est signifié généralement comprenant moins do 104, oon'ime moins de ΙΟ3, en particulier moins: de 102 oa moins; de 1Q-1 particulés virales du typé pertinent par dose. .tes procèdes appropriés pou r déterminer le nombre des: particules virales comprennent 1‘analyse par PCR quantitative, la CL.HP a naïf tiqué ou des procédés speetrophotomet ri que s basés sur i'ipf.c ,--.¾.
Par sensiblement dépourvu de, dans le contexte d’un antigène poiypepti d i que, il est signifié généralement comprenant moins: de 1 pg, en particulier moins de: :Qy01 pg de l'antigene ou des antigènes pertinents par dose. Les procédés appropriés pour déterminer la quantité d'antigène: peptidique sont connus de l’homme du métier et selon la composition, ils peuvent combiner des procédés de purification pour aider â faciliter un procédé de quantification approprie {comme une CI.HP analytique ou des procédés s p e g t roph o t om é t r i q u es). Généralement, 1fobjectif du procédé de i'invention est d’induire une réponse immunitaire protectrice, c’est-à-dire, d'immuniser ou de vacciner le sujet contre un agent pathogèhé: apparenté, .bar conséquent, i'invention peut être appliquée à la prophylaxie, au traitement ou à; 1! amélioration; d'urie infection par des mycobactéries;, comme une infection par Mycobacterium bovis ou Mycoba c t e ri uni tuberculosds, en particulier Mycoba c t&amp;r.î uia tüberculo&amp;Â&amp;i L'invention: peut être fournie dans l'objectif de r - la prophylaxie d’une tuberculose active due à une infection (c ' ost-à-dire, une tuberculose primaire} ou d'une réactivation (c' es i>· à-dire, une tuberculose secondaire), comme par une administration au süjdt qui est neun infecté, om en variante sa·. sujet qui sou ivre d'une n f cet ion .La t: ente ; - la p.rcphylaxie d'une tuberculose latente, comme par une aetministrat'.ioii à un sujet qui est non infecté ; - le traitement d'une tuberculose latente ; *- la pré vent; ion ou le; retard de la réactivation d'une tuberculose, s pé cia lernest le retard de la réactivation:, par exempte, d ' ime période de plusieurs mois, années ou indéf .i.niment ; ou - le traitement d1 une tuberculose active {comme, pour réduire Je besoin d1 un traitement chimiothérapeutique t comme la réduction du terme d'un traitement ch ,i.m 1 o t'n é r a pu u t i qu e, de la complexité d'un régime médicamenteux ou du dosage du traitement ch imi bt h ira p eut i que ; en variante, pour, réduire le risque d ' Une; rechute ultérieure à ta suite d1 un traitement chimiôtSêrapeutique),
ta réponse immun i taire déclenchée peut être une réponse des lymphocytes T spécifiques de l'antigène {qui peut être une: réponse systémique et./ou local e) . Les réponses systémiques peuvent être détectées, par exemple, à partir d'un échantillon de sang total. Les réponses locales (par exemple, la réponse locale dans; le poumon) peuvent être détectées à partir d'un échantillon de tissu approprié (par exemple, du tissu pulmonaire) ou; un autre procédé d ' échpntili.Qnnaqe concentré localement (par exemple, an lavage bronchoulvéola ire} . La réponse des lymphocyt es T spécifiques de l'antigène peut comprendre une réponse des lymphocytes T CD4 + , comme une réponse impliquant les lymphocytes: T €0.44/ exprimant une pluralité de? cytokines (par exemple,· 1 * II’S--gamma, le ?NF~cdpha ou l'TL-2, spécialement 1! .1 FM-gamma, le TNF-al pha et i ’ 11,-2) . i£n va xi ante, ou en outre, la réponse des 1 ymphocytes T spéelfi.ques de l’antigène comprend une K réponse des lymphocytes T CD8+> comme une réponse impliquant les lymphocytes T CD8+ exprimant une pluralité de cytokines fpar exemple, 1 ' iEN ~ gamma, le TNK-alpha ou 1 ’ IL-2, spéci alement 1 ’ IFN-gamma, le TNF-alpha ci 1'IL-2),
Le terme « infection active- » së rapporte a Une infection, par exemple une infection par M. tuberculosis r avec des symptômes manifestes de la maladie et/ou des lésions,: de façon appropriée avec: des symptômes manifestes de la maladie. les termes « infection inactive », « infection dormant®: » on infectibît latente >> ou <<. tuberculose latente » se rapportent i une; infection./· par exemple une infection par M. [:tufo&amp;£üuiosis sans symptômes mani fastes de la· maladie ët/ου lésions, de façon appropriée sans symptômes manifestes de la maladie. Un sujet souffrant d'une infection latente sera un sujet dont le résultat de test est positif poux une. Ihfëctibh, par exemple par le test cutané à la tube roui.Inc ( TCT ) ou les tests de libération d'interféron gamma (TLIG), mais qui n'a pas démontré .1 es symptômes;: de la maladie et/ou· des lésions qui sont associés a une infection active.
Le terme « tuberculose primaire » se rapporte à: une maladie clinique, par exemple, la inanifeatétion des symptômes de la maladie:, :: directement a la su i t. e de 1' i nfeci ion, par exemple une infection pär M. tübereu 1 oui s. Voir, Harri son's Principlen of
Internai Meeiiciné, cisajj.ltre 150, pp. 953-966 ( .1 borne éd., Br a unv?aid, et a 1., éd., 2 0 05 ) . les: termes « tuberculose secondaire » ou «t tuberculose po s f -ρ r i ma ire » se rapportent à la réactivation d'une infection dormante, inactive ou latente, par exemple une infection par M. taberculoals. Voir, Harrison'S Principies Of: Internal Jîedxcine, chapitre 150 , pp. 953-966 (ISème: éd., Brauhwâld, et al^ f éd., 2005}.
Le terme <t réactivation d'un© tubereulose » se rapporte à* la manifestation ultérieure des symptômes do là: maladie chez un individu dont le résultat de test eéf positif pouf une infection ( par exemple;, par le test cutané à la tuberculine ( TC T} ou les tests de libération d1 i n t o r f é r on gamma (TLTG) ) mais qui ne présente pas de symptômes: apparents de la ma Ici die. De façon appropr iée, l' individu n ' au ra pas été réexposè à une infection. Le test de diagnostic positif indique que l'individu est infecté, toutefois, l'individu peut: avoir présenté ou pas auparavant des symptômes manifestes de la maladie active: qui avait été traitée suffisamment pour conduire la tuberculose dans un état inactif ou latent.
De façon appropriée:, les procédés: sont appliqués à un sujet qui est non. infecté ou qui souffre: dl une infection latente pur dés mycobactéries, comme une infection pdf: MycobadtelÉim by&amp;eyculosis. dans un mode de; réalisation, les procédés sont appliqués: à un sujet qui ne souffre pas d'une infection par Mycobacterium i uhcrculosis {dans le cor.texl o des suie; s irmâàihs} ou: MycohacbebSum bbyis (dans: le contexte des sujets bovins), :Dàns un autre mode de réalisation:, des procédés; sont appliqués à un sujet qui souffre d'une infection latente1 par des mycobactéries,. tellês Mycobacteyàum buberculosis {dans le contexte des sujets humains) ou Mycobacterium bcvxb (dans le contexte dés sujets bovins ) ,
Dans certains modes de réalisation, 1® sujet a été vacciné auparavant par le ;;BCG:. tes approches dé la présente invention peuvent* par exemple, être utilisées pour un sujet au moins un an après la -vaccination pat le BCG, par exemple au moins deux ans après la vaccinâtioh par le BCG comme au moins cinq ans après la vaccination par le BCG.
Dans certains modes de réalisation, le sujet a été infecté: auparavant pari M. tuberculosis.
Antigènes di:: utilisa tien dans l'invention
Les épitopes des lymphocytes T sont dès séquences contiguës courtes: çi·' acides aminés qui sont .reconnues, par les lymphocytes T (par exemple, les lymphocytes T CD4+ du CiSdd) 'L * identification: des épitopes des lymphocytes f peut être obtenue par des expériences idé cartographie des épitopes qui sont connues de l'hommè du métier (voir, par exemple, Paul, Fundamental IromurioXogy, 3ème éd. , 24 3-247 (1993) ; Beißbarth et al. Bioinformatics 2005 21(Suppl. 1) : Î2S-Î37) . Dans une population non consanguine divers i.S.Mée, telle que les êtres humains, las différents types HLA signifient qne des épitopes particuliers peuvent ne pas être reconnus par tous; les membres dé 1 a populatioh. Comme conséquence de l'implication essentie1io de la féqööëe de lÿïiïphoçytes 1 dang: la tuberculose, pour maximiser le taux de résonnai ssande; et 1" échelle de la réponse1 immüuitairë;, un dérivé: Immunogène d'une séquence de référence est dë; façon s cubait aigle un 'dot lié gui contient la majorité (du de façon appropriée la totalité;} des épitopes des; lyirphocyt.es T intacts;. Mortier et η 1. BMC Immunology 201.f> 16: 63 ont entrepris l'analyse de la conservât ion des séquences et dès prédictions in sflico des liaisons antigène-peptide dans des leucocytes humains pour les antigènes va ce i.naux candidats contre la tuberculose Mtb72f et. M7 2. T.î 1 homme du métier comprendra que des substitutions,, des délétions ou des additions individuelles dans une protéine qui modifient, ajoutent ou délètent un seul acide aminé ou un petit pourcentage des acides aminés est un «: dérivé immunogène » où la modification ou les modifications entraînent la substitution d'un acide; aminé par un acide aminé teuct formellement similaire on; la substitution/déiétion/addition de résidus qui niant sensiblement aucun impact sur la fonction immunogène.
Les tableaux de s ubs t i. t u i i on.s konservatives fournissant des; acides aminés 1 on et i or; ne 1.1. eurent similaires sont bien; connus dans· l’art. En général, de teilen; substitutions conservatives se situeront· aù sein de l ' un des regroupements d' acides aminés spécifiés: ci -dessous, bien que dans certaines ci roonstances d'autres substitutions puissent être; possibles sans affecter sensiblement les propriétés: immunogènes de; il.'antigène;. Lee huit groupes suivants contiennent chacun des acides aminés qui sont. q 6 π 6 r a .1. erue n f des s u b s t 1.1 u t1 os ) s conservat J.ve.s à un autre : 1) alanine (A), glycine (G) ; 2} aéidé aspartique ( D) , ac i de glui.amique (E) ; 3} asparagine (N), glutamine (Q) ; 4} arginine (R), lysine (K) ; 5) isoleucine {i} , ieucine (:¾) , méthionine (M) , va line if ) ; 6} Phenylalanine (F) , tyrosine (Y) , tryptophane m. ί 7) sérine (S) , thréonine (T) ; et 8) cystéine (C), méthionine (M) ivoir::, par exemple,: Greigiiton, Proteins 1984) ,
De fiàçôh appropriée, ces substitutions ne surviennent pas dans la région d'un épitope et, par conséquent, n'ont pas un. impact isignljii natif sur les propriétés immunogènes dé i:1 antigène,; tes dérivés immunogènes peuvent également comprendre·· ceux dans. lesquels dés acides aminés supplémentaires: sont insérés comp a r a t i. v eine n t à la séquence de référence, De fagôh appropriée, de telles insertions ne surviennent pas dans la région d'un épitope, et, par conséquent, n'ont pas un impact significatif sur les propriétés immunogènes de 1'antigène. Un exemple d'insertions comprend une séquence cou rte de résidus d ' hist.i dine {par exemple, 2 à 6 résidus) pour aider .1 'expression et/ou la purification de i'antigène en question.
Les dérivés immunogènes comprennent ceux dans lesquels des acides ont été délétés comparativement à las séquence de référence. De façon a pp r ορ ri ée, de t e îles délétion?; no surviennent pas dans la région d’un 6pi tope, et, par oonséqueni., n'ont pas us impact signif icitif sur les propriétés immunogènés de Γantigèno, I) ' homme du mét.i er comprendra qu'un dérivé i mmunogène particuliëf : peut comprendre dos substitutions:,, des délétions et des additions Ion l’une quelconque de leurs comb ina .1 s on s ) ,
Bes termes « identique » ou pourcentage « d'identité: », dans le contexte de deux Séquences polypeptidiques ou plus, se rapportent à deux séquences ou sous-séquences ou plus qui sont les mêmes on qui présentent un pourcentage spécifié do résidus d* acides aminés qui sont; les: mêmes (c’est-â-dire, 70 % d’identité:, é^ent ue 1 lemen t 7 5 %, 80 1, 85 %, 9:0 :l, 95 %, 9S % ou 99: % d'identité sût une région spécifiée), lorsqu'elles sont compapéês et alignées pour une correispondax'ice maximale: auf: une:: fenêtre de comparaison, ou une région: désignée mesurée: en utilisant l’un des algorithmes:: de comparaison de séquénces suivants ou par un alignement: manuel et: Un examen visuel. Cette définition se rapports également au complémentaire d’ûme séquence à tester,: éventuellement, l'identité êtiste, sur une regiem qui: a: :ηη©· longueur d'au moins 2OÖ: acides aminés, comme an moins 300 acides aminés ou au moins 100 acides aminés::, lis façon appropriée, la comparaison est effectuée sur UUf fenêtre correspondant a la longueur entière: de la sêquèrice de référence {par opposition à; la séquence du dérivé) .
Pour la: comparaison: de Séquences, une séquence aqit comme: la séquence de référence, à laquelle les séquences à tester sont: comparées. Lorsque d.'oh ôtliise un. algciithme de compapaieon de: séquences, léa séquencés à tester et de référence sont entrées: dans Un ordinateur, les coordonnées, des sous^qêqnences mont désignée®:, si nécessaire,; et les paramètres du programme de 1 ’ algorithme- dés séquences1 sgiit désignés. Les paramètres par défaut du programme peuvent être utilisés:,: ou des paramétrés1 alternatifs peuvent être désignés::. L'algorithme dé comparai sdh dé séquences calcule:: ensuite les pourcentages d'identité de séquence pour les séquences à tester par rapport à la séquence de référence, en se feasant sur les paramétres: du programme.
Une « fenêtre de comparaison .>>, tel qu'utilisé ici, se rapporte à un segment, dans lequel une séquence peut être comparée à une séquence de référence du même pompre de positions consécutives après que les deax séquences sont alignées de façon optima1e. Les procédés d ' a.1 i qnement de séquences pour une comparaison sont bien connus dans 11 art. L'alignement optimal de séquences pour une comparaison peut être conduit, par exemple, par l'algorithme d'homologie locale de Smith &amp; Waterman, Άάν. Âppl. Math. 2: 482 (.1981} , par l'algorithme d'alignement des homologies de Séèdleman &amp; Wunsch, J. Mol, Biol. 48: 443 ( 1970}, dans la recherche pour le procédé de similarité de hearson &amp; Lipman, Broc, Nat'l, Acad. Sei, BSA 85; 2444 ( 1988), par des mises en œuvre informâtiaees de ces algorithmes {GAF, BESTFIT, PASTA, et TFASTA dans le progiciel de Wi sconsin Genet ic s, Geriet les Computer G roup, 575 Science Dr., Madison, WI) , ou par un alignement manuel et un examen visuel (voir, par oxetr.p 1 e, Carrent Protocol s in
Molecular Biology {Ânsube'l éé cil:,::, éd, supplément de 199b)}.
On exemple d’un ai gorithme utile esi. PILÉUP . PILEÜP crée un alignement de séquences multiples à partir d'un groupe de séquences apparentées en utilisant des alignements progressifs par paires pour montrer la relation et le pourcentage d'identité des séquences. Il trace également un arbre ou dendrograinme montrant les relations des regroupements Utilisés pour Créer l’alignement. PILEUP utilise une s.iinplild.catidn du procédé d ' alignement progressif de Fong &amp; Dooliltie, J. Mol. Evol. 3b: 351 -360 (:19:87). Le procédé utilisé est similaire au procédé décrit par Higgins &amp; Sharp, CÄBlöS 5:i :151-153: 1198:9)::. Le programme peut aligner j usqu ’ à: 3Ö0 séquences, chacune: d' une l ongueur maximale des 5|;ÖÖ: nucléotides ou acides aminés, La procédure dés alignements multiples débute par 1'alignement par paires des deux séquences les plus similaires, produisant un groupe de deux séquences alignées. Ce groupe est ensuite aligné avec la séquence suivant.c la: plus apparentée ou à un groupe de séquences alignées. Deux groupes de séquences sont: alignés par une simple extension de l’alignement par paires de deux séquences individuelles, h'alignement final est obtenu par une série d'alignements progressifs par paires. Le programme est exécuté en désignant des séquences Spécifiques et leurs coordonnées d,:acides: aminés pour dés régions comparaison dé séquences et en désignant les paramétras: du programme.:. Er· uti il sant Pltlutr "Une séquence dé: irlfèrence: est comparée à; d1 autres Séquences à lester pour déterréner la: 'relation· du pourcentage d ' identité; de séquence en utilisant les paramètres su liants : poids· de la prêche par cêiaat ί:{|ΐ Ö'ö) pids de; M longueur de la, brèche par defaut (:0/10), et brèehés termina.’! es pondérées. PILEüP peut être obienu à partir du progiciel d'analyse de séquences de GCG, par exemple, ver. si on 7.0 ( Do ver eaux et a./.. , Nue. Acids Res. 12: 387-395 pâli)).
Un antre exemple d * algorithme qui est approprié pour la détermination: du pourcentage d'idettlté de séquence et de similarité de séquence consiste -èlù les algorithmes BLAST et BLAST 2.0, qui sont décrits dans Alt-schul et ai., Nue. Acids Res. 25: 3319-3402 ( 1977) et Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respeoflvemefit. Le logiciel pour effectuer les analyses BLÄST est diçpohihle au public par l'intermédiaire du National Center: for Biotechnology Information (site: fpp à :W'Ww. ncb:i,;iïî:ift. üih. Cet algorithme implique d'abord l'identification des paires de aêquences de score élevé1 (HSP) en identifiant des roots courts de longueur W:: dans la séquence de requête., qui spit correspondent soit satisfont un corla in score seuil de valeur positive T lorsqu'ils sont alignés avec un mot de la même; longueur dans une séquence de la base de données. T est appelé seuil du score des mots du voisinage lÄIfsphui ep al., ci-dessus) . Cés: correspondances des mots: du voisinage agis sent comme des graines pour initier des recherches afin de trouver des HSP plus longues les contenant. Los correspondances des mots sont étendues dans: les deux directions le long; de chaque: séquencé tant qu’il est possible d’augroenter: is score:: d 'alignement cumulatif. lies scores: cumulatifs sont calcules en utilisant,; geur les séquences nucI.:éotMiqUë:Sr les paramétrés M (score de récompense pour une paire de résidus: correspondants ; toujours > 0} et M (score: de pénalité pour les résidus .ne
correspondant nas ; ton jours < 0} . Pour les séquences déacides aminés, une matrice dé score est utilisée pour calculer le score cumulatif. td extension des correspondances des .mots dans chaque direction est stoppée: lorsque : le score dé 1 'alignement: cumulatif 'baissé? de la quantité X à partir de sa valeur maximale: obtenue: ; le score1 cumulatif atteint rèio où en dessous',: à cause de l'accumulation d'un ou de plusieurs aixffneménts de résidus de score négatif ; du i ' extrémité de l’une pu i' autre séquence est atteint, les paramètres de l’algorithme BLAST W, T, et X déterminent la sensibilité et la rapidité de 1 ' alignement. .Le programme BLATN (pour les séquences nucléotidiques) Utilise comme paramètres par défaut une longueur de mot (W) de 11, um.: espérance (E) de 10, M = 5, M - -··': et une compara i son des deux brin::;. Pour les séquences ri'aci des aminés, le programme BLASTF utilise comme paramètres par défaut une longueur, de mot de 3, et: une espérance (E) de '10, et la matrice de score BLOSUM62 (voir lie ri i.kof f &amp; Heni kofi, Proc. Nr.it 1. Acad. Sel. OSA 89: 10915 (1989)) des alignements (B) de Ml, une espérance {E ) de 10, M : 5, N =r -4, et une comparai son des deux brins ,: I, ' algori i.hme BLAST effectue également une ana i y se statistique: de la similarité entre deux séquences (voir, par exemple, Karl, in k Alt schul, Proc. Nat. ' .1. Acad. Sei. OSA 90;: 5873-578? (1993}}. Üné: mesure de similarité fournie par1 liplporithime BLASf: ©ét la somm des probabilité s la plus basée; ¢9(¾))¾ qui. fournit une: indication dé' la probabilité: selon laquelle une: correspondance entré deux séquences nucléoti d i que s ou d'acides aminés est due au hasard. P a r exemple, un acide nucléique est considéré comme similaire à une séquence; de référence si la somme des probabilités la plus basse dans une comparaison de 1’acide nucléique à tester à i ' acide nucléique: de référence est inférieure I environ 0,2, de laçon durantâge préférée inférieure â environ 0,01, et dé façon; préférée entre toutes inférieures à environ 0,001.
Dans tons: les cas, les dérivés iMtunogènes d’une séqu e ne® pciypépt idi que : ut il i s e sont ;fi ab.it lie I 1ornent essentiellement la mimé activité que; la séquence de référence. Par essentiellement la raêrae activité, il est .signifié an moins 50 de façon appropriée au moins 75 % et spécialement au moins 90 % do i;1 activité de la séquence de référence dans un test de restimulation in vitro de CMSP, de sang total, de tissu pulmonaire ou do lavage b ronchoa 1 véo.i. a i re avec des antigènes spécifiques ({par exemple, une resi imulation pondant une période située entre plusieurs teures a jusqu'à: deux semaines, comme jusqu'à un iour, 1 jour à 1 semaine ou 1 à 2 semaines) qui mesure 1'activation des cellules par .1 yrap h op roi il é r. a t i on, production de cytokines dans le surnageant de culture (mesurées par des tests F:';.]., ISA, CBA, etc.) ou caractérisation des réponses des lymphocytes T et; B par coloration intrn-et exlraccilula i. re (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques de marqueurs iimunitaires, tels: que CK% CD-"'i, CD3, 1 ’ XL--2, le li^F-alpha.·* 1 * IFN-gamma:, 1 ' IL-17, CB4Ö1, CD-69,; etc.) suivie: de l:,drialyse par un oytoraètre en .1. lux. De façon appropriée, par essentie 1. lemen t la même activité, i 1 est signifié au moins 50 %, dé façon appropriée a u moins 7 5 | et. spécialement; au moins 90 %: de l'activité de là séquence dé: référence dans; Un :Èest: dé prol ί U ration: dés lymphocytes f et/ou de. production d ' IfN-garuxiâï
Dans un mode· de réalisation.,·.. l'antigène po 1 ypep t. i d i qu e et l’antigène codé sont des antigènes apparentés à Rvll96, Le terme « antigène apparenté a Rvflt'ï »: se rapporte à la protéine Rvll96 fournie par SEQ ID NO ΐ 1 ou à l'un de ses dérivés immunogènes. Tel qu'utilisé iiei, 1©: terme; « dérivé » se rapporte à un antigène qui. est modifié par rapport à la séquence de référencé.:,;.. Les dérivés immunogènes sont suffisamment.· similaires à la séquence de référence pour .conserver sensihle?neiu. les propriétés immunogènes que la séquence dé référence et demeurer càpaMes de permettre le soulèvement d'une; répons© immunitaire contre ;ia sequcnce de référence. 'Uir dérivé immunogène peut comprèndre, par exemple, une version modifiée de la séquence de référence ou en variante, xi peut. être Constitué d’une; version modifiée de la séquencé:: dé référence. L’antigène appat enté Ryf:196 peut cputenirq par exemple, 2500; résidus d'acides aminés ou moins, comme 1500 résidus d'acides aminés ou moins, on particulier 1200 résidus d’acides amines ou moins, .spécialement ISO O résidus d’aeidès aminés ou moins, généralement 800 résidus d'aeidés aminés ou moins.
De f açon appropriée, 11 ant i gène apparenté à -Rvll'96 coaiprendra, comme sera constitué de, une séquence présentant an moins 70 % d’identité avec 3KQ ID NO : 1, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécialement au moins 99 S, par exemple au mains 98 %, comme au moins 99 %.
Un exemple spécifique d'un antigène apparenté à RV1196 est Rvl.1.9-6 issu de la souche de Mycobacterium taberculosis 'H37Ry, t:é:|: que fourn.1. par 3SQ 1D NO d.
Par conséquent,:: dans; un mode de: .réalisation 'de ‘’invention, X'antigène apparenté à Rvii96 est une protéine: comprenant SEQ I©: 130 : ί.*: Dans un second11 mode de réalisation de 1’invention, l’antigène apparenté à Rv.11.96 est une prôtêiiië constituée de SEQ ID NO ; .1.
Qu autre exemple d’un antigène apparenté a Rvl.1.96 est Rvl 196 issu do la souche de Mycoba a t cri am tuberculesis Fil. Dans un mode de réa iisation do Ί '.invention, 1 'antigène apparenté à Rvl 196 est une protéine comprenant SEQ I ! > 310 : 2. Dans un second mode de réalisation de 1 'invention, l'antigène apparenté; à Rvl 3/9.'6 est une protéine constituée de SEQ: ID NO r 2.
Les antigènes apparentés à Rvi116 types comprendront {comme seront constitués de) un dérivé immunogène de SBQ ID MQ t 1 présentant un petit nomhre de déléti ons, d ’ insertions et/ou de subst J. t ut i crus. Dos exemples sont ceux présentant des délétions do jusqu’à 5 résidus; au niveau.: dé 0 à emplacements::,· des inserf ions de jusqu’à 5- résidus au niveau de 0 à 5 emp 1 a c ente ; i t s èt une substitution dé jnsqu'à 20 résidus, D'autres; dérivés immunogènea de :.Kvli9.S ·οοηΡ· ceux comprenant ;(:eostmé· constitués dé)' uù fragment; de SEQ LD KO : I: qui a :Une longueur d'au me ins :20¾ acides aminés.,: comme:· une longueur: d:I au moins ;2·5'0 acides aminés, en particulier· une longueur d ' au moins 3 0 0 a cides aminés, spécialement une 'longueur· ci ’ ait moins '.ISO: Oeides aminés· t d'IsttreS: dérivés immunogènes' de Rvli§;§ sont ceux comprenant, comme constitués de, un fragment; de :>1Q 111 NO : 2 qui a une longueur d'au moins 200 acides aminésr nommé une longueur d’au moins 250racides aminés, en particulier une longueur d’au .moins 300 acides aminés, spécialement une longueur d'au moins 350 acides aminés*
Los antigènes; apparentés à Rvl 15} 6 peuvent cu.ro préparés par des: procédés décrits auparavant; {na r exemple, Sillon et a 7.. Infection; and Immun i t.y 1999 61(6} : 2941-2950 ; WO 2006/117240) , ceux fournis dans les exemples, ou des procédés qui y sont analogues.
Dans un mode de réalisation:, l’antigène polypept i dique et l'antigène codé sont des antigènes apparentés à Rv0.1.25, Le terme « antigène apparenté à RVÖ125 » se rapporte à la protéine Rv0125 fournie par SEQ ID NO η 3 ou à 1 ' un do ses dérivés i mmunogènes. Tel qu'utilise ici, le terme « dérivé » se rapporte à un antigène qui est modifié par rapport; à 'I a séquence de référence. Les dérivés immunogènes sont suffisamment similaires à la séquence de référence pour conserver sensiblement les propriétés immunogènes que la séquence :ΐΜ référence et demeurer capables de permettre le souièvement: d'une: réponse iiranunitaire contre la séquence de rê'f éiencé.... Un dér ivé immunogène pedt comprendre, par exemple, une version modifiée de la séquence de référencé' ou en variante, il peut être constitué d’une version modifiée: de la séquence de référence. L'antigène apparenté à Ev0:'i25 peut contenir, par exemple, 2500s résidus d'acides aminés ou moins, comme ISQQ. résidus: ά ’ acides aminés oU môlris, en particulier itôé résidus: d'acides aminés ou moins, apécialemènt 1000 résidus: d'iadictes aminés ou moins, généralement tOO résidus d!acides aminés ou moins.
De façon apprbpriéèu l'antigène apparenté à RvOiRS comprendra;, Commè:: sera: constitué de, une séquence présentant, au moins 70 % d’identité avec SEQ ID NO ; i, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécialement au moins §5 par exemple au moins 98 %, comme au moins 9S %.
Un exemple spécifique d'un antigène apparenté a Rv0125 est Rv0125 issu dé la souche de My cobac ter lim iübercu.loeis H37Rv, tel que fourni, par 3EQ ID NO : 3. Rar consequent, dans un mode de 'feealisatlpn de itinvenfion, l'antigène apparenté à EvOlRé est une protéine comprenant 3EQ ID NO : 3. Dans un seconc mode de réalisation de 1 ' invention, 1 ' antigène apparenté à RvO.125 est une protéine consti tuée de SEQ ID NO : 3.
