BE1025210A1 - Conjugues immunogenes et leur utilisation - Google Patents

Abstract

La technologie fournie se situe dans le domaine de la conjugaison de vésicules de membrane externe natives (nOMV), non extraites par un détergent, à des antigènes pour former des conjugués nOMV-antigène, qui sont particulièrement utiles pour des compositions immunogènes et une immunisation ; des procédés pour la préparation et l'utilisation de tels conjugués sont également fournis.

Description

CONJUGUES IMMUNOGENES ET LEUR UTILISATION

Cette invention se situe dans le domaine de la conjugaison de vésicules de membrane externe « natives » (nOMV), non extraites par un détergent, à des antigènes, pour former des conjugués nOMV-antigène, particulièrement utiles pour une immunisation.

Contexte de 1¹ art

La conjugaison d'antigènes à des supports est une procédure établie pour améliorer l'immunogénicité, spécialement pour des saccharides. Par exemple, les saccharides capsulaires bactériens sont des antigènes naturellement indépendants des lymphocytes T qui donnent naissance à une réponse immunitaire à laquelle il manque plusieurs propriétés importantes. La conjugaison à une fraction de support convertit ces saccharides en antigènes dépendants des lymphocytes T qui peuvent alors produire un effet de mémoire immunologique, et déclenchent également des réponses immunitaires efficaces chez les jeunes enfants.

Une source connue de support protéique dans de tels conjugués est le complexe des protéines de membrane

BE2017/5855 externe (OMPC) de N. meningitidis du sérogroupe B (par exemple, voir le document EP-0467714, Merck & co.), qui a été inclus en tant que support dans des vaccins approuvés à base de conjugués de H. influenzae B. L'OMPC a été également utilisé comme support dans des conjugués de protéines. Selon l'art antérieur, 1'OMPC est conjugué à un antigène par l'intermédiaire d'un résidu de protéine, qui peut être activé ou modifié chimiquement afin d'effectuer plus efficacement la conjugaison avec l'antigène choisi.

Wu et al. (PNAS USA 2006 ; 103(48): 18243-18248) rapportent que la conjugaison de Pfs25H (une protéine humaine bloquant la transmission du paludisme) à 1'OMPC a abouti à un vaccin à base de conjugué Pfs25H-OMPC qui a été > 1000 fois plus puissant dans la production d'une réactivité anti-Pfs25H par la technique ELISA chez des souris par rapport à une dose similaire de Pfs25H seule. La conjugaison de 1'OMPC à la protéine Pfs25H peut être obtenue en faisant réagir la Pfs25H activée par un maléimide avec des protéines de membrane externe thiolées au sein de 1'OMPC (pour une référence générale, voir, par exemple, le document WO 2006/124712), comme il est représenté sur le schéma 1.

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OMPC i	ί Pf$25H J
	1	i Q /y / i ..... \
ƒ		f ,,.·· .......\ \
1 .. . Λ .....J.	s X i l \ -A. y*
	3 i

*

X f / I \ —f $ s-r- pfs2SH $ ' L ^Λ

Schéma 1

Même si Ie procédé peut représenter une voie de synthèse valable, les vésicules considérées peuvent être difficiles à obtenir sous une forme pure, et elles sont habituellement recueillies par l'intermédiaire de procédés laborieux. En outre, la connexion avec l'antigène choisi nécessite la présence et l'activation d'une protéine de vésicule appropriée, posant ainsi un problème supplémentaire à la lumière de l'utilisation de détergents ou d'agents chimiques durant l'isolement des vésicules, qui peuvent modifier la composition des protéines de surface. Par conséquent, il existe toujours le besoin de fournir de nouveaux conjugués utiles en tant que composés immunogènes qui surmontent les problèmes de l'art antérieur, et qui peuvent être obtenus par une procédure simple et pratique.

Le demandeur a découvert à présent que lorsque des nOMV sont connectées à des antigènes choisis par

BE2017/5855 l'intermédiaire de fractions saccharidiques, les conjugués ainsi obtenus sont dotés d'une immunogénicité remarquable et peuvent être obtenus par un procédé fiable et pratique, tel que décrit ci-dessous plus en détail.

Résumé de 1'invention

Dans un premier aspect, l'invention se rapporte à un conjugué immunogène nOMV-antigène, comprenant une vésicule de membrane externe native (nOMV) obtenue par un procédé dépourvu de détergent, comportant au moins une fraction de saccharide de surface natif connectée à au moins un antigène étranger choisi.

Dans un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé de préparation dudit conjugué, comprenant les étapes suivantes :

i) l'activation d'au moins une fraction de saccharide de nOMV, généralement liée à la surface des nOMV, et ii) la connexion du saccharide activé ainsi obtenu à au moins un antigène choisi.

Selon un mode de réalisation préféré, les saccharides liés à la surface des nOMV sont activés par oxydation, et ensuite connectés avec les antigènes choisis, de façon davantage préférée dans des conditions d'amination réductrice.

Dans un autre aspect, l'invention se rapporte également au conjugué ci-dessus pour une utilisation en tant que médicament, particulièrement en tant que composé immunogène, ou pour la préparation d'une composition immunogène ou d'un vaccin.

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Dans encore un autre aspect, l'invention se rapporte à une composition immunogène ou à un vaccin, comprenant le conjugué indiqué ci-dessus et au moins un support ou un adjuvant pharmaceutiquement acceptable ; et à un procédé pour produire une réponse immunitaire chez un vertébré, comprenant l'administration de ladite composition ou dudit vaccin.

Dans un autre aspect, l'invention se rapporte également à l'utilisation de nOMV pour la préparation de conjugués immunogènes.

Brève description des dessins

La figure 1 représente les structures de -OAg pour S. sonnei.

La figure 2 représente les titres en IgG anti-Vi (figure 2A) et anti-OAg (figure 2B) après immunisation avec le saccharide Vi fragmenté (fVi) conjugué à des nOMV de S. typhimurium comparativement au fVi mélangé physiquement avec lesdites nOMV ou conjugué au support plus traditionnel, le CRM197 (formulé avec du Alhydrogel). Des souris CD1 femelles, âgées de 5 semaines (8 par groupe) ont été immunisées par voie sous-cutanée aux jours 0 et 28 avec 1 pg de Vi/dose. Les titres ont été mesurés aux jours 0, 14, 28 et 42.

La figure 3 représente les titres en IgG antiCTF1232 après immunisation avec le polypeptide CTF1232 conjugué à divers supports (formulés avec du Alhydrogel) Des souris CD1 femelles, âgées de 5 semaines (8 par groupe) ont été vaccinées par voie intranasale avec 30 μΐ de vaccin (15 μΐ par narine) aux jours de l'étude 0, 21

BE2017/5855 et 38. Les sérums ont été recueillis aux jours 0, 14, 35 et 52. La dose était de 0,5 pg de CTF1232.

La figure 4 représente les titres en IgG anti-Pfs25 après immunisation avec le polypeptide Pfs25 conjugué à des nOMV de S. typhimurium 1418 AtolR comparativement au Pfs25 seul ou mélangé physiquement avec lesdites nOMV. Des souris CD1 femelles, âgées de 5 semaines (8 par groupe) ont été immunisées par voie sous-cutanée aux jours 0 et 28 avec 0,1 pg de Pfs25/ dose (figure 4A, avec Alhydrogel) ou 1 pg de Pfs25/dose (figure 4B, sans Alhydrogel). Les titres ont été mesurés aux jours 0, 14, 28 et 42. La figure 4C représente les titres en IgG antiOAg en utilisant 2 et 0,1 pg de Pfs25/dose, et correspondant à 10 et 0,5 pg de nOMV/dose, respectivement (formulé avec du Alhydrogel). A nouveau, des souris CD1 femelles, âgées de 5 semaines (8 par groupe) ont été immunisées par voie sous-cutanée aux jours 0 et 28.

La figure 5 représente les titres en IgG anti-RO6C (figure 5A) et les titres en IgG anti-OAg (figure 5B) après immunisation avec RO6C seul, ou conjugué à des vésicules nOMV de S. typhimurium 1418 AtolR (formulées avec du Alhydrogel) . Un conjugué recyclé a été préparé par recyclage de RO6C non conjugué à partir du premier lot de conjugaison. Des souris CD1 femelles, âgées de 5 semaines (8 par groupe) ont été immunisées par voie sous-cutanée aux jours 0 et 28, et des doses de 1, 4 et 20 pg de RO6C ont été utilisées. Pour les conjugués, les doses correspondantes de nOMV étaient de 13 pg, 52 pg et 258 pg, respectivement (4 pg de RO6C et 32 pg de nOMV

BE2017/5855 pour le conjugué recyclé) . Les titres en IgG ont été mesurés aux jours 0, 14, 28 et 42.

Figure 6a - Réponse en IgG anti-Pfs25 induite chez des souris (200 μΐ par dose injectée en SC aux jours 0 et 28, prélèvements aux jours 0, 14, 27 et 42) par des conjugués de nOMV de l'invention produit par conjugaison de nOMV de S. typhimurium avec l'antigène Pfs25, avec ou sans réaction de neutralisation, selon les modes de réalisation de

1'invention.

Figure 6b - Réponse anti-OAg induite chez des souris (200 μΐ par dose injectée en SC aux jours 0 et 28, prélèvements aux jours 0, 14, 27 et 42) par des conjugués de nOMV de l'invention produits par conjugaison de nOMV de S. typhimurium avec l'antigène Pfs25, avec ou sans réaction de neutralisation, selon les modes de réalisation de l'invention.

Description détaillée de l'invention

Pour faciliter la compréhension de la présente invention, un certain nombre de termes et de phrases sont définis ci-dessous. Les synonymes ou les variantes reconnues dans l'art des termes et des phrases qui suivent (y compris les temps passé, présent, etc.), même s'ils ne sont pas décrits spécifiquement, sont envisagés

Tel qu'utilisé dans la présente divulgation et les revendications, les formes au singulier « un », « une », « le » et « la » comprennent les formes au pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire ; c'està-dire, « un(e) » signifie « un(e) ou plusieurs » sauf indication contraire.

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Les termes « environ » ou « approximativement » signifient à peu près, autour de, ou dans les régions de. Les termes « environ » ou « approximativement » signifient en outre au sein d'une plage d'erreurs contextuelles acceptable pour la valeur particulière déterminée par une personne de compétence moyenne dans le domaine, qui dépendra en partie de comment la valeur est mesurée ou déterminée, c'est-à-dire, les limitations du système de mesure ou le degré de précision requis pour un objectif particulier, par exemple, la quantité d'un nutriment au sein d'une formulation nutritive. Lorsque les termes « environ » ou « approximativement » sont utilisés conjointement avec une plage numérique, ils modifient cette plage par extension des limites audessus et au-dessous des valeurs numériques présentées. Par exemple, « entre environ 0,2 et 5,0 mg/ml » signifie que les limites de la plage numérique s'étendent audessous de 0,2 et au-dessus de 5,0 si bien que la valeur particulière en question atteint le même résultat fonctionnel qu'au sein de la plage. Par exemple, « environ » et « approximativement » peuvent signifier à 1 ou plus de 1 écart-type selon la pratique dans l'art. En variante, « environ » et « approximativement » peuvent signifier une plage jusqu'à 20 %, de préférence jusqu'à 10 %, de façon davantage préférée jusqu'à 5 %, et de façon davantage préférée jusqu'à 1 % d'une valeur donnée.

Le terme « et/ou » tel qu'utilisé dans une phrase telle que « A et/ou B » est censé inclure « A et B », « A ou B », « A », et « B ». De la même façon, le terme « et/ou » tel qu'utilisé dans une phrase telle que « A,

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B, et/ou	C	» est	censé englober	chacun	des	modes	de
réalisation	suivants : A, B, et C	; A,	B	, ou	C ; A	ou
C ; A ou	B	; B ou	C ; A et C ;	A et	B	; B	et C ;	A
(seul) ;	B	(seul) ;	et C (seul).
Sauf	précision	contraire, à toutes	les désignations
« A %-B %	»	, « A-B	-g », « A o cL	B % »		« A	à B %	»,

« A %-B », « A % à B », il est donné la signification habituelle et conventionnelle. Dans certains modes de réalisation, ces désignations sont synonymes.

Les termes « sensiblement » ou « sensible » signifient que la condition décrite ou revendiquée fonctionne dans tous les aspects importants comme le standard décrit. Ainsi, « sensiblement dépourvu » est censé englober des conditions qui fonctionnent dans tous les aspects importants comme des conditions dépourvues, même si les valeurs numériques indiquent la présence de certaines impuretés ou substances. « Sensible » signifie généralement une valeur supérieure à 90 %, de préférence supérieure à 95 %, de façon préférée entre toutes supérieure à 99 %. Lorsque des valeurs particulières sont utilisées dans le mémoire et dans les revendications, sauf indication contraire, le terme « sensiblement » signifie avec une plage d'erreurs acceptable pour la valeur particulière.

Une « quantité efficace » signifie une quantité suffisante pour provoquer l'effet ou le résultat référencé.

Une « quantité efficace peut être déterminée empiriquement et de façon routinière en utilisant des techniques connues en relation avec ' obj ectif indiqué.

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Tel qu'utilisé ici, « hétérologue » signifie que les deux molécules ou structures référencées ou plus sont dérivées d'un organisme différent. Par exemple, un antigène hétérologue est l'un qui est dérivé d'un organisme différent de la vésicule nOMV à laquelle il est annexé. « Homologue » tel qu'utilisé ici signifie que les deux molécules ou structures référencées ou plus sont dérivées du même organisme.

Tel qu'utilisé ici, « étranger » signifie que les deux molécules ou structures référencées ou plus ne sont pas associées naturellement les unes aux autres. Par exemple, un antigène choisi qui est censé ici être « étranger à » un saccharide de surface de nOMV ici signifie que l'antigène n'est pas conjugué de façon naturelle ou innée au saccharide de surface et, par conséquent, n'est pas conjugué de façon naturelle à la molécule de nOMV même si l'antigène et le saccharide (ou la molécule de nOMV) peuvent provenir du même organisme. De cette façon, un antigène étranger n'est pas nécessairement un antigène hétérologue mais un antigène hétérologue est un antigène étranger.

« L'identité de séquence » peut être déterminée par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman tel que mis en œuvre dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular), en utilisant une recherche affine de brèche avec les paramètres de pénalité d'ouverture de brèche = 12 et de pénalité d'extension de brèche = 1, mais elle est déterminée de préférence par l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch (voir, par exemple, Rubin (2000) Pediatric. Clin. North Am. 47: 269-285), en utilisant les paramètres par défaut (par

BE2017/5855 exemple, avec une pénalité d'ouverture de brèche = 10,0, et avec une pénalité d'extension de brèche = 0,5, en utilisant la matrice de score EBLOSUM62). Cet algorithme est mis en œuvre de façon pratique dans l'outil Needle du progiciel EMBOSS. Lorsque la demande se rapporte à l'identité de séquence avec une SEQ ID particulière, 1'identité est censée être calculée sur la longueur entière de cette SEQ ID.

Le terme « p/p en % » indique le pourcentage en poids d'un composant donné, par rapport à un composant différent ou par rapport à la teneur totale d'une composition, selon l'indication.

De façon analogue, le terme « % v/v » indique le pourcentage en volume d'un composant donné, par rapport à un composant différent ou par rapport à la teneur totale d'une composition, selon l'indication.

Le terme « -OAg » (antigène O) est utilisé au sein de la présente invention pour indiquer une fonctionnalité d'antigène présente dans les lipopolysaccharides (LPS) ou les lipooligosaccharides (LOS) sur la surface de la nOMV considérée, utile pour la conjugaison avec un antigène correct (généralement indiqué par Ag) selon l'invention. De façon plus détaillée, les LPS sont généralement formés de trois parties différentes, connues en tant que : le lipide A (responsable de la toxicité des LPS), le noyau oligosaccharidique et la chaîne -OAg, un polymère répétitif de glycanes et le principal contributeur à la spécificité sérologique des bactéries.

Le terme « groupe alkyle ou alcényle en Ci à C_x linéaire ou ramifié » comprend dans sa signification un

BE2017/5855 groupe alkyle ou alcényle linéaire ou ramifié saturé ou insaturé bivalent comportant 1 à x atomes de carbone. Par exemple, le terme groupe alkyle ou alcényle en Ci à Cio bivalent comprend dans sa signification un groupe alkyle ou alcényle saturé ou insaturé bivalent comportant 1 à 10 atomes de carbone tel que les groupes méthyle, éthyle, vinyle, allyle et analogues.

Tel qu'utilisé ici, le terme « fraction saccharidique (ou de sucre) » comprend dans sa signification des monosaccharides, ainsi que des unités polysaccharidiques. Il faudra comprendre que les fractions saccharidiques peuvent exister sous forme ouverte et fermée (cycle) et que, lorsque des formes fermées sont présentées ici dans les formules structurales, les formes ouvertes sont également englobées par l'invention. De façon similaire, il faudra comprendre que les fractions saccharidiques peuvent exister sous des formes de pyranose et de furanose et que, lorsque des formes de pyranose sont présentées ici dans les formules structurales, les formes de furanose sont également englobées. Différentes formes anomères de fractions saccharidiques sont également englobées.

Le terme « oligosaccharide » comprend dans sa signification des polysaccharides comportant de 3 à unités monosaccharidiques.

Sauf disposition contraire, le terme « polypeptide » se rapporte à des polypeptides d'une longueur quelconque capables d'agir comme antigène choisi. Le polymère d'acides aminés formant le polypeptide de l'invention peut être linéaire ou ramifié, peut comprendre des acides aminés modifiés, et il

BE2017/5855 peut être interrompu par des acides non aminés. Le terme englobe également un polymère d'acides aminés qui a été modifié naturellement ou par intervention ; par exemple, la formation de liaisons disulfure, la glycosylation, la lipidation, l'acétylation, la phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, telle que la conjugaison avec un composant de marquage. Sont également compris au sein de la définition, par exemple, des polypeptides contenant un ou plusieurs analogues d'un acide aminé (y compris, par exemple, des acides aminés non naturels, etc.), ainsi que d'autres modifications connues dans l'art. Les polypeptides peuvent apparaître sous la forme de chaînes simples ou de chaînes associées.

La « masse moléculaire moyenne en poids » est censée indiquer la masse moléculaire moyenne en poids obtenue par le moyen arithmétique ordinaire ou la moyenne des masses moléculaires du composant individuel, par exemple, des acides aminés dans le cas de dérivés polypeptidiques.

Le terme « polysaccharides/saccharides capsulaires » (PSC) indique ces saccharides qui peuvent se trouver dans la couche qui repose à l'extérieur de l'enveloppe cellulaire des bactéries, faisant ainsi partie de l'enveloppe externe de la cellule bactérienne elle-même. Les PSC sont exprimés sur la surface la plus externe d'un large éventail de bactéries, et dans certains cas même dans des champignons.

Sauf disposition contraire, le terme « conjugaison » indique la connexion ou la liaison des

BE2017/5855 entités soumises, particulièrement en référence à la nOMV et aux fractions antigéniques choisies.

Par « quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, soit sous la forme d'une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité peut varier selon la santé et la condition physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de 1'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'estimation du médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée par l'intermédiaire d'essais de routine.

Le terme « nOMV » ici indique une vésicule isolée du milieu ou détachée à partir de cellules, et il s'agit de vésicules membranaires intactes non exposées à des détergents ou à des agents dénaturants, c'est-à-dire, non extraites par un détergent. Les nOMV de l'invention présentent les protéines de membrane externe (OMP) et le lipopolysaccharide (LPS) dans leur conformation native et orientation correcte dans l'environnement membranaire naturel, et auxquelles il manque habituellement les composants cytoplasmatiques.