Les antigènes apparentés: a Rv0125 types comprendront (comme seront constitués de): un.; dérivé immunogène: de SEQ: ID KO : 3 présentant un spotit nombre de ciel étions, df insertions: e t: / ou de substitutionsv Des exemples sont çaix présentant: des délétions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à S emplacements, dés insertions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements et: une substitution de jusqu'à 20 résidus, D'autres dérivés immunogènes de Rv0125 sont ceux comprenant {comme constitués de) un fragment de SEQ ID NO : 3 qui a une longueur d'au moins 1.50 acides aminés, comme une longueur d'au moins 200 acides aminés, es;; particulier une: longueur: d'au moins ISO acides aminés, spécialement une longueur d’au moins 300 acides aminés:. Des: dérivé® immunogènes particuliers de RvG12S sont ceux comprenant: {comme constitués de) le fragment de SEQ: ID NO : 3 eorrespondar1t aux résidus 1 à 195 de SEQ! ID NO i: 3,, D'autres dérivés immunogènes de Rv0125 sont ceux complétant: (comme constitués de) le fragment de SEQ ID NO : 3 cor re s pondant aux résidus 192 à 323 de .$èq: ni mo, : 3,
De® antigènes apparentés à Ky012S particulièrement préférés: sont des dérivés: de SEQ ï:D Nû : 3 dans lesquels an moine Ψ un. (par exemple un:, deux, voire même les Croisas de la triade ca ta.lytique a été substitué ou délété, de telle façon que l'activité protéase: a été réduite et 1 a protéine plus facilement produite o le résidu de sérine catalytique peut être délété dû substitué (par: exemple, substitué par l'alanine) èt/ou le résidu d'hisridine catalytique peut être délété ou substitué et/ou le résidu d'acide aspartique catalytique peut être délété ou substitué:. Sont d'un intérêt spécial, les dérivés de SEQ ID NO : 3 dans lesquels le résidu de sérine Catalytique a été substitué (par exemple, substitué par .11 alanine) . Sont également d1 un intérêt:, les antigènes apparentés à Ry0125 qui. comprennent;,: comme sont constitués: de, nne séquence présentant au moins 70 % d'identité étec SEQ ID NO r 3, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécia loment au moins 93 %, per exemple au moins 98 %, comme an moins 99 % et dans lesquels au moins l'un (je la triade catalytique a été substitué ou dé 1 été ou ceux comprenant, comme constitués de, un f ragment de SKQ ID HO : 3 qui a une longueur d ' au moins ISO acides aminés, comme une longueur d'au moins 2ÖÖ acides aminés, en particulier une longueur d'au moins 250 acides aminés, spécialement mie longueur d'au moins 300 acides aminés et dans lesquels au moins l'un de la triado catalytique a été substitué ou délété. D'autrea dérivés; immunogènéé de RuOigé sont ceux comprenant (comme constitués de); lé fragment de SEQ ID Mp : 3; correspondant aux résidus 192 à 32:3 de SEQ ID H G : | dans lequel au mol ns l'un (par exemple, un, deux, yoire même les trois) de .la triade Catalytique a été substitué ou délété. Des déri y es immunogènes particuliers de Rv0125 sont ceux comprenant (comme constitués de5 le fragment de SEQ ID NO : 3 correspondant: aux résidus 1 à 195 de SEQ I.D NÖ : 3 dans lequel lé: résidu de: sérine catalytique {position 17&amp; ;de: SEQ ID NO : 3) a été substitué: (par exertpie,, substitué par i'alanine).
Dans certains modes de réalisation.,· l'antigène polypeptidique et l'antigène codé sont des antigènes apparenté® I Rvi 196 et: RtOtif:, tels que des ant.(.gènes apparentée gu M"7:2. Dés dérifés particuliers: d:e la protéine: M72 comprennent ceux avec des résidus Bis supplémentaires; à l'extrémité -N-terminale Ipar exemples, deux: léeidus H.1.s, comme fournis dans dEQ ΙΘ Ni) i ; du un marqueur polyhistidine de cinq ou ::pârt:idul:iireïftent de six résidus Mis, qui peut être utilisé pour la puil-fi cation; par; affinité au nie tel) , Mtb72f qui confient le féaidü de sérine :d* origine· qui a été mute dans M72, est un autre, dérivé de M72, comme le sont les protéines: Bfh?2f avec des résidas His supplémentaires à 17 extrémité N-terminale (pat exemple,, deux résidus: Mis ; ou un marqueur polyhistl.dine de cinq du particulièrement de six résidus His;, qui peut être Utilisé pour une purification par affinité fp nickel). Néanmoins, l'homme du; métier comprend que dans certains modes de réaIi sation, -deux polypeptides distincts, un étant un antigène apparenté à Rvll96 et un étant un antigène apparenté à EvOlgB, peuvent être fournis au sein d'une composition. Pans de tels cas,:: il faudra comprendre que les exclusions indiquées auparavant: en ce: qui concerne des adénovirus codant pour un antigène apparenté à Rvll96 et des adénovirus codant pour un antigène apparente; à Rv0.1.25 peuvent être tontes les deux appliquées- à la composition mut a ï.is .mnfandis. Dé la même façon, les. exclusions indiquées auparavant en ce qui concerné 1’administration Simultanée d'adénovirus codant pour un antigène apparenté à :Rvll96 et d'adénovirus codant pour un antigène apparenté à EvOlIS peuvent être toutes les deux appliquées: î|îc ta ri s miitaaMs.
De même dans certains modes de Réalisation, un seul adénovirus peut coder pour deux ρ o .1 y pe p 11 d o s distincts, un étant un antigène apparenté â Rv 1.196 et un étant un antigene:- apparenté à EvO.1.25. ©ans de te.ls cas, il faudra comprendre que les exclusions Indiquées auparavant en ce qui concerne un anti gène polypeptidique apparente â Rv 11:96 :et un antigène polypeptidique apparenté à: Rv0125 péuyèui être toutes les deux appliquées à la composition 'MMtMtls Mutaïiâis^ Dé la même façon, les exel usions .i.ndiquées auparavant en, ce qui. concerne liaémir*iàt&amp;àticM. simultanée d’iin aptigènè: polypeptidique: apparenté :à Stil 96 et d'un :aatigèné;: polypeptidique apparenté à Ev0125 peuvent être toutes les deux appliquées mutatis mutandis.
En variante, deux: constructions adénovirales: distindtêïs peuvent être fournies, une codant pour un antigène: apparenté à :Rvll96 et :.u:ne codant pour un antigene apparenté à Rvfllt-. Dans de tels cas, il faudra: coirprendre: que les exclusions indiquées auparavant en ce qui concerne un antigène polypeptidique apparenté à Rvl196 et un ant i gène polypeptidique apparenté à Rv0125 peuvent être toutes les deux appliquées à la composition mutatis mutandis. De la même façon, les exclusions indiquées auparavant en ce qui concerne 1'admin i stration simultanée d'un antigène: polypeptidique apparenté â Rvl 19 6 êt d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv012 5 peuvent être toutes les deux appliquées muta t is muta mi.i s.
De façon appropriée, un antigène apparenté au M72 comprend ra, comme sera constitué do, une séquence présentant au moins 70 % identité avec SEQ ID NO : 6, comme au moins 80 %, en. particulier au moins 90 %,
Spécialement au moins 95 domme; au moins: 90 %;, par exemple au moine: 9S %.
Les antigènes apparentés: au Mi2 types comprendront, comme seront constitués: de, un dérive de: S;IQ ïi;p : 6 comportant un petit: nombre de déiéti ons, d’ insertions ét/du: de substitut ions. Les ëxémpléè sont peux comportant des délations: de j usqu ' à 5 résidu à au niveau de ψ a 5 emplacements, des: insertions de jusqu'à S résidus au niveau de 0 à 5 emplacements et une substitution de j usgu ' à /.U résidus. D’autres dérivés de M7 2 sont ceux comprenant, comité.....consr. · rués de, un fragment de SÏÙQ ID MO : 6 gui a une longueur d’au moins 450 acides aminés, comme une; longueur d'au moins 500 acides ami. né s, comme une longueur d'au moins 550 acides aminés, comme une longueur d’au moins 600 acides aminés, comme une longueur d’au moins 650 acides aminés ou; une longueur dTaU: moins- 700 acides aminés, farde que ;M72 est une protéine' de fusion dérivée de deux antigènes iindiyi duels, tout fragment d'au moins; 450 résidus comprendra une pluralité d'épitopes provenant de la Séquence pleine longueur {Sbeiky et al, J. IniRunol. 2004 i 72: 7618-7628 ; Skeiky Infect, Immun. 19:99 U7 (i;) : 3998--4 00 ; ; Dillon Infect. Immun, 1999 67(6) : 29:41--2950) . "Dans des modes dé réal isaf ion particuliers,: i1 antigène apparenté au M72 comprendra les résidus :2 à 1|3 de SEQ ID ÎÉO :î 6, par exemple comprendra (ou sera constitué: de) StiQ ID: NO ; 6.
Dans im mode 4d 1 ' antigène po.l ypept.1 dique correspond a SÉQ 1D NO : 4 et 1 ' anti.géne code a SEQ ID NO : 6.
Les anti gènes apparenté?? au M72 pensent être prépe rés ρ a r dés' procédé:? dédritô auparavant {VvO 200:®/117:240) ou des procédés qui y sont: analogues:. 1. ' antigène polypeptidique peut être le même que ou Peut être s imitai re à J 'antigène: codé. Dans un mode do réali cation, 1 ' antigène polypeptidique est le Âme que 1'antigène codé.
De façon appropriée, 1.'antigène polypeptidique: est si milai.ro à l ' antigène codé . .ï?a;r: exemple/ 11 antigène codé peut présenter 70 % d'identité/ pomme au moins 80 % d’ident, i ré, de façon appropriée: au .'moins S0 1 d'identité/: en particulier au moins :95:% d ' identité a vec ,l'tant!gèite polypêptidlque. En va ri.ante, I 'antigène codé peut comprendre un fragment d'au moins lüü résidus d'acides aminés, comme au moins 200 résidus d'acides aminés, de façon appropriée au moi.ns 300 résidus d'acides aminés de l ' antigène polypept i d i que. Dans certains cas, l'antigène codé comprend un fragment d'au moins: 4 00 résidus d'acides aminés, en particulier :5:0:0 résidus; d ' acides aminés, comme au moins: 600 et de façon appropriée: Six moins; 700 résidus de l'antigène: ïftÿ c o b a c t ê rien pdiÿ pep tl d i. que * •L ’ antiqènè .'polypeptidique ét l'adenovirus peuvent être fournis; sPus': la formé; de compositions immunogènes qui comprennent :;u:n ou plusieurs autres composants antigèniques,
Les composants antigèniques süppléiitenta .i.ros peuvent être prévus pour renforcer ou c ornp 1 érnen te r les réponses immunitaires sollicitées dans le domaine de ia prévenu ion et du traitement de le tuherculcso ou des antigènes shppiémentMtes pourront êt re associés à d'autres agents pathogènes et sont prévus pour une co administrât ion pour dés raisons de commodité::, idrogu’an certain nombre de composant® antigèniques sont î présents au sein d’une composition, ceux-ci peuvent être fournis sous: la .forme de „polypeptides individuel.s ou de protéines do fusion.:. Dans certains eu s, les composants antigèniques supplémentaires peuvent être fournis:: sous .la forme d’un p o 1 y nu c I é o t i d e (on de pol ynucl éotides ) codant, pour un eu plusieurs polypepti des. Généralement, pour une administration à des êtres humains, les compositions contenue i un antigène polypeptidique apparenté: à Rv.i.l 96 comprendront entre 1: : pg et 1ÖÖ }iq d* antigène apparenté à RvllOG, comme entre 1 \xq et 50 μ g par dose. De façon appropriée,, entre: 1 pg ef 50: pg d tant i gène: apparenté â: Ryil96 ( comme entre 5 μ g et 50 μ gît spécialement entre: 1 μ g et :2:0 μρ: (comme entré:. 5: μ g et 20 pg) et en particulier autour de .ou "exactement 10 ug sont fourni s. Généralement, pour une administration â des êtres humainâ:, des composttions contenant un antigène polypeptidique apparenté a Rv0!25 comprendront entre I μ g et 100 μ g d ' antigène apparenté à Rv0125, ::pomme entre 1 μ g et 50 gg par dose. De façon appropriée, entre 1 μ g et 50 pg d ' an l i.qène apparenté è Rv0125 ( comme entre 5 μ g et 50: μ g}, spécialement entre I μ g et 20 pg (pomme entre 5 pg et 20 pg) et en particulier autour de ou exactement 10 μα : sont fournis. Généralement, pour une administratlgn à des êtres humaias, des compositions r.on tenant. un antigene apparenté au polypeptide M72 c οπτρ r · e n ci ro π t entre 1 μ g et 100 p.p d'antigène apparenté au M72, comme entre 1 pg et 50 pg par dose. De façon appropriée, entre .1. pg et ‘3 0 μ g d1 antigène apparenté a υ M72 {comme entre 5 pg et 50 pg) , spécialement entre 1 μ g et 20 pg (comme entre; b μ g et 20 pg) et en particulier autour de ou exactement 10 pg sont fournis. Généralement, un po1ypept1de d'utilisation dans 1 ' invention ( s i trouvé dans la nature) sera un polypeptide isolé esi-a-dire, séparé de ces composants avec lesquels: il peu t être trouvé
Par exemple, une protéine existant à Idêfat natuzel: est isolée:; si elle est séparée de certains: :p:u de la totalité des matériaux coexistants dans lé Système naturel,: De préférence, de tels polypepfcidès: sont au médité purs ê environ 390 %, de façon davantage préférée au moins purs à environ 95' §: et de: façon préférée·1 entre toutes au moins purs à environ 99 %, Un polynucléotide est considéré comme éfanfe isolé si, par exemple, il est ciguë: dans %m vpçfeur qui ne fait pas partie ;de l'environnement: : naturel.
Adjuvants d'utilisation dans l'invention
Comme il U été décrit ci-dessusta us un aspect de l'Invention, i 'antigène poIypeptidiqUé ast fourni dans Une composition immunogène qui comprend un·: adjuvant. De façon appropfiéé:/ l'adjuvant comprend: un agoniste dés ÏLR et/ou une Ssaponine immunologiquement active.
Dans certains modes d1# réalisation., l'ad juvanfc peut oomprendré: de X ' hydrçxf dé: d'aluminium; ou du pho s pii a t e d ’ a lumini um.
Mnsi, 'dans:: un mode de r&amp;äiisation, 1 ’ adjuvant comprend on agoniste des ÎLE". Lads un autre mode de réaliéatiart, l'adjuvant comprend1 urie saponine irimumoi logiquement active. Damé: endoré: dm autre mode de réalisation:, 1 ^adjuvant comprend an agoniste des ILS et une saponine; lïTOunologiquemsni active. L ' adjuvant peut comprendre un agoniste 'des TLR et· mm. saponine "dans "Une formulation l : posomique. Le rapport de; l'agoniste des ÎLE1 sur .la saponine peut se situer entre 5/1 et l/d' (p/piu de façom appropriée entre 2:/i. est 1/2, généralement autour de 1/1.
Id utilisation d'agoni steg des TLR dans des adjuvants est Pied connue dans liait et a été décrite, par exemple, par Lahiri. et al. (2008) Vaccine 26: 6777. Les TLK qui peuvent être stimulés pour obtenir un effet d’adjuvant comprennent les agonistes des TLE2, T!.R4, TLR5, TLE7, TLR 8 et TLR 9. Les agonistes des T LE 2, TL Ri, TLR7 et: TLR8, par Lieu I .i.è reinen i:. les agonistes du TLR1 sont préférés.
Les agonistes appropriés du TLR4 comprennent des lipopolysaccharides, tels que lé monophosphoryi-iipide Ά (MPL) et le moneph osph o ryi -1 i pi.de Ά 3-0-de sa cy le (3D-MPL) . Le brevet US 4 436 727 divulgue le MPI. et sa fabrlcat i on. Le brevet US 4 912 094 et le certificat de réexaroen Bl 4 912 Q94 divulgue le 3D-MRL et un procédé pour sa i ab rie a Lion. On autre agoniste du. TLR4 est 1 ' adj avant, glucopyranosy i -1 i pi de A. (GLA) , une molécule synthétique de type lipide &amp; (voir, par exemple, Fox et al. (2(1; 2} Clin, Vaccine Immenoi 10 : 1633) . Dans an antre mode- de réalisation,, l'agoniste du ΊΜ,R4 peut être en agoniste synthétique; du 11:.14: comme une: molécule eynthétique de disaccharide, similaire en .structure au MBL et au 3D~ïdRL on oc peut être des; molécules synthétiques de monêsacCCnrides, comme les composés amiuoa Ik.y.i.-g'i ucosaml ri i.de phosphate: (ÂGE) divulgués dans, par exemple, les documents WO 98503.99, WD 0134611, WO 0212258, WO 3065806, WO 04062599, WO 06016997, WO 0612425, WO 03066065, et WO 0190129. Do telles molécules ont été également décrites dans la. littérature scientifique et des brevets comme des mimétiques: du lipide A. Les mimétiques du lipide A partCiéht:: une certaine activité fonctionnelle ct/ou struptutàl.e:: avec le: lipide À, et dans tin aspect, ils sont reconnus par: les récepteurs: TI.R4 . Les AGP tels que décrits ici sont parfois appelés mimétiques; du lipide A dans l'art. Dans un mode de réalisation préféré, 1'agoniste du TIR·) est le ID^MPL, Dès agonistes du 1LR4, tels que le m.onopnó'apnöryl‘-dlipide A â-O-désadylê |:3:D"MP:I.:·).,. ét leur utilisation: en tant qutadguvants dans des vaccins: ont été décrits,: par exemple, dans led documents- WQ 96/33739 et WO:: 2007/068907 et décrits, dans Ai ving et a:!.: (2012/ Gurr ©ρΐη Tmmunol 24: :310. L'adjuvant peut: comprendre «ne saponi ne iMnanologiquoment active, telle qu'une fraction de .Saponirvë immunelogiquemen!.. active, comme Ls QS21.
Des adjuvants comprenant des saponines ont été décrit s dans l 'art , Dos saponin.es ont été décrites dans; : La e a il), e - Dubo .1 s and Wagner:...... .1 9 9 6 ) A revi ew of thé: biologie al and pharmacol oq i cal activité es of saponin :.3. Phy t omed i c i ne v ol 2 : 363, Les s a po n i nes sont connues en tant qu’adjuvants dons des vaccins. Par exompl o, Qu i 1 Δ {dérivé de l ’ écorce de 1 ' arbre d' Amérique du Sud Qui lia ja Saponarlà Mélina) ,· m été décrit par Da 1 sqaard et ai, en 1974 ( "Saponin 3:dj uvantSi'1,;: Archiv. fuxr die· gesamte yirosticrseli:ung:,. 'liol. 44, Springer Ver:ldg> ^étlin.* 243) comme possédant une activité d'adjuvant. il g été isolé par CLHP des fractions pufif léés- de Quil M qui conservent, li'^activité d'adjuvant sans fa: toxicité associée au Qu i. i. A {KeagiX et :a;i. (1991) d.. Immunol, 146: 431. Des .fractions dix
Quil Ä; sont également décrites dans le: brevet US 5: öd?)1 540 et dans ''Saponins as vaccine adjuvants", Kerisil, Q. H., Crit Rev Dier Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55.
Deux de: ces fractions, appropriées pour une utilisation; dans la présente invention, sont QS7 et QS21 (également: connues sous le nom de QA-7 et QA-21.}, QS21 est une fraction de saponinc immu no logiquement active préférée pou r: une ut.i Usât ion dans la présente invention. QS21. a été décrit par Ken si I. (2000) dans 0' Hagan : Vaccine Adjuvants: préparation mer. h ods and research protocole. Homana Press, Totov/a, New Jersey, Chapitre 15. Dés systèmes adjuvants particulaires comprenant, dés fractions du Quil A, comme QS21 et QS7, sont décrits, par exemple, dans les documents WO 96/33739, WO 9:6/11711 et WO 2307/068907.
En plus des autres composants:, l'adjuvant comprend de préférence un sLéroI. La présence d'un stéroi peut réduire en outre la réactogéni cité des compositions comprenant des s a poni.nes, voir, par exemple, le document EP 0 822 8 31, Les .siterol appropriés comprennent: le bêta-sitostepol, le s t i g$f.s· t é rsl* 1 ' e ego s térc.] , ï ’ e r g o c a 1 c i f é r oil et: le choie s'cér o 1. Le cholestérol est particulièrement approprié. Do façon appropriée.,, la frac Ici cri de sspôrtifté i.nmn t π o i oq i qu emon t active est le: QiSSil: et le rapport QSllƒstérol est de 11100' a 1/1 p/p, Pommé: de 1/10 to 1/1 p/p, par exemple de 1/5 à 1/1 p/p.
Dans un: mode de réalisation : préféré- des procédés de 1'invention, l’agoniste du 11M4 est le 3D™ÄPL et la saponine i mm u r i o i o g i q u eme ni. .active: est le QS2Î,
Dans certains modes de réalisation, .! 'adjuvant se présente sous la forme d.':Wne émnlBii.on huile dans l'eau, par exemple:,: comprenant da Sgnalène, de l’alpha-tocqphérol ©t un tensioactlf (voir, par exemple, KO 95/11210) ou siens la formé: d1 an liposome. Une présentation liposomique est prefiri:©,. Lé- terme X- liposome » lorsqu::’il est utilisé ici se rapport© à des structures lipidiques uni- ou iïïiultilame lia ires ( par iè .cernent, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, op; 1.0 lamellaires selon le nombre de mércibranes lipidiques formées); renfermant un Intérieur aqueux* Les liposomes et les formulations llpqsqmlgues sont bien, connus dans l’art. Des présentafipns: Liposomiques sont décrites, par exemple, dans les document c KO 96/33739 ét 10 2007/:068 907. Les lipide:·s qui sont capables do former des: liposomes comprennent.. toutes les substances dotées de propriétés: grapses OU, .de; type .gras. Les lipides :qm peuvent: constituer les lipides dans les liposomes peuvent: être choisis: pans le groupe comprenant des glyeérides, des: gi.;ycê:ropliospholip:idesf des· Irï<s:i3L ;ί·ϊ>·1 r des: 'g:lyÏ3é^:Q:phosphons:l.3;::pi:dgs':,':' des: siiBi^öli.pades, ses :spdxji§dlipides, des :p3sd:s:pd:öiipi'dd.S',' dés IsiöpréföO'ides, des stéroïdes, des stéarines'/ des: stércls, dos arohéö.l ipides, des lipides cati oei qnes de Synthèse et des glucides: contenant des lipides. Dans un mode de réalisation particulier de .1 ' invention, les liposomes comprennent un phospho1 ipide. Les phospholipides appropriés comprennent (mais n'y sont pas limités) : la phosphochoiino (PC) qui est un interméiliaire dans la synthèse de la p h o s p h a t i d y i c h o i i ri e ; des dérivés: phospholipidiques naturels ; 1 a phosphochoi ine de l'œuf, la p h. o s p h o c h o 1. i n e hydrogénée de l'œuf, .la phosphochoiine du soja, la phosphochoiine hydrogénée du soja, la sphingomyéline en tanr que phospholipides naturels ; et des dérivés phospho.lipi digues synthétiques ; la phosphOehoiine ( d i dé c a no y 1 - L - a - phosphatidylcholine [DDPC:],, la diladröylphösphdtidyi“ choline [DLPC], la döfrisf oylpfepsphatid|fiÄoiÄe [DMPCj, la dipalmitoyl-phosphatidylcheline [DPPCj, la distéaroylphosphatidyl-choline [DSPC], la dioiéoyl-phosphatidylcholine ['DPPCjla 1 -palmitovl, 2-oléoylphosphatidylchoiine: [POPC], la diélaldoyl- phosphatidylcholine [DEPC]), le phosphoglycérol; (1:,2-: dimyristoyi --sn~glycéro-3-ph:Osplvo:gif pérol [DMPG] , 1,2- d i p a 1 mi t o y l - s n - g I y c é r o - 3 - p h o s pho g .1. y c é r o .1 | DP PG] , 1,2- d i s t é a ro y 1 - s n - g .1 y cér o - 3 - pho s p ho gi y c é r o 1 f D3PG] , I- paim.i.S.oyl-lh oléoy 1 -sn-glycéro-3-phosphog.i.yoéroI [POPGj ), l'acide phosphatidique (acide 1,2- d.ùny r i s t o y 1 - s n - -gl y cé r o - 3-ph o sphat i.d iqü e [DMPE], acide dipalmitoyi“ phosphatidique [DPPA], acide dàstéaroyi-phosphatl.diqüe [DSPA] ) , la phospbuéthanol am i no ( 1,2 ·· d i my r.i s toy 1 - sn-q 1 y o é r o - 3 - p h o s p h o 6 L i i a i ι o 1 ami n o [DMPÜJ , 1,2-'dipa.l mi toyl- s;n-qly céro-3 •“©hospiioétharyo lamine [ DP PE] , 1,2- d i. s t é a r o y 1 - s n ··· g 1 y e c r o - 3 ·· pho s p h o é t. h a η υ 1 am i n « [DM P S ] , 1,2 - d ί o I é o y 1 - an - g iy c é r c:· - 3 - p h o s pli o é t; p a no 1 ami i i e. [ DOPE ] ) , la pàosphosérine:,. le pol yélhy.f ène q ! ycoi [ P RG ] phosftooliplde. la taille des liposomes va r i c de 30 nm à plusieurs pm selon la egnpogifeiop::: ph o sph o 1 i p i.d.i q ue oL le procédé utilisé pour leur préparation. Dans des modes de réalisation part iculiers de i 1 inventi on, la taille des : loosornes sera située dans la plage de 50 nm à 500 nm et dans d'au très modes de réalisation, de 50 nm â 200 rira. La diffusion dynamique de la lumière au laser est un procédé utilisé pdur mesurer la taillé: des liposomes, bien connu de 1. ' homme du métier.
Dans un modo de réalisation part ίου 1ièrement approprié;, les liposomes utilisés dans 1 ' invention comprennent de la DOPC et un stérol, en part icalier le cliolestérol. Ainsi , dans un mode de réalisa l..i on particulier, les composi t ions de 1' invention comprennenl du QS2.1. dans une quantité quelconque décrit i ci sous la f ormc d ' un liposome, où ledit liposome comprend de la DO PC et un stérol, en particulier 1 e choiestéro1.
De préférence, i'ad]avant comprend du 3D-MEL si du QS21 dans une forma 1 a 1 .ton liposomique, id adjuvant peut comprendre 1 à 100 microgrammes d1 agoni ste du TLR4 par dose. ii1 ad j avant peu t comprendre 1 à 10 0 microgrammes de saponlne îmmrmologiquement aetive: par: dose.
Dans un mode de réalisation pour une utilisa tien chez l'etrë: iiömaiö,: llâdjuvaht comprend en tare .il, 3 it 75 microgrammes dé· 3D~Mï?]i,: et entré:: 12.,5: et 75 microgrammes de QS21 par dose dans une foririulation liposomique.
Dans un autre mode· de réallsatign, 1 '.adjuvant:· comprend entre 12, 5 et 37*.Ig comme entre 20 et 3D microgrammes (par exemple environ ou exactement: :25 microgrammes) de SBcMFL et entre 12, 5 et 37:* 5, comme entre 20 et 30 microgrammes (par: exemple environ ou exactement 25 miditOgiiimmeB) de (3321 dans une formulât!on liposomique par dose. De façon appropriée, la quantité de 3D-MPL' est la même que la quantité dé: QS21.
Le polypeptide ou l'adénovirus se présentera sons une forme pharmaceutiqnement acceptable, appropriée pour la voie d'administration prévue.: Les solutions présenteront une; osmolalité pha rma cent iquement acceptable pour éviter la distorsion ou la lyse des cellules < Une osmoJ allté pharmaceutiquement acceptable signifiera généralement que les sol utions présenteront une osmolalité qui est approximativement isotonique ou 1 égè renie n t h ype r t oni que. De façon appropriée,:: lés: compositions immunogènes de 1 a présente invention présentèrent une osmolalité située dans la plage de 250 à 750 mOsm/kq, par exemple, 11 osmolalité peut se situer dans la plage de 250 à 550 mOsm/kg, comme dans la plage de 280 à 800 mOsrn/Kg. L ’ osmolalité peut être mesurée selon deq techniques connues dans l'art, comme par 1'utilisation d ' un osmomètre disponible dans le commerce, par exemple AdvancedCé Model 2020 dispon.i.bl e chez Advanced inattumentsv tnçç (Etats-0his ); > Un. «s agent df isoton|.G'±M: » e;st un composé qui est physioiogigaemant: toléré: et qui confère sune tonicité: appropriée é une formulation (par exemple, des compositions immundgènes: de 1! investi on) pour :prétehir: le flux nét' .d,':èsu. a travers les: ;ïpmfc>r.iânés qui sont en contact tvet ta- formulation:·. Oh donnait. des compositions adputahtes aqueuses: qu i contiennent 100 îîïM de chlorure de sodium, ou plus, par exemple: le système adjuvant A ÎJ3A) dans les documents :WO 2ÖQ5/112991 et WD 2:008/1421:33 îou·: les adjuvants: liposomiques divulgués dans le document WO 2007/065907.
Dans certains modes de réalisation, 1’agent d’isotonicité utilisé pour la composition est: un sel. Toutefois, dans $1autres modes dé réalisation, la composition comprend un agent d1 i s o t ο n 1 c i t. é non ionique ét la concentration de chlorure de sodium ou la force ionique: dans la composition: est inférieure à 100 mM, comme inférieure à 80 mM, par: exemp.l.e intérieure à 30 mM, comme......: inférieure: à 10 mM ou inferieure à 5 roM.
La composition peut comprendre: «n agent d1isotohieitè npn ionique ::©t la, conductivité: ïde la: composition se si inférieure à 5 mS/cra, comme inférleur© à 4 raS/cra. Sans un mode: de: réalisation préféré·, l'agent d'isotoniclfè non i.onlqué: est: un polyol, comme le sortitoi, La concentration. dp: sorti, toi peut: être,, par exemple:,, située entre environ 3 % et environ 15 % (p/v), comme entre environ 4 f éf: environ 1Q: % (p/vj . Des adjuvants comprenant une fraction de sappnine inuaunol uniquement active et un dg on a été· du Tipt où I ' agent d ’ isotenicifé est un sel ou un polyol: Ont été décrias dans; les: documents WO 2012/98:03¾ et Wö 2012/08::0370 etui soyit incorporés lei en référence.
He pH dés compositions iïïfflmnopêriès devra être approprié pour une adm i.n i si ra L.1 on. Généralement, le pM se situera dans la plage do 6,0 à S,0, comme 7,0 à 9,U, spécialement 7,2 5 à 8,35, comme 3,5 à B, 5, en particulier pM: 7,15 a 8,25. Un pH d * envi ron 8,0 est d’un intérêt particulier.