Au contraire, le terme « OMV » ou « dOMV » englobe diverses vésicules protéoliposomiques obtenues par rupture de la membrane externe d'une bactérie Gram négatif généralement par un procédé d'extraction par un

BE2017/5855 détergent pour former des vésicules à partir de celleci. Des complexes de protéines de membrane externe (par exemple, 1'OMPC de Neisseria meningitidis) peuvent être considérés dans une telle définition, parce qu'ils ont une structure tridimensionnelle et une composition similaire aux dOMV, et qu'ils sont isolés par des procédures d'extraction par un détergent (voir, par exemple, les documents EP 0467714, US 4 271 147, US 4 459 286 et US 4 830 852) . Le procédé d'extraction par un détergent élimine le LPS et les phospholipides, conjointement avec les lipoprotéines immunoprotectrices. Une telle élimination change la structure des vésicules natives et favorise l'agrégation. L'agrégation peut conduire à des problèmes conséquents en termes de développement du procédé (rendement, régularité de production et de stabilité). A la différence des nOMV, caractérisées par une distribution homogène définie des tailles (généralement dans la plage de 20 à 250 nm, mesurée par la technique de diffusion dynamique de la lumière DLS), les dOMV présentent une distribution hétérogène indéfinie des tailles (habituellement dans la plage de 550 à 5500 nm mesurée par la technique de diffusion dynamique de la lumière DLS) provoquée par une agrégation des vésicules induite par le détergent (voir pour une référence générale, Vaccine 28, 2010, 4810). Le procédé d'extraction par un détergent provoque également une contamination de la composition contenant les OMV (par exemple, des vaccins) avec des protéines cytoplasmiques comme conséquence de la lyse des cellules bactériennes.

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Selon des méthodologies de l'art antérieur, les dOMV et les nOMV peuvent être analysées et décrites en termes de taille, de forme et d'apparence globale des impuretés ou des matériaux contaminants non-OMV (comme les agrégats de vésicules ou les résidus de détergent dans le cas des dOMV) en utilisant la microscopie électronique en transmission (MET). Pour des références détaillées concernant les différences entre les dOMV et les nOMV, voir, par exemple, van de Waterbeemd (2013) J. Prot. Res. Quantitative Proteomics Reveals Distinct Differences in the Protein Content of Outer Membrane Vesicle Vaccines ; et J. Klimentova et al. Microbiological Research 170 (2015) 1-9 Methods of isolation and purification of the outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.

Comme il a été indiqué ci-dessus, dans un premier aspect, l'invention se rapporte à un conjugué comprenant un antigène choisi connecté à une fraction saccharidique présente sur la surface d'une vésicule de membrane externe native non extraite par un détergent (nOMV). A noter, les nOMV conformément à la présente invention sont recueillies et isolées sensiblement sans l'utilisation de détergents, à la différence, par exemple, des dOMV de l'art antérieur obtenues par l'intermédiaire d'une extraction avec du désoxycholate ou en utilisant des détergents zwittérioniques comme Empigen BB (voir, par exemple, le document US 4 707 543) ou similaires. Au contraire, il faut souligner qu'une étape d'extraction par un détergent peut être non souhaitable dans la présente invention, pour toute une série de raisons, parmi lesquelles le fait qu'un

BE2017/5855 détergent réduira la quantité de lipopolysaccharide (LPS)/lipooligosaccharide (LOS) présente sur la vésicule, qui peut être vraiment utile pour la conjugaison avec l'antigène choisi tel que décrit ci-dessous.

De façon plus détaillée, les nOMV sont des vésicules membranaires existant à l'état naturel qui se forment spontanément durant la croissance bactérienne et qui sont libérées dans le milieu de culture. Elles peuvent être obtenues, par exemple, par culture de bactéries dans un milieu de culture de bouillon, en séparant les cellules entières des nOMV plus petites dans le milieu de culture de bouillon (par exemple, par filtration ou par centrifugation à basse vitesse pour agréger uniquement les cellules et non pas les vésicules plus petites), et ensuite en recueillant les nOMV à partir du milieu appauvri en cellules (par exemple, par filtration, par précipitation différentielle ou agrégation, par centrifugation à haute vitesse pour agréger les vésicules) . Les souches pour une utilisation dans la production de nOMV peuvent être généralement choisies sur la base de la quantité de nOMV produite en culture. Les présentes nOMV sont caractérisées par le fait qu'elles sont recueillies et isolées à la suite d'une procédure dépourvue de détergent. De préférence, les présentes nOMV sont libérées dans le bouillon de fermentation et sont purifiées en utilisant une centrifugation et une étape de filtration subséquente (pour une référence générale, voir, par exemple, Clin

Vaccine Immunol.

encore préférée, les présentes nOMV sont libérées dans le bouillon de fermentation et sont purifiées en

BE2017/5855 utilisant les deux étapes consécutives suivantes de filtration à flux tangentiel (FFT) : (i) une microfiltration dans laquelle le surnageant de la culture contenant les nOMV est séparé des bactéries, et (ii) une ultrafiltration dans laquelle les nOMV sont séparées des protéines solubles (pour une référence générale, voir, par exemple, PLoS One. 2015; 10(8): e0134478) . Les nOMV ainsi obtenues peuvent être ensuite utilisées directement au sein de la présente invention sans étape supplémentaire de purification/isolement. Les nOMV présentement considérées présentent une distribution des tailles préférée comprise entre 20 et 250 nm, mesurée par la technique de diffusion dynamique de la lumière DLS.

Selon certains modes de réalisation, les nOMV sont préparées à partir de bactéries de type sauvage ou à partir de bactéries qui ont été manipulées génétiquement en général pour augmenter l'immunogénicité (par exemple, pour hyper-exprimer des immunogènes), pour réduire la toxicité, pour inhiber la synthèse des saccharides capsulaires, pour réguler négativement l'expression des antigènes immunodominants, et analogues. Elles peuvent être également préparées à partir de souches hyperbourgeonnantes. Les nOMV de l'invention peuvent également exprimer des protéines exogènes sur leur surface et elles peuvent être appauvries en endotoxine.

De préférence, les nOMV à utiliser dans la présente invention sont produites à partir de souches bactériennes génétiquement modifiées qui sont mutées pour amplifier la production des vésicules, et éventuellement aussi pour éliminer ou modifier des

BE2017/5855 antigènes (par exemple, le lipide A) et/ou pour surexprimer des antigènes homologues ou des antigènes provenant d'autres organismes. Lesdites nOMV préférées sont également connues en tant que modules généralisés d'antigènes membranaires (GMMA) comme il est décrit, par exemple, dans PLoS One. 2015; 10(8): e0134478.

La production spontanée amplifiée des vésicules peut être obtenue, par exemple, par une délétion ciblée de protéines impliquées dans le maintien de l'intégrité de la membrane. Il a été observé que la surface externe des nOMV correspond sensiblement à la surface externe de la bactérie à partir de laquelle elles sont dérivées, en préservant les antigènes membranaires (y compris, par exemple, les lipopolysaccharides, les lipooligosaccharides et les lipoprotéines) dans le contexte de la membrane. De façon avantageuse, les nOMV utilisées dans l'invention (à la différence des dOMV extraites par un détergent) conservent ces composants de la membrane externe dans leur conformation native et orientation correcte, préservant mieux l'immunogénicité contre la souche bactérienne à partir de laquelle elles sont dérivées.

Généralement, les nOMV pour une utilisation dans la présente invention peuvent être préparées à partir de toute bactérie appropriée, où les bactéries préférées comprennent, mais n'y sont pas limitées : Neisseria (par exemple, en particulier N. meningitidis de tout sérogroupe y compris A, B, C, X, Y ou W135, ou à partir d'une Neisseria non pathogène), Shigella (comme

S. sonnei, S. flexneri, dysenteriae ou boydii), des sérovars de Salmonella enterica (tels que paratyphi A,

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B ou C, enteritidis, typhi ou typhimurium), Haemophilus influenzae (par exemple, H. influenzae non typable), Vibrio cholerae, Bordetella pertussis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis BCG, Escherichia coli, Bacteroides (y compris Porphyromonas), Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylori, Brucella melitensis Campylobacter jejuni, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Xenorhabdus nematophilus, Moraxella catarrhalis, ou Borrelia burgdorferi.

Les bactéries particulièrement préférées sont choisies parmi au moins l'une de : S. sonnei,

S. flexneri, la bactérie Salmonella, et le méningocoque, particulièrement le méningocoque du sérogroupe B.

Les souches virulentes de Shigella possèdent un plasmide de 220 kb qui médie les propriétés de virulence. Il a été montré que ce « plasmide de virulence » code pour les gènes pour plusieurs aspects de la virulence de Shigella, y compris des adhésines pour les cellules épithéliales cibles, les antigènes des plasmides d'invasion, virF, virG, et analogues. Une Shigella utilisée avec l'invention peut posséder ou pas un plasmide de virulence. L'absence du plasmide peut stabiliser la souche durant la culture industrielle, atténuer la souche par élimination des facteurs de virulence (augmentant de cette façon la sécurité de la fabrication), éviter la présence de l'entérotoxine ShET2 (codée par le gène ospD3 ou sen sur le plasmide) , et éviter la présence de msbB2 qui est une seconde copie du gène msbB responsable de l'acylation du lipide A. L'absence du plasmide de virulence peut également perturber le lipopolysaccharide. Toutefois, les gènes de

BE2017/5855 biosynthèse pour 1'-OAg devront de préférence être conservés, soit par le maintien d'un plasmide de virulence muté, soit par l'inclusion dans un autre plasmide soit par le clonage dans le chromosome bactérien

Tant que la bactérie Salmonella est concernée, une souche particulièrement préférée est choisie parmi : Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis et Salmonella paratyphi A.

Les nOMV des bactéries Meningococcus sont également préférées. De telles vésicules peuvent être préparées à partir de toute souche méningococcique. Les vésicules sont préparées de préférence à partir d'une souche du sérogroupe B, mais il est également préféré de les

préparer	à	partir de	sérogroupe	s autres	que B,	comme
1'un de :	A	, c,	W135 ou Y, selon	des	procédures connues
dans 1'art.	La	souche	peut être	de	tout	sérotype	(par
exemple,	1,	2a,	2b, 4	, 14, 15,	16,	etc.	) , tout	séro-

sous-type (par exemple, PI.4), et tout immunotype (par exemple, Ll ; L2 ; L3 ; L3,7 ; L3,7,9 ; L10 ; etc.). Les méningocoques peuvent être de toute lignée appropriée, y compris des lignées hyper-invasives et hypervirulentes, de préférence l'une quelconque des sept lignées hypervirulentes suivantes : sous-groupe I ; sousgroupe III ; sous-groupe IV-1 ; complexe ET-5 ; complexe ET-37 ; groupe A4 ; lignée 3. De façon préférée entre toutes, les OMV sont préparées à partir de la souche NZ98/254, ou une autre souche avec le séro-sous-type de PorA PI.4.

Dans un autre mode de réalisation, les bactéries pour la préparation des nOMV utiles pour l'invention peuvent être des souches mutantes qui ont été manipulées,

BE2017/5855 par exemple, pour amplifier la production des vésicules, pour exprimer un ou plusieurs antigènes souhaités, et/ou pour inactiver ou modifier un gène non souhaité (par exemple, un qui code pour une toxine ou qui code pour une enzyme impliquée dans la production d'un produit toxique, telle qu'une endotoxine).

Dans cette direction, d'autres nOMV pour l'invention sont produites par une bactérie Salmonella, particulièrement une S. typhimurium (également connue sous le nom de Salmonella enterica sérovar typhimurium) qui n'exprime pas une protéine TolR fonctionnelle.

Lorsque les vésicules sont préparées à partir d'E. coli, de Shigella ou de Salmonella, la bactérie ne peut pas exprimer plus de 4 des protéines TolA, TolB, TolQ, TolR et Pal. Ainsi, au moins une protéine parmi le système des cinq protéines Tol-Pal naturelles peut être absente, résultant en une bactérie qui, durant la croissance dans le milieu de culture, libère des quantités supérieures de vésicules de membrane externe dans le milieu par rapport à la même bactérie exprimant les 5 protéines Tol-Pal. De préférence TolR n'est pas exprimée, mais les quatre autres protéines peuvent être exprimées (c'est-à-dire, une souche ATolR).

Dans des modes de réalisation préférés, au moins l'une des cinq protéines Tol-Pal dans E. coli, Shigella ou Salmonella est éliminée, par exemple, par délétion ou inactivation du gène codant pour la protéine. Ainsi, la bactérie peut exprimer 0, 1, 2, 3 ou 4 des protéines TolA, TolB, TolQ, TolR et Pal. L'élimination de l'une des cinq protéines peut suffire, en quel cas la bactérie exprime seulement 4 de ces protéines. De préférence, la

BE2017/5855 protéine TolR est éliminée, par exemple, par inactivation du gène tolR d'une souche de départ. Ainsi, une bactérie préférée peut être tolA+ tolB+ tolQ+ TolRPal+.

Dans certains modes de réalisation, la bactérie exprime les cinq protéines Tol-Pal, mais au moins l'une est mutée pour provoquer un hyper-bourgeonnement. Par exemple, la protéine TolA, TolQ, TolR et/ou Pal peut être mutée de telle façon que la protéine conserve sa localisation membranaire mais ses interactions avec les autres membres du système Tol-Pal sont perturbées. La bactérie conservera ainsi TolA, TolQ et TolR en tant que protéines transmembranaires dans la membrane interne, et la protéine Pal en tant que lipoprotéine faisant face au périplasme dans la membrane externe, mais au moins l'une des protéines TolA, TolQ, TolR et/ou Pal est mutée et pas totalement fonctionnelle.

En outre, d'autres mutations peuvent être également présentes, par exemple, pour donner des souches déficientes en OAg, par exemple dans ces cas où la fonctionnalité -OAg n'est pas prévue pour la réponse immunitaire souhaitée, ou dans ces cas où 1 '-OAG peut avoir un impact négatif sur l'immunogénicité contre l'antigène hétérologue. Dans cette direction, les mutations possibles peuvent être AgalU, AgalE ou AwbaP dans des souches d'E. coli, de Shigella ou de Salmonella.

Dans un autre mode de réalisation préféré, un méningocoque n'exprime pas une protéine MltA fonctionnelle. L'inactivation de MltA (la transglycosylase lytique liée à la membrane, également connue sous le nom de GNA33) dans le méningocoque fournit

BE2017/5855 des bactéries qui libèrent spontanément des grandes quantités de nOMV dans le milieu de culture, à partir duquel elles peuvent être facilement purifiées. Par exemple, les vésicules peuvent être purifiées en utilisant le procédé de filtration par taille en deux étapes, comprenant : (i) une première étape de filtration dans laquelle les vésicules sont séparées des bactéries en se basant sur leurs tailles différentes, avec les vésicules passant dans le filtrat ; et (ii) une seconde étape de filtration dans laquelle les vésicules sont retenues dans le rétentat.

Dans la présente invention, il est préféré que 1 ' -OAg soit présent sur les nOMV parce que nous avons observé (par exemple, des nOMV provenant de Salmonella et Shigella) que, la présence de 1'-OAg sur la surface desdites nOMV est avantageuse dans la fourniture d'un vaccin bivalent, car 1'-OAg peut agir en tant qu'antigène protecteur. Certaines souches préférées comportent un LPS penta- ou tétra-acylé moins toxique, qui comprend 1'-OAg fixé, après la mutation de msbB, htrB, ddg et/ou PagP (voir, par exemple, Rossi O et al., Clin Vaccine Immunol. 4 avril 2016; 23(4) : 304-14 et Rossi O et al., J Biol Chem. 5 septembre 2014; 289(36): 24922-35.

Dans Neisseria, la souche comporte de préférence un gène fur modifié. Selon ce mode de réalisation, les Neisseria mutantes sont modifiées pour réduire ou désactiver l'expression d'au moins un gène impliqué pour rendre toxique la partie lipide A du LPS, en particulier du gène lpxll. De cette façon, les nOMV résultantes présentent une toxicité réduite par rapport à la souche

BE2017/5855 de type sauvage, depuis la conversion du lipide A acylé en une forme moins acylée.

De façon similaire, les Neisseria mutantes préférées pour l'invention sont modifiées pour réduire ou désactiver l'expression d'au moins un gène impliqué dans la synthèse ou l'export des saccharides capsulaires, en particulier des gènes synX et/ou ctrA. De cette façon, les nOMV résultantes peuvent présenter une protection croisée contre divers sérotypes, ce qui est particulièrement apprécié de l'homme du métier.

Dans des modes de réalisation préférés, une souche peut comprendre une ou plusieurs des mutations d'inactivation et/ou d'hyper-expression divulguées, par exemple, dans Fukusawa et al. (1999), Vaccine 17: 29512958. Par exemple, en suivant les conseils et la nomenclature qui y sont indiqués, les gènes utiles pour la régulation négative et/ou l'inactivation comprennent : (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, et/ou TbpB ; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, et/ou TbpB ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE,

LbpA, LpbB, Opa, Ope, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, et/ou TbpB ; ou (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX et/ou SynC.

Tel que susmentionné, les présents conjugués sont obtenus en connectant au moins une fraction saccharidique de surface de nOMV (comprise de préférence dans 1'-OAg apparenté) à un ou plusieurs antigènes

BE2017/5855 étrangers choisis, c'est-à-dire qui ne font pas partie de la vésicule.

Tant que la fraction saccharidique de nOMV est concernée, il faut noter qu'elle peut faire partie de la fonctionnalité -OAg présente sur la surface de la nOMV (par exemple, dans le LPS ou le LOS), ou elle peut être présente au sein d'une partie différente de la surface de la nOMV, par exemple un PSC, comme il est décrit cidessous en détail. De façon avantageuse, tout antigène correct peut être conjugué à la nOMV pour obtenir les conjugués nOMV-antigène de l'invention, de préférence sous la forme d'un (poly)saccharide ou d'un polypeptide. Dans tous les cas, la connexion d'un ou de plusieurs antigènes choisis produit un conjugué immunogène qui peut produire une réponse immunitaire qui reconnaît ledrt antrgene, et qur reconnart egalement un ou plusieurs composants dans ; pratique et utile pour la multivalent. Les antigènes présents conjugués à une suffisamment élevée pour dé administrés à un hôte, une a nOMV, ainsi de façon préparation d'un vaccin seront inclus dans les concentration qui est :lencher, lorsqu'ils sont réponse immunitaire qui reconnaît cet antigène. En outre, la réponse immunitaire est de préférence protectrice contre le pathogène à partir duquel l'antigène a été dérivé, de façon même davantage préférée contre l'un des pathogènes énumérés ci-dessous.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la nOMV est conjuguée à au moins un antigène homologue, c'està-dire dérivé du même organisme à partir duquel les nOMV sont dérivées. Dans un mode de réalisation encore préféré,

BE2017/5855 l'antigène choisi est un antigène hétérologue, c'est-àdire dérivé d'un organisme différent de l'organisme à partir duquel les nOMV sont dérivées.

Dans tous les cas, les antigènes sont choisis généralement parmi des polypeptides immunogènes quelconques, c'est-à-dire des polypeptides capables de déclencher une réponse immunitaire lorsqu'ils sont administrés à un sujet. Les polypeptides utilisés avec l'invention comprendront un acide aminé ayant un résidu, ou une chaîne latérale, avec un groupe fonctionnel approprié pour la conjugaison, de préférence un groupe amino ou thiol, de façon même davantage préférée de formule générale : -NH2 ou -SH. Ces résidus peuvent être naturellement présents dans un antigène, ou ils peuvent être introduits artificiellement pour les objectifs de la conjugaison. Les résidus d'acides aminés préférés comprennent, mais n'y sont pas limités : l'arginine, la lysine, l'asparagine, la glutamine, la cystéine et l'histidine. Le résidu d'acide aminé préféré entre tous pour la conjugaison est la lysine. En fait, sa chaîne latérale -NH2 peut réagir avec un groupe -OH oxydé activé à partir d'une fraction saccharidique de nOMV et peut réagir avec le groupe aldéhyde ainsi obtenu par amination réductrice, selon le procédé divulgué ici en détail.