Pour les compositions liquides administrées par voie parentérale, le volume cte la çompositiiori se situera généralement dans la région de 50 pl à: 2 ml (selon la voi e spécifique ;J , On volume de 400 à 600 μΐ, comme autour de 500; pi est généralement utilisé, en particulier pour une: administration par la voie Ißt r a mu s eu lai. re.
Les Compositions seront gémi râlement stériles. Vecteurs adénoviraux l'adênovirus a :été: largêmént utilisé pour des applications de transfert. de gènes grâce à sa capacité d' obtenir un transfert de gènes hau te· muni; efficace dans divers tissus cibles; et à: sa grande capacité de transgènes. Les; vecteurs adénoviraux d’utilisation dans (1.¾.. présente, invention peuvent:: être dérive s de t ou t; un éventail d'nôtes:: mammifères. Xi a été isolé plus de 100 sérotypes distincts: dtadénovirus qui infectent diverses espèces de maîffiilf ères, les sérotypes adénoviraux ont été classés en six sous-genres (A à F ; © est sops-dlvisé on Bl et 132 5 selon 1 ’ homologie de séquence et selon leur capacité: d'agglutiner les hématies (TaLuis and Ertl Mo l er.ular Therap>y (2:004) 10 : 616-629).
Les exemples d: * adénovà rus d’origine humaine sont: Adl, M2, Ad4, Ad5r Ad6., Ad II, hd21, Ad34 et Ad35. lien que les; vecteurs â; hase;' d'AdS aient été largement utilisés; dans un certain nombre φ·*essais de thérapie génique,: il peut; y avoir dés limitations sur i! utilisation dé l'AdS et d'autres vecteurs· adénoviraux humains du groupe C à cause d'une iitMUnité préexistante dans la population, générale due: ä une affection na tut elle. l'Ädö ét d'autres : membres humains du groupe C tendent à faire partie des sérotype.·: les plus séroprévaients. En outré;,. :!I peut se développer une immunité contre des: secteurs existants bömme conséquence d'une exposition au vecteur durant le ft ai tement:« Ces types d’'immunité préexistante ou développée contre des vecteurs séroprévalents peuvent limiter 1? efficacité d'une thérapie génique ou. des efforts de vaccination. Des sérotypes adénoviraux alternatifs constituent ainsi des cibles très importantes à la poursuite de systèmes d ' a dm :i ni s t r a t i ο n de gènes capables d’échapper à la réponse immunitaire de l'hôte.
Le vecteur adénoviral d'utilisation dans la présente invention est dérivé d'un adenovirus simien non humain. De nombreux adénovirus ont été isolés à partir de simiens non humains tels sqne ..l.e:s; chimpanzés, les bohobos, les macaques Rhésus; et les portlles, et les vecteurs dérivés; de: ces adénovirus indulisent de fortes réponses inenunifaires contre des fransgènes codés par ces vecteurs;: fdollgoa; et a.2:> ( 2 012} Sei. transi. Med. 4: 1 -9 ; Roy et; al. (2004) Vi.rol. 224: 3(·>I — 3 /2 ; Roy et al . 12010} J . of Sene Med. J.s : i /~Z5) .
Certains avantages des vecteurs? à Sas® d ' adenovirus: simien··.* soin in·ce ms comprennent ie manque reiatii;? d! anticorps de neutralisation didisée contre 'cés. adéndivirus ciads la population èiblé, exemple·, une: réaction croisée de certains adéncvirus de chimpanzé, avec des réponses d'anticorps neutralisants? préexistants n'est1 seulement présente que chez 2 % de la population cible comparativement ?à 3S % dans le cas dé; certains vecteurs adénoviraux humains candidats?.
De façon spécifIque?, lé vecteur: adénoviral est dérivé? d ' un adenovirus: simien non humain, en particulier un adenovirus de chimpanzé tel que ChAd3, ChAd63, ChAdêl, ÇhAdlSdy Pan S:,: Pan 6, Pan 7 (également appelé C7} ou Pan. 9. Des exemples: de telles souches sont décrits dans lés documents MO 01/00028.3, m 2Ü05/&amp;21Æ93,: WO 2010/086189 ét m 1510357,5 et sont également :disponib3.es à l‘American Type Culture
Collection, iQSûl Dniversity iBoulévard, Manassas, Virginia 20110-220:9, et d'autres sources. ?En variante, les vecteurs adénoviraux peuvent être dérivés d'adênövirus simiens non humains isolés a partir de bonobos, tels que PanAdl, PanM2 ou? PanAdB. Des exemples de tels vecteurs décrits peuvent: être trouvés par exemple dans; les documents W02005/071093 et 1020:10/08 6189. Des vecteurs adénoviraux peuvent également dériver d' adénovirus isolés de gorilles comme décrit dans les documents 102013/52799, 102Ö13/52B11 et 102013/52832.
Certains vecteurs adénoviraux peuvent démontrer une ou p.tusleurs des eargetéristiques suivantes améliorées par rapport a d'autres vecteurs : une product!vipé supérieure, une: immunogénicité améliorée et une exprespion de transgènes augmentée. .Mhs uh febde de réalisation, le vecteur adénoviral est: un adénovirus simien non humain contenant ait moins un penton choisi parmi SEQ TD( NO : 10 ou SEQ Π3 MO : 20, un h ex on phoisl parmi SEQ ID ::NQ r 11 pu SEQ Tl NO : 21 Pu une fibre choisie parmi SEQ ID NO : 12 ou
SlQr ID NO : 22, en particulier un penton et un hexon, un pehtph; et une libre, ou art hexon et une fibre, comme .un penton, lui hexon et une fibre. Dans certains exemples, le vecteur adénoviral est un adénovirus simien non humain contenant au moins le penton de SEQ II) NO ; 10, l'hexon de SEQ ID NO : 11 ou la fibre de SEQ ID MO > 12, on particulier: un penton et un hexon, un. penton et une .fibre, ou un hexon et une f.ihre. Dans iet' autres exemples, le vecteur adénoviral est un adénovirus simien non humain contenant au moins le penton de SEQ XQ MO ; 20, .1. ' hexon de SEQ ID: NO s: 21 ou la fibre de SÎQ XQ NQ ; l£>, en particulier un penton et i:'un ihexoa, un penton: et une· fibre, ou un hexon et une: fibre:,.
Pané:· un mode: de réalisation, le vecteur adénoviral est dérivé: du OhÂDi: et contient, au moins un penton |SËQ: ID MO ; 1Q:);, un hexon (SEQ ID NO : 1:1} et une: fibre: (SEQ ID MO ; 12): gui; en proviennent, 'Dans Uh mode: de réalisation, le vecteur adénoviral est dérivé du Ch&amp;dlbb et Gbhtieht un penton (SEQ: 1:DI:M0 r 20} , un hexon (SEQ ID NO :: 21 ) et line fibre (SEQ IP NÖ : 22) gui: en proviennent, pans un mode de réalisation, le vecteur adénoviral est un adénovirus simien non humain contenant au moins I©: p en ton de S BQ 1:0 NO : 15, 1 ' ru,non de SEQ :1.:D NO : %$ on la fibre de SEQ 10 NO : 17> en particulier un penton et an hexon, un penton et. une fibre, ou un texon et une libre. Dans certains exemples, le vecteur adénoviral est dérivé du ChAd63 contenant au moins le penton de SEQ I.D NO : 15, .1 ' hexon de SEQ ID NO : 16 et la fibre de SEQ ID NO : 171
Structure des vecteurs adénoviraux
Les adéncvirus ont une morphologie ; caractéristique isvec: une capside: ieosaédr iqu e comprenant trois protéines:: majeures, 11 hexon (11) , le penton ( 1 J. i ) et une f.ihre globulaire (IV) , accompagnées d ' un certain nombre d'autres: protéines: mineures, Vi, vu .1, IX, '.ilia et ÎYa2. L'hexon représente la majorité dos composants structuraux: de la Capside, qui est constituée de 240 capsomères d’hexonsstrimèfes et 12 bases de pontons. L·'hexon comporte trois structures: en tonneau conservées, alors que le haut comporte trois structures en forme de tour, chaque tour contenant une boucle issue de chaque sous-unité qui forme la majeure partie de la capside. La baie de 1 ’ hexon est hautement conservée entre les sérotypes adénoviraux, alors que les boucles à la surface sont variables {Tatsis and Er11 Mol e eu la.r Tlierapy 12001} 10: 616-629:}. Lé: penton est une autre protéine: de la capside adénovirale qui .forme une base pentamère à laquelie la fibre se fixe. La protéine trimere de la: fibre dépasse de la base, du penton au niveau de chacun des 12 sommets de la capside et est. une :sf rupture de: type: bâtonnet globulaire. Le rôle principal de la protéine: fibre est la fixation dé la capside virale à la surface cellulaire par I ! ialeracx. i on de Ia région, globulaire idée un fédepbeftf: cellulaire,, et les variations de la tige flexible aidai que des régions /globulaires cio la fibre août Caractéristiques des différents:· .sérotypes iNicklin éê aL·, Kólecular Therapy 1005 12: 314-393) , le génome adonovi.ra 1 est bien caractérisé. L' ADN double brin; linéaire: est associé: à la protéine VII hautement basique ef: a un petit ;; peptide px (également nommé mu) . One: autre: protéine., tv est eneapsidée avec ce complexé:: M)il~protéine et fournit un lien structural à la capside par iiinh&amp;rmédiaix'e· rie la protéine VI. Il ri existe urié conservation générale dans 11 Organisation globale du génorao adénoviral par rapport à des; cadres de lecture ouverts: spécifiques. posifidnnés de façon similaire/:: par exemple 1f emplacement dès gènes E1&amp;, E1..B, E2Ä, E2B, E3> E4, bl, L2, L3, L4 et 55 de chaque virus. Chaque extrémité: du génome adénoviral comprend une séquence connue comme une répétition termina.! e inversée II TR) , qui est néce s sa i re à la réplication virale, η*extrémité 3’ du génome adénoviral contient les éléments cis en 5' nécessaires; à 11 en caps i da ti on et à la répi i cation ; c* est-à-diré, les séquences ITR en. 1’ (que fonctionnent comme dès origines de réplication) et les domaines: amplificateurs· de 1 ’ endap;|ldation en 5 ’ natifs (qui contiennent des sëquendèè: nécessaires a 1 ’encapsidation des .génomes linéaires des &amp;d: et dés éléments amplificateurs pour le promoteur El), ït' extrémité 3’ du génome adénoviral comprend les éléments cis en 3:r ty compris les ITR); nécessaires à \ ' eticapsidat ion. te virus comprend également une protéase codée par le virus, qui est nécessaire au tEaifefôMent dé :ee:ïr:i: airs es des protéines structurales x«guises pour produire des virions infectieux. La structure du génome adénoviral est décrite sur la base de .1 ' ordre selon lequel les gènes viraux sont exprimés a 1 a suite de la transduction des cellules hôtes. De façon plus spécifique, les gènes: viraux sont qualifiés de gènes précoces: {£) PU tardifs {.&amp;§ Selon si la transcription .Survient, avant ou après, .lé début, de la réplication dé: 1:1ΙΜ. Dans la phase -précoce de la transduction,: les::: gènes E1Ä, ElB, E2&amp;, E2b, E3 ét S4 dos adénovirus sont: exprimés pour préparer ia celluie héfeé % I4 réplication virale. Durant la phase tardive de: l'infedtion, l'expression des gènes: tardifs Ll à L5, qui codent: pour: les composants structuraux; des particules: virales:, est activée, L’annotation dé: lu séquence de type sauvage du Ciind3 (8EQ: ID KO 1 9} est fournie ci-dessous. Séquences codantes ¢38 au tarai} lift 3Ö- SX- Début: : sii Fi o : 1544:
Descripilon de l'emplacement d'origine 1 jouet i on 1589. . Î1S9, 1.243.. H,4 4 ) eis 25, sk: Début.. : sm Hit ; :1:.544:
DéScrIptinîi da 1 ’ Gifiplaàep;en.t: d'origine : j'tihptidb ' p::8 S , 8 91, ' 12 il, ,15 4 4 f SIB 22K Début· t 17:f.6 Fin : .:22.7:1
Description: de 1 ' emplacement d'origine ::
Il 1:6 ....22 7 9 FIS.. S7K' Début: : 202 4 Fin : 3544:
Description de 1 'emp Ia cement df origine |Qgl..3544
IX Début r 3640 Fin : 41.04
Description de l'emplacement: -d’origine : 3640.. 4104 ÏVa2 Début : 4163 Fin ; 5790 (complémentairej Description de 1 'efapiacement d'origine : complémentaire- (4163, ► 5499, 5778-, .5790} pai.
Début : 5269 Fin : 14236 {complémentaire) 'Description de 1 ’emplacement· d'origine ; complémentaire (5269. .886-5, 14228. .14236} pTP
Début : 8664 Fin : 14236 (complémentaire) Description de 1'emplacement d'origine : complément ai re (8664. . 1066.7, 14228, .14236) 4.8-K Début : 11120 Fin : 12379
Description de 1’emplacement d'origine : 11120.. 12379 pilla
Début : 12403 Fin : 14181 Description de 1 * emplacement d'origine : 124 03. ,14.181 I II Début : 14273 Fin : 16054 Fenton
Description de J. ’ emplacement d'origine : 14273. . 1.6054 p VII
Début : .16069 Fin : 16665 Description de 1'emplacement d'origine : 16069-.16665 V Début : 16-738 Fin : 17853
Description de 1 'emplacement: d!-origine :
16738.. 17853 pX Début: : 17 878 Fin : 18123
Description de 1'emplacement d’origine ;
17878.. 18123 pVX Début : 18219 Fin : 18974
Description de 1’emplacement d'origine : 18219.»18974 hexqn Début : 1908S Fin : 21968
Description de l'emplacement d’origine : 19086. .23:968 protéase Début : 21998 Fin t 22627
Description de 1’emplacement d’origine :
21998.. 22627 DBF Début : 22743 Fin : 24395 '(complémentaire} Description de 1 ’ emp la cernent d'origine ; complementaire (227 4 3. . 24395} 92« Début : 24445 Fin : 26940
Description de I'emplacement d'origine : 24445.. 26910 22« Début: ; 26630 Fin : 27229
Description de X'emplacernent d’origine : 26630,-27229
33K
Début : 26630 Fin : 27551 Description de 1’emplacement d'origine : jonction (26630,.26966, 27169.,27551) p VI II Début : 27626 Fin ; 28309
Description de .l'emplacement d'origine :
27626.. 28309 E3 12K Début : 28310 Fin : 28627
Description de 1'emplacement d'origine :
28310.. 28627 E3 CRl-alphapQ Début ; 29125 Fin : 29325
Description de 1 ' emplacement d'origine ;
29125.. 29325 E3 gplSK
Début : 29328 Fin ; 29819 .Description de 1'emplacement d’origine ; 29328. .2981.9 E3 33K Début : 29848 Fin : 30738 .Description de i’emplacement d'origine :
29848.. 30733 E3A 11 K Début : 31293 Fin : 31589
Description de 11 emplacement d'origine : 31293.. 31589 S 3 RID alpha Début.·: 3160.1 Fin: 31873
Description de 1’emplacement d'origine : 31601, .3187 3 E3 RID bât:à
Début : 31876 Fin ; 32274 Description de 1‘emplacement d'origine : 31876'. . 32274 R3 15 K Début : 32267 Fin : 32653
Description de .1 ' emplacement d'origine : 32267.. 32653 exon ü Début : 32 684 Fin ·: 32.84-8 (complémentaire) Description de 1'emplacement d’origine : complémentaire (32684,,32848) fibre Début : 32859 Fin : 34490
Description -de l'emplacement d’origine : 32859.. 34490 ORF6/7 de F4 Début : 34698 Fin : 35858 {complémentaire} Description de l'emplacement d/origine ; complémentaire (34698..34973, 35685..35858) ORF 6 de E4 Début: : 34 974 Fin : 35858 {complémentaire) Description de l'emplacement d'origine : gomplémentaire (34974..35858) ÖRF4 de £4 Début: : 35758 Fin : 36123 ( complément: a i re) Description de 1 '.emplacement d’origine : complémentaire (35758..36123) ÖRF3 de E4 Début : 36139 Fin : 3-6486 {complimentai re )
Description de 1-*emplacement d'origine : complément a i re {3 6139..3648 6) 0RF2 de E4 Début ; 36483 Fin : 36875 (complémentaire) Description de 1'emplacement d'origine ; coffipiémentaire (36483..36875) 0RF1 dé Si Début : 36928 Fin J 3'?314 (complémentaire) Description de .1 * emplacement d'origine ; complémentaire (36928,. 3 ?314) diverses caractéristiques (3 au total)
ARN VA I Début : 10693 Fin ; 10860
Description de 1'emplacement d'origine :
10693.. 10860 VA II Début : 10927 Fin : 11102
Description de l'emplacement d'origine- : 10927.. 11102 délétion de H3 - 5’ Début : 28642 Fin î 28647
Description de .1Templacement d’origine ; 28642.. 28647 L'annotation do ïla séquence de type aauvape dû; ChAd63: (SEÇ? 1D tlO : 14) est fournie ci-dessous, EQQ0S ChÂ.d63 - ADÎf iinMire de 35994 pfo - 27 juillet DEFIIjitlÖS: .Adénovi rus de; phimpanaé 63, génome iootoplöt COMMt^XSlRl: ..Annotation, sAldn '.alignement: da ChAtï63 üöatre la touche de rétëreöce do -1 ' adénoviçus· >'4. duaain NC __ 0032 66 GASÂdTERlSÏIQOES Emplacement/Qualificateurs spufe-ë' 1.., 35994 /organisme ·-»· « Adênovirus de chimpanzé 63 » /type de molécule — « ADN génomrque » /aexOiiyïne = « ChAd€>3 » région de I,.129 répétitions. /nom standard - « ÏTR » /type -do répétition “ iîwersêé gène 479,,:,1301 /gêne ·---· « A » s é que n c e 479, .484¾ régulatrice /classe des sëgueùceù fégulaffigés « ho'î 1&amp;I&amp;: » /gine - <4 E1Ä, A· séquence codsh'fé .jönöfioti /53 6,11:43, lil/j igéte: — «: h IA p /produit ™ << proté : ne de 'Contrôle E1Ä. :» /traduction ~ « MKBLRDLPGEVH1ATGNKÏLELVVDAMMGDDPPEPPTPFKAPSIADI; YD{.EVDVPENDPNEEAVNDLFSDAALLAAHiQANTDSGSDSDSSîi.a!TPftP GHGEirKXPElKGSELDLRCYE}j;cn,PPSDDH;E)jEEAiVjmM.SEÖyiv3iAÖE Sfc'SLDCFTLPGHGCKSCBHlïRMNTGDKNV64CALCYl»CVf.St¥§P VDH:TPÏSECISSPPeiGEEPPEDnHRPVAVRVTG8.RA|i»ii:DÓtljÖi3' GDEPLÖECfSKRPRH » introô 114 4..1228: /gène =··-= « Ë1Æ » séquence 14:95..1.501 régulatrice /d'idese des séquences régulatrices “ « séqueneé signai polyA » /gène - « ElA » g|n:ë 155B,. 3:953.: /gène « ElB » séqsëFicô 16-55. ..:.60¾ xègüiatriets /classe des séqiieiices rêguiatrictes « boite \‘ATA » /gène ······· « S1B: » séquence codante 1601. ./.1 ?5 /gène = « E l B » /codon de départ « 1. /produit - « protéine rie contrôle El® 19K » /traduction; ==-
MEIWÎVT.snFHQTà^ËïlÉ8S-SSEVSY-£iji;FMX3GBIiÂiiÔV:Yi<A'KQl)ÿKS: QFEDiLRSOPGIFDSÄfSfiQSMFNQSÄMBOFSTPSRg’iAAyAFFÄF 1 ïiDKWS Q E T H S· SSllf AI S SYL PVÇtP VDï BR IÉ8LÖSPQE'HQRRQQ^E^IrÄBDRKENLRÄf^öfßVÄEEBE » s é qo ·:: u c e : : o d a r; t e :190:6.. 3410 /cène = « ElB » /cocïdn dë: :départ: « 1 /produit' ~· « protéine de çcSitpdlë:' ËiB 5:§K » /traduction « « MESRî^PFOCÏGLPSGLLSSSEVgNMEVPAPECMLRLLASTAGFHÂEDP ESPVTPGTPTPPAäääGÄAARGGGGPRREPESRSGPSGGGGGGVäBLFP ELRRVLTRSSSGRERGrKRERHEBTSHRTELTVSI.MSRRRÎ’SSVWWHEV QSQGIOEVSVMHEKYSIjKQVKÏCWLEPEDDWEVAïRMYAKIiALKPDKKY KITKLIWIRNSCYISGNGâBVEXSTQEKAAB'RCCMMNKÏPGWGMEGVT K'MNTRFRGBGYEGVVFMANTKLTV.KGCSFE'GFNNHCiEÂWGSVSVRCGS FSAtWMGVVGRTKSVVSVKKCLFERCHljGVMSROEAKVKHCASTETGCF VLIKGNAKVKHNMICGAS DSRGYQML.TCAGGMSHMLÄTVHVÄSRRRKTl PEFEHtP'/ldTRCNVHLGSRRGt'lFMPYQCHMQFVKVLLEPDAMSRVSLTGV FDPiNVELWKi LRYDESKTRCRACECGGKHAiRLQPVCVEVTEDLRP'bHLŸi LG CNGT EFGS SGKE S 5> » gene 34 04 . . 3953 /gene - <·: TX » séquence 3454,, 3459 régulatrice /classe des séquences régulatrices - « boîte TÂTA ». /gène - « IX » séquence codante 3505., 3333 /gène - « IX » ./prochji t = « protéine de la capside ΣΧ. » /traduction =
MS.G.SAS.FEGGVFSPYL'PGRLPSViAGVRUNVMGSTVOGRPVQPANSSTLT
YATLSSSSVDAAAAAAAASAASAVRGMALGAGYYSSl.iVANSSSTNWPAS