Les antigènes polypeptidiques sont préparés de préférence sous une forme sensiblement pure ou sensiblement isolée (c'est-à-dire, sensiblement dépourvue d'autres polypeptides). Ils peuvent être préparés par divers moyens, par exemple, par synthèse chimique (au moins en partie), par digestion de polypeptides plus longs en utilisant des protéases, par

BE2017/5855 traduction à partir d'ARN, par purification à partir d'une culture cellulaire (par exemple, à partir d'une expression recombinante ou à partir de la culture native), et analogues. L'expression recombinante dans un hôte d'E. coli est une voie d'expression utile. Les antigènes polypeptidiques peuvent prendre diverses formes (par exemple, native, fusions, glycosylée, non glycosylée, lipidée, ponts disulfure et analogues).

Les antigènes polypeptidiques utilisés avec l'invention ont une masse moléculaire moyenne en poids préférée d'au moins 1 kDa, de façon davantage préférée d'au moins 3,5 kDa, de façon même davantage préférée de 10 à 80 kDa. De façon encore davantage préférée, la masse moléculaire moyenne en poids est comprise de 15 à 75 kDa.

D'autres antigènes polypeptidiques préférés pour la conjugaison aux nOMV selon la présente invention comprennent un épitope provenant d'un polypeptide fungique, bactérien, de protozoaire ou viral. Les polypeptides de protozoaires préférés proviennent d'un Plasmodium (tel que P. falciparum, P. vivax, P. ovale). Les polypeptides bactériens particulièrement préférés sont choisis parmi : E. coli, N. meningitidis, et les streptocoques (tels que S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes) .

Les antigènes polypeptidiques d'E. coli préférés comprennent CTF1232, 405 et 3526. En tant qu'exemples préférés non limitatifs, les nOMV provenant de Shigella ou Salmonella peuvent être conjuguées à CTF1232, selon la présente invention, pour produire un vaccin bivalent couvrant à la fois E. coli entérotoxigène (ETEC) et Shigella/Salmonella.

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Dans un mode de réalisation, les polypeptides de N. meningitidis considérés sont capables, lorsqu'ils sont administrés à un mammifère, de déclencher une réponse en anticorps qui est bactéricide contre le méningocoque. Les polypeptides de N. meningitidis préférés pour une utilisation avec l'invention sont choisis parmi au moins l'un de : NHBA, NadA, NsPA, NhhA, App et fHbp, comme il est détaillé ci-dessous.

Antigène NHBA

L'antigène NHBA a été inclus dans la séquence génomique publiée pour la souche de méningocoque de sérogroupe B MC58 en tant que gène NMB2132 (numéro d'accession GenBank GI:7227388 ; SEQ ID NO : 2 ici). Les séquences de l'antigène NHBA de nombreuses souches ont été publiées depuis lors. Divers fragments immunogènes de l'antigène NHBA ont été également rapportés. Les antigènes NHBA préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus)

avec SEQ	ID	NO : 2 ; et/ou	(b) comprenant un fragment
d'au moins	« n » acides	aminés	consécutifs	de
SEQ ID NO	;	2, dans lequel	« n » vaut	7 ou plus	(par
exemple,	8,	10, 12, 14, 16,	18, 20, 25,	30, 35, 40,	50,
60, 70,	80,	, 90, 100, 150,	. 200, 250	ou plus) .	Les

fragments préférés de (b) comprennent un épitope issu de SEQ ID NO : 2. Les antigènes NHBA les plus utiles de l'invention peuvent déclencher des anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué de la séquence

BE2017/5855 d'acides aminés SEQ ID NO : 2. Les antigènes NHBA avantageux pour une utilisation avec l'invention peuvent déclencher des anticorps antiméningococciques bactéricides après administration à un sujet.

Antigène NadA

L'antigène NadA a été inclus dans la séquence génomique publiée pour la souche de méningocoque de sérogroupe B MC58 (voir, par exemple, Tettelin et al. (2000) Science 287: 1809-1815) en tant que gène NMB1994 (numéro d'accession GenBank GI:7227256 ; SEQ ID NO : 3 ici) . Les séquences du gène NadA de nombreuses souches ont été publiées depuis lors, et l'activité de la protéine en tant qu'adhésine neissérienne a été bien documentée. Divers fragments immunogènes de NadA ont été également rapportés. Les antigènes NadA préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent une

séquence d'acides aminés :	(a)	présentant 50 % ou	plus
d'identité (par exemple, 60	O O r	65 %, 70 %, 75 %,	80 %,
85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93	o θ r	94 %, 95 %, 96 %,	97 %,
98 %, 99 %, 99,5 % ou plus)	avec SEQ ID NO : 3 ;	et/ou
(b) comprenant un fragment	d'	au moins « n » acides
aminés consécutifs de SEQ ID NC	' : 3, dans lequel	« n »
vaut 7 ou plus (par exemple,	8,	10, 12, 14, 16, 18	, 20,
25, 30, 35, 40, 50, 60, 70,	80,	90, 100, 150, 200	, 250

ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope issu de SEQ ID NO : 3. Les antigènes NadA préférés entre tous de 1'invention peuvent déclencher des anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3. Les antigènes NadA avantageux pour une utilisation avec

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1'invention peuvent déclencher des anticorps antiméningococciques bactéricides après administration à un sujet. SEQ ID NO : 7 est un tel fragment.

Antigène NspA

L'antigène NspA a été inclus dans la séquence génomique publiée pour la souche de méningocoque de sérogroupe B MC58 (voir, par exemple, Tettelin et al. (2000) Science 287: 1809-1815) en tant que gène NMB0663 (numéro d'accession GenBank GI:7225888 ; SEQ ID NO : 4 ici) . Les séquences de l'antigène NspA de nombreuses souches ont été publiées depuis lors. Divers fragments immunogènes de NspA ont été également rapportés. Les antigènes NspA préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 4 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 4, dans lequel « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope issu de SEQ ID NO : 4. Les antigènes NspA préférés entre tous de l'invention peuvent déclencher des anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué d'acides aminés SEQ ID NO de la séquence antigènes NspA avantageux pour une utilisation avec l'invention peuvent déclencher des anticorps antiméningococciques bactéricides après administration à un sujet.

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Antigène NhhA

L'antigène NhhA a été inclus dans la séquence génomique publiée pour la souche de méningocoque de sérogroupe B MC58 (voir, par exemple, Tettelin et al. (2000) Science 287: 1809-1815) en tant qu'antigène NMB0992 (numéro d'accession GenBank GI:7226232 ; SEQ ID NO : 5 ici). Les séquences de l'antigène NhhA de nombreuses souches ont été publiées depuis lors, par exemple, WO 00/66741 et WO 01/55182, et divers fragments immunogènes de NhhA ont été rapportés. Il est également connu en tant que Hsf. Les antigènes NhhA préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent une

séquence	d'acides	aminés :	(a) présentant 50 %	ou plus
d'identité (par exemple,	60	%, 65	O θ r	70	O θ r	75 %	, 80 %,
85 %, 90	%, 91 %,	92 %,	93	%, 94	o θ r	95	o θ r	96 %	, 97 %,
98 %, 99	%, 99,5 %	ou plus)	avec	SEQ	ID	NO	: 5	; et/ou
(b) comprenant un	fragment	d ' au	moins	«	n »	acides

aminés	consécutifs	de SEQ ID	NO	: 5	, dans lequel «	n »
vaut 7	ou plus	(par	exemple,	8,	10,	12, 14, 16, 18,	20,
25, 30,	35, 40,	50,	60, 70,	80,	90,	100, 150, 200,	250

ou plus). Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope issu de SEQ ID NO : 5. Les antigènes NhhA préférés entre tous de 1'invention peuvent déclencher des anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5. Les antigènes NhhA avantageux pour une utilisation avec 1'invention peuvent déclencher des anticorps anti méningococciques bactéricides après administration à un suj et.

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Antigène App

L'antigène App a été inclus dans la séquence génomique publiée pour la souche de méningocoque de sérogroupe B MC58 (voir, par exemple, Tettelin et al. (2000) Science 287: 1809-1815) en tant qu'antigène

NMB1985 (numéro d'accession GenBank GI:7227246 ;

SEQ ID NO : 6 ici) . Les séquences de l'antigène App de nombreuses souches ont été publiées depuis lors. Divers fragments immunogènes de App ont été également rapportés Les antigènes App préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 6 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 6, dans lequel « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope issu de SEQ ID NO : 6. Les antigènes NhhA préférés entre tous de l'invention peuvent déclencher des anticorps qui, après administration à un sujet, peuvent se lier à un polypeptide méningococcique constitué de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO

6. Les antigènes App avantageux pour une utilisation avec l'invention peuvent déclencher des anticorps antiméningococciques bactéricides après administration à un sujet.

Antigène fHbp

La protéine de liaison du facteur H existe sous la forme de trois variants (vl, v2 et v3), et l'invention

BE2017/5855 peut utiliser l'un quelconque de ceux-ci en tant que mode de réalisation préféré.

Un vl de fHbp comprend de préférence (a) une séquence d'acides aminés qui présente au moins k' % d'identité avec SEQ ID NO : 8, et/ou (b) un fragment de SEQ ID NO : 8. k' se rapporte à un pourcentage d'identité et pourra être défini comme tout nombre de 1 à 100. En référence aux séquences d'acides aminés ou d'acide nucléique, généralement l'identité utilisée dans la demande démarre aussi bas que 40 % avec des références spécifiques à des pourcentages supérieurs, c'est-à-dire, 70 %, 75 %, 80 %, etc.