LNEEKI.LLLMAQLHÄLTQRLGELTQQVAÖI^MirRi^VA.TVKTK s é que nee 3925.,3334 régulatrice /classe des séquences régulatrices - « séquence signal polyA » /note - « ElB, IX » séquence 3344.,3943 régulatrice /classe des séquences régulatrices ·= « séquence signal polyA » /note ------ « ΞΙ B, IX » séq uence 3948..3953 réguiut ri Ce' /classe des séquences régulatrices -= « séquence signal polyA » /note «: E1B, IX » gène complémentaire (399-2 . ,26364) /gène ~ « E2B » gène complémentaire i3992,,5735) /gène ------ « !Va2 » séquence complémentaire (3992,,3997) régulatrice /classe des séquences régulatrices “ « séquence signal polyA » /note ;== « IVa2, E2B » séquence codante complémentaire {jonction (3993..3326, 5$05,.5617}) /.gène ~ « XVa2 » /produit = « protéine d'encapsidation IVa2 » /traduction -
« METRGRRPG&amp;VLDOPDEPEAHPRKRPARRAPLÔRDGDHAr'ADPATLE GP 0 PGÏAGR P S PGALLPQS PQPÄKRGGI.1: DRDÄ LE R ï T KL/îDRLE LLQQ T LS LM P MA DG L PCPLKM FAS LQEL1S LOGE RL LAE L VRENM H VREMMNE V APLLSEDGSCLSLNYHLQPVIGVIYGPTGCGKSQLLRNLLSÂQLISPAP ETVFFIAPQVDMrPPSELKAWEMQrCEGNYA.PGJFiGTFVPQSGTLRPKF TKMAYDELTQDHNYDVSDPRNVFAOAAARGPTAITMDECMÈiMLGGHfOSV SK.FFHÄFPSKLRDKFPKCTGYTVLVVLHNMNPRRDLGGKIÄNLKIÖAKM HLISPRMR PSQLNRFVNTYTKGLPVÄISLLLKDIVQHHALRPCYDWVÎY NTTPFHEALQSîS YLHPRDGliMPMYLNlOAHLYRV'LKKIHRVL.NDRDRWS RÄYRARKIK » séquenaë codante oocaplénsen i:ai re ( fonction ( 5096. . 8 659, 138¾. .1:3849) ): /gène ~ « R2B ®; /sóméfeö EC 2..3 ,7 . 7 .» /produit --· « SÛR polyrtièrasa /'fer a dacfe i on “ « : töf SGS RGI.H PEÄ8 D PGRÖfe'SipRSRQSEfeGÄVPEfelRÄRRRB/i. fAft&amp;Aa;GP'RiV\]:jAASI<ftSSPPLLSMEPPPPKKKRGTWM->Q'GR^,ïiiï0AV:· pVSTlKfeWElKyHLDLPPdiLEKKfeQ^RÄPefePTDltlPQRLRT^SSGL ;:ΕΑΕνΕΑ1,ΕΡνΡ.ΑΕνΚΙ3Ι^ί1Τ,ν3^^ ..IjHß^LKFLVKGTQVQLVQpyfl PYORŒHCGRLïKH.||BÉCS ARRKB FY'FH jmSHSSNWWQEXQFFEpGSaP'RÏERI.rLÏÏDVSTY-TWMGSrGKQLVPr
::MLyMKL·SGDePL·VSLÄÉD8Ä)::ûï,KWDRWίIGnPRTEfeC¾:PEKKiÄÿ;SQÛF Κΰ:3Κϋ8Ε0ΙΑΕ®\?0ϊ1»ϊ3ΕΙ)3ΑΝΡ.Η\&amp;βΜΕΕαΗΰΕ0ΕΡΆΕ1,!ΓΪ0Ε1ΚΚ ltPHyMRPRF¥ELYiyGHNINSFDEI¥ï!MQyiNNRM:^EQ;PE’E3::TREE'; MPRÄGKiM'HDVTFm,RNPBYKKRfePF^ RDfeF&amp;EjHfeSliSRÄAQÄ.iÄL?VEK£/CXÄYK3iVROFYMyGSyRftpC5DGj?R $!sE'Ef^HDfiEifMÄ:SÄQKGÜX^DIIW|.DYCÄ®mW^LVM: LQÎ3S YÄHPI RDS VGL PBM E'Kf IEQ RPtlS'S NS.HÄXERSXV YR&amp;KKRQRS Hlïeï’eLÎ^PSflSLYDWM'SISGGReYPTXÏGVi^EEÎ.YVŸDICqÇiÿÂS ΑΕΐΕΒΚΡνί^'ΡΡΕδΡΥΕβΆΙ,ΑνΚΟνΫΟΑβΕΟΡΡ^ϊαίΕΥΚΟΡΕΕΕΡδϊΕΤν Dftp®8pELMLDPLRPi!GSRKGGRI»pWEMEPERGEVATSVDI,ITLHSRGW RVRT VPDaLïfeV FPBWKG^EYVÖIÄÄÄKKßADKii KNQTMRS T fi KLL SRALYGSEATKLDtIEKïyFSDQMDEGLMKGVSNGTVRTKaLKPLRTDHL SAFVMPAi7ERSYLfe'QCiIjÄLLDSDPERSfr;DEQGPAPi.:^Trfel&amp;GT)?GHVÄY TYKP Ί TrLDV;)EGDMCLRTLElVni?L-VDNDRYPSHVASPv’Li'\Wfel<AFVS &amp;WAGΑg..Y0EDilGTl:d.,.RDRPIKÏÏVYGDTDSL.I;‘VTQRGHELME‘i‘RGKKRTK KHGGS1G^FDPDRPDIA,W,LVECETVCäSCGÄDäYÄP:EvSVFLAPKT.,Y?\I,KS 3G/:PVCGMæSK|îSÎ!^pHÂAEAI^YELMLBlCYLatmQGADLERFSTSR Μ8ΕΚ8ϊΕΑ8Α0Ρ:3ΑΙ:ΡΕΤν:Τ:ΕΤΤ1#:ΕΤΕ:8ρ.ΜΚΒΚΤΐ.Α0ΕΕΑΠΚΕνΕ·Υ&amp;Κ SRPHPRNEEVCWIEMP: » xntrpn Ggmjitî.:ëraentaxî:ë ¢8327.,5804) /gène =· « IVa.·? » gène: 5K7 , . 33S94 /gène - « K> » gene 5917..27469 /i.v: ···· « 1*4: » géne 5917,,21839 /gène ®; « L3 » gène 5917,,17466 /gène « L2 » ge ne 5917 .. . 13 8 2 7 /gène « Ll. » séquence 5917..5922 régulatrice /classe des séquences régulatrices - « boîte TATA » /note = « L »
Intron 598 9..700 9 /note - « entré les séquences de tête de Ll et L.2 » intron 7082..9518 /note - « entre les séquences de tête de L2 et L3 » intron 7082..7850 /note - « entre les séquences de tête de L2' et i ; précède la séquence codante de la protéine 13,6 K » séquence codante jonction (7877..8275, .9519..9539} /gène ~ « Ll » /codon de départ “ 1 /produit - « protéine 13,6 K » /traduction ~ « ΜΚΑΙΐαΕΕΪΧη.5ΡΡν!36ΜΑνονΜΕνΕΜΡΤΑΗΡΛΙ.νΐ,νΠ0Α8Αν3:!ΑΤΪ1 HGHHVLHELYLGSFDEEFQWAVERSmLHLVLYYVL,AXGVAT:VOLDGGHA DE PAREAG P D LGS DGS S S H! DEGÄQÄGAVQG PET LRSQG L HART » séquence codante -complémentaire (jonction (845$ .. 10392, 13841,,13849) /gène — « Ë2B » /produit - « précurseur de la protéine terminale p T P » /traduction ------
« MALSIHDCARLTGQTA&amp;TMNYFLPLRNI WNP.VREFPRA5TTÄAGITW MSRYTYGYBRLMLEDIAPGAPATERWPLYRQPPPHFLVGYQYLVRTCMD YIH'DTRÄYSRLKYHSLVRPGHQTVNWSVMÄMCSYi'INTGÄYHRFVDFDD FOTTiTQTQQAIlAERVVArjLALVQPOPGPöljTRMHGRÄGEESVPVERI, MQDYYKDLARCQORAWGMADRIRIQQAGPKOLVLLATÏRRLRTAYFNFI TS3IARPPPDQIPEEQETGLSLPGDCDVaEÄPVCT?FSDPVDLETLRSLR GVPTGOLIRCIVSÄLSL PNGDPPGGHLEMRGGVPT LRPREDGRÄVTETM RRRRGETTERF.rDSLPVRRRRRRÂPPPPFFPEEEVEEMLVEEEEEEMEE EPPGAFEREVimTIAELIRLLEEßLTVSARNSQFFlSIFAVDPYEAMERLe ÄLGDVSEMPLRRWIMYEFVTEHXÄTTLNYLYQRIiCWYÄVPTRHVBLNlA QVVMRARDPDGAWYSRVWNBÄGMNÄFSQLMGRXSN01AATVERÄGRGD· LQEEE1EQ FMT EIÄYQDMSGDVQEï LRQAAVNDTB1DSVELSERFKLTC PVAFTORRQIQDVNRRV VÄHÄS LLRAQYQNL PARGAD VP1P î? L PPG PEP PLP PGARPRRRF intron complémentaire (8660,,26296) /gène ~ « E2R » intron 9606,.32253 /gène - « LS » /note « précède la séquence codante de la fibre » intron 9606.,26463 /gène - « L4 » /note - « précède .la séquence codante du précurseur de la protéine de la capside -pVIII » intron 96Ö6.,25554 /gène = « L4 » /note ----- « précède les séquences codantes de la protéine 33 K. et de la protéine d*encapsidation 22 K » intron 9606,.23430 /gène --- « 14 » /note ·~ « précède la' séquence codante de la protéine d'assemblage de 1 'hexo.n 100 K » intron .9606 , , 2117 7 /gène- - « 13 » /note - <« précède la .séquence codante de la protéase » intron 9606..18296 /gène - « 13 ;.»· /note ----- « précède la séquence codante de I ' hex-απ » intron. 9606..17508 /gène ~ « L3 » /note = .« précède la séquence codante du précurseur de la protéine de la capside pVI » intron 9606..17201 /gène ----- « L2 » /note; - « précède la séquence codante du précurseur de. la protéine nucléoeapsidique p-X » intron 9606. .154 98: /gène = « 12 » /note - « précède la - séquence codante du précurseur de la protéine nucléoeapsidique pVIï » i n t r ο n 9 6 0 6..13 887 /gène ~ « 12 » /note -· « précède la séquence codante de la base du. persten » intron 96Ö6. . 120-13 /gène ~- « L1 » /note - « précède la séquence codante du précurseur dé la protéine de. la capside pilla » intron 9606..10844 /gêne - * U >.· /note ·- « précède la séquence codante de la protéine d' encapsidatiors 52 K » infcroa complémentaire (S 0393,,2ή296) /gène = « Ψ,'/.V, » gène 1D4 2 6. . :TQ58ê:; /gêne « VAX » ARN dilièrent 10426. .:10585 / gène « VA Y » ./ pi: ociui L - «·; ÂRjf As;sQc:ië: Au: ViteMS ï » gêne 10548. .lOBI« /gène = VAïl » ARN: dif: lié rente 10'6 4 8 .. 10:81:0 /gène == ;«: VAll » /prod'-ii.!: « ARN associé an virus II s séquence codante 10841.,..12020 /gène — « ni » /produi t =» « protéine d ' encapsidei ion 52 R » /tra-:!uct :i on ·-·-·-
« MHPVidigMUi'HRVi'ORPLRQQOQQRATU.PPPQOCYQh’ArTAAAAVSG (l/OY'TlTVtrYtKCltCil.i/VRIVlÄSSPERHPRVQtJKRiJÄRItAYVPKQNLFRDRS ü EE PE EMBAS RF‘EAG B ELÄRGL D fïlRV ÜRiDS QFEADElï'G ï S PÂRAiIVA: ΑΑΝ1,νΤΆΪΕ:ΘΤνΚΕ.Ε:0'Ν:Ρ§Κδ:1;’ΚΗ:Ην.ΚΤΐ'1ΑΗ'ϊίΕνΤ1.01ΜΕ1Μί)Χ'.1®Α1 V QN PT S K PlTAQli FlVVQSSR DNE'If SEALLN I IE B ÉGRW1LDL VN IRQ 3:ΐν¥0Ε:η0ΪίΡ1^ΕΚ1ΑΑΙΒΕβνΐΛ8:ΐ<(1Ε¥ΥΑΚΚίΧΚΐΚ'Χν:ΕΙ©ΚΕΛίΚΪ;β(3' Ε^3ΜΤ^Κί/:ί:1ίΕ3ΟΡΐί0νΥΙ^:Ρ:3^Ηϊ^ν$Α5^8^^3.ρ0Εΐ>ΜΚΕ1Θ1ϊΑ1ί. fSAGÏEGEaiRDMGADRRlSQPSRMI-EAMiéVPYVEBVDDEriEESEYEl L> » 'sêqqep^Sit codant® :12:044 . .13:8:10 /gen©. ~ « fei. » /produit: -ό *: précaxisëür de la protéine dé la •capside pilla » /1 r a du (31 ion - «: •MÇK^PPPPPPDPAMSAALQSQ.pSGTNSSDDWTOAMQRXÎÔàif^^el ;^pQQPQBNRLSAILm;VVPSRSNFI.,.HEKVl«AlVNALVENfö|I»«3ßEA<| :ÈVyNALLEWARXSSTNVQTf£ï>I04VTfJVIO!:AVSQRERFHKKSNÎ.1GSMy'· •M,NM'LSÏQM»VPRGQEDÎf8S^Mi^GipaEVPQSEVYÔSG£>DYFFQ': T.SRÖ^Qf^SQÄFKNl:QGlWGVOAl,VGimTVS'SI:I.TPNSRT.ET,TJLV': »PFlMiSSSElGSlLGYLLNtYREAÏGÿÂHTOEQTYQEITiIVSR^LGQE DTt/Hi.Ei’VTiiNFLLÏ KP.Ö Ç)Ki P PQ ï Al S ï fi EF RI LR Y V QQF, V-'T? , FT..MQ ['.0 AÏÊS AÂÎjDM3:âRMMEP fl MY ARRR P F TNKliMDYIiiïôVVUdNdLd'h'TNAXL N PiM. ? PF® FYÎ GEYDÖëtpN DG FLWÖÖfÜ S S V FSPRP ΤΐίΜΜΚ DRRP88ALSGRAGi\AAAVPaAASPFRS'.r'F8T.K3VRS8FLGR1,TRi-RLL : GËSE Y LEDS LLÏfPËRËKN FP HNÇ1 ES lOTKMS RWKT ŸAH EHRDëPÉ&amp;S S ÀGTERR!3RH0RQEÔLWDDEDSAODSS«:LDLGG06GGt3PFÂftï4|fmï.$R LM » séquence 13822:. ,1382 7 :iégula triee /classé des ségueiices régulatrice^ ^ ssqùeôçé signai ipolyA » /gene; ·*· ··< i.-.l. » /séquence codante 138o'9. ,15511. /gène ·-·-· « L2 » ./prbdiiit ---- « base du pentobi >> /trbduçtio'n. “
<<: iMMRaVYPEGPPPSïESVMQQÂVÂAipQfPLEAPYyplSRpjfPifÉGRN :;S:i:RïSS:LÂP;.dDTTa:idLVDNKSÂDlMi,SÏQNDHSNÉIjïï^V:C|MfÎ:DFT f’M&amp;S T# :I NH'DERS RWGGQL KT I MM TNMi^WNEFMYGSKEfö'R^MfS R ';ΚίΡΜ6νΤ^ΟΟΥΕ65ΏΟΕΕ.ΤΥΕΜνΕΡΕΪ:ΡΕβΚΕ3νΤΜΤΪ.:0ίίΜ^»Ι::;έΕΝ tïÂGf^VÏ^S0l6ÂiJ^FRÂD^fcÊVMPGVXÂÂiiî :V£k;PGßiiÄETESÄplM /Ë&amp;YÈ ë SEE'EAEÄSÄfSä^MÄÄ'i V&amp;DÀT VTRG]5?FB^TQÄEEäS:SLM:T.P' :BSES ΚΪΚΚΡΥΈ KÜSENÎ^ ΐΥΕ:Ι/1ίΐΕ0ΧΐΤΰ0:ΥΒ'0^Υ«5:ΕΡΡΜΜ00ίνΤΕ&amp;3Τ'Ε0^8ΗΥΡννθΑΕΕΐ.;Ρ:?'' :Υ8«:δΓ^Ε©Α?Υ8:ζ|0ΕΜ:ΕΦ§:6ΦΗΥΕ^ΕΡΡΕΝ0Ι1,νΗΓΦΑΡΤ1ΥΤ«8:1Μ ^PBEGiDiHGïXiPEB'SiPPIRCd/QRVÎ^’lYiARÎÎÙSTCiPYVYKÂLGWPiPR^ÎiSS .Rff: »
Ipt PPA çôiïipl éimeöt aire {1 i 013, , 2 62 9 6 ) /gêne; « E23 » /note — : » précède les séquences codantes de l'ADPf pcsiÿiiiêrâse et du précurseur de la protéine terminale pTP » séquence codante iSSlS..18099 /qèno = « L2 » /ρ>·οπιπ t: — « précurseur do la protéine nue.l.éocupsl d.i que pv i ! » /traduction --··- .·< MSitlSéSNN^GWGtRAPSKMYGGÂRQRSTQpPVRVRSaEÉÀP^ô/Ôït KGRVRSRTT VDDVÏDQi/vADÂBSYf RAÂAPASÎVDAV I DSVVftDÂRRYA P.AKS RRRP.Ï AR RP RS? RMSÄ'ÄL XÄRRTGRiS^ILfööiRPimS GS S SAGRTRRRAATAAÄÄÄiBSMS'RPRRGNrYWVRDÄÄiGifRRPVRYRPRRT' '» séquence codante: IRtié. . 17101 /gêæ · « LS » /produit -= « prol; éi ne nudlêocapO.dicpie V >> /traduction ==
« MS KRK ÏKK EML'QaÎIAPë ÏYGS&amp;AaVKH^RKPRKIiKRVKKDKKB®S©i3 GLVEF'VREPäPRRRVQWRSRKVRPVERPGTTVVK’TPGERSGSäSKRSYS «¥YG[)SD:t|iEQ^ERLGi»FÄYSlRSRPftPi.KgEAVHi Pt PHÜRPTPSLR :pVTL^m?!^iRRGFKR-EGGBI)LYPTMQ i .MVPKRQK IVKIW l.diiMKVÖ P ·’.VQ -·!·:.>/' KVK !:= IKQ VA F G i..GVQT V D i KI i 'TE PKETvT KI ’ V K Pi.:· T STMÏ, V
1IPTPSYRGTRHTR GYi!SSSSiÄ^ä‘ESRRRSRRSSÄSiaVRRVYRSGREP3:,TLPRÄRYHP SI Al » séquence codante 17204, ,0:¾¾ /qê.no = « 1,2 » /produit; = « précurseur de la protéine nucléocapéldique pX » /t:.vY»duotî on === « MAi,TCRi,RVp;i TGYRÜRKPRRKRnTGNGtRïUliiaRRRHAISKRLGGG EXFAORIï&amp;AAIGAX^^ » séquence l/Or., ··' 4 o 6 négu'· atrxóo /cias:&amp;e ém séquences réguiatriGSS - « séquence: signal ·ρο:ί:^. ./gène η «: E2: » séquence codant·®: 175Sä . , 1823 7 ./gène: == « :1,3: » /produit. - « précurseur de la prêtétne de la caps i et·::· ρ\ί/. /
Jt/adUcti.op: ===:
« MEDiMP'SSldlPRHGlRFRMGTWSt/GiSSÏ^GGAENWSSitWfGLKRF GSTLKTYGNKAWNSST|ÓSJ/^Ö,KBQ>ÏFOC!K^VOGbASGINGVV:ï5£«iW3 ΟΑνΟΚαΐΒβΕΙ,ΙΙΑνΡίΙ&amp;βΕνΕΜ^νΕΕΕΙΡΡΙΡΚΚΘίΙΚΚΡΚΡΡΑΕΕΐϊ,Ε ΤΗΤΟΕΡΕΡΥΕΕΆνΚΙ^Ι,ΡΤΙΚΡνΚΡΙ,Α^’ΰνίΚΡΚΙίΕΗΟΡΑΤΙ,ΟΪ,ΡΡΡΑδ
RPSTY:SRPliPRyAVÄSRAPR(iRPQANWOSiijis!SlVGl,GVQSVKRRRCY » Séquence GüdaRtö 1:8329 · 21154 /géide = «: Ii 3 » /qi'qqui / - « pnc/téa/ïé: é© l:a capside IT » /ppodu i i:î « hdkçtl:: /traduction =«
« i^TPSMifeQWÄYMiÜäÖlMÄLSPÜLVQKARATOTYH’SLGNKFBN Ρΐ^ΡΤΗΠνΤΤίίΚβΟΕΪ/Η^ΜΡΚΰΗΕΙΙΝΤΥίίΥΚνΚΥΤΙ,ΑνΟΟΝΚνί,ΟΜ j&amp;PTFD mGVLORGPSB’KP ï sgtaynslapkgapntsqwkdsdskmhtf
GVÄAMP GVVGKKI EAOGIi PIGXDSSS GT DTI I. YADKT FQPE PQVGS DSW ^f^GÄF.RKYGGRALKDTTNMKPCYGSFARPTNKEGGQÄNIKDSETAST i&amp;MDÏDraAFB'DSKSIAANYDPDIVMYTENVELQÏPD'i’HXVF'KPGTSDE SSEgNIiGQ(^MPNFPNYIGE'RDNFXGI,MYYNSTGNMGVL&amp;GQASOL»AV ^|>XiQDRMTEliS YQLLLDSLGDRTRYFSMWiiQAVDS YOPOVRI3 KNHGVE DE LPti’-Y TPLNGVGFTDTYQGVKVKTDTAATGTNGTQWDKDDTÏ’VSTAS iviaSGid^F^EIWigANX.Ï'JRNi’LYANVALYLPDSYKïTPMrrTLPTRTN TY&amp;YMNGRWÄPS L V DAYI MIGARWSLDPME'NVN P FMHHRNAGIjRYRSM J!,lGNGRYVPF}ÎIQVPOKFFAIKSLLLLPGSYTYEWNFRKDVήÎIÎ.QSSL QMÔLRTDGÂST&amp;FTSINÉYÂTFFPÎ^HîSTÂSTLgÂMBRMDTSDÛSFKDY LSA^IîiitPlPANÂTNVE^TSIPSRÎÎWAAFRGWSffMBfCTRFTPaï^ÉGF 0BYFVYÖÖS1PYLDGTFYLN RTFKKVSIT EOaSYS»PGNDRLLYMEFH: |KRTTOGEGYN\mQCNMTR[)WE7JVGMLÂHYSTGYQGFYV'PEGYKDIlîYg :Fi»^»RQVVDEVNYK0YOAVTLAYQHNNSGFVGYI,APTMRQGQB¥ tAPiY:PY:lPI.,IGKSÄVÄS:yTQEI<FLCDRVMÄ,SIPFSSfiE'MSMGAI1l'DLGQlJ MiliYPPiSARRFDMNFEYDPiiDESTLIjYVVFpyf DVRVMWRIPFSPt'it’MSM βΑρΤ0Β00ΝΜΒΥΑΕ3ΑίϊΑΒ©ΜΗΡΚνθΡΜΟΡ8ΤΙ:Ι,ΥννΡΕνΡον\'ΚνΗ0Ρ HRGVTEÂVYLRTPFSAGIîATT: » séquence GG^aétq : 211B 2..218 0 2 /gène ά « M » /numéro ES: - w Ru/--22/3 9 » /proüoi î: ~ « protéase » /teadiictien: “ .« TÂÇGgGFSÉBRAl/l'i/ÎGCGPCFLGTFDEEFPGFMAPHKLÂCAiyNT AGRETGGEBWlAl’AWYPRSRTgYLFGPFGÎ'SDPRLKQîYQFlYEGLLRR :SAlATEDpiTT:l.S:KSTQfyQGpPSAj|(:G]:YOe«FLHÄEYHWPBRPMDK!I PTMSBBYG^PWGMEQSiPQyËPYLRRttQEALYRFI.NAHSAYFRSÎIRARÎS ;KATAf pRSÎPSOiP; :>> séquence 2183-1. . 21839 régulatrice /classe des séquences régulatrices e « sèguénce: signal polyà » /gène ····· « î.3 » gène c ompl émen t aï ire ( 218 7 ?.. 2 63 64 } /gène :« « Ε2Λ » ':?èr;e complémentaire (2187V . .23341) /gène =~: « E2A--ï> » séquence complémentaire (21872::,:.;) réguratiioe /classe des: séquences: régulatrices -- « séquence1 signal poïyA ·» /roté =-·= « Κ2Λ, H;2A-L >> séquèncè: codante complésientaire (218:82...23417} /gène - « Κ2Λ » /produit ^ « protéine de 1iai3on d’ADN slmple brin » /t: rackicf: 1 on ···
« MÄ0RGGSQSSQRRQERllE8XrRGSASSB8NRESPSP8PlPÖKR}(AYR P.VVSDDCÏQEEÏb^VVVSHl.NSRSPSiTSPPPPiPPKKKPIlKÏKHPPLQDïSQ DSS DÈRQAEEELAAVG FS FF P7Ri:ïEKDGK:RPFETlRSSD:PET S®i^ïK M$VKlîÂÎ)SLtrVSAWEKGMEV^Î,IllERY«VS!Sj3èïÎjglfÔÂiÎ^»:Vy RRiCHMVNBBHRGTPLJïd'SNK® αϊε€ΐ1«18ααΐΐ;ΑΡ:0ΚΙ,Κ0ΕΚ:βΕ¥Μ'ΙΏΚΕΗΪΙ:ΕΜ©\ί&amp;5ΕΝΕ0ϊΐΛΕΚΕΝ FDR&amp;K|:ï.QKÏiS,WGRSVVQi.ANHDARCCyHDACCATïü!Q^.SXSCGVFFTEG GKAQ9^fîilQlEAFMKfiHYPGMSSF.QAOMMLIPLHCpÇ^;8KPG€VPSMGR. S5ECKMfg||SMANAFDLDVEGITOÂTVLÂ3VKBPAR^MaÇCKPVYRNSR Ας(ΝΑ6Ρ1^5:βΡΚΪ37^Ρ0Ι/ί.,Θ2^ΐ.:01/ΤΡ.Κ1.·Κ308ΡΡΙ3ΪΡνΡ{ίΐΕ.Ϊ:ΡΕΡΚΪ·ίΐΡ KigpRpySLPAGHÄESRQNi/lllF » intron complémentaire ¢23427,,24079} /note - E2A, Ε2Λ i, ; précède la séquence codante de la: protéine: de liaison d'AON si np F:·· brin séijpënoe: .cedante' 23443, ,;2S:S42 /qèxie "J <<i Li; * /produit'« protéine: :<&amp;' âssembla$&amp;. fäte i'tfeex'OH 100 K » /traduction.
« ÄEGQPSG.PÏS'&amp;SÄS&amp;ÄDEKQQQQNES Ε@δ:0Ε]:ΐ1!^ΟΪ'«5^ΡΑΕΗΕΒ®&amp;ΜΚΡ3ΑΡΕΕ11ΗδΕ0;έΕ@ΕΑΕ'$;ΕΰςΰΆ6Εΐ: HQDYLFdÄK.DViLXKEiÄ SPBÏPlKPQPNGTCEfSPRLNfEF^EAVPSAIArïïiEEfMÖEliPVS^CR: AFR? ΕΑΘΑΕΕΕΕίίΡΑ ARLPDI PSLEgVPKÏ PEGEG:S;:llE>fRASMALQG:SG.
EE:HEöH:SÄLPSI:E:G:p33SEEÄVI:KETP:EId1HFÄf.f^ljSJiPPKlif!SiäliW4DQ
RL IERAS PLS B KEMQ [) P ESdßSGRFdVS DEQ ïiARWijSAi|g:ÏPQSiiEE:RR K^jj^VBWVBï,BOïRRfï^jœ|imKVBEÂÂÂif^^CKiÈ· MVEuPNEVSÏ'MGÎLRENRLGQN^LHfiTLRGEÂREDYiRDCP/AÎLéHÏWt QT(^GVWQQCîJ3EQNLKELCKU.Qï8ÎIi'KÂLW'îëÂil'fAiSÔïiâ-ÔÎ-irSs
ÉRI,RLTLRHGLPDï’WSQSMLQNt'RSFlEERSGÎIÂ|SSÂLPSfî:EPPLT
H'RECPPPLWSHCYELRLANYIAYE3DVISDVSSEGixEMm;CReFECTPM
RSEÄGSPQlilSEiQI XgTFEïiQGPGEGKGGI.KÉ'TRÔEWTSAYLRKFPfE DYHPFETRFYßDQSÖPPKÄHRt^ GHGf YSd PQYGE ÉENPS FpQDKP RKQQEÄES G^ÄS&amp;GGf GÖREGEQSG RCiE3GREGßHSGR®GQPARQSGGG:RRGGGöGRGRSSpRSf¥¥FGGGiSK3 EGYBERSGGGERRPGPQ » idtPöß çamplémentaire ( 2 415 1 · · 26/96} /note; :" << E2A, H2B » -; ;;l'ron cornp I éutoni./ü. r:o (24137 . .:25253) / cic'itjt.·! — « E2A-L: » cequence cca&amp;plêmentaire :(25336..25341} r égalai: r ioo /classe des séquences régulatrices ^ « boîte: ΤΆΡΑ » /gène - « Κ2Λ~ L » ;'sé:qi3ë:iÏÖ!a codëgËë gpnct: löti {2S'S5&amp;* . 2588:1? :26056 , , 26399) /géne =v « ï,4 » /produit - «· protéine 33 K » /traduction -
« MM0S3KKI,fCiELPLSFEDI:KKDWKdSQÄEEME«ÖST^Sit)SLQD :SI,EÉÉ0EVESKAE:EEAiUmKPSSSiÜù£KaSSTD$i:3ÂPGRSRSSRAHSR iPETGREg® PT ïQTAPm-VSKKRQKP 333 SRKRAÄÄAMRKS T AAAG GL SI AANEPAQ'TREI.RNRÏFPÏiïYAÏ FOQSRGQEQllpK»ipRSl,RSLïRSC LYHKSEDQl/pp/iMdiDAEALÏvSKÏCALïLKE » séquence/ codante 25556 . . 261.25 /gèrip ~ << Lé » /produit '==: «: ppöteißfä. d:t encap si dation: :·22 K » /traduction: s= «: MPRGSSlEÄVBL&amp;PJ?ßBÄDWBSSQAH:SMEDWDÄAE-SMl^P· SEEEEDEVgEEAESEAAÄAKRSSBAEEKASSTDTISAPGRGiyäGRÄHSR: fDETGRFPNPTTQTGKKBRöGYKSWMKmïVgCLQftCGGNTSETggï EL· FHRG VN F PRB X 1HYYRU LH SP YYCPX>EEAF,TQQQQQKT SG SS » int: r-oa 258:f1i: *26055; /gêne » ·« 14 ·>. SBduëdd©' coBipléraent =u re -:(.^6388 . ; 2':63:9:|j" nétJipïSÏinxdé: /classe des. séquencés regnlaiirieés ~ «: boîte fATA » sequenöéi iögdSiitd 2È4.T1 * ,:21:15:¾ igêiïïSï μ··. :«.· .Ei' » /pEqduiÈ: « préciirsev:?? de 1¾. ijëxofcéin.e dë la caps·: de pVIII ». /fora duet ion ~ « MSKF.TPTΡΥΜ®3Ύ0Ρ^βΕΑΑ6ΆΑ0ΟYSTBHEWLSAGPSMIsSRWNDï RAHXtMÇd:L.idXQSA:!:TAX.XPRHHÏ,NPRKAXPAJXLyY@:E;XPQ:EÎTVLi;:fRDAQ ïmE'¥!QÏ,f^SGVQr,«GSAAIiCRHRPAQGIKRLyïR#8^TQLNDEVVÉSSLC? ΕΗΡΪ3δ¥ΓβΕΑ03ΰΚ33ΕΤΡΒ0Ανΐ,ΤΕΕ38389ΡΚ300ϊβΤΕ0ΕνΕΕΓΤΡ SyYFNFiPSGSPGlXYPfîEFÏPNFDÂISESVDGÎD: » gèAë 2 6836:. ..32Ö7S: /gêna: e: « E3B: » s è que nc-e 2683 6.,26 8 42 régulatrice /classe des séquences régulatrices = « boîte TATA » /gène ·- << F.3 » intron 268-8$.. 3.1546 /gène - « E3 » /note - « précède la séquence codante de lei protéine de contrôle E3 14,7 K » intron 26888,.31038 /gene - « £-3 » /note ~ « précède la séquence codante de .la protéine membranaire E3 RID-bé'ta » intron 26888,.330849 /gène = « E3 » /note " « précède la séquence codante de la protéine membranaire E.3 RlD-aJ.pb.a » intron 26838.,29956 /gène “ « E3 » /note ~- « précède la séquence codante de la glycop>rotéine membranaire E.3 CRl-gaiama » intron 26888,<28596 /gène ~ « 113 » /note - « précède la séquence codante de la glycoprotéine iRembranaire. E3 CRI--bêta » intron 26888.. 2.8011 /gène = « E3 » /note « précède la .séquence codante de la glycoprotéine membranaire E3 gpl9K » intron 26888..27377 /gène = « E3 » /note ~ « précède la séquence codante de la glycoprotéine membranaire E.3 CRI-alpha » séquence Giqdarite1 271E>ö:. .2/470 /gène ----- « E3A: » /produit «. protéine! da contrôla; E,3 X2y:S K » /traduction ==: :« MSHGGÄÄDIjÄRLRHIiPilCRR'FW^'ÄRDLÄSiiiirFELPEEHBQGPMS VRâ VVEGGI:DSHI,t,RÏ li’SQRP IL/EREÔGQTI/Æl/Cl CNH PGti®/>l»C CLLCTEïtïKS » séquence codant® 2 /423..2 3 OS 9 /gène ----- « K3 » /produit- ··" « g 1. ycoprotéinn membranaire E3 €Rl" alpha » /t.racuc.i..i.oxi - « ΜΚ^Ε^νθθνΐ.ιΕ:ΐ:ί.ΚΆΜϊΕΒΥ30Ε0β0¥ΡδΧΝΙΐ5ΕΡΓΤΏΜΕΤβΕί3^00 :κΡΕΚΚΥΕΤ^Εί;ρΰ3ΡΙΑν¥®;ΗβΒΝΡβ¥ΕΧ,3βΡΜΙ.7ίΕ0ΤΗΕΒΚ&amp;0Ϊ^Η:'ΟΪ?