Le fragment comprendra de préférence au moins un épitope issu de SEQ ID NO : 8. De préférence, le vl de fHbp peut déclencher des anticorps qui sont bactéricides contre les souches vl, par exemple contre la souche MC58 (disponible auprès de 1'ATCC en tant que « BAA-335 »).

Un v2 de fHbp comprend de préférence (a) une séquence d'acides aminés qui présente au moins k' % d'identité avec SEQ ID NO : 1, et/ou (b) un fragment de SEQ ID NO : 1. Des informations concernant k' et les fragments sont données ci-dessus. Le fragment comprendra de préférence au moins un épitope issu de SEQ ID NO : 1. De préférence, le v2 de fHbp peut déclencher des anticorps qui sont bactéricides contre des souches v2, par exemple, contre la souche M2091 (ATCC 13091).

Un v3 de fHbp comprend de préférence (a) une séquence d'acides aminés qui présente au moins k' % d'identité avec SEQ ID NO : 9, et/ou (b) un fragment de SEQ ID NO : 9. Des informations concernant k' et les fragments sont données ci-dessus. Le fragment comprendra

BE2017/5855 de préférence au moins un épitope issu de SEQ ID NO : 9. De préférence, le v3 de fHbp peut déclencher des anticorps qui sont bactéricides contre des souches v3, par exemple, contre la souche M01-240355.

Les antigènes de Streptococcus du groupe A (GAS), de Streptococcus du groupe B (GBS) et de Pneumococcus sont aussi préférés de façon égale. En tant qu'exemples non limitatifs, les antigènes GAS25 (Slo), GAS40 (SpyAD) et GAS57 (SpyCEP) peuvent être incorporés dans des conjugués conformément à certains modes de réalisation de l'invention.

Les antigènes de Plasmodium sont en outre préférés. Ceux-ci peuvent provenir de toute espèce appropriée, où les espèces préférées sont choisies parmi : P. falciparum, P. vivax et P. ovale.

Encore un autre antigène préféré est Pfs25 (SEQ ID NO : 10), qui est un antigène du stade sexuel de P. falciparum exprimé sur la surface des formes zygotes et ookinètes du parasite. Un autre antigène préféré est Pfs48/45, qui est un vaccin candidat bloquant la transmission. Récemment, le fragment C-terminal de 10 cystéines (10C) de Pfs48/45, contenant trois épitopes connus pour les anticorps bloquant la transmission, a été produit sous la forme d'une chimère avec la partie N-terminale de GLURP (RO), la protéine riche en glutamate antigène du stade sanguin asexué. La protéine de fusion résultante (RO10C) a déclenché des taux élevés d'anticorps bloquant la transmission chez des rongeurs (voir, Theisen et al. (2014) Vaccine 32: 2623-2630). Shing et al. (2015) Vaccine 33: 1981-1986 décrivent une chimère contenant des fragments tronqués de 6C, qui

BE2017/5855 augmente le rendement du conformère correctement replié. La construction RO6C a été capable de déclencher un titre élevé d'anticorps bloquant la transmission chez des rats RO6C (SEQ ID NO : 11) est un antigène préféré qui peut être conjugué selon la présente invention.

Un autre antigène préféré est la protéine circumsporozoite (CSP ; SEQ ID NO : 12).

Des peptides plus courts issus de la CSP peuvent être également conjugués selon la présente invention. Par exemple, le peptide de 12 acides aminés (NANPH (SEQ ID NO : 13) dérivé de la CSP peut être utilisé selon des modes de réalisation préférés.

Dans encore un autre mode de réalisation préféré, les antigènes sont une espèce de saccharide. L'invention est en fait également appropriée pour conjuguer un ou plusieurs antigènes saccharidiques aux nOMV, grâce à quoi les saccharides peuvent être utilisés sous leur forme naturelle pleine longueur. Comme variante, une fraction d'une taille particulière peut être également choisie de façon avantageuse. Ainsi, les saccharides peuvent être fragmentés à partir de leur longueur naturelle, et éventuellement une fraction de taille de ces fragments peut être utilisée. Même en outre, les saccharides ne sont pas limités à des saccharides purifiés à partir de sources naturelles et des saccharides synthétiques ou semi-synthétiques peuvent être utilisés à la place.

Les antigènes saccharidiques préférés sont des saccharides capsulaires (PSC) bactériens. Ceux-ci comprennent, mais n'y sont pas limités, les saccharides capsulaires choisis parmi au moins 1'un de : Haemophilus

BE2017/5855

in fluenzae	de	type B ;	Neisseria	meningitidis des
sérogroupes	A,	C, W135,	X	et	Y ; Streptococcus
pneumoniae	des	sérotypes 1	, 2,	3, 4,	5, 6A, 6B, 7F, 8,
9N, 9V, 10A	, 11A, 12F, 14,	15B,	17F,	18C, 19A, 19F, 20,

22F, 23F, et 33F ; Salmonella y compris Salmonella enterica sérovar typhi Vi, soit pleine longueur soit fragmenté (indiqué par fVi) ; Streptococcus agalactiae des sérotypes la, Ib, et III ; Streptococcus pyogenes, Shigella sp., Streptococcus du groupe A et B (GAS et GBS respectivement). Les antigènes saccharidiques davantage préférés proviennent de Neisseria meningitidis des sérogroupes A et C. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, la nOMV est un GMMA dérivé de MenB, et l'antigène choisi est un saccharide capsulaire provenant de MenA ou MenC. Dans un mode de réalisation encore supplémentaire, l'invention se rapporte à un GMMA issu de MenB conjugué à un saccharide capsulaire provenant de l'antigène de MenA par l'intermédiaire d'un résidu polysaccharidique, dans lequel ledit GMMA est également conjugué à un antigène de MenC par l'intermédiaire d'un résidu polysaccharidique différent, obtenant ainsi une vésicule GMMA fonctionnalisée double, comme il est décrit ci-dessous plus en détail.

Dans tous les cas, et comme il a été susmentionné, les antigènes choisis pourront être conjugués à des nOMV dérivées de la même souche bactérienne et même d'une souche bactérienne différente, fournissant ainsi un conjugué multivalent. A cet égard, dans un mode de réalisation davantage préféré de l'invention, la nOMV et l'antigène saccharidique sont dérivés de souches bactériennes différentes.

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D'autres antigènes saccharidiques préférés sont des ß-glucanes, particulièrement utiles pour la protection contre C. albicans (pour une référence générale, voir Sandlin et al. (1995) Infect. Immun., 63: 229-37).

D'autres antigènes saccharidiques préférés sont des oligosaccharides de poly-rhamnose pour la protection contre Streptococcus du groupe A (GAS). Le saccharide de GAS natif a un squelette de poly-rhamnose substitué par NAcGlcN. Des oligosaccharides synthétiques de polyrhamnose, ou des oligomères avec la structure du saccharide de GAS natif, peuvent être conjugués à des nOMV selon l'invention.

Selon un mode de réalisation préféré, les conjugués de nOMV de 1'invention comprennent une fraction saccharidique de surface de nOMV connectée directement à un antigène choisi, où la connexion directe peut être obtenue par activation de la fraction saccharidique suivie d'une réaction directe (par exemple, par l'intermédiaire d'une amination réductrice) avec l'antigène choisi, comme il est illustré dans le présent exemple 4. Dans un mode de réalisation préféré de façon égale, la nOMV est connectée à l'antigène choisi indirectement, c'est-à-dire, par l'intermédiaire d'une fraction de lieur, comme il est décrit ici plus en détail et tel qu'illustré dans l'exemple 3.

Les conjugués de l'invention sont immunogènes, comme il est démontré par les études chez des souris et supporté par la partie expérimentale incluse ici. De façon avantageuse, en dehors d'être capables d'induire une réponse immunitaire contre l'antigène conjugué, les conjugués de l'invention sont également capables

BE2017/5855 d'induire une réponse immunitaire contre le composant nOMV, étant ainsi des bons candidats pour la préparation d'une composition immunogène multivalente de ceux-ci. En fait, il a été observé de façon surprenante que la conjugaison des antigènes choisis par l'intermédiaire de la fraction saccharidique présente sur la surface des nOMV n'a pas d'impact négatif sur la capacité des nOMV à induire leur propre réponse immunitaire, à la différence des dOMV. Par conséquent, les conjugués de l'invention peuvent être utiles, par exemple, en tant qu'agent immunogène bivalent, appropriés pour la préparation de vaccins, avec la nOMV et l'antigène hétérologue conjugué présentant tous les deux une bonne immunogénicité. En outre, il a été découvert de façon avantageuse que les conjugués de l'invention induisent une réponse élevée en IgG spécifiques anti-antigène chez les souris, sans aucun impact sur la réponse des IgG anti-OAg, comme il est supporté par exemple dans les présents exemples 5 et 6. Les conjugués de l'invention offrent plusieurs autres avantages comparativement aux antigènes non conjugués, comme il est présenté par exemple dans les exemples 3 à 6.

Comme il a été présenté auparavant, dans un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé de préparation des conjugués décrits ci-dessus, comprenant une première étape d'activation d'une fraction saccharidique de surface des nOMV, et une seconde étape de connexion de la vésicule activée ainsi obtenue à au moins un antigène choisi, éventuellement par l'intermédiaire d'un lieur bivalent.