FheGTyQߥS0SCIiHJFH.IdPNTTj®hhÄiiNQiThQRfiRRDhSESSiJ-i' ΜΤΘ0ΕΕΚ0ΗΡΤΒ0ΙΥΥβΡΜΕννα:ήϊΑΕβΕ¥Άβ®ΕΕΑΕβΥ1:ΪΙ,Ρββ®-Τ, WLCCWFKÄKfP » séquence 2?4 64;·» .27469 régulatrice /classe dés /éqgggces .régulatrices -e. « séquence signai poIyA » ./gène. ·-·-· << i/: » séquencé .cçg.a:n:.t.a: 28037 ,. ^2^:570- ,/gèrïÇ' ™ << E3 /procàiit - «: glycoprotéine membranaire E3: gpl9K » /traduction. :~ « MGKXTigSCGVLyAVVi.SiVGlüGÄÄVyKEFKÄDPGhHESPPKCQlS PQ PDGil RCT VL IKCGWECLNV ft J F, Y NNKT R NNTLA S V®Ç) PG PPiEîSil’Γ/ S VPGÂDGSPRTVNNÎFÏFAHMCDïVMWMLKGYDMWPPÎK&amp;NIVVFSïÂYS·: LCTALIT Aï VCLSI HMT.I AIRPRNMAF-KS RQP »
séquence codane 286®.v˧3ÛS /gène '< Κ.ί » /produit « ci 1 ycopt ot:éin:e m«rabr.a na:i re K3 GE1-hêt·:· » /traduction: ·· « MASVTiJ^^IF'LGLyGTSSTFQfnNKTVMGSKSVLPGHQSHQK^SWY WSjKSiaf^Vt^KGHQteXN^gieiFFKCKKNNXTLIjSXTKHYSGT.yyGT' SKSI KQPTMSVT VL DPT T PPTTT K PT TTKRH TKEKT TKKT TVKTTT TE TTTlVKATTSTTÏAA?THTHTSï,?LQTTRL>tiALbOK«DdSTTSd5;:ErP ;:MmGiJViWCMLIIALC*MVYÏ’Aï,eYRK'HRr.NOKT..Sfa, » autres 29136../9946 car aci.èr. isl. .1 que:; / note ==: régi en en 3’ rés i.doe't '1 e non fonctionnelle de la séquence codante de la glycoprotéine membreπa:i re E3 CRI-ganüna qui est intacte dans d'autres membres de cette espèce ; à laquelle il manque l'accepteur d'épissage et la région ë» 5’ » séquence: codant:« 239611 ... .3ô85:7; /gô'îïé ®3: » /produit . :: « glydoprotiéine membranaire Si GRl- delta. ;» /îtiadgôt'iGit :** « MKAVSÄLVFCS LI Gl V FSAGFLKÎÆLTIYEGENAT LVG ISGQNVSWLK: YHl,DGWKDlCDWNyTVYTCdGydI,TlTSATßDßNGRFKGÖSETRKMGYE SHNMFIYDV TVIRM&amp;TAT T TQMPTi iiGSÏTT TMQTTQTT T ΕΎΤΕΤβϊίΜΤ. ITTAAKPSSAAPQPQAI.AIiiaèSPSTfl'ETbEQTTDFlS'rVESHTTMS 8Αΐ’33Τ/^Ι.·35Ι.ο3ΤΡΙ8ΕΑΤΪ’:1γ?Ε0\Ρ1Ρ1ΕΕΕΚβΤ:ΕΒ30Μβ%βϊ:Τΐίχ:,Ι V rCLVILÄVULY Y ï iGP.EiPlÄHgEPVYKBiyßGgPEPtQVSGGLEKliI» FS ET VW :>>: séquence: uodàntè 3 0 8 65. .:3114:0 /gène « 83 » /produit: - « protéine membrànaire 83 RIDealpÎia >> /tradilctior; == « ΜΐρΚβΒΐΙ:]:ΤΙ1ΙΟ11βν©ΑΤ1ΛΐνΑΝΑ3Ρ0©1βΡΡΑ3ΥνΐΡΑΡνΤ€Ι: C(Xt3'SVCLLITFi‘QFIDWlfc-VR.:.AYLRKH10YPnQEVA5Vi:iid,L » séqueriC© coulante 31146. . 31577 /géne « E3 » /codon de départ ··= 1 /produit = « prôtéine membranaire E3 RÎD-bêta » /traduction ~ « MldéldldlLÂLLi.JjVdiPRPVNPRSPTQSPEEVRKCKEQEPWKFLKCYRQ KSDHHPSWIMIIGIVMILÂGÏLISFV:): YPCFDFGWt?SPF.ALYLPPEr?DT P PQQ PQA H Al·, P P PQ P R PQYMPT EWEAE PQRPMLPAIS YFMLTGGDD » séquence codaata 31570..31977 /gêne « E3 » /note - « famille de 12,5 K » /produit = « protéine de contrôle E3 14,7 K » /traduction - « MTDPLAMNNVNDLLLDMDGRASEQRIÄQr.RIRQQQERÄVKELQDGXA 1HQCKKGT ECIiVKQAKI S YE VT QTD H KLS YELLQQRQK FT CLVG V N P ! V ΓTQQS G DT KGCIHCGC DSPDCVHT LIKT LCG LRDLLPME » séquence 32001. .32006 régulatrice /celasse des séquences régulatrices ;;; « séquence signal polyA » /gène = « E3 » séquence 32070..32075 régulatrice /classe des séquences régulatrices « séquence signai polyA » /gène ** « E3 »
Siêqneàce codante :3:2254¾ .:.:3:3331::: /gC.-î'o o « 3.5 », /noté· =4 « protéine. de là. car::; i d« IV » ^produit:; - « fibre·· % itradöebloii·. » :f MSSKRVRV:D:ßjJFDßVY.:h»V.läÄßMlfVPfINPPfVS3:.D(i3ßEKPL.G.Vf :δ^Ε^|^^ϊ||^ί^ϊ^!^Ι^^5ΚΙ1δΝΤΐΙ^®^|ΡΪ,δ^^ΐΝΤ I 'SfNMDB R F YYRÖGKËS GQ VS RFRtli.RÏS I Ι,Ν ïL&amp;ïi öf MGAGARGSä lÄOLVSp PÏFD® GM 1 KGFFORSiaVF1 G DAT κ: :! RIS OAKG c K. 1:£|>cn 1: Aï K IGNGLEFGSSS T RIGVD'DfiYRIQViCLG SGI, 3 F D S ? GA T ‘ 1 AO ; 1K S Π· :DKLTLWTÏÏJDl>oPWCQlL·ÄENDAKL·ÏL·ClLÏKC^SS:ßïL·ÄϾSVL1VV'GS¾ï^ I«!IJ?I:lGlV:S:SÄQVli:R.B':DANGVlii33:H.S:T:LKKYWGYRßG.D3I:Dölpv4iM ÄVGl’MPEL^YPKSÖSSlTKRSIVGQVYSiNGDVSRRKfiRlITLliiGTDDS .I4S3^SMSGSYTWTNGSYVC5ÄTFGÄRSIT;FSY:[AQE » séquence 33595,.33604 réfiiLlaÊrièe /classe des séquences; r égala ter.1 cés: ~ « :séqaetite® :· signal. po.LyA » /gène ··-· « L5 » gène complémentaire (3:362 0, ,:336255: /classe des séquences régulai; ri ces = « séquence sighal pol y Λ » /gène — «: 1:4 » Séquence cgn^lémenf aire (33620. . 34 630) régulatrioc ,/qènc = « ES » séquence codante complémentaire (;ioncte i on (3.36 s b. . 33089, 34621,.34791} /gène;: ····= « E4 » /produ i I ·· « protéine de cou r r A i e 0RF6/7 de E4 » /traduction ~ «... iilSESNGXHTRSKARSAASRHRPYRP/VPLPRSEEÏEÏRASLVEDriPVA );dX:DïLSMHN:rTV!:PTÏRnKPQLLSC2y0M3ECI;EGF:!.SLT0t;RLARSE TVWMVETKSMSITNGVQMI;’KAVRGERVVY-SM3WEG6!GKITÄRIL » séq'aenoo codanI:¢:: complémentaire (33886.·. 3479.1)' /gone « « K-'i » /note1 « « ORΓβ do F, 4 ;; i.arai 1 11 o de 34 K » /produit « protéine dé controle E4 34 K » /traduction s- « MSESNClMTRtjRi-VRSÄASRHHPYRPÄPLPRCRETETRÄSoVSDFiPVI. PDCDTLSMHNVSSVRGLPCSAGFiV/LQEFpypWDMVLTPEELRVLKRCM S VC LOC At : 10 L FS SQM1 HG ï E RWVLH CHC RDFSSÏjRGMAGGAV'ÏjAI.W FR RlIRGCMFjSäQRVMWYREVVNRRMPKETMYMSSyFWRGRHLIYLRI.WYDS HVO^;tLPAMSFGWSVLRYCl,l1NNLVVI..CCTY.CSOLSElRMRCCAR^Rg LMimVGIMlltESLDPDPLSSSLlH0RRROP:tlLRGLMRHHRlJIidilp:fß:S BERSSASSR » ûnépon ioóiapléiae'nt ai te (33890..34620) /gène = « E4 » isé'guence codante complémentaire ¢34 697 . .35062) ./gén®: ci « E4 » /produit ™ « protéine de contrôle ORF4 de :E4: » /tradiiction « ΜνΕΡ¥ί.Β:§ΡΑνΤΕΤ00Ν0ΪΪΜΕ0ΕΑΗ3ΐν^0«Ι®ΑΪΚΗΐ7βΤΡΊΤΡΞ&amp; LDLLHGJ,Ri';Wt.FyNFi4TÏÏHGKRRDRRl<R3VCGAR:]?3FCYEKÏH;NVRKC)!, IHî DT VAS T Γ S RV P P f : ?V GAG P LTTL » •i îtt.ron comp 1 émentaire (343:15:. .::36232) /gène ·-·-·· « M » /note ~ « précède la séquence codante de la protéine de contrôle E4 34 K » séquence codante complémentaire {35072..35425) /gène -···· « f.i » /produit: « protéine: de contrôle ORF3 dé E4 » /traduction « MRVCT.RMPVP;C;ALREI:FIMAC;T,.Di,P<))ELVRÏ IQGWKÎ iEE nGtlVQEC ΝΜΜΙΕΕ1<ΕΚΡΡΑΓΑΪ'νΕΕ'10¥ΚνΕΑ]:3:ΐ;Αΐν|)Ηΐ.ΐ;Νβ:ΐ:τ:ΕΕ1Α¥:1:ΕΪί0Κ SGGK RC H 3-1 P. DLH FEVLRDBLD » intron complémentaire (35136..36232) /gène ~ « -E4 ». /note ” « précède la séquence codante: :tie la protéine de contrôlé: ÖR.F4 'de M » séquence codante complémentaire (35-322,.358115 /gène ···'-' « K 4 » /produit: ~ « protéine de cor,i. rôle 0RK2 dé: li » /trachiet ion ~: « ΜΕΕΚΐ/3£ϊί3ΐννΕΕ&amp;Ι;Ννΐί5Κ0ΐ:··3ΓνϋΡΐ,ΚΝ01βΰΚΙ.83ΥΒβΒΙΤ0 330ΗΑΥ553ΑΕβΚΑΗ^(3β5ΚΕ:Κ;ΐν/\ΟΡΝΜΡ3ΟΡΜΆΚ8Ρ0ΕΠΜΚ3ί^Ι^ IJd;RP3SLRDRGSEFDIPI.:VlvLLQVNQ:EQNÏLET.( intron complémentaire (35-355- .3:6232) /gène ~ ç E4 » /rote ······ s; précède la séquence codante; de; .! h protéine de contrôle. 0RF§ de El >> ixitrod: complémentaire (35827..362:323 /gène · << E4 » /nôteï - « précédés: la séquence: codante de .la protéine de contrôle QRE2 de: Ê4 » séquence codante complémentaire {35851.. 3622:5:) / g ê n e ~ « E4 » /note =* « spécifique du genre s* tarn i île PURE » /produit - « protéine: de contrôle ORF! de S4 » /traduction ------- « ΜηΑΕΑΤΛ··νΥ1.ΕΓκ3ΟΑΙ,Ιύ·>ν01ν33ΝΥ lLiALtENKVLHldlG:iAÏ,:i.,r>T,R): K ΓWR YSELGRFFSLADAEV PGV YSSCR.T 1B fiGHRERT.RVMVFM HS DN F X EGRAGDRVACLVLEET TYP PVRQASMV : >> séquence complémentaire (36314 . . 36 31 ')) régulatrice /classe des séquences: régulatrices - « boite TATA » /gène. ~ « K4 » région de 36515..36643 répétitions /nom standard «- « ΓΓΕ » /type dé répétition ··· inversée 'annotation de ia seguence de tÿpe sauvage dg Ch Ad1!>ή (SEQ ID W> t 1.9) est fournie cladesaous.
IjOCBS 'Ch&amp;dlSD - ADE linéaire de 37 836 pp - TU Anis 2015 ;DEFINITION Adenovi r us do chixrpanré 155, : génome complet C.OMÎSEN'f AI RE Annota t: ion selon I * alignement du ChAd.155 contre la souche de référence de l'adénovirus 2 huinain EiC_0.014 05
Deux ORF putatifs dans la région H3 ajoutés manuellement CAR AC TH! RI S TIQ-0 ES Emp lac emenf / Qua M £ i c.ate ur s source 1,,37830 /organisme « Adenovirus de -chimpanzé 155 » /type de molécule === « ADN génomique » /acronyme = « ChAdlöS » région: de 1..101 répétitions /nom standard — « ITR » /type de répétition = inversée géne 466..1622 /gène “ « ËlA »
séquence TATA 466..47 I /gène »= « ËlA » transcrit 497..1622 primaire. /gêne ~ « ËlA » séquence codante jonction {577.,1117,1231.,1532) /gène ~ « ElA » /produit ·- « E1A. 28OR » séquence codante -jonction (577 . . 979,1231, ,1532) /gène « ËlA » /produit « EIA 243R » signal poiyA 1600..1605 /gène ~ « E1A » gène 166/2,.4131 /gène = « El B ». séquence l'.AïA 1662. . 1667 /gène « El B » trans crit 1692. .4131 primaire /gène ~ « SIS » séquence codante 1704..2267 /gène ~ « ElB » /'produit « E1B_19K » séquence codante 2009..3532 /gène - « El8 » /produit: - « K1B__55K » gène 3571,.4331 /gène ·---· « ÏX » séquence Τ.ΆΪΆ 3571. .357-6 /gène ~ « IX » transcrit 3601..4131 primaire /gène - « IX » séquence codai)te 3628..4 092 /gène - « IX » /produit. - « IX » sigîi a 1 p ö .1 y fi 4 09 7 . .4102 /note ~ « E1R, IX » gène complémentaire. /4117..27523} /gène - « E2R » transcrit: complémentaire (4117. .274 94) primaire /gène » « E2R » gène· complémentaire ¢4117.,5896} /gène ----- « IVa2 » transcrit: complémentaire (4117. .58 96} primaire /gène =* « IVa2 » séquence codante complémentaire (jonction (.4151. .5487, 5766.. 5770}) /gène = « IVa2 » /produit = « E2B lVa2 » signal polvA complémentaire (4150..4155} /note - « !Va2, E2B- » séqu'ence codante complémentaire (jonction ¢5257.,8-838, 14209.. 14217)) /gène ~= « E2B » /produit “ « E2B_polymérase » gène 607 8..3460 5 /gène = « 15 » gène 60 7 8..2 8 612 /gène - « 1,4 » gêné 607 8 . , 2 26.88 /gène ----. « 1,3 » gêné 6078,,18164 /gène - « 1,2 » gène 6076,,14216 /gène ™ « L1 » séquence TATA 6078 , , 6083 /note -- « I, » transcrit 6109,.34605 .primaire /gène ™ « LS » transcrit 6109,.28612 primaire /gène ----- << Li » t r an scrifc 6109..22 6 5 8 primaire /gène ~ « L3 » transcrit. 6109, ,1.8164 primaire /gène ----- « £2 » transcrit 6109..14216 primaire /gène -- « ï,l » séquence codante jonction (8038.,8457,3722..9742) /gène - « L1 » /produit ™ « Ll__L3,6E< » séquence codante complémentaire (jonction (8637..10640, 14209,.14217} /gène « « E2B » /produit - « E2B_jpTP » gène 10671. . .10832 /gène ~ « VAI » ARN différent 10671..10832 /gène = « VAX » /produit: « VAI >> gène 10902..11072 /gène - « VAI1' » ARN di !: lièrent 10902 . . 11072 /gène ~ « VAU » /produit. ^ « VAIÏ » séquence codante 11033..12352 /gène “ «: 1.3 » /produit -- « L1_52K » séquence codante /2376..14157 /gène ··· « 11 » /produit te. « .1/1 pilla » signal polyA 14137,.14202 /gène — « L1 » séquence codante 14254,.16035 /'gêne = << L2 » /produ.i.t. “ « L2_penton » séquence codante 16Ö50..16646 /gène *--· « L2 » /produit ·! « 12 pVII » séquence codante 16719..17834 /gène = « L2 » /'produit = <*; 1.2 V » séquence codante 17859,.18104 /gène » « L2 » /produit " « 12 pX » signal polyA 18143, . i 8.1.4 8 /gène ------ << L2 » séquence codante 18196..18951 /gène -™ « L.3 » /produit = « L.3 pVX » séquence codante 19063..21945 /gène = « L3 » /produit - « L3 hexon » séquence codante 2.1975. ,22604 /gène - « X>3 » /produit - « L3 protéase » s i gna1 po1yà 22 6 30. . 2 26 3 5 /gène = « Là » gène complémentaire {22632..27523} /gène — « Ε2Ά » transcrit complémentaire (22632. ,27-194} primaire /gêne - </ E2A » gène complémentaire (22632..26357) /gène *» « Ε2Ά"ί.< » transcrit -complémentaire (22632..26328} primaire /gène ~ « E2A-L » signal polyA complémentaire (226.49. .22654) /note - « E2A, JS2Ä-L » séquence codante complémentaire {22715. .24367) /gène - « E2A » /note ~ « -DBP-, commune au genre ; -famille DBP » /codon de départ - 1 /produit - « E2Ä » séquence -codante 24405..26915 /gène « 1.4 » /produit « L4_10Dk » séquence TATA complémentaire {26352..26357) /gène = « E2A-L- » séquence codante jonction (26602.,26941,27147, ,27529) /gène = « L4 » /produit « « L.4 _33K » séquence codante 26602. ..27207 /gêne « 1.4 » /produis: « L4 22K » séquence TÂTA. Complément aire (27518..27523) /note "= « E2Ä, E2B ; nominal » séquence codante 27604..28287 /gène - « L4 :» /produit = « L4 jaVIIï » g èr.e 2 7 9 6 9 , . 3 2 6 8 6 /gène ” « Ê3B » g è π e 2 7 9 6 9 . .31611 /gène “ « E3Ä » séquence TATA 27969..27974 /note - « E3A/. E3B » transcri t 2 7 998,.3268 6 primaire /gène - « E.3-B » t: î: a ns c r i t 27 9 98 . . 31611 primaire /gène s= « Ε3Ά » séquence cod mlc 28288..2060¾ /gène - « E3A » /produit =. « E3 ORF 3 » signal poiyA 28594 . .28.899 /gène = « L4 » séquence codante 2-9103...,29303 /gène “ « E3A » /produit: =» « ORF2 de E3 ·» séquence codante 29300..2 97 97 /gène - « E3A » /produit ~ << 0RF3 dé E3 » séquence codante 29326..30731 /gène = « £3 A » /produit: = « ORF4 dë E3 » séquence codante 30728 . ..31579 /gène -· « E3Ä ». /produit: .» « ORF5 de E3 » séquence codante 31283..31579 /gène — « E3A » /produit =--- « ÖRF6 de E3 » sigtiâl poiyA 31578..31584 /gène t;; « K3A » séquence codante 31591..31863 /géne << E3B » /produit ·-- « ORF7 de E3 » séquence codante 31866..32264 /gene --- « E3B » /produit « ORF8 de E3 » séquence codante 32:257..32643 /gène ·- « E3B » /produit: -==· c ORF3 de E3 » signal. poiyA 32-659 . , 32664 /gène: ~ « E3B » gène complémentaire. {<32678..32838) /gène " « 0 » séquence codante complémentaire {<32678..328385 /gène: — « 0 » /note « exort codant pour l'extrémité extermina le non idenaitiée ; commun au genre » /produit ~ « protéine U » séquence codante 32849.,34585 /gène - « 355 » /produit -· << L5 'libre » signal polyè 34581. .34506 /gène « « L5 » gène cornpléiaentaire (34 611. .3 7 52 0} /gène “ « El » transcrit complémentaire (34611..37490} primaire /gène -- « El » signal polyA complémentaire (34 625,.34 630} /gène — « El » séquence codante complémentai re { jonction {34794 .. 3X5069, 35781.,35954} /gène « « El » /'produit: ~ « ORF7 de EX4 » séquence codante complémentaire {35070,.35954) /gène — « Ë4 » /produit: - « ORFb de S4 >> séquence codante complémentaire (35875..36219} /gène - « E4 » /produit ~ « ORF4 de Si » séquence codante complémentaire (.36235. .36582) /gène ~ « Ei » /produit = « ORF3 de F.4: >> séquence codante complémentaire (36579,.36971} /gène '=: « E4 » /produit - « ORF2 de F,4 » séquence codante complémentaire (370-29. . 37415} /gène - « E4 » /produit - « ORFl de E4 » séquence TÄTÄ complémentaire {37515..37520} /gène =- « Ei » région cio .17740 . . 37 770 répéf. liions /πογ,ϊ standard ····· « IT R » /type d<: répét.i t. i o'n ·· inversée
Tr ant; gén es
Les vecteurs adénoviraux peuvent, être: utilisés pour administrer des séquences d'AHN ou de protéines souhaitées, par exemple des séquences hét érologues, pour une expression i a vivo, Un vecteur peut; comprendre tout, élément génétique y compris de i ! ADN nu, un phage, un transposen, un eosmide, un épinome, un pi a smi.de, ou un virus. Far « cassette d’expres s ion » (ou « minigène »), il est signifié la combinaison d'un gène hétéro.'! ogue choisi (transgene) et des autres éléments régulateurs nécessaires pour diriger la traduct i on, la transcript loti et/ou l’expression du produit gén ique dans une cellule h cle. Généralenen a:,, Un vecteur adénoviral est conçu dé: teile taçon que la cassette: d’expression est localisée dans Tins molécule d’aeide nucléique qui contient d'autres séquences adénovirales dans la région native à· un gêne adénoviral choisi. La cassatte d'expression peut; stre; insérée dans! Une région -de gène, existante: peur perturber 1 a fonction de cette région, si eiest souhaité. En variante, .la cassette d ' expression peut être insérée dans le site d ' un gène adénoviral partiellement ou Iota J ement délété. Par exemple, la cassette dlexpressios peut être localisée dans le site d'uné mutation, d’une insertion ou d'une délétion qui rend : non fonctionnel ali: moins un gène d'une région génomique choisi dans Xo groupe constitué: dé :ΕΧ%, El®, Ε2Δ, Et H, E3 et E4. Le terme « r. end non fonctionnel p signifié qu'une quant i Lé suffisante de la région du gène est éliminée ou sinon perturbée, de telle façon que: la région du gène n’est plus capable dé produire des produits fonctionnels de .1 'expression génique. Si c’est souhaité;, la région entière du gêne peut être éliminée: |-ét de façon, appropriée remplacée par la cassette; dte&amp;pré&amp;Âbn ) . Dé façon appropriée, isp gènes: E.1 d’adébOVirus; sont diiêtês et remplacés par une cassette: dlexpression constituée du promoteur de choix, d’une séquence d'ADMc du férié d‘intérêt et d'un signal poiy A, produisant: un virus;; recombinant défectueux pour là répilcation. dUé: séquence: de : transgène peut également comprendre: une séquence1 rapporteur, qui lors de 1 texpression: produit un signal détectable.. Ile telles séquences rapporteurs comprennent, sans limitation,: des séquencés d'ADN codant pour la jß-laetamase, la ;ß~ gaiaefosidase (LacZ) , la phosphatase alcaline, la thymidiné:: kinase, la protéine fluorescente verte jiâffî?). la chlor amphénicol acêtyltransférase (CAT}, la iuciférase, des protéines liées à la membrane y compris^ par exemple, CD2, CD4, CD8, la protéine;; bémagglutinine du virus de la grippe, éb d' autres bien connues dans lr'art;, contre lesquelles des anticorps de haute; affinité sont dirigés et existent du peuvent être: produits par des moyens traditionnels, et d鮄protéines, de fusion; comprenant: une protéine liée à la membrane fusionnée: de façon appropriée; à; un domaine de marqueur antigénique parmi, entre autres,: 1 ’ h émagg lutinine ou Myc. Ces séquencée codantes, lorsqu '’pifps sont associées; à des éléments régulateurs qui dirigent leur expression, fournissent des signaux dé te et cibles par des moyens traditionnels, y comptas des test® enzymatique®, radibdrapniques:, eoiorimétrigues, de ftubrésçence ou autres sbeptrographi.qu.es, des tests de tri de cellule® activées par fluorescence et dos tests immunologiques, y compris un tost ELISA (enzyme: linked sisMühü sortent ashay);un test radioimmunologique; (RILL et ï'immunohistochimie.
Eh plu® bu; transgêne, la cassette d'expression comprend également des élément® de contrôle traditionnel® qui sont liés de façon f o ,n c t i ο η n e 1.1 e au transgene; d'une façon qu i permet sa l ranser i.pt.i.on, sa trabuction ét/btï son expression dans une cellule transfectée avec le vecteur; adénoviral. Toi qu'utilisé ici, dos séquences « liée® de façon fonctionnelle » comprennent à la fois des: séquences de contrôle de l'expression qui sont; contiguës au gène d'intérêt et des séquencés; de; contrôle de .1 ’ expression qui agissent en trans ou à une certaine: distance pour cdhtrêiéb le· gène d'intérêt, lié®: séquencé;®:;: de contrôle de I ' expression comprennent:: des séquence® d'initiation ;de: la traii script;;! on, de terminaison, promoteurs et amplificateurs ï dé®; signaux de traitement dp l'ARN efficaces tels que; des signaux d-; épi. s s âge ;e;t de .ppiya:dényi;a;tion: {poly A) y Compris le; si.gr:al polyA de la bêta-giobine de lapin r de® séquences qui stabilisent l'ARNin cytoplasmique ; des séquence® qui amplifient 1!efficacité de la traduction (par exemple, la séquence; consensus de boxait); ; des séquences qui amplifient; la stabilité des protéines ; et lorsque c'est souhaité:, des séquence® qui amplifient là sécrétion du produit codé::, Farfil d'antres séquev.ces, des introns1 chimériques peuvent êtle utilisés:, Ün « prompteur » est: uné séquencè: nucléotidique qui 'permet là liaison de itÂRN: ipolÿtiérase et qui dirige la transcription d'un gène., Géné rai eMe.nl: , lin : promoteur est localisé dans la région non. codante en: 5' rd’un gêne, en position proximale par rapport au site de dépai de la tfanéeription du gène. Les éléments de séquence au sein dés promoteurs qui fonctionnent dans l'^initiatiop de la transcription sont Souvent catqetèrlsés par des séquences nucléotidiques consensus, Des exemples: dp promoteurs: comprennent, mais n'y sont pas limités, des prometeures provenant de pactêries, de levures, de végétaux:, de virus, et de mammifères (y compris des êtres humamsl · Un- grand nomOre de séquencés dé controle: de l'expression, y compris des promoteurs qui sont internes, natifs, constitutifs, inducti blés ei. /ou spécifiques des tissus, sont connues dans l'aft et peuvent être utilisées.
Des exemples de promoteurs constitutifs comprennent, sans limitation, lé promoteur TRG, le promoteur LTR du virus rétrovi rai. du sarcome de Rous ( é v e n t u e 11 eme n t : avec: l'amplificateur), le prompteur du cytomégalovirus (CMV) ( é ven t uc 1 i. einer, t avec l’amplificfteur du CMV, voir, par exemple, Beshart et a I, Ce.il, i .1 : '321-5 30 (1985) ) , le promoteur CAG1 (WO 2(fl 2/1.15980) , le promoteur du BV40, le promoteur de la di h yd r:o i ol a t e réductase, le promoteur do la ß-actine, le promotour de la phosphoglycërol kinase (PGK), et le promoteur EF1a (Invitrogen).
Les promoteurs induo!, ibles permetténi la régulation de Ί 'expression des gènes et: peuvent être régulés par des composés fourni s de façon exogene, des facteurs en vi ronnementaux tels que la température, ou la présence d'un état physiologique spécifique, par exemple,, aine phase aiguë, un état de di fférenciation particulier de: la cellule, ou des cellules: en; réplication uniquement. Des; promoteurs iiiductibies et des systèmes inductilblés sont disponibles auprès de diverses sources1 commerciales, y compris, sans limitation./ inylferogan, C 1cm te ch et Ariad. De nombreux autres systèmes; ont été; décrits et peuvent être facilement choisis par l'homme du métier. Par exemple:, les promoteurs inductiblBS comprennent le promoteur do la m c >" a 11 o t h i. ο n é i n e ( MT ) de mouton inductible- par le xihc et: le promoteur du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV) inductiblë par la dexaméthasone (Dex.) < D'autres systèmes induetibias comprennent le système du promoteur de? la T7 polymérase (WO #:8/100¾} ; .Le promoteur de 1’ecdysone des insectes {No et a/., Proc. Nat 1, Äoad:. Sei. USA,. 33:: 3346-3351 (1936} }, Le système tagtimable par la félraeycline (Gossen et al,, Proc. Nati:.: ;,icad:, |ci, OSA,; 89 : #541-5551 (1992) ) , le système: inductible par la ..tétracycline (Gössen et al,, Science, 378: 1766-1769: :(1195)::, «voir également Harvey et al.,
Curr. Spin. Chem, ;liôl,: 2: 512-518 {1998)?), {D’autres système^; cdfigfenrént: lé; dimère de F150 6, 7516 on p65 utilisant le oestradiol, la diphénoi :müri;slë?roue, le système; inductible par EÖ48 6 (Wang: et al../· Nat. Biofeech;,:, 15:: 239-243: (1997) et Wang et. al.., Gêné Thé t· , 4* 432:-441: (1997)) ét le système inductible ipaf: la rapamycine (Magarî et a1., J. Gifu. Invest.;, 100; 2.865-2872 ί18¥7;)::1. L' efficacité de :cefta|ns promoteurs inductibles augmente avec le temps·. Dans de tels1 cas, ôa peut amplifier l’ai iïloacj. lé de ces systèmes par 1insertion de r apres saur s npltipies en tandem:, pat exemple, TetR lié % un TetR par un 1RES.
Le transgene peut être lié de façon fouettonnelle à un promoteur spécifique du tissu. Par exemple, si 1'expression dans le muscle squelettique est souhaitée, un promoteur actif dan s le muscle devrai être utilisé. Ceux-ci comprennent les promoteurs issus de gènes codant pour la ß-actine sque.l et:tique, la chaîne légère 2 h de .La rayes i ne, i.u dystroph! ne, I a créât, i ne kinase musculaire, ainsi que des promoteurs musculaires de synthèse avec des activités supérieures aux promoteurs existant à l'état: naturel (voir Li ci al,, Nat. Biotech.:,: 17 ; fi 245 plllp. Des exemples de promoteurs qui sont spécifiques des tissus sont connus pour le toté·· (albumine, Mlyatake et fl., J. Virol, 11; 5124-32 (1997 ) ; le promoteur de la nncléoçapside; du virus de l'hépatite B, bändig et fl a Gene: Ther,, :3 : 1002-9 P9M): ; 11 alpha-fiStoprofêiïlè: JpR}:,: Arhufhnot
et ai.,. Mum:. Gene Ther., 7: £1:03:-1:4 {1096:): P l'ôstéocalçiuei: osseuse (Stein et ri., Mol, Biol. gRsp.;, 24: 185-96 {1997)} ; la sialoprotéihe OSSéuSe (ehçh St: al., J. Bons: Miner. Res., 11: 654-64 p.9:96)):, iês lymphocytes (CD2, Hansal et ai,, J. Imraunol, 161: 1063-f: (:1998) ; la chaîne lourde des lBmiunoqlobulinê:S .la chaîne des récepteurs des lymphocytes 1()::, neuronaux tomme le promoteur de i’énclase spécifique des neurones (NSE) (Andersen et al,, Cell. Mol. peupoipoi,, 13 : 7 0 3 - 15 ¢159:3:} ) f le gène de la.. chaîne légère des neuroCltäftents '{licci© li et ai., Proc. Na 11. Acad. Sei. OSA, 88: 5611-5 (1651) } , et le gène vgl spécifique des neurones :biccioii et a.)., Neuron, 15: 373-84 Π 695} ) , pariai- d’autres.