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Selon le présent procédé, au moins une fraction saccharidique sur une nOMV est conjuguée à un antigène choisi (comme il a été décrit ci-dessus) pour former un conjugué de l'invention. Selon un mode de réalisation différent, deux fractions saccharidiques ou plus sont conjuguées à deux antigènes choisis différents ou plus, fournissant ainsi un dérivé de nOMV conjugué avec deux antigènes différents ou plus, ce qui est particulièrement approprié pour la préparation de compositions immunogènes polyvalentes. Comme il a été indiqué ci-dessus, l'étape de connexion implique généralement l'activation de la fraction saccharidique de surface des nOMV et/ou de l'antigène choisi. De façon similaire, l'étape de connexion peut impliquer l'introduction d'un lieur entre la fraction saccharidique des nOMV et l'antigène choisi, comme il est détaillé ci-dessous. Ainsi, dans un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : (i) l'activation d'une fraction saccharidique sur la surface des nOMV ; et (ii) la connexion directe de la fraction activée avec un antigène choisi, pour obtenir les conjugués de nOMV de l'invention

Comme variante de mode de réalisation, le procédé de 1'invention comprend les étapes suivantes : (i) l'activation d'une fraction saccharidique sur la surface des nOMV ; (ii) la connexion de la fraction activée à un groupe lieur bivalent pour former un conjugué vésicule-lieur ; et (iii) la connexion d'un antigène choisi au conjugué vésicule-lieur pour former les conjugués de nOMV de l'invention.

BE2017/5855

Comme autre variante de mode de réalisation, le procédé de 1 ' invention comprend les étapes suivantes : (i) l'activation d'une fraction saccharidique sur la surface des nOMV ; (ii) la connexion d'un antigène choisi à un groupe lieur bivalent pour former un conjugué antigène-lieur ; et (iii) la connexion de la fraction activée de l'étape (i) au conjugué antigène-lieur pour former les conjugués de nOMV de l'invention.

Comme autre variante de mode de réalisation, le procédé de 1 ' invention comprend les étapes suivantes : (i) l'activation d'une fraction saccharidique sur la surface de la nOMV ; (ii) la connexion de la fraction activée à un groupe lieur bivalent pour former un conjugué vésicule-lieur ; (iii) la connexion d'un antigène choisi à un groupe lieur bivalent pour former un conjugué antigène-lieur ; et (iv) la connexion de la fraction du lieur de l'étape (ii) au conjugué antigènelieur de l'étape (iii) pour former les conjugués de nOMV de l'invention.

Tant que la fraction saccharidique de nOMV est considérée, il faut noter qu'elle peut faire partie de la fonctionnalité -OAg, ou de la région du noyau naturellement présente sur la surface de la nOMV (par exemple, dans le LPS ou le LOS) , ou elle peut être présente au sein d'une partie différente de la surface de la nOMV, par exemple, un PSC. Dans tous ces cas préférés, le procédé de l'invention permet la connexion de ladite fraction saccharidique avec un antigène choisi d'une façon simple et efficace, menant ainsi aux conjugués de nOMV finals de l'invention, dotés d'une activité immunogène remarquable. De façon avantageuse,

BE2017/5855 la présence de 1'-OAg n'interfère sensiblement pas avec la réponse contre l'antigène choisi. Les exemples comparatifs 9a à c montrent que lorsque le présent procédé est appliqué à des dOMV, il ne se produit aucune conjugaison avec l'antigène, prévenant ainsi la formation du conjugué vésicule-antigène souhaité.

Selon l'espèce à partir de laquelle les nOMV sont préparées, diverses fractions saccharidiques (y compris des sucres tétraoses, pentoses et hexoses) peuvent être utilisées pour l'activation et la conjugaison subséquente. De préférence, des lipopolysaccharides, par 1 ' intermédiaire de la partie -OAg ou de la région du noyau, ou des saccharides capsulaires peuvent être utilisés pour l'activation et la conjugaison subséquente Les fractions saccharidiques préférées sont choisies parmi au moins l'un des : glucose, galactose, fructose, mannose, ribose, abéquose, galactosamine, glucosamine, mannosamine, acide sialique, suifoquinovose, érythrose, thréose, arabinose, rhamnose, sorbose, ribulose, xylose, xylulose, lyxose, tagatose ou céto-désoxy-octulosonate. Une fraction saccharidique sur la nOMV est activée de préférence par oxydation d'un groupe hydroxyle du saccharide pour former une fonctionnalité aldéhyde carbonylé, en présence d'un agent oxydant approprié, tel que le TEMPO ou un sel periodé. Ce dernier est choisi de préférence parmi un periodate ou un métaperiodate d'alcali, de façon davantage préférée le NaIO4. L'agent oxydant est utilisé de préférence sous la forme d'une solution aqueuse dans une concentration située dans la plage de 0,5 mM à 20 mM, de préférence de 3 mM à 20 mM, où les concentrations de 10 à 20 mM et de 0,5 à 5 mM ou

BE2017/5855 de 3 à 5 mM sont encore davantage préférées. D'autres réactions d ' activation selon certains modes de réalisation surviennent en présence de :

réactifs de cyanylation tels que le

CDAP (par exemple, le tétrafluoroborate de

1-cyano-4-diméthylaminocarbodiimides, des hydrazides, des esters actifs, le norborane, l'acide p-nitrobenzoïque, le N-hydroxysuccinimide, le

S-NHS, l'EDC et le TSTU.

En général, lorsque les polysaccharides sont oxydés, il n'est pas nécessaire d'oxyder tous les sucres disponibles. En effet, il peut être souhaitable de conserver au moins une partie des structures de sucres naturels, particulièrement lorsque ceux-ci un antigène utile. Il faut également noter constituent le fait que, à cause de la composition et de la conformation particulières des nOMV telles que détaillées ci-dessus, la fraction polysaccharidique peut être activée de façon pratique par le présent procédé menant à la formation d'une espèce intermédiaire de nOMV oxydée hautement réactive. Dans un mode de réalisation préféré, pour une fraction saccharidique donnée d'intérêt, la proportion des résidus oxydés peut se situer dans la plage de à 100 de ou de 2 0 à 35 %, tandis que l'oxydation de au sein structure d'-OAg est particulièrement préférée. Dans cette direction, il a été découvert que lesdites plages permettent une conjugaison efficace avec un impact mineur ou sensiblement absent sur l'intégrité structurale de l'-OAg. En outre, il a été noté qu'un degré d'oxydation supérieur de la nOMV correspond à une taille inférieure de 1'-OAg, ce qui signifie qu'il y a

BE2017/5855 un impact majeur sur la structure native de 1'-OAg et sa capacité à induire une réponse immunitaire spécifique. La proportion des résidus oxydés peut être déterminée par une chromatographie avec échange d'anions haute performance avec une détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD), en comparant les résidus de sucre intacts de la nOMV, de même que le pH peut influencer la conduite globale de l'étape d'oxydation, comme par exemple il est indiqué dans le présent exemple 2, tableau 2c. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'agent oxydant est utilisé en excès par rapport à la nOMV de départ, où un excès molaire de 3/1 ou de 2/1 par rapport au nombre de monosaccharides qui peuvent être soumis à l'oxydation est particulièrement préféré. L'agent oxydant est utilisé de préférence sous la forme d'une solution aqueuse dans une concentration située dans la plage de 0,5 mM à 20 mM, de préférence de 3 mM à 20 mM, où des concentrations de 10 à 20 mM et de 0,5 à 5 ou de 3 à 5 mM sont encore davantage préférées.

La concentration des nOMV est comprise de préférence entre 0,2 et 5 mg/ml.

De préférence, le pH est compris entre 4 et 8, tandis que des valeurs de 5 et 7 sont particulièrement préférées. De cette façon, le pH peut être ajusté en utilisant un agent tampon, tel que 1 ' acétate/phosphate et analogues.

Lesdits paramètres peuvent être fixés de façon pratique afin d'obtenir un degré d'oxydation préféré compris entre 20 % et 35 % sur la fraction saccharidique soumise. Ceci permet une autre conjugaison efficace avec

B E2017/5855 l'antigène choisi, sans impact sensible sur la structure de la fraction saccharidique.

Par exemple, les résidus Rha dans une fonctionnalité -OAg peuvent être oxydés, par exemple,

5	conw	5 il est indic	jué sur le	schéma 2 ci-des	sou
	utilisant du Na 10·;.

Schéma 2

L’étape d’oxydation est généralement effectuée à température ambiante (par exemple, d’environ 15 °C à environ 40 °C), pendant un temps approprié, par exemple compris entre 30 min et 3 h, selon, par exemple, la quantité et le type des nOMV considérées. Dans tous les cas, il a été découvert qu'il ne se produisait aucune réticulation et/ou agrégation sensible des nOMV. Ceci est de la plus haute importance également pour

B E2017/5855 l’efficacité de l'étape de conjugaison subséquente avec l’antigène choisi tel que décrit ici en détail.

Après l’oxydation, les nOMV peuvent être, éventuellement soumises à une étape de réduction, par 5 exemple, avec du NaBH«, pour stabiliser les nOMV oxydées par élimination des groupes CHO formés* Les nOMV oxydées stabilisées peuvent être ensuite stockées et/ou en outre c a r a c t é r i s é e s .

Généralement, après l’étape d'activation du présent 10 procédé, les nOMV oxydées obtenues sont isolées et purifiées, par exemple, par ultracentrifugation à 4 ®Ç à 110 000 tr/min pendant 30 min, et ensuite mises à réagir avec l'antigène choisi.

Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le (i) 1'activation de la fraction saccharidique sur nOMV, de préférence par oxydation ;

f:

isolement des nOMV oxydées ainsi obtenues ; et (ii) la connexion de:

nOMV oxydées de avec au moins un antigène choisi, é v e n t u e 11 erae n t par l'intermédiaire d’un lieur bivalent.

Dans un mode de réalisation encore préféré, le

N&2SO3 .

Ceci est particulièrement avantageux parce qu ' en neutralisant la réaction d'oxydation avec du

NasSOs, le procédé en une

1. ' i solement des nOMV oxydées (étape (i-bis) comme il est illustré dans gagner du temps, en obtenant

B E2017/5855 ainsi lé conjugué final d'une façon simple et efficace. En pratique, et selon le mode de réalisation illustré, après 1’étape d'activation (1) la réaction est neutralisée avec une quantité correcte du sulfite 5 alcalin, et laissée réagir pendant une durée correcte (généralement comprise entre 5 et 20 minutes) afin de de neutraliser l’excès de l’agent oxydant. Après cela, l'antigène choisi est ajouté directement au mélange (c'est-à-dire, sans isolement des nOMV oxydées), selon 10 l’étape (il.) , obtenant ainsi les conjugués de nOMV de 1 * invention.