Dans d'autres laodes de réalisation:, 1 ' élément: régulateur post- i.ranser 1 pt tonne.!. du virus de I ' hépatite de la marmotte (SPRF.) (Zuffrey et al. (1999) J VIroi ; 73(4}: 2886-9) peut être lié de façon fonctionnelle au transgene.
Construct, i on dés vecteurs adénoviraux
Les vecteur:·; adénoviraux sont; produits par : a modification de 1'adénoVirus de typé sauvage pour exprimer des gènes hél·éroiogues et/ou pour doiôler ou inactiver des séquences adénovirales indésirables. Lee vecteurs adénoviraux peuvent également présenter une compétence de réplication modifiée:. Par. exemple, le vecteur peut être défectueux pour 1a réplication ou présenter une réplication limitée de telle fapon qü/il dispose d'une capacité réduite: à se Mépiίquer dans: des cellules non de complémentation, comparât:·! vemen t, éu ytpus de type sauvage,: Ceci, peut être réalisé pal la mutation du virus, par exemple,, pai une inactivation fonctionnelle ou une délétion d'un gène impliqué dans la réplication, par exemple Ela, Elb, (il, E3 ou E-1. les vecteurs adenoylraiix çonformèment à la présente invfhtion peuvent: comprendre un El fonctionnellement inactivé ou délété. Ainsi/ les vecteurs adénoviraux selon .1 ' I nvention peuvent êt re défectueux pour. la réplication a cause de .1 ' absence de la capacité d ' exprimer io gène Ela et/ou E i b adéno vira \ .
Les adenovirus fècömbinants peuvent également porter des iiiâ'GCivatioui fonctionnelles dans -d'autres gènes (voir .-le- document WO 03/000283)1 par exempte, des délétions, dans les gènes E3 ou E4. Le gène précoce retardé: des adénovirUs E3 peut être éliminé de la séquence adénoviral.«;: qui. forme une partie: du virus recombinant. na fonction de E3 n’est pas nécessaire à la production de la particule adénovirale reeomhinahte. Ainsi, il n’est pas nécessaire' de remplacer la fonction de ce produit de gène pour ©neapsider un adénOVirus recombinant utile dans l'invention:,· Dans un mode dé réalisation particulier, les adenovirus recombincsnls ont les gènes El et 13 foncrionneilepent délétés. La construction ne tels Vecteurs est. décrite dans Roy et aï.r H aman......Gêné Therapy 15: 5î 9-53Ö, 2004.
Les adénovi rus recombinant s peuvent être également construits:: en comportant Une délétion i on ci;, i on ne lie du gène E4, Dans un mode de réalisation particulier, les adénovi ruig:: reuomhinants présentent les gènes El et E4 fonctionne] i ement. délétés comme il est déc fit dans Colloca et a 1. (2012} Sei, Transi. Med. 4: 1-9 ; Roy et al. (2004) ¥lrpl. 324: 361-372, Dans certains modes de réalisation^ il peut être souhaitable de conserver la fonction de 1'ORF6 de El, Dans un mode de réalisation, la région native de .1 ' OR F 6 de E4 peut être remplacée par un ORES do E4 hétéroiogue, comme de 1. ' Ad5. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral peut être fonctionnellement délété dans El et comporter la région de 1'ORF6 de E4 provenant de .1 ' Ad 5. lies vor.tour» adénoviraux selon 1 ' invention peuvent également contenir une délétion fonctionnelle dans io gène précoce: retardé Ëlà. Dés délétions peuvent être égal eroent. réalisées dans i ' un quelconque des gènes tardifs l'd. a 115 du génome adénoviral. De façon s Lmiiairo, des délétions dans les gènes intermédiaires IX et 1 Va peuvent être ut .i. les. D’au1res délétions peuvent être réalisées dans les a ut res gènes structuraux ou non structuraux des: adénovirus. Les délétions ci -dessus peuvent être utilisées individuellement, par exemple, une séquence adénovirale pour une utilisation dans La présente invention peut contenir des délétions de El uniquement. En variante, des délétions de gènes entiers ou de parties de ces derniers efficaces; pour détruire leur activité biologique: peuvent; être utilisées dans une combinaison quelconque:. Par exemple, dans un exemple do vecteur, les séquences adénovirales peuvent scOmportep des délétions des gênés fl et du gêne Eid, ou des gènes Bl,: E2,a et £3, du des gènes El et Έ3 (comme déa délétions fonctionné lies dans E1 a et F.lb, et une délétion d’au moint une partie de; &amp;3}:, ou des gènes SI, EX a et. K 4, avec ou sans délétion de E;3 et: ainsi do suite. De toiles délétions peuvent être des délétions partielles ou totales de ces gènes et peuvenu être utilisées en combinaison avec d'autres mutations, comme des mutations sensibles à la température pour obtenir un résultat souhaité,
Ces vecteurs: sont produits: en utilisant des techniques connues: de l'hqipie du métier. De telles techniques cn.mp.rennent des techniques ^traditionnelles de clonage de l’SDNe telles que celles décrites dans des textes , 1 ' utilisât! on de séquences aliganuéléotidiqué® chevauchantes dés génomes adénoviraux, J.a.....réaction en chaîne de ila poigmêrasé.,: et tout procédé: .approprié qu i. fournit la, séquence nucléotidique: souhaitée·*· 'tes procédés· p a r t i c u 1 i è r eme n t appropriés comprennent des procédés: de recomho nnison homologue classiques tels que ceux :f pur nia : ;dan$ Co'; loca et al» (2:012) Sol . Transi. Med. 4: 1-9 ; Roy et al,., (2004) tirpl. 324: ; Roy et al. {20101 J. of
Gene: Med» 13 : 117--25 ; et. WO 2Ο1·Ο/0:·δΒ::98 4 ou des procédés de génie .génétique raêdié par des: sre combi nais ans·· tels que. décrits· dans Warming et al. Nue. Acids Res* (200h) 33e e36.
De f açon appropriée, une séquence adénovi ru i c pour une utilisation dans- la présente invention contiendra une inactivation fouet i onneile (comme une délétion) au mo in s des gènes El et E4, éventuellement avec une inactivation ionct i onnei le de E3 (comme une délétion) , conjointement avec une substi Lui.ion du gène Ad5E4orf 6 .
Dans un mode do réalisation, i'adénovirus comprend Une inact i va t.ion ionct tonnelle (comme une délétion) des gènes El et E4, avec j. neo r po r a t i. on de -EiorfB provenant de l'AdS. sDans de tels modes; de réalisation, 1'adenovirus est dérivé de façon appropriée du ChAdl55, GhAdScou ChAd63, particulièrement du ChAd.3.
Dans un second mode de réalisation, 1'adénovirus comprend: une inactivaiidu fonct ionnelie (comme une eiélétipn): des gènes El, E3y ét IM, avec incorporation de £4orf6 provenant de i ' Ad.5, Dans de tels mede® de réodiïïati.on, 1 ' adénovirus: est dérivé· de (façon äpp repliée du ChÄdlJS, ChAd3 öu :ÇhMâ3/ pa r t i cui i.c reinent. du ChAd63 .
Production des vecteurs adénoviraux
Les vecteurs adénoviraux peuvent être produits: en utirisant toute ligné#· cellulaire approprié# dans iaqhëlle le virus est: capable de se répliquer. En particulier.,: des lignées cellulaires de complémentation qui. fournissent lêS: facteurs: manquant: au vecteur viral, ce qui entraîne un# altérai:,ion de ses caractéristiques: •de réplication :(cOamë El ) peuvent être utilisées * Sans limitation,·· de telles lignées cellulaires peuvent être des cellules Hete :tio. 1' accession ÄTCC CCI- 2), A54f; (Ko. d? accession AT CG CCL MS), HEK 2 93, :|S |:CCL IM , Detroit (par exemple , Detroit 510, CCL 1:2:1 et VîI-38 (CCL parmi d‘ autres. Ces lignées cellulaires sont toutes disponibles auprès de: l'American Type Culture Collection, iÜ8i:i Universlty Boulevard, Manassas,
Virginia: ;20I10:-22S:9, D'autres lignées cellulaires parentes appropriées peuvent être obtenues auprès d ' autres sources:, comme des cellules PER. C6TM, telles que représentées par les cellules déposées sous le no. KCÄCC 96022940 à I'European Collection of Animal Ce.1.1 Cultures (ECACC; au Centre for Applied Microbiologe and Research (CAMR, Roy a urne-U ni ) ou des cellules lier 96 ICrueell);,
Une lignée cellulaire de Complémentation particulièrement appropriée est la lignée collui aire Rrdcèl 1:9:2. La lignée cellulaire Procell92 est basée sur dès cellules HEK: 293 qui expriment les gènes adénoviraux El:, transfectées: avec le pépresseur Tei sous: lé contrôle: du promoteur de la phosphogly'cêrate kinase- i. (PÖKl liumalne,: et du gène de realst ange au 0:4:18; iditeili ei a 1. PL05 One /20:1:3'') 8(e5S435): 1-9) . 9r:ôée::ii92. S est: adaptée pour la croissance dans des conditions de suspension et est également utile pour la production de secteurs adénoviraux exprimant dea protéines toxiques (www. okairos . o om / c / i η n e r s . phprnv- QQQ.84, dernière consultation le 13 avril 20.1.5) .
Procédés d- administration d'adenovirus et dosage
Les vecteurs adénoviraux; peuvent être administrés: dans des eomposiflons immunogènes. Une compos i.tion immunogène telle que décrite ici est une composition comprenant un ou plusieurs vecteurs recombi nuats capables d'induire une réponse imiciunitai re, par exemple une réponse humorale (par exemple, des ani icorps) et/ou a médiation cellulaire (par exemple, un lymphocyte T cytotoxiqiiéj:, contre le produit d u t: r a n s g é n e administré par le vecteur: à la suite d'une administration à un jaammif èrë, de- façon appropriée un être humain, du adénovirus recombinant peut comprendre ;(dè façon appropriée., dans 1 ‘ une quelconque dp ses délétion.® dé gènes:) un gêné codant; pour 1. ' immunogène souhaité et, par gonséquant, il peut être, utilisé dans un vaccin.
De telles compositions vaccinales ou autres, immunogènes: peuvent être formulées dans un. véhicule d'administration approprié. Généralement, lés doses pour les compositions immunogènes· se situépt dans la plage: définie ci-dessous sous « Procédés d'' administration fil dosage ».
Event uêliement:, upe composition vaccinale ou immunogène de Xl'inVention peut être f ormulée: pour crmitenir d ' aut res composants, y compris,:; par exemple, des: adjuvants, d©&amp; s. t aïxl i:i giant®.*· des :ä:geß;ts d ' ajustement: du pii,·., ci©© conservateurs ©t analogues:, On adjuvant peut étire administré: avec un vaccin et© sensibilisation à base d'ADN codant pour un antigène afin d ^amplifier la réponse irtminnitaire spécifique de 1. 'antigèn© pompanativement à la: réponsè: iMimnitsir©: produite lois; de la sensibilisation avec un vaccin à bas©: d’ADN codant pour ld antigène uniquement. Ι,ο vecteur a dé nqv irais peut être préparé pour s© administration par une mis:© en suspension ou une disse l union dans un; support pharmaceutiquèrnont ou physiologiquement acceptable tel que 1© sérum physiologique: isotonigue ; une: solution do sels i s dtp niques: ou d'autres formulations qui seront évidentes pour .1 'homme du métier. Le support; approprié sera évident pour l'homme du métier et dépendra en grande partie de la voie d'administrai i on. Les eomposit.1 οns décrites ici peuvent être admi n.i.ut rocs a un mammifère dans une formulât ion à libération prolongée en utilisant un polymère biocompatible biodég roda b 1 o, ou par une adïïd.ni straf ion: au site en utilisant des micolles, des gels ©t des liposomes.
Dans certains modes de réalisation, 1'adénovirus recombinant do 1 ’ invention est administré à un sujet par une injection 1 n t r arnu s c u 1 a ire, une inject ion intra vaginale, une injection i n t r a v o i n ei e e, une injection intrapéritonéale, une injection sous-cutanée, une administration épicutanée, une adminlst ration intradermique, une administration nasal© ou une administration orale. Une administration au poumon peut être également souhuitable. L* administration intrarausou i .5ire peut: êt.re une voie typique, pour des raisons do simplicité et de praticité.
Si le régime: thérapeutique implique la c o a dmi n i s t r a t i. on d' un ou de plusieurs vecteurs adénoviraux et d ' un autre composant:, chacun (formulé dans des compositiehs différentes,· ils sont iadmiUiiiléS:: des façon favorable co-localcment· au niveau ou près dû mime site. Pést exemple,: les composants peuvent être administrés (par. exémplë:, par 1 ' iutéOTédiaire d’une vole d'administration choisie parmi intfanvusculatre, transdermique, intradermique, sous-cutanée) du même côté ou à la même extrémité {administration « colatérale ») ou à des côtés ou. des extrémités opposés {administration. « controlatérale »} *
Les dosages du vecteur viral dépendront principalement dé facteurs: tels que l'affection traitée, l'âge, le poids; et ! ' état de santé du patient, et peuvent ainsi varie r parmi les patients. Par exemple, un dosage humain adulte ou vétérinaire thérapeutiquement efficace du vecteur viral contient généralement ! x 1.0s à 1 x:i 10^ particules virales,: comme de 1 x 108 â 1 x 10m {par exemple, 1 x .10% 5 x 10% I. x X0\ 5 x K)% .1. x 10;0, 2,5 x 10«, 5 x «w, 1 x 3 0U, i x tO12 pt·ri icules) . En variante, un vecteur viral peut être administré à une dose qui est g én é r a 1 u.me n t de .1 x 1Ö5 à 1 x 1020 unités formant une plaque {PF! i} , comme 1 x 105 P FU, 5 x 10:a P FU, 1 x: I0fi P Mi, 5 x 10 8 P FU, 1 x 107 P FU, S x 10v P FO, 1 x 10« P FU, 5 x 10« P FU, 1 x 10« PFU, 5 x ΠΡ PFU, ou I x 10iü PEU. Lés dosages varieront selon la taille de II arrimai et la voie d ' adm.i.nist rat i on . Par exemple, un dosage pour l’être huma in ou veterinaire approprié {pour un anima], d ' environ 80 ky) pour une injection i ntramuscuinire se situe dans: .] a plage d ' environ i x 10" à environ 5 x iô:1" part i ouïes par; mi, pour un seul site. Eventuellement:, des sites multiples; d ’aÄiniÄ peuvent être utilises, Dans un autre exempt e, un dosage pour 1'être humain ou vétérinaire approprié peut se situer dans i a plage d1 environ 1 x 101¾ à environ 1 x 10!- particules pour une formulât ion orale.
Le vecteur adénoviral peut être quantifié par une analyse de PCE quantitative ÎQ--PCR), par exemple avec des amorces et une sonde conques sur une région du promoteur du CMV en utilisant comme courbe d'étalonnage une; dilution en série dé: 1 ’ ADN pt asm i digue contenant le génome du vorcteur avec; une cassette d'expression comprenant le promoteur du HCIW. Le nombre de copies dans l'échantillon à tester est déterminé par le procédé d'analyse des lignes paralleles. Des procédés alternatifs pour la qu an t .1. f i o a t i on des particules de vecteur peuvent être la CLHP analytique ou un procédé speetrophotométriqué basé sur l’Â26o nm. Généralement, une dose: humaine sera dans un volume situé entre 6, M ml. et B mlAinsi;, la composition décrite ici peut être formulée dans un volume, par exemple, de 0, 5, 1,0, 1,5 ou 2, 0 mi. de dose humaine par individu ou de composants immunogènes combinés. On volume de 400 à 600 pi, comme autour de 500 pi est généralement. utilisé, en particulier pou r; une a dm i n i si r a L i ο π par la voie intramusculaire . liitfeomme: cte idétier peut· ajustât tes doses, 'Uéldn la voie b' administrât ion ét 1 ' application thérapeutique ou vaccinale pour laquelle le vecteur recombinant est employé. Les taux: d’ expression du tien s gène, oit .pour un adjuvant, le taux :ii,;ant:ioorps circulants, peuvent 'être contrôlés pour déterminer la fréquence d'administration du dosage.
Les taux thérapeutiques,, ou le taux de réponse .immunitaire eoni re, la protéine codée par le trans gène choisi peuvent être contre lés pour déterminer lé besoin, le cas: échéant1, de rappels. K la: suite d'une estimation de la. réponse dès lymphocytes; T: CiPSty ou éventuellement, des titres en anticorpây dans lé sérum, des immunisât ions de rappel éventuèlles. peuvent être souhaitêéS:.· Eventuellement, le vecteur adénoviral peut être: administré: en une sonie a dm in ist. rat ion ou dans divers régimes combinés, par exemple, en combinaison avec un régime ou un cours de traitement Impli quant, d'autres principes: actifs: ou dans un régime de s e n s i b i.l. i sat.io.n~r appê 1..
Transgène M72.
Un autre aspect de la présente invention concerne up nouveau polÿôucléotidê codant pour un antigène M72. qui a été optimisé pour une ut.i Usât ion. dans: la présente invention mais qui aura.: également une utilité dans d’inttes; contextes:, Par. conséquent:,: l'invention fournit êgaloment un polynudléotidè: comprenant :SEQ. ID NO :: 8 un: 1 ' wv dé ses variants dégénérés présentant au moins 95 % d'Identité: avec· :SEQ ID NO· : 8. (comme au moins 98 % d1 identité, de façon appropriée au moi.ns 99 % d1 identité, en particulier; au moins 99, 5 % d ' ident .Lté et spécialement 100 % d ' identité ) . il sest éga lernent. fourni,. un, polynuciéotide constitué dé SEQ ID NO ï ip ou de l:,un de sep variants dégénérés· présentant au moins 95 % d’identité avoo SEQ: ID NO : 8 fcommé au moins; 96 % d’identité, de laçon appropriée an ;Moi.ÄS: 9.9 I d':,:idéntité., ém partieulier au moins 99/ 5 ;%; d’identité et spécialement; 1ÖQ % d' identité::) , Par 1©; terme variant dégénéré, il est sign.it 16 un variant: du po.I ynuc.! óolide qui code pour le même polypeptide .
Le p ol y n u c .1 é o é i. d e optimisé aidé a garantir que les bénéfices; de la présente invention sont pleinement obtenus par l'intermédiaire d'une expression et"fioaco des transgenes dans des cellules humaines. C o nsi ruct ions a d éη o v iraies
Un autre aspect de la présente invention concerne de inpuvéiiés constructions adénoviral es d’utilisation dans la présente invention mais ayant également; une utilité; dans d'autres contextes. Éar conséquent, 1 ' invention fournit également un adénovirus; simien:: non humain comprenant un transgène: codant: pour un sntigène apparenté à:; Rvll96 ou Rv0I2S- De façon appropriée, l'sdénqvirus; simien non humain comprend un pent on de |;ÇQ ID: LO : 10, un hexon de SEQ ID ND : il ou une fibre de SEQ ID MO : 12, en particulier Un pen L. c n de SEQ ID NO : 10, un hexon dp SpQ ID î NO 11 et une; fibre de SEQ ID NO: : 12. En variante, 1 'adénovirus simien non humain comprend un pent on: de s;EQ: ID NO : 15, un hexon de SEQ: Ip. NC) : 16 ou uns fibre dé QEQ ID NO : 17, en particulier un pent on de SEQ ID; ffQ t 15, un hexon de SEQ ID NO : 16 et une f ihre de SEQ ID NO : 17. En outre:, 1'adénovirus simien non humain peut comprendre un peiitas d# SEQ ID Nö: :. 20; un hexon; de SEQ ID NO :; 2:1 ou une- fibre de SEQ ID NO :; 22, en parrn cul 1er un penton de SEI ID NO : 21, Un hexon de SEQ Iß NO : 22: et une flore de: SEQ ID NO 1 232
Le transgéne: codant pour un antigene apparent·#:: à EviUS peut lira· une séquencé codant poux un po1ypept ide comprenant, comme constitué de, une séquence présentant au moins 30 % d Videntité; avee SEQ IB NO : 1, spécialement au moine 95 %, par exemple au moins 90 comme au moins 99 % avec SEQ ID NO : 1., comme SEQ ID NO : 1.
Le transgène codant pour un antigène apparenté à RvO 12 peut être une séquence codant pour un polypeptide comprenant, comme constitué de, une séquence présentant au moins 90 % d'identité avec SEQ ID NO l 3, spécialement au moins 95 %, par exemple au moins 38 comme: au moins 99 I avec SEQ ID NO : 3, comme SEQ;; ID NO 3.
De façon appropriée,, le transgène1 codera pour un antigène; comprenant (comme:: constitué: dé) une séquence présentant an moins: $·Θ: % d'identité avec SEQ ID: NO : €:>: En variante, le· "transgene, .codera pour an antigène, comprenant (comme constitué de} un fragment de SEQ ÏD NO : 6 qui a une; longueur d'au moins 150 acides; aminés. Dans certains mode s de réalisation, sic transgène codera pour un antigène, comprenant (comme constitué. de) les acides aminés 2 à. 723;: de EEQ; IDiNQ: ! 6. De façon appropriée:, le transgène comprend SEQ ID: NO : :8 ou l';un de ses variants: dégénérés présentant au moine 95 % d1identité avec BÈQÎ 'ID KD : (8:::, Dan*:; certains; modes de: réalisation, le Iran s gène comprend SEÇ) XD. NO ; 8 .
De façon appropriée, 1'adénovi rus est déficient pour la réplicationPar exemple, 1 'adénovirus comprend; une inactivation fonctionne lie (comme une délétion) du gène El, f ’ adénovirus peut comprendre une inactivation fonctionnelle {comme une délétion) du gène El. L1adénovirus peut également comprendre une inactivation fonot.ionno 11 e (comme une délétion) du gène E3. L'adénovirus peut également comprendre une Substitution du gène Ad5E4orf6,
Des exemples dé constructions # adénovirus; selon 1 ’ in vent, ion sont ceux ayant la séquence nucléotidique de; SEQ: ID NO r 13 ou 18.
Un aspect; supplémentaire de l’invention est. une séquence polynucléotidique comprenant SË£J IB NO : 13 ou j 8, comme une séquence polynuoléoi i dique sonst i tuée de ses;; Π) NO : 13 ou 18 . Régimes d’immunisation, populations cibles et modes d’administration
Dans un mode de réalisai i on, le sujet reçoit une seule dose de l’antigène polypeptidique et une spule dose de 1'adénovirus associé. Dans d’autres modes de réalisation, le sujet reçoit deux doses de l’antigène polypeptidique et une seule dosé do 1’adénovirus associé (la dose supplémentaire de 1(antigène polypeptidique: peut être donnée: avant l’initiation des procédés classiques protéine/adénovirus ou adénovirus /protéine pu à la suite de la compléti on des procédés classiques) , Dans d;:> autres modes de réalisation;,:: le sujet reçoit une: dose de l'antigène: polypeptidique et deux doses de .1 * adérioviriis associé (la dosa supplémentaire de 1'adénovirus associé peut être donnée ayant l'initiation de® procédés: classiques· protéine/adénovirus ou adênovirus/protéine ou à la suite: de la; complétion des procédés c la s® i que®} . Lorsque deux doses d( adénovirus codant pour I * anti gêné; sont: fourni es, elles peuvent iitiliser ou pas: la même: souct@: d:Iadénovirus et le même insêrh.
Lorsque le sujet reçoit, deux, dosas d ' antigène poiypepiidigue, de façon appropriée, la dope supplémentaire est d'une Semaine à trois mois,: en particuirer de deux semaines: à deux mois, généralement de; trois semaines à: six: semaines:, calme de trois semaines à cinq semaines,, par exemple autour de quatre semaines avant 11 initiation ou à la suite dé la complétion; du procédé classique.
Lorsque le sujet reçoit doux doses d'adénovirus associé, de façon appropriée, la dose supplémentaire est d'une semaine à trois mois, en particulier de deux: semaines à deux mois, généralement de trois semaines à six semaines, comme de trois semaines à cinq semaine®;, par exemple autour de quatre semaines ayant 1 ' initiation ou à la suite de la complétion du procédé cIa ss ique.
Le sujet à traiter en utilisant lé procédé dé l’invention peut être d ' un âge quelconque. Dans on aspect de l'invention, le sujut est un être humain.
Dans un mode de; réalisation, le sujet est un être humain adulte (généralement âgé de 18 à 60 ans).
Les compositions du polypeptide et de 1!adénovirus peuvent être administrées par diverses voies appropriées, y compris une: administration·' pu rent érale, comme: intramusculaire ou sous^eniarièe.
Dans un mode de réaiiuafion: particulier, les une ou plusieurs: çoiaposipions sont: administrées par ydie ihtrhdèimique. Le: terme intradermique 'tel. qu’utilisé ici est prévu: se rapporter ä I ' application: d'antigenes dans: lè :derme fet/ou 1 ’ épiderme: dp la peau humaine. L'application intraderraique et’une composition immunogène peut être effectuée en, utilisant un procédé cutané; quelconque connu de L1 homme du métier' y compris, mais n'y étant pas limité, une administration en utilisant un dispositif à aiguille courte :('urï dispostt i i. comprenant: une rnioro-aigui. lie dont la longueur se situe entra environ 0,2 et environ 0, 6 mm) ou une 'Utilisation, en utilisant: un patch cutané. Des dispositifs appropriés pour une utilisai ion avec les vaccins cutanés décrits ici comprennent des dispositifs à aiguille courte tels que ceux décrits dans les documents OS 4 886 4:99, US b 190 52.1, US b 328 483, US 5 527 288, US 4 270 537, OS 5 015 235, US 5 141 495, US 5 417 662 et ËP 1092441. Les vaccins cutanés peuvent être également administrés par dos d.i npositifs qui lirai Lent la longueur: de ponét ration efficace d’une aiguille dans .la peau, tels que ceux décri ta dans le document WO 99/34850. Sont également appropriés, des dispositifs d’injection à jet qui administrent des vaccins liquides dans le derme à l’aide d1 un Injccteur de: iêt liquide ou à l'aide d ’ une aiguille. Sont également appropriés, des dispos il.:· i s balistiques d'administration de poudre/particules: qui utilisent du gaz comprimé pour accélérer le vaccin sous forme de poudré; à travers igS; couches externes de 'la peau jüsqüdhäii derme. hes:: patçhes cutanés comprendront généralement une plague d'appui qui comprend: un substrat solide. Les patches administrent X’ahtùgèhg et l’adjuvant utilisés dans 1 ’ invention, au derme ou à l'épiderme. Dans un mode de réalisation! particulier, les ipatehes utiles. dans la présente; invention comprennent: une pluralité de microprojections. Les:; o*i$ peuvent: être de touté forme appropriée pour percer ia: couche cornée, l ' épiderme ol / ou le derme: Pt administrer1' l’antigène et 1 ' adjuvant à l'épiderme .PU: ;àp: derme. Dans uUsmode de réalisation particulier:, lés microprojectiens sont biodégradables et comprennent un polymère foiodégradable.
Dans uné: variante d'approche, le polypeptide peut, être administré par voie i nt ramuscn lai re et 1 ' adenovirus administré par vo.i e liftranassle ou par aérosol aux poumons.
De façon appropriée, les: deux compositions sont administrées: par voie intramusculaire.
Les compositions immunogènes utilisées dans 1 1 invention peuvent être fabriquées en mélangeant le ou les antigènes et % ' adjuvant. Le ou les antigènes pèuyênt être fournis abus une forme lyophilisée ou dans unê; formulation liquide.: Il peut ptre fourni, un kit comprênant; un premier récipient comprenant l'antigène et un second récipient comprenant: I 'adjuvant.
De façon appropriée, lés compositions selon la présente invention ont., un volume de dose humaine situe entre 0,05 ml et 1 ml, cotntftë; entre 0,1 et 0,5 ml, en particulier un volume de dose d:* environ Ou 5 rai, pu: t,:'f ml, Le volume de la seconde: composi L : on irmunogèmé .peut être réduit, «t s.e: situer, par: exemple, entre 0,05 inl et 0,5 ml, comme entre 0,1 et 0,2 ml.. Les vq i lime a des compositions Uitrllsës peuvent dépendre de la voie d' administration avec des doses plus petites étant données: par: la vola intradermique ·
Les autres modem de réaff nation: de invention comprennent: i (a) Un adenovirus s i.mien non humain comprenant un transgène codant pour un antigène apparenté à: lvl.196 ou RvO12b, ledit adenovirus comportant au moins le ponton de SEQ ID 10 : 20, 1’hexon de SEQ ID NO : 21 ou la fibre de SEQ ID HO : 22. (b) 1. 'adenovirus simien non humain selon (a), comprenant les protéines oenton {SEQ ID NO : 20}:, hexon (SEQ IDtNO: : 2:1}¾ et libre (SEQ ID HO : 2:21 dé CbMll'Sl {eh 1,! adénovifus' simien non humain selon soit: (a) soit (b) oli l'antigène: codé comprend: une séquence présentant au moins 90: % d'identité avec SEQ ID :I|Q/ : 6, ::{:d;:}: L:' ariénovi.rus simien toa humain selon l'un quelconque: de (a), (b) ou (q) QU l'antigène codé comprend un fragment: de SEQ ID MO : 6 qui a une longueur d'au moine 4S0 acides aminés, comme les acides aminés 2 à 723: de SEQ ID HO : 6, (e) L'ndènovirus simien non humain selon 1'(un quelconque de fa} à (;dj , qui est un adenovirus déficient pour la réplication, (f ) !.i1 a<iénovirus :ùlraie.n: non humain sel on 1 un quelconque dé (a) a {e} , ou 3 'adenovirus comprend une inactiva tien fonctionnelle {comme une: délétion) du gène El. (g) 'Ij ' a;;(jéno:\iri::5:us: simien non hitmalh selon 1 ' un qtelconque de {a:) è (fl,: où lladénoviruâ comprend une inactivation, fonetionnellê (comme une délétion) du gène M. (h) Lfadéadvlros simien nun humain: selon l'un quelconque de (a| à; (gi, où l'adenovirus comprend une inactivâtion fonctionnelle (comme une bélétion) du gène 13:'',: (T) L'adénovirus simien non humain ne Ion 1'un quelconque de (a)s à {&amp;) , où 1 'adénovirus comprend. une substitution: du gêne: AdSE^otf®..