Comme variante, le groupe aldéhyde carbonylé de la fraction saccharidique obtenu par l’étape d'oxydation peut être en outre modifié pour former une fonctionnalité 15 correcte qui peut ensuite être mise à réagir avec l'antigène choisi Ou avec un lieux comme cela peut être le cas (dans ce cas pour donner un conjugué- vésiculelieux qui peut être ensuite couplé à. l’antigène choisi) .

L’antigène choisi est généralement ajouté dans un 20 rapport de 1./1 p/p par rapport aux nOMV utilisées, â température ambiante, pendant une durée correcte, par exemple, comprise entre 2 heures et 24 heures. Lorsque l'antigène est dérivatisè avec un lieux, la réaction est réalisée de façon pratique en utilisant un excès de 25 1‘antigène par rapport aux nOMV, de préférence dans un rapport de 2/1 ou de façon davantage préférée de 3/1 p/p, comme il est indiqué par exemple dans le présent exemple 3.

Dans un mode de réalisation particulièrement 3Ό préféré, le procédé de: l’invention comprend les étapes suivantes : (i) l'oxydation d'une fraction

B E2017/5855 saccharidique ; et (ii) la réaction de la fraction oxydée avec un groupe -amino sur un résidu de l’antigène choisi. De façon même davantage préférée, ledit résidu

de 1 ' a nt i g è ne résidu de lys Z—1 *“*\ *l fM 4	choisi est un groupe amin	o -Nh:,· sur un polypept idi que
line au seii	a d'un antigène
Ç'RO.l· 5.1 » De préf	érence, le	3 couplage de	la fraction
s a cchar idique	oxydée de 1	.a nOMV avec le gr	oupe amine, de
préférence un.	groupe -Nil?	libre, de 1'antiç	fène est obtenu

par .amination réductrice, de façon davantage préférée en utilisant du NaBH3.CN,. par exemple, selon une procédure connue dans l'art. Le NaBHuŒ est utilisé dans des quantités en poids (p/p) comprises entre 3 et 1/3, de préférence de 1 sur 1, par rapport aux nOMV oxydées. De 15 façon pratique, le NaBHsCN peut être ajouté conjointement avec l’antigène choisi, directement au produit intermédiaire des nOMV oxydées, comme il est illustre de façon générale sur les schémas 3. et 4 ci-dessous, en. utilisant, à titre d’exemple, une nOMV qui est conjuguée par 1’intermédiaire- d'une unité de rhamnose oxydée aux protéines membranaires paludéennes Pfs25 o.ü 'R0.6.C, respectivement.

I nOMV i™------------->

i.....................s ax nOMV <>

’ << \ ^s » \ ' nOMV « i c«;· 2 ..-NH

PG25

Schéma 3

B E2017/5855

nöMV l·.........:.........*

NaiO., ox nÖMV

Comme variante de mode de réalisation, l'antigène choisi peut être modifié, soit pax 1 ’ introduction d'un groupe lieur soit par conversion d'un groupe fonctionnel sur l'antigène en un autre groupe fonctionnel approprié pour la réaction avec la fraction saccharidique activée sur la nOMV, ou avec un lieur du conjugue vésicule-lieur lorsqu'il est utilisé. En particulier, si 1'antigène choisi est un saccharide, il peut être modifié par réaction avec un lieux soit de façon aléatoire (r) .,. ce gui signifie que le lieur est introduit à des points multiples tout le long de la chaîne de sucre, soit sélectivement (s), ce qui signifie que le lieur est introduit à l'extrémité réductrice de la chaîne de sucre (c'est-à-dire, au niveau d'une seule position). Dans un mode de réalisation préféré, le lieur est introduit de façon sélective au niveau de la position terminale de 1 ' antigène choisi, comme il est indiqué par exemple dans 1'exemple 3.

La modification sélective de l'antigène est obtenue de préférence par réaction avec du dihydrazide de l’acide adipique (&DH) en présence de NaBHaCN, comme il est .représenté de façon générale sur .le schéma 5 en utilisant le fVi comme antigène. La modification aléatoire de l'antigène est obtenue de préférence par activation d'un ou de plusieurs groupes acide carboxylique sur

B E2017/5855 l’antigène, par exemple en utilisant du NHS/EDAC, et une réaction subséquente avec de. l'ADH, coms il est représenté sur le schéma 6 en utilisant le fVi comme antigène. Ce type de réaction de conjugaison est illustré sur le schéma 1 ci-dessous, en utilisant, à titre d’exemple, une nOMV qui, est conjuguée par l'intermédiaire d'une unité de rhamnose oxydée au fVi modifié pour inclure un -NHa par réaction avec de l'ADH,

Schéma 5

NHS

........i aa<.:

(VI 0ΠΟΜ ...........»

Schéma 6

I nOMV nOMV <<

<

nOMV fVi-ADH 1. ·

-------------> 'Ά

HaSHsen „g Ά. ; /

N !>· ' ⁰ ' 'ϊΐΗωΚΙίΟ^ΟΝΗΝΗΐνΐ

Schéma 7

Une variante de mode de réalisation de l'invention se rapporté à un procédé comprenant les étapes suivantes :

a) la modification d'un antigène choisi pour inclure un groupe amino, de préférence -NHs ; b) l'activation. d'une nOMV par oxydation d’un çjroupe hydroxyle d'une fraction saccharidique conme il a été discuté ci-dessus, et c) la

51

connexion de la fraction sa

l'antigène modifié de /l'étape é

amination réductrice, comme il a

Une variante de mode de ré<

un procédé de fabrication d'un

comprenant la connexion d'une

oxydée d'une nOMV activée à

fabriquant de cette façon les

l'invention, ou l'antigène a été

groupe ami.no, de préférence -NH

et fraction iccharidique oxydée à se rapporte a n OMV-an t igèn e un antigène, modifié.

conjugués de nOMV de modifié pour inclure un où la nOMV a z · ,z^:.

et e

B E2017/5855 activée par oxydation d'un groupe une

Dans un autre mode de réalisation de 1'invention, l'étape de réaction est une amination réductrice.

Comme il a été présenté ci-dessus en détail, les conjugués de nOMV de

1'invent ion comprennent une fraction s a c ch a r i d i gu e de .surface de la nOMV connectée di rectement un antigène choisi

Dans un mode de réalisation préféré de façon égale, la fraction saccharidique de surface de nOMV activée est onnectée à l’antigène choisi indirectement, par exemple, par 1'intermédiaire d ' une sera généralement un lieur bifonctionnel, utilisant un groupe fonctionnel pour

1'intermédiaire de la fraction saccharidique activée) et un autre groupe fonctionnel pour réagir avec 1'antigène choisi. Le lieur peut être un lieur hétérobifonctionne.l· ou un lieur homobifonctionnel de formule générale (I)

X-L-X'

B E2017/5855 dans lequel les groupes X et X' sont indépendamment identiques fraction, saccharidique de surface de la nOMV activée et i respectivement et

L représente un espaceur préférence f o mu l e g é n é r a 1 e ( 1I. ) (II)

TO indé p e ndamme n fc identique ou différents 1’un de 1'autre et sent choisis groupe carbonyle (C~O), ester

1o r s qu’i1 c ompren d a u moins 3 parmi : un ( - C ( O ) O~ ) ou ami do un groupe linéaire, (ou, un groupe alkyle cyclique ramifié .en Cl à CIO comportant 1 à 10 atomes de carbone

C6, 07, 08, 09, C10) ;

et

L2 représente un groupe alkyle .en Cl à. C10 linéaire ou ramifié comportant à 10 atomes de carbone, de préférence comportant 4 davantage préférée sous atomes de carbone;, de façon même la forme d'une chaîne linéaire.

Ä, un résidu sulfo~N-hydrox.ysuccinimi.de et

N-oxysuccinimide éventuellement substitué.

fois la nOMV et tone t i orme1s, il de deux groupes X impliquent les identiques.

meines

Iis er groupes un lieur où les

B E2017/5855

Lorsque les groupes fonctionnels sur la fraction saccharidique de la nOMV et sur 1’antigène choisi sont tous les deux des aldéhydes, il est préféré d'utiliser un ,l.ieur homefonctioimel. ayant X choisi parmi : un groupe 5 réactif -NHx, -NH-NH2 oü -O-NH?. Dans un mode de réalisation, encore préféré, le lieur est le dihydrazide de l'acide adipique (ADH) de formule générale :

Le lieur peut être ensuite mis à réagir avec la ££ nOMV et/ou l’antigène par amination réductrice comme il a été présenté ci-dessus.

Les lieurs- bifonctionnels préférés particulièrement utiles pour la réaction avec des groupes amines de l’antigène choisi, sont choisis parmi : des halogénures ,θ d’acryloyle, de préférence le chlorure, le glutarate de disucçinimidyle, le subérate de disuccinimidyle et l'éthylène glycol bis[succinate de succinimidyle].

D'autres lieurs encore préférés sont choisis parmi :

le groupe ß-propionamido, la nitrophényl-éthylamine, des 95 halogénures d'halogénoacyle, des liaisons de dérivés glycosidiques, 1'acide 6-aminocaproïque.

Dans un mode de réalisation encore: préféré, le lieur est choisi parmi : le N-hydraxysuccinimide, le Noxysuccinimide, de façon même davantage préférée à 3Q partir du diester de N-hydroxysuccinimide de l’acidè adipique (SIDEA).

B E2017/5855

Lorsque la réaction avec la nOMV et l'antigène implique des groupes fonctionnels différents (tels qu'une amine sur la nuMV et un thiol sur l'antigène), il faudra comprendre qu’il sera utilisé un lieur 5 hétérobifonctionnel capable de réagir sélectivement avec les deux groupes fonctionnels différents. Dans ce cas, les lieurs hétérobifonctionnels préférés sont choisis parmi au. moins l'un de : le 3- ('2-pyridyldithio)propionate de succinimidyle (SPDP), le