Les dh:s:ei..gqetten:ts· de toutes les références' dans la présente demande, y comprit: les demandes de brevet et les brevets: délivré^:, sont:: incorporés ici en référence dans leur intégralité·. One: composition ou une méthode ou un /procédé; déf i ni comme « comprenant » cer tains éléments doit être compris comme englobant une composition, une méthode ou un procédé (respect .i vement ) constitué de ces éléments. L'invention va être on outre: dicrite en référence aux exemples non I Imitatifs suivants.
Exemples
Exemple 1 ·-· Production: dès vecteurs ChAdl. et 'ChAdéd: codant pour la protéine :17;2: iFqbrication.. "des c ο n s i : r u c t i ο n s
One séquencé d'ADN de M72 a été optimisée par GoneArt© (], i fe Technologies Corporat i on) pour l'expression humaine (S;EQ TD NO î B} . Selon des procédés classiques, la séquence: d'ADN optimisée a été y y ni. hétisée et c .1 onde par ββηο&amp;Είζ© sous le contrôle du système; promoteur du HCMV ~ Tetü et de séquences polyA de la B GH dans le plasrai.de n ave‘.te P VJ en utilisant les sites de restriction EcoRV-Mpil♦ de qfasmide a été clivé par les enzymes de restriction Spel et Sgiî et recombiné dans le vecteur soit ChAdÛ (avec délétions de El et E4.) seit ChAd63 {avec; délétions de El, E3 et Eà) par recombinai soir Pomologue dans B. coli ;BJ5183,
En bref, la construction des vecteurs ChAd.3 s ' est. déroulée; par; l'intermédiaire des étapes fournies ci-dessous;
Ee; ;yécteut pChAd3 est dérivé du génome de 11 adênovirus;: dé chimpanzé de type 3 de type sauvage. 1 ’ adén©virus; de chimpanzé de type 3 de type sauvage n été isolé d'un jeune chimpanzé et bonne santé: hébergé dans i1 établissement ds les Iher i a Research Center (New Ibei:i.a Research Center;: The üniversity of Louisiana à Lafayettej en utilisant dos procédures classiques* Le génome viral a été ensuite cloné: dans un vecteur p]asmidique et ensuite modifié pour porter les modifications suivantes dans différentés régions du génome viral du ChAd3 .ts 1) la délétion de la région El (do la pb 4GO à la pb 354 3) du génome: virai ; 2) la délétion de la région codante B 4 entière de ChAdB {couvrant les nucléotides 34634 à 37349 de la séquence de type sa rivage du Ch Ad 3) et la substitution par le gène A.d5E4orl6. La région délétée; contenait la totalité de i a région E4: à ! ’ excopl. ion du prompteur natif de E4 et du signal de polyadënylation,
La;; iconstructiön? des vecteurs Cfo&amp;d"63: .s'est déroulée pa !. Ij'ïBÎerniédiaire: des étapes tou, râle s ci--dessous . l'adênoyirus de chiimparité de type 63 de type sauvage a été isolé d’ un groupe de chimpanzés en bonne santé hébergés dans 1 'établissement de |few Ib.eria en utilisant des procédures classiques:, te génome viral a été: ensuite cloné dans un 'vé&amp;té'ur piasm!digue et ensuite modifié pour porter lës: mpdiflestions suivantes dans différentes régions du génome viral du ChAd63 : 1} la délétion de 1 a région El (de la pb; 456: à 1.a pb 3421} du génome vi ra i ; 2) la délétion de la région 13 (de la pb 27208 à la pb 31786) du génome viral ; 3) la délétion de la région codante 14 entière du ChÂd€3 (couvrant les nucléotides 33ü2b à 3621 6 de la séquence: de typé sauvage du Ch/\d63) et la ; substitution par le gehe Ä5;E:4örf:0. La région;: délétée contena it la totalité de la région E4 à 1‘exception du promoteur ,nati.f de E4 èt: ïdh, signa.], de poivudènylatron.
Test de confirmation
Des virus récupérés et des: virus cl1 amp i i i ication (du passage 1 au passage 4) ont été produits dans la lignée cellulaire proceï .1.-92. S selon des procédures olgsBlques et la structure génétique des ADN Vifaux a été vérifiée au passage 3 {M72~ühAd63) ou au passage 4 (M72-ChAd3.) par deux schémas do restriction différents. Chaque virus recombinant a été purifié à partir d'une culture à l’échelle: de 1 litre par i'ixitermëdiaire d’un procédé: a gradiënt ch·: CSCi. Les virus purifiés ont été titrés par PCR quantitative et I’lnféchivité a été mesurée par un procédé d ' i3mrunocplorat:ion: de si' héron.
La bonne expression de M72 a épi confirmée par Western blot* après infection d'lifte lignée cellulaire BéLa ayée dès virus pari fies. La stabilité génomique a été évaluée jusqu:'au passage: löset la: séquence d’ADN de là. cassette dj expres s ion complète a été confirmée par séquençage.
Exemple 2 ~ Etude de la dose d’adénovirus chez : des souris
Groupes testés L'objectif do cette étude a été d' estimer et de comparer l'immunogénicité dé 2 adénovirus de chimpanzé Godant pour l'antigène: M72 dè la tuberculose : M72--
CftAd3 et M72~ChAd6'3. Les adénovi rus ont été produit s Selon 1'exemple 1. A des souri, à CB6Ei/©iaÎlsd femelles âgéosi de :6 semaines, 12 sduris par groupé:, il a été injecté par la voie; intramusculaire 50 μΐ au jour $ (.solution :dè ChAd3 : pH ?, 4, 1¾ mM de TRIS, 10; mM d'ftistidine, 5 i de saccharose, 75 mM de NaÇlq 1 mM de MgGlà, 0,02 | de polyserbate 80, 0,1 mM d.'EDTA, 0,5 (y/U:} d'éthanol 7 solution de ChAd.63 pH €,r 6, 1:0 ::mM d'histddine, 7,5t| de saccharose, 35 mM de NàCl, L. mM de MgGlm, 0,1 % de polysorbate 80, 0,1 roM d ‘ EDTA, ü, 5 % fv/v) d'éthanol:) r
Afin de disposer d * un vol ume suffisant, le sang:: total de 4 groupes de 3 souris pour les groupes a été; prélevé aux jours Ί, 14> ft 21·
Mesure de la réponse immun it-a ire cellulaire - Coloration des cytokines intrace!lulaires (ICC;
Isoi ornent des leucocytes à partir du sang total A chaque point de temps, du sang a été prélevé à partir: de chaque souris et; ensuite: groupé (4 groupes de 3 souris1) . te sang a été prélevé: dans des sfcubes contenant;,'du kPMl/nddiLids (ΕΡΜΑ 1 niO, comflêménté: avec de la glutarrdne, de la pénicillineistrepfeomyciné:, du pyruvate de sodium, dés.: acides: aminés non essentiels et du 2-me reapt o é i h a η o 1 ) contenu ut 5 0 0 0 unités /m'1 d ’ héparine (héparine:: Leo) . Dix volumes de tampon de lyse ont été:: ajoutés au sang totale et les: tubes; ont été incubés à température ambiante (TA) pendant 10 min. Après centrifugation {335 g, .10 min à TA) , le culot a été récolté dans du R PM I./ add i t; i fs et filtré (tamis coi lu lai re de 100 pm) . Les cellules ont été à nouveau centrifugées ( 335 g, 10 min à TA) et remises on suspension dans du rai lieu complet (P PMI 1640, coïftpléménté avec de la glutamine, de la pénicillinelstreptomycine, du pyruvate de sodium, des acides aminés non essentiels· et du 2···mercap i<.,é r.ha ηo 1, et: 5 % de sérum de veaUs fcètàl inactive à la chaleur) . Stimulation in vitro des leucocytes trais Des leucocytes ont été déposés sut sdns; flaques de SS puits à fond arrondi à approximativement 1 .million de ce I Iules par puits. Les leucocytes ont été ensuite stimulés pendant 6 heures (37 °C, 5 % de COI avec des anticorps anti~CD28 (clone 37,51) et anti-CDi9d (cloné 9C10) à 1 pg/ml, avec: eu sans 'I pg/ml de peptides couvrant 1a séquence de 872 (mélange do peptides 15-mer se chevauchant sur .1.1 résidus d * acides aminés). Après une période de stimulation de 2 heures, du réactif BD GolgiPlug™ contenant de la broie ldi.ne A dilue dans du milieu complet (dilution finale au 1/1000} a été ajouté pendant 4 heures supplémentaires, tés plaques ont été ènsuité: transférées à 1 °C, pendant une huit.: IM de l’IFKg, de 17 IL-2, du T N F-a Les cellules ont été colorées et analysées en utilisant un test ICS a $ copieurs.
Les cellules ont été: transférées dans des plaques de 96 puits à fond en formé de; Y, centrifugées à 189 g pendant 5 min à 4 °C après lavage avec 700 ql de tampon circulant (PBS IX, 1 % dé remises en suspension dans :5Q pi de tampon circulant contenant dçs anticorps anti-MM/·3'2 (clone 2.4G2) dilués au : /50, pendant: 10 min,: :à: 4 °c. Puis, 50 pl de tampen circulant contenant des anticorps anti-004-VISd (clone RM4~S:r dilués au 1/50} et anti-CDS-PerGp-Cyd.d...../clone $Μ~φ.7..+ dilués au 1/50) et du AÏVE/DEAÔ® Pacifie Orange (Lifo Technologies, dilué ans 1/500) ont été ajoutés pendant 30 min à 4 °C!. Les cellules ont été centrifugées (18 9 g pendant. S min à: 4 °G:): et iaivées ivec 200 μi do tampon circulant.
Les leucocytes ont. été fixés et. perméabilisés par .1 * addition de 200 μΐ de solution C y t o f Λ x / C y i op e r m (tampon commercial de Becton Dickinson} pendant 2U min à 4 c'C. Les cellules ont été centrifugées: (IBS g: pendant 5 min à 4 °G) et lavées avec 200 μΐ de tampon Perrri/Wash {tampon commercial de Becton Di okinson dilué au 1/10 dans de l'eau distillée). Après une autre étape de centrifugation, les cellules ont été colorées dans 50 μ i. de tampon Perm/Wash avec des anticorps ant i —11:2 — F ITC (clone JES6-5H4, dilues au 1/400) , ant i-IFNg-APC: (clone XMG1.2, dilués au l/iOD) et anti-TNFa-®l! (clone MP6-XT22, dilués au 1/700), pendant 1 heure a 4 °C. Les cellules: ont été lavées; dieux fois avec le tampon Perm/itosh et rémises en suspension dans 220: pi de PBS. Les cellules colorées: ont été analysées par cytométrie en flux: en utilisant: un LS R II et le logiciel FlowJo. Résulta··, s
Comme on peut le voit sur les: figurés 1 et 2 (réponse des lymphocytes T CDi pour les sonst routions if?2-ChÂd3 et jä72---ChÄd€3 respectivement) ét sur les figures 1 et 4 (réponse: .des lymphocytes; T CBS pour les cons t ruct ions M? 2-ChAd3 et ÎÎlX-ChAdéd r e spe et i. v emon t ) , une; dose de 1 x 10s particules virales par souris a induit lë taux le plus élevé de réponse spécifique de M72 au point de temps 14 PI pour I es deux constructions M72-Ch&amp;d3 et M?2;-~ChAd6;3.
Exemple 3 - Etude de 1'impact de la coformulation de 1 ' adenovirus et de 1:'adjuvant sur 11 infectivité
Ij 'impact: dé Ia odfarmula t iqh a été évalué av.ec: l ' eGF?~0hAd3 ou lleßFMhÄdBd recombinant. Ces ChAd3 et Chl.ci63 sont des témoins construits (pour; exprimer la protéine fluorescente verte à la place du tren.sgênéi i:P‘12 dan S; les squelettes respectifs et ' adénovirnS de chimpanzé |ChAd3 d éi été de EP -F, 4 et ChAd63 délété de El-lddËl): la doformulatidn avec 1 ’ ASOli (une. foritdlatidn: liposomique de I ' agoniste du TLK4, ie et. dé la. sapon.ine QS21) a été évaluée à l'aide d'un test. d'ilnfeotlvltéabasé sur"des cellules Hela,.
Hatét!aux et procédés lesé d:tinfe.o t i vité
Dies cellules Héla ont été développées en eroissdnee expoïïéitâélle et ensemencées pendant 24 il avant. l'Infection. Des cellules ReLa ont été utilisées en t. rc les passages Pi 5 et P 65 (Mol.bi.ol ; G SK Rix) .
Jou r 0 : rèco.i to des cellules le milieu a été prélevé du flacon et les cellules ont été rincées s o i g no u s e me n t avec du DPBS pour él.i.miner le milieu cellulaire résiduel. 5 ml de trypsinerlDl&amp; ont été: ajoutés sur les cellules, eèc! suivi dé: 1* observât ion des: cellules sous microscope Inversé gusquiau détachement; et la dispersion de 1 a couche cellulaire (2: à 4 minutes) . La suspension cellui aire a été doucement pipe bée vers le hau b et vers le pas et transférée dans le tube Faicon et centrifugée à 1200 trlaln: pendant 5 à 10 minutes à température ambiante, le culot cellulairés à été remis en suspension dans un volume approprié et compté:, les cellules1 ont; été ensemencées dans une plaque de 96 puits à 1,5 x 104 c e 1.1 u 1 o s / p u i. t s ( on s'attend à ce que les cellules ÉsLa soient: é. 3 x 104 ceilûies/puits le jour de 1 *infsetion). «Jour 1 : j our de 11 i n i ect.lon tes ce! i nies HeLa ont été observées et elles étaient confidentes de 50 % à B0 .Le milieu entier a été prélevé dés: eelïu les. Les stocks d ' cGFP-ChÂdl et d ' edFP-ChAdGS reooinbinants ont été d:i. lues ) usqn ' à un titre final de 5 x 107 ptlml: dans 80 μΐ de milieu de Eagle modifié par Du!becco complet (DMEM) , fe voiuïue ©St pour 1 pulls. 80 μΐ dié chaque échantillon ont été ajournés dans chaque puits pour infecter (ceci est réalisé en double) , Hn témoin négatif de cellules Meta non infectées avec une formulation avec des: tampons seuls dans du DMEM complet: a été utilisé pour' si&amp;esurér tout impact négatif sur: 1 ’ adéno-infectivité dû au tampon de i'adjuvant. Un témoin positif do l'infection de: cellulés: HeLa infectées avec 1 ' eGFP-ChAd3 (mêmes conditions d'infection) a été traité dans des conditions identiques. Âpres 3 heu tes à 3 7 * C, 5 % de Q&amp;2f 120 μ I de DMEM complet ont été ajoutés et ensuite 1 es cellules ont été cultivées a 37 "C, 5 % de ¢)0¾ pendant approxima tivement 2Ί heures.
Jour % : récolte et lecture de FACS
Les surnageants cellulaires ont été récoltés dans une plaque de 96 puits. Les cellules Hela ont été rincées avec 40 μ! de trypsine/EDTA et ensuite incubées avec encore 4 0 pi du mélange tryps i ne/EDTA, One fois que les: cellules se sont détachées do la plague, chaque puits a été: alors doucement purgé pour récupérer toutes les cellules. La plaque de 96 puits a été ensuite centrifugée à 1200 t r/min pendant 10 minutes. Les eu r nageants ont été: jetée. Les col iules ont été éïi suspens i.on dans: :£:$:Q: fi de DPBü et maintenues à I cC i usqu! à la. résiiéafiô'ii dé .1! acquisition FAC S sur ce lie S"- ci : 08RII Beekman Dickirson) . Résultats
tarnpöö ÄS pit B, 0, 10 ·ϊ·Μ de PO.j, 5 jnK de NaCl, 4, ' % de nor bitol tampon Oh Ad .3 : pH 7, 4, IC :hiM de TRÏ'S, 10 mM d' hlar/idi.rRj, 5 % de Saccharose, 75 raM de NaPl, I. siM de MaC3.>, 0,0¾ % de poiysor.b.·:;· o 80, 0,1 ïïiM d’KDTA, 0:,5 $ fv/v) o’ei:hanci. tampon ChÄd63 : pH 6,6, 10 ïrM dthé^tidlnè, 7,5 % de saccharose, 35 ffiM de Na Cl, 1 mM de MqOb, 0,1 % de poiysorbate 80, ü, 1 m.M d'EDTA, 0,5 I (v/v) U' éthanol les données sont exprimées: en pourcentage de cellules exprimant la GFP en corrélation avec le nombre de cellules infectées par le virus ChAd-GFP. Pour foutes les conditions, la viabilité cellulaire a été enregistrée:. Ceci a été réalisé: pour estimer toute toxicité ce 3. lu la ire possible gui pourrait fausser la conclusion. Heureusement, ceci n'a pas été le cas car la viabilité çaliaiaita dans toutes les conditions a été: acceptable et comparable.
Selon lés données/ aucun, impact négatif de 1 VAS sur soit GhAd3- soit: ChAdfé-GFP n'est observe. te véctédî: Cft&amp;d3~GFP coformaié avec l'AS01S a gardé son potentiel dtinfectivite/: gui était cd^afable au CbÂd3--· GFP seul.
La même observation à été faite pour le ChAdUi-GFP Dans ce dernier cas, une augmentai, ion de l'infectivité a meme été observée, laquelle peut:: être due aux tampons ut i lises dans J es quel s 1 ' a dé nô virus·: à: été dilué.
Exemple I o; gitude de l'impact de: la :eoformulâti®n de 1 ' édênovirga; et; de 1 ‘ adjuvant sur la neuf ralisat :i.on du QS21: L 'Objectif de .1 ' étude a été de vérif ier la dé t o.x i f i cet .i. on du QS21 .
Ca ra c t é r i s a t ion s
Les échantillons formulés contenant 1 ' adjuvant: ou le ::tampon .fie: 1 ' adjuvant .ont: une osmolalité: > 28 5 mösti/lg. le pli a été pn;|# sur un bâtonnet indicateur;.
Lavage; des érythrocytes
Lps; érythrocytes (IQ: rai) ont ôté centrifugés pendant 10 rain i|: 1.60:0; trJïsàii.. fSSÖ g) 'M 4 et le surnageant a été; prélevé. Les; érythrocytes ont été doucement remis en suspension avec un volume de tampon it-BS jiuspu'au volume à' o? iqrne f± 10 mi.) . L' opéra tion a été répétée {minimum dé 2 à: 3 toi s) jusqu ' à dé que le surnageant soit limpide (disparition de la coloration rougeâtre, ma i s .1 e surnageant ne devient jamais; complètement translucide) et on a ensuite éliminé le dernier surnageant après lavage. Le culot a été stocké à 4 °0 pendant un maximum de 8 à 4 jours s*il n'est pas utilisé directement (et lavé; à nouveau lé jour où il est utilisé) et il a été dilué environ uu 1/10 dans le tampon s'il est utilisé le meme: jour.
Prédi lut .ions des érythrocytes
Il a été effectué differentes prédilulions des érythrocytes::. La prédi lut i on pour laquelle il est atteint 100 % de lysé; avec une valeur de DO (540 nm) située; entre 1,5 gf 2 % été choisie. L:öS dilutions suivantes: ont "'été préparées dans des tubes d'bémol |pe<>
Les; érythrocytes: ont été :ôé'ïï'trifugés (ÎO rai) pendant; ï# ®in.ute;&amp; à 1600 tr/rain :{5:$.Q ;g) à 4 °C. 100 μΐ dé la jprédlliition: ont été prélevés, mélangés avec 000 μι d'eau pour inieeLable et centrifugés pendant 5 minutes à 2 000 hr/rain {900 g) . Le surnageant a été: transféré: dans une cuvette pour speet. roscορie et la DO a été mesurée a 540 nm. La dilution choisie a donné une DO située entré; 1, b et 2.
Préparation de .la courbe d'étalonnage du QS21
La courbe d’ étalonnage du QS2.1 a été fabriquée à partir d'une solution dé travail: de QS21 (à 2 mglïïtl;! diluée ex t erop o r an érae n t à 20 pgiiib dans du tampon: P04/S:ôi:bitdl .
La détermnation de l'activité lytique a été réalisée par un test dee limites. il. La limite de: détection ;i,OD) a été définie comme ici concentration la plus basse de QS21 menant à une DO : - supérieure au taux de base (DO > 0,1) - autour de trois fois supérieure à la DO du tampon (le « 0 uq » du QS21) — dans la partie ascendante de la courbe ^ déterminée pour chaque test. 2 . L ' act:i vi.té 1 y L .1 que du QS21 a été retenue comme Étant positive dans 1 os échuntilions d’adjuvant si la DO pour 1’óchant i11 on d'adj avant était supérieure a la DOvo.
Exemple de courbe du QS21
*Éôcsptô i si 1® delta (DO de il* eeharitillon >* DO du tampo-O; < tOD (lit)) eîu test du. jour ^ÎSe jatê :: si le delta (DÖ de 1'éöïiant iiiör! - DO du t:anpo·» ) > ï-OD |pO) φϊ·, test du. ;|:0:UÙ
Conclusion
Lors d’une forma tat ion de I ' eGFP ChÂc.j 3 et de I ’ eGFP-ChÂd63 séparément avec de Ί ’ ï\S01 K, la taille de l'adjuvant demeure inchangée apres la formulation. En outre, il n'y a pas de QS21 libre après ! a formulation, comme il est observé par le test de i y se des érythrocyles.
Exemple 5 - Régi tue s de dosage de M72 Evaluation de .1. * application de vecteurs adénoviraux de chimpanzé ne se répliquant pas exprimant M72 dans le contexte d'un vaqcin contre la tuberculose, par estimation des deux stratégies de vaccination par sensibilisation.·“ rappel homologue (ühÄd/C.hÄd) et hétérologue (Prot/CîiAd ou ChAd/Prot) ainsi qu'en combinaison avec le M72/ASÛ1E donné en mélange ou en c oadmi n i s t r a t i o n,
Matériaux et procédés Modèle animal A des souris CBöFI/OiaKsd femelles - âgées de 6 semaines - 12 souris par groupe - il a été injecté par voie intramusculaire 50. μΐ aux jours 0 et 28 comme il est indiqué dans le tableau ci-dessous.
;t.ampönÄS : aj!px-ö5ïie«3+viwem<3nt tjjjö 3,0:, löi igM Sb a*K »eei, £,? % de sbibitoï tampon ChÄti3 : pH 7,4, IC ntt d'#· 08¾ 1Ö -h S de sacchsr.oaè, :7S' raid .dp 'SaCl:, 1 ïii&amp;ï cie •McfOlî, 0,02 % de polyeiorbate: :8Ö, .0,:.1 tö-i d'EDT.t, Ö,:S %: iy/'y} d'ethanol tampon ChAd63 : pH, 6>::6, ilö jriil déiirstididbi.' %$· %: '§&amp; 'iS'Sööharb&amp;e, 35 t®5 de -Hadt 1 «M ite MgCIs* 0., 1 %: dé ipoiysotbate 80, 0,1 aiM d'söm,: 0,5 i iv/v) ü’éthanol
limitât,ions;i3^"pïéi®Pè^i|s! ;pûlmona.ir:es pas joui, par cörisëguéöt:: 1 ' etude a été etf octuóe en plusieurs rép.i.icats * * Pour -ie;; ; olmens pratiques, I er, échantillons do sér-jjn ont été prélevés 1 jpar avant, le sang total
Afin de disposen d * un volume suffisant, le sang total de I groupes de 3 souris pour les groupes a ité prélevé uux jours 14, et 42. Au jouir: 42, le même-procédé a été appliqué pour les poumons. A cause des 1 imitation.'? de prélèvement par ίour., un groupe! do chaque groupe: a été traité pair jour -durant 4 jours afin de disposer de 4 groupes par groupe. Des sérums individuels ont été prélevés au jour 41.
Les souris ont été identifiées afin de faire le lien entré PI. et PII pour les deux lectures d ' ICS et de sérologie. Réponse immunitaire cellulaire ··· Coloration des cytokines intracellulaires:: (ICS)
Isolement des lëueoeyiés à partir du sang total A chaque point de temps, du sang a été prélève à partir de chaque souris et ensuite groupé (4 groupes de :3i souris) . Le sang a été prélevé dans des tubes contenant du &amp;f!f4T/additifs fRpMÏ 1640, complémenté avec de la glutamine, de la pénicilline/s treptovffyci -e, du pyruvate de sodium, des! acides aminés non essentiels ét du 2™mercaptoéthanQXj: çontexiant de 11' héparine {1/101. Dix volumes de tampon de lyse ont été ajoutés au sang total et les tubes ont été incubés à température ambiante (TA) pendant 1;0: min. Après centrifugation (335 g, 10 min à TA) , lé' culot ;a, été récolté dans du RPMI/additifs et filtré: {tarais! cellulaire tte lOQ μ®).
Les cellules ont été; à nouveau centrifugées .....pli g, 10 min à TA} et remises en su spëhsi on dans du milieu complet (RRMI 1640, complémenté avec de la glutamine, de 1 a pén i ci.1.1 ine / 5?t rep t omyc A.rse, du py ruvate de sodium, des acides aminés non essentiels et du 2-mercapte™ éthanol, ét; 5 % 'ti©:: sérum de -veau foetal Inactivé à la, chaleur).
Isolément des: leucocytes à partir du poumon
Le poumon a été prélevé dans des tubes courenant du HFMI /addi ti fs (R.PMÏ IML;, complimenté avec de la g J ut anti ne, de la p én i ci 1.1. i n e / s t r e p t omy c i n e, du pyr uvale dp: sodium,, des aeides aminés non essentiels et du 2-raereaptoél hanoï 5 . t. ' échantillon. a été transféré; dans une boite de Petri et le prélèvement a été découpé en petits morceaux (approximativement 5 x :5 mm) « tes prélèvements ont été remis en suspension dans un tube Gent]oMACS G (violet) contenant 10 ml de milieu complet préchauffé contenant de ia Libéra se ( t), 0 62 5 U1 /mi -50 pi) t DNase (25 μ g - 2b μΐ) . Le tube C a été fixé la tête en béé dans le manchon du dissoeiateur GentleMACS le prbgrarrane poumon de: souris 02 (40 s) a été exécuté. A ia fin du programmé/: Le tube C tube a été détaché et. incubé pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur sous agitation. Après 1rincubation/ 1'échantillon a été: transféré' sur un tarais: cellulaire (100 nm) placé eur un tube na Icon de 50 ml,. Lé tamis cellulaire a été rincé deux foie: avec 5 ml de milieu complét (RPMÏ l&amp;lô, "ç omplém&amp;ïit éf avec de la: glutamine, de la p é n i c i .1 i i. a e / s t r e p t: omy ein e, du py ru va te dé sodium:, des acides aminés; mm essen biels cl du 2 -mereeptoéthanoi, et 5 % de sérum de veau fœtal Inactivé à la chaleur) . Du milieu Complet a été ajouté jusqu'à 4 5 ml. Lès cellules ont été centrifugées (4 00 g pendant 10 min -4 °C), le surnageant a été aspiré et ensuite les cellules ont été remises en suspension dans 10 ml de milieu complet. Gèftè étape de .lavage a été répétée.
Après: le second lavage, l es coliu.'l es ont été remises ©n suspension dans 3 ml do Per col I P30. La cou cite de PercoII F30 contenant les cellules a été placée au-dessus du gradient dés: couches Percol J P4Ö/P75. Les cellules ont été centrifugées pendant 20 rai n à 754 q a TA, Les cellules considérées se situaient à 1 inter phase entre P 40 et P75 à la fin de la centrifugation: (interphase inférieur©) · lié couche P3Ö a été aspirée' et; les ce 11 nie s* ont été recueillies à; 1inter phase; B40~P75:. Les; cellules ont été recueillies: dans un tufed de 15 mi ef; du milieu complet: a été ajouté jusqu'à un volume; final de 1.5:;BtU: Les cellules ont été centrifugées (900 g pendant: 10 min - 4 °C) . Le surnageant a été aspiré et: les cellules ont été lavées deux fois avec: 15 ml. h;ë milieu complet.. Le culot a été remis en suspension avec du milieu complét jusqu'à un volume final de 250 μΐ. Lés cellules ont été comptées par le procédé Macsquant incluant la viabilité avec du PI,
Stimulation in vitro des leucocytes frais
Des leucocytes; ont été déposés sur des plaques; de 96 puits à fond arrondi à approximativement 1 million: de ce? Ίinl.es par puits. Los leucocytes ont été ensuite stimulés pendant 6 heures (37 °C, 5 % de CCg) avec des anticorps ant i -CD28 (clone 37.51) et anr.i-CD49d (clone 9S10) à 1 pg /mi, avec ou sans 1 μ g/ml de peptides couvrant la séquence dé M72, Après: une stimulât i on de 2 heures, du réactif BD GolgiPluy™ contenant do la bref©ldine A dilué dans du railieu complet (dilution finale au 1/1000) a été ajouté pondant encore 4 heures.
Les plaques; ont été ensuite transférées à 4 °'&amp;r pendant une nuit. ICS de il IFNg, de 1 ' IL-2, du TlF-a - a 14 Si -Sang tôt a]. (üBLO)
Les cellules ont été colorées et analysées en· utilisant un t-es-fe ICS à 5 couleurs.
Les cellules ont été transférées dans des· spiaqueS: de :96 puits à Tonet en forme dé V, centrifugées | 1.8:0' g pendant: 5 min à i °C après lavage avec 200 pi :de tampon circulant (PBS·; 1¾ X % de: r cellules .ont été rémises en suspension dans 50 μΐ de tampon circulant contenant des anticorps anti ~C 0:16/32 {clone 2.4G2) dilués au 1/50,- pendant 10; min à 4 °:C. Ensuite, 50 pi de tampon circulant contenant des anticorps anti~C;M'~ ?450 (clone RM4- 5,: dilues aü 1/501 et apti-ÇRômperCp-Cy5.5 (clone 53(-6. Ί, dilués au .1 /50} et du réactif LivorDead PO (dilué au 1/500) ont: été ajoutés pendant 50 min à 4 °C. Les cellules ont été centrifugées (189 g pendant 5 rain à 4 nC) et lavées avec 200 μί de tampon circulant.
Les leucocytes ont', été fixés et p e rmé a b i X1 s é s par 1 'addition de 200 pl do solution C y i.. o f i x / C y t o p e r m (tampon commercial de Becton; pietinson) pendant 20: min à 4 wC. Les cellules ont été centrifugées (189 g pendant 5 min à 4 °C) et lavées avec 200 μί de tampon Perm/Wash ( tampon commercial do Bec ton D i.ckinson dilue au 1/! 0 dans; de l'eau distillée) . Après une autre étape de centrifugation, les cellules ont été colorées dans 50 μί de tampon Perm/Wash avec des anticorps anti-TL2-F1TC (clone ϋΕ36-5Η4, dilués au 1/400) , anti-ÏFNg-ÂPC (clone; XMG1.2, dilués au 1/200) et anti.-TNFa·-PE (clone MP6-XT22, dilués au 1/7|:Q:}, pendant 1 haare à 4 °c. Les: ieelidXes ont été lavées deux fois avec :1e tampon? Perm/fiash et: remises en suspension: dans 220 μ! dé ΓΒΰ. Les cellules? colorées: ont: été: analysées par cytométrie:: en flux en utilisant un LSRII et le logiciel FlgwJo. ICS? de i'TFNg, de 1 ' IL-2. du TNF-a et de .1 'IL-I7 è M PII - Sang total (WBLO) et poumon
Le même protocole a été utilise à 1 ’exception de l’ étape des cytokines ; les cellules ont été col orées dans 50 pi de tampon Perrn/Wash avec des anticorps anti-IT..2-FITC (clone JKS6~5JI4, dilués au 1/400) , anLi-IFNg-APC (clone XMG1.2, dilués au 1/200} et anti-TNFu-PE (clone MP6-XT22, dilués au 1/700), anti-IL17 BV786 (Clone TC1.1.-18Mi.0, dilués 1 /50) , pendant 1 heure A 4 °C.
Réponse humorale - Sérologie des Ig totales anti— M:72 par? un test ELISA
Des plaques ELISA de ,96 puits ont· été revêtues de X ’antiigàne M72 recombinant à 0,25 gg/ml dans du PB,3 et inquMes pendant' une nuit é 4 °C. Les· sérums prévenant, des? souris vaccinées à Rost: Al? ont été dilués ,au 1 /5000 ou au 'I./40 00 0 pour la répétition* dans: du PBS (0,2 %}-BSA et ensuite· une dilution ?en sérié au ;ί/·2 ést. effectuée du puits 1 à 12 et incubée. Les dilutions en série du matériau étalon et témoin ont été utilisées: pour? calculer les: titres des? étalons des anticorps ant Î--M72 des sérums testés? et pour garantir la validité du test. Les plaques? ont été lavées avec du tampon P B B 0,1 % Tween 20 après chaque étape d’Incubation. Un anticorps de chèvre biot inylé spécifique des Ig de souris: est ensuite? agouté ét lé complexe antigène-an ni corps est révélé par: incubation. svse. un complex© streptavidiae-peroxfclas^ et un, substrat dé la ::peröxyda.s% i'fe: dichlorhydrate d'ortho- phénylènédiémlne/¾¾¾, bes densités optiques {DÖ) ont été, enregistré:##: à. 496:-620 lijft* Le titre: en anticorps anti“Mt2: de, chèque sérum de:; souris individuel est déterminé a·· pas. tir de la courbé dJé:t:a:Xônnage du test ELISE en: utilisant ïhn iMbdele de régression et exprimé en unités ELI SA (tîEf Âît Le# titres iRôyéns géométriques (TMG) sont ensuite calculé# podb sobàque groupe; de souri:#. KÉsuitat#
Réponses des:. lymphocytes T :â» Réponse de# lympbpcytfes T CD·! et i CD8 spécifiques de M72
Pour évaluer 1'application de vecteurs adénoviraux de cbimparité ne se répliquant pas: exprimant M72 dans le contexte d'un vaccin contré: la tuberculose, les deux S t:r a t é g i e s de v a c c i n a t i on par s e n s i b 11.1 s a t ion - r a pp e 1 homologue (ChM/ChAd) et hétérologue {Prot/ChAd ou ChAd/Prot) ont été estimées ainsi qu'en combinaison avec P172/AS0:L4 donné err: mélange ou en coudrai n i.s L r et i on . Les stratégies de: sensibilisation/rappel et de combinaison ont été évaluées dans un calendrier de 70-J28. Le sang totai a été prélevé à 14 PL et 14 PII pour estimer 1’induction systémique des lymphocytes T CD4 et CD8 spécifiques de M72.
Parmi tous les groupes, il a été observé une réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques dans le sauf total avec le pic de réponse se situant an-dessous de 3 % {figures 5 et: 6) . Les taux les pins élevés de lymphocyte# T CD4 spéci fiiques de H72 dans le sang total ont été observés avec les si. ra féales de vaccination hétéroi ogue (Prot/ChAd ou. ChAd/Prot ) (figure 5} , La sente b.i.iisal:.') on des souris avec, les vecteurs M72-€hAd et le cappe.l avec M72/ASOIE ont indu i.1; un taux: supérieur do lymphocytes T C!>4 spécifiques dé 1472 par rapport à l ’ opposé et dans·1 dëS: deux' Pas le ÄfcchAd.3 :a: été plus1 puissant: que le MlS-ChAdöd (figure 5) . La vaccination par sens:ib:id..is:at^i:on“'rappë"l:. avec les veotéüf:s: M72-ChAd, soit homologué: (M72“:ChAd3/M7 2-Chi\d3] + /-: soit hétérologue (M32~;ßhÄd3:/M7 2~ChAd6:3 ou M'72aCiAd6:3:/:M72“-ChÄd3} n ’ a pas: fourni de valeur ajoutée en termes: di'ampleur dg: là. réponse: des lynphoéÿtes ï OM comparativement à la référence de H72/AS01E (figure 6;. La combinaison. à la fois: de M72-ChÄd3 et c|a: M72/ÂS01Ë à. légèrement induit un taux supérieur de lymphocytes T Cô4: spécifiques de M72 comparativement à la référence de M?2/AS01E, mais inférieur à la vaccination par s e n s i b i 1 i s a t .1. ο n -· r a pp e .1 hétérologue (Prot/C’nAd ou ChAd/Prot) * La coa dmi n i.s f: ra t ion a induit des taux similaires de lymphocytes T CDi spécifiques de M72 par rapport aux combinaisons suggérant que la proximité physique n1 est pas requise (figure 6),
Le taux de lymphocytes T GD8 spécifiques de M72 a été trouvé: fortement augmenté cher les souris recevant un·: vecteur M72-ChÄd soit en sensibilisation, soit en rappel soit les deux. Lorsque 1e vecteur M72-ChAd a été incl us durant: là sensihiilisatlpn, fe taux de lymphocytes T CD8 spécifiques: de M72 n'a pas encore augmenté: après le rappel: sauf lorsque les ppuris ©nf été: sensihilis'éeé avec M72v:GhAd63 et ont reçu un rappel avec M7 2:~GhÂd3 : (figures 7 et 8) , CéeL suggère également que le Μ·7·2:3 ©SÉ plus puissant que le M72~ChÂd6;3 Le rappel syet M7|:/ä$Ö1E die la sensibili sation af-éq M72~EhAd3; a induit. des taux: supérieurs dé lymphocytes: T: CD8 (médi ane = 30 %) par rapport à M72'-€hAb63' (médi ane - 17 %} . L ' add.it'i on de M72~ChAd3 à Ia protéine M72 adjuvée dans une combi naison a également fortement augmenté le taux de lymphocytes T CD8 spécifiques de M72 (méd La ne = 13 %) camp a r a t i v emen t à la réference actuelle: (médiane - 0,2 %1,
Le même profil général de réponse a été obsex vé dans le poumon (figure 9} comparnti vemen! au sang total (figures: 5: et 67 à 1exception de la étratêgié: de vaccihatiQn: par la combinaison dtiéiangée. Pané les poumons, la stratégie de combinaison: a induit un, taux inférieur ce réponse par rapport au sang total, ce qui fait gué 1 ' oh a pu observer un taux comparable; de lymphocytes T CD4 spécifiques de M72 avec le -vaccin de combinaison et avec la yacclhatlön par sensibilisation'-^ rappel hétérologue (Prot/ChAd ou ChAd/Prot) , tous présentant une augmentation du taux des lymphocytes T CD4 comparativement â la référence actuelle.
Le profil: général dé :1a réponse des lymphocytes1 ’î: €D8: spéeifbqnes de M72 dans les poumons: (fxgure· 10¾ a éga lernen t reflété ce qui a été observé dans: le sang total ({f igures 7 et 8) . Des: taux très bas de réponse des lymphocytes T CD8 spécifiques ont été observés lorsque les souris ont reçu la référence M72/AS01F (figure 10} ét l'addition du vecteur M72~GhAd a fortement amélioré le taux des lymphocytes T C;D8. Le: taux le plus élevé de lymphocytes: T CD8 spécifiques de M7 2 a été observé lorsque les souris ont été sensibilisées avec le: M72/&amp;SD1E et ont. reçu un rappel: a\fec le F;72-ChAd3 (médiane = 36 % - Figure 10:} , B. Ppbiil; dés çyto-kiBes des répons®;® des lymphocytes T G:ïM: et: Cl'8 spécifiques de M72:
Dans lès groupes; qui ont été sensibilisés avoc lé M72/ÄSQ1E, la réponse des lymphocytes T GD4+ spécif :i gués de M72 comprenait surtout des cellules à sécrétion double (11.-.7/TNFa) dans le sang total à 14 PI ( figures 11 et 12) , Au contraire,: la sons loilise tien avec un vecteur: ;;M7:2'~Cltó a induit une réponse des lymphocytes :T 'GDI spécifigllés de M"2 polyionctionrieis avec une majorité: de lymphocytes T CD4: triplement positifs (lL-2/IFNg/TNFa), et dans; une moindre mesure., à: production, double pFMg/TNFa) et simple (;'f:fNg uniquement) (figures 11 mt. 12) * La combinaison à .la fois de· la protéine:; et du vecteur Ch Ad a induit des taux bas do lymphocytes T CD4 à production triple ( IL 2 /1FN g / TNFa)....., et doublé (IFNg/TNFa} (figures 11 et. 12 ) ,
Un profil similaire d’expression des: cytokines par les lymphocyte® T CT)A i a été observe à 14 PIÏ dans le sang total (figures 13 et 14) et dans les poumons (figures 15 et 16); dans tous les groupes où la stratégie de vaccination comprenait un vecteur M72-ChAd. La réponse des lymphocytes T CD4 + spécifiques de M72 comprenait de façon; prédominante des cellules triples; ( IL2 /1 FNg /TNFa ) et doubles: (IFNg/TNFa) positives.
Comparativement à la référence, il a été observé un taux réduit rie cellules sécrétrices d ' Π.,-2/TNFa ot un taux accru dé ce 11ule s sécrétrices d"IFNg/TNFa en présence d mm vecteur M72-ChAd. ta sécrétion d ' IL-17 a été: égalemont estimée à 14 j PI l à la fois dans lé sang total et dans les poumons. Toutefois, lés taux détectés étaient extrêmement feas dans toutes les conditions.
Des profils similaires des cytokines des lymphocytes T CD8 .spécifiques de M72 ont été observé;; parmi tous les groupes positifs dans le sang total, à 14 PI (figures 17 et 18) , à 14 Pli {figures 19 et: 20'· ainsi, que dans les poumons à: 14 PII (figures: 21 et 22} . Les: réponses des lymphocytes T Cl>8 spêdiflques de H72 ont et# principalement composées de Lymphocytes T C08 à production double (IFNg/TNFa): et simple (IFUg uniquement} . Des lymphocytes T CD8 i produisant des; taux bas d’J1,-2./INFg/TNFa et des taux très bas de ÏNFa ont été également détectés.
Globalement, la stratégie de la vaccination nia pas dû; d’impact considèfabie sur le profil des cytokines des lymphocytes T CD8 spécifiques de M72, Réponses dés: ani Lcorps Μ·.··. Sérologie: des îg totales: an ci-M72 Gomme il est représenté' sur la figure 21, i§ sérologie des Ig totales a nid -M72 a été hautement variable parmi tous les groupes et des non-répondeurs ont été observés; avec toutes les stratégies do vaccinâti ou sauf dans ffapproche combinée donnée on coacminislrntion. En ce: gu L concerne la réponse dés lymphocytes T, le F72-CnÄd7 semble plus puissant1 que le M72· ChAdfej dans .1 ’ induction d'une réponse immunitaire car le nombre d’animaux non-répondeurs est augmenté lorsque: le M7:2:-C:hÂd63 est utilisé.
Dans tout le mémoire êt dans toutes les revendications qui suivent, 4 moins: que le contexte s'y oppose, Ip: terme M comprendre: », et: des variât ions telles que « comprend » et « comprenant » devra être compris comme impliquant: 1 ' inclusion d 1 un nombre entier, d'une étape, ê1;e groupe de nombres entiers ou d'un groupe: d'étapes indiqué mais pas l'exclusion de tout autre inombre entier, étape·:). groupe de nombres ientlëts: on: groupe d'étapes.
Tous les documents auxquels il est fait référence ici, y compris les brevets et les demandes de brevet, sont incorporés en référence. dang: leur· intégralité.
Bien entendu, l'invention r7 est pas limitée dUx exemples de réel isstion ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d7 autres: formes de réalisation;, sans; pour autant sortir du cadré de l'invention.

Claims (90)

  1. REVENDICATIONS
    1. Procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet comprenant : (i) l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv1196 au sujet, suivie de 1'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 ; ou (ii) l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 au sujet, suivie de l’administration d’un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125.
  2. 2. Procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet comprenant : (i ) 1'admi ni st rat i on d'un adé ηovi rus simi eη ηο n humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, suivie de l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 au sujet ; ou (ii) l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, suivie de 1'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 au sujet.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 comprenant : (i) 1'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 au sujet, suivie de l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 ; ou (i i) 1'admi n i s t r at i on d ' u n a dé η ovi rus s i mi e η η ο n humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, suivie de 1'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 au sujet.
  4. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2 comprenant : (i) l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 au sujet, suivie de l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 ; ou (ii) l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, suivie de 1'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 au sujet.
  5. 5. Antigène polypeptidique apparenté à Rvll96, pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où : (i) l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 ; ou (ii) un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de 1'administration de l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96.
  6. 6. Adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où : (i) un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de 1'administration de 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 ; ou (ii) 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de 1'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96.
  7. 7. Utilisation d'un antigène peptidique apparenté à Rvll96, dans la fabrication d'un médicament destiné à 1'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96,
  8. 8. Utilisation d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, dans la fabrication d’un médicament destiné à l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de l'administration de 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96.
  9. 9. Utilisation d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96, dans la fabrication d'un médicament destiné à l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de l'administration de l'antigène polypeptidique apparenté à Rvl196,
  10. 10. Utilisation d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, dans la fabrication d'un médicament destiné à l'induction d'une -réponse immunitaire chez un sujet où l'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 est administré au sujet, suivi de l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96.
  11. 11. Antigène polypeptidique apparenté à Rv0125, pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où : (i) l'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de l'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 ; ou (ii) un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi, de 1 ' administration de l'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125.
  12. 12. Adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, pour une utilisation dans 1'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où : (i.) un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de l'administration de 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 ; ou (ii) 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125.
  13. 13. Utilisation d'un antigène peptidique apparenté à RvQ125, dans la fabrication d'un médicament destiné à 1'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où l'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de 1'administration d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125.
  14. 14, Utilisation d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, dans la fabrication d'un médicament destiné à l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de l'administration de 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125.
  15. 15, Utilisation d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125, dans la fabrication d'un médicament destiné à l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvO.125 est administré au sujet, suivi de l'administration de 1'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125.
  16. 16, Utilisation d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, dans la fabrication d'un médicament destiné à l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet où 1’adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 est administré au sujet, suivi de l'administration d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125.
  17. 17, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5 à 10 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 comprend une séquence présentant au moins 90 % d'identité avec SEQ ID MO : 1.
  18. 18, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5 à 10 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 comprend un fragment de SEQ ID NO : 1 qui a une longueur d'au moins 200 acides aminés.
  19. 19. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5 à 10, 17 ou 18 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 comprend une séquence présentant au moins 90 % d'identité avec SEQ ID NO : 1.
  20. 20. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5 à 10, 17 ou 18 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 comprend un fragment de SEQ ID NO : 1 qui a une longueur d'au moins 200 acides aminés.
  21. 21. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 ou 11 à 16 où 1'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 comprend une séquence présentant au moins 90 % d'identité avec SEQ ID NQ : 3.
  22. 22. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 ou 11 à 16 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 comprend un fragment de SEQ ID NO : 3 qui a une longueur d'au moins 150 acides aminés.
  23. 23. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 ou 11 à 16, 21 ou 22 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rv0125 comprend une séquence présentant au moins 90 % d’identité avec SEQ ID NO : 3.
  24. 24. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5 à 10, 21 ou 22 où l'antigène polypeptidique apparenté à RvO125 comprend un fragment de SEQ ID NO : 3 qui a une longueur d'au moins 150 acides aminés.
  25. 25, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 où 1'antigène polypeptidique contient 1500 résidus d'acides aminés ou moins,
  26. 26, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 où l'antigène codé contient 1500 résidus d'acides aminés ou moins.
  27. 27, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 où un antigène polypeptidique comprenant un antigène apparenté à Rv119 6 et un antigène polypeptidique comprenant un antigène apparenté à RvO125 sont fournis.
  28. 28. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon 1'une quelconque des revendications 1 à 27 où un adénovirus codant pour un antigène apparenté à Rvll96 et un adénovirus codant pour un antigène apparenté à RvO125 sont fournis,
  29. 29. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 27 où 1'adénovirus code pour un antigène apparenté à Rvll96 et un antigène apparenté à Rv0125.
  30. 30. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon 1'une quelconque des revendications 1 à 29 où 1'antigène polypeptidique comprend une séquence présentant au moins 90 % d'identité avec SEQ ID NO : 6,
  31. 31. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 29 où 1'antigène polypeptidique comprend un fragment de SEQ ID NO : 6 qui a une longueur d'au moins 450 acides aminés, comme les acides aminés 2 à 723 de SEQ ID NO : 6.
  32. 32. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 où l'antigène codé comprend une séquence présentant au moins 90 % d'identité avec SEQ ID NO : 6,
  33. 33. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 où 1'antigène codé comprend un fragment de SEQ ID NO : 6 qui a une longueur d'au moins 450 acides aminés, comme les acides aminés 2 à 723 de SEQ ID NO : 6.
  34. 34. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l’une quelconque des revendications 1 à 33, où le sujet est un être humain.
  35. 35. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l’une quelconque des revendications 1 à 34, où le polypeptide et l'adénovirus sont administrés par voie intramusculaire.
  36. 36. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 35, où le polypeptide et l'adénovirus sont administrés dans une plage de doses de 400 à 600 μΐ compris.
  37. 37. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 36, où la plage de doses du polypeptide est de 1 à 100 pg compris.
  38. 38. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 37, où la plage de doses de l'adénovirus est de 1 x 10à 1 x 101S particules virales compris.
  39. 39. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 38 où l'antigène polypeptidique est fourni dans une composition qui comprend également un adjuvant.
  40. 40. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 39, où l'adjuvant comprend un agoniste des TLR et/ou une saponine immunologiquement active.
  41. 41. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 40, où 1'adjuvant comprend du 3D-MPL.
  42. 42. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication soit 40 soit 41, où 1'adjuvant comprend du QS21.
  43. 43. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication 42, où l'adjuvant comprend du 3D-MPL et du QS31 dans une formulation liposomique.
  44. 44. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication soit 42 soit 43, où l’antigène polypeptidique est fourni dans une composition qui comprend entre 12,5 et 75 microgrammes de 3D—MP.i.1 compris et entre 12,5 et 75 microgrammes de QS21 compris.
  45. 45, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 44 où 1'intervalle de temps entre les administrations se situe dans la plage d'une semaine à trois mois compris.
  46. 46, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon 11 une quelconque des revendications 1 à 45, pour la prophylaxie, le traitement ou l'amélioration d'une infection par des mycobactéries, comme Mycobacterium tuberculoses.
  47. 47, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication 46, pour la prophylaxie d'une infection par des mycobactéries, comme Mycobacterium tuberculoses.
  48. 48, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication 46, pour le traitement d'une infection par des mycobactéries, comme Mycobacterium tuberculoses.
  49. 49, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 47, où le sujet n'est pas infecté.
  50. 50, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 46 ou 48, où le sujet souffre d'une infection latente.
  51. 51, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 46 ou 48, où le sujet souffre d'une infection active,
  52. 52, Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 49, où le sujet a été vacciné auparavant par le BCG.
  53. 53. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 9, où la réponse immunitaire comprend des lymphocytes T CD4 exprimant de 1'IFN-gamma, du TNF-alpha et de l'lL-2.
  54. 54. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 53, où 1'adénovirus est un adénovirus de chimpanzé.
  55. 55. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication 54, où 1'adénovirus est défectueux pour la réplication.
  56. 56. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication soit 54 soit 55, où 1'adénovirus est un ChAd3.
  57. 57. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon la revendication soit 54 soit 55, où 1'adénovirus est un ChAd63.
  58. 58. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon 1'une quelconque des revendications 54 à 57, où 1'adénovirus comprend une inactivation fonctionnelle (comme une délétion) au moins des gènes El et E4, éventuellement avec une inactivation fonctionnelle (comme une délétion) de E3, conjointement avec une substitution du gène Ad5E4orf6,
  59. 59. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon 1'une quelconque des revendications 1 à 58 où 1'antigène polypeptidique apparenté à Rvl196 est fourni dans une composition qui est sensiblement dépourvue d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, comme sensiblement dépourvue d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien, en particulier sensiblement dépourvue de tout adénovirus simien non humain, spécialement sensiblement dépourvue de tout adénovirus codant pour un antigène mycobactérien (comme sensiblement dépourvue de tout adénovirus).
  60. 60. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 58 où l'antigène polypeptidique apparenté à RvQ125 est fourni dans une composition qui est sensiblement dépourvue d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, comme sensiblement dépourvue d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien, en particulier sensiblement dépourvue de tout adénovirus simien non humain, spécialement sensiblement dépourvue de tout adénovirus codant pour un antigène mycobactérien (comme sensiblement dépourvue de tout adénovirus).
  61. 61. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 58 où 1'antigène polypeptidique apparenté à Rvl196 est fourni dans une composition qui ne comprend pas un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvl196, de telle façon qu'elle ne comprend pas un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien, en particulier elle ne comprend aucun adénovirus simien non humain, spécialement elle ne comprend aucun adénovirus codant pour un antigène mycobactérien (de telle façon qu'elle ne comprend aucun adénovirus).
  62. 62. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 58 où l'antigène polypeptidique apparenté à RvO.125 est fourni dans une composition qui ne comprend pas un adénovirus simien non humain codant pour un antigene apparenté à Rvll96, de telle façon qu'elle ne comprend pas un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien, en particulier elle ne comprend aucun adénovirus simien non humain, spécialement elle ne comprend aucun adénovirus codant pour un antigène mycobactérien (de telle façon qu'elle ne comprend aucun adénovirus).
  63. 63. Procédé, utilisation, polypeptide Q adénovirus selon l'une quelconque des revendications j à 62 où 1 'adénovirus simien non humain codant pour Un antigène apparenté à Rvll96 est fourni dans , composition qui est sensiblement dépourvue Un antigène polypeptidique apparenté à RvllSS, co>rr sensiblement dépourvue d'un antigène mycobactérj Dolypeptidique, en particulier sensiblement dépo;,„ -'vue de tout autre antigène.
  64. 64. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendication à 62 où 1'adénovirus simien non humain codant pour - un antigène apparenté à Rv0125 est fourni dans UtlQ composition qui est sensiblement dépourvue ,, u Un. antigène polypeptidique apparenté à Rv0125, '-OïÎirno sensiblement dépourvue d’un antigène mycobactév. · polypeptidique, en particulier sensiblement dépou· de tout autre antigène.
  65. 65. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendicat-ï r. -cris 3_ à 62 où l'adénovirus simien non humain codant ρ0υ Un antigène apparenté à Rvll96 est fourni dans une composition qui ne comprend pas un antigène polypeptidique apparenté à Rv119 6, de telle façon qu'elle ne comprend pas un antigène mycobactérien polypeptidique, en particulier elle ne comprend aucun autre antigène.
  66. 66. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 62 où 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 est fourni dans une composition qui ne comprend pas un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125, de telle façon qu'elle ne comprend pas un antigène mycobactérien polypeptidique, en particulier elle ne comprend aucun autre antigène.
  67. 67. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 66 où l'antigène polypeptidique apparenté à Rvll96 n'est pas administré au sein d'une période d'un jour (comme deux, trois ou six jours) d'un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, comme un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96, par exemple, un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien (comme tout adénovirus simien non humain), en particulier tout adénovirus codant pour un antigène mycobactérien (comme tout adénovirus).
  68. 68. Procédé, utilisation, polypeptide 0u adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 66 où l'antigène polypeptidique apparenté à RvOigs n'est pas administré au sein d'une période d'un jour (comme deux, trois ou six jours) d'un adenovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à RvQ125, comme un adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125, par exemple, un adénovirus simien non humain codant pour un antigène mycobactérien (comme tout adénovirus simien non humain), en particulier tout adénovirus codant pour un antigène mycobactérien (comme tout adénovirus).
  69. 69. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 68 où 1'adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rvll96 n'est pas administré au sein d'une période d'un jour (comme deux, trois ou six jours) d'un antigène polypeptidique apparenté à Rvll96, par exemple, tout antigène mycobactérien polypeptidique (comme tout autre antigène}.
  70. 70. Procédé, utilisation, polypeptide ou adénovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 68 où 1 ' .adénovirus simien non humain codant pour un antigène apparenté à Rv0125 n'est pas administré au sein d'une période d'un jour (comme deux, trois ou six jours) d'un antigène polypeptidique apparenté à Rv0125, par exemple, tout antigène mycobactérien polypeptidique (comme tout autre antigène).
  71. 71. Adénovirus simien non humain comprenant un transgène codant pour un antigène apparenté à Rvll96 ou Rv0125.
  72. 72. Adénovirus simien non humain selon la revendication 71, contenant au moins le penton de SEQ ID NO : 10, 1 ' hexon de SEQ ID NO : 11 ou la fibre de SEQ ID NO : 12.
  73. 73, Adénovirus simien non humain selon la revendication 72, comprenant les protéines du penton (SEQ ID NO : 10), de l'hexon (SEQ ID NO : 11) et de la fibre (SEQ ID NO : 12) de ChAd3.
  74. 74, Adénovirus simien non humain selon la revendication 71, comprenant au moins le penton de SEQ ID NO : 15, l'hexon de SEQ ID NO : 16 ou la fibre de SEQ ID NO : 17.
  75. 75, Adénovirus simien non humain selon la revendication 74, comprenant une protéine du penton (SEQ ID NO : 16), de l'hexon (SEQ ID NO : 17) et de la fibre (SEQ ID NO : 18) de ChAd63,
  76. 76, Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 75 où l'antigène codé comprend une séquence présentant, au moins 90 % d'identité avec SEQ ID NO : 6.
  77. 77, Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 76 où 1'antigène codé comprend un fragment de SEQ ID NO : 6 qui a une longueur d'au moins 450 acides aminés, comme les acides aminés 2 à 723 de SEQ ID NO : 6.
  78. 78, Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 77, qui est un adénovirus déficient pour la réplication.
  79. 79, Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 78, où 1'.adénovirus comprend une inactivation fonctionnelle (comme; une délétion) du gène El.
  80. 80, Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 79, où 1'adénovirus comprend une inactivation fonctionnelle (comme une délétion) du gène E4.
  81. 81. Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 80, où 1'adénovirus comprend une inactivation fonctionnelle (comme une délétion) du gène E3.
  82. 82. Adénovirus simien non humain selon l'une quelconque des revendications 71 à 81, où 1'adénovirus comprend une substitution du gène Ad5E4orf6.
  83. 83. Adénovirus simien non humain selon la revendication 71, constitué de la séquence de SEQ ÏD NO : 13.
  84. 84. Adénovirus simien non humain selon la revendication 71, constitué de la séquence de SEQ ID NO : 18.
  85. 85. Polynucléotide comprenant SEQ ID NO : 8 ou comprenant l'un de ses variants dégénérés présentant au moins 95 % d’identité avec SEQ ID NO : 8.
  86. 86. Polynucléotide selon la revendication 85, comprenant SEQ ID NO : 8 ou comprenant un variant dégénéré présentant au moins 98 % d'identité avec SEQ ID NO : 8.
  87. 87. Polynucléotide selon la revendication 85, constitué de SEQ ID NO : 8 ou constitué d'un variant dégénéré présentant au moins 95 % d'identité avec SEQ ID NO : 8.
  88. 88. Polynucléotide selon la revendication 85, constitué de SEQ ID NO : 8 ou constitué d'un variant dégénéré présentant au moins 98 % d’identité avec SEQ ID NO : 8.
  89. 89, Polynucléotide selon Ia revendication 85, comprenant SEQ ID NO : 8.
  90. 90. Polynucléotide selon la revendication 89, constitué de SEQ ID NO : 8.
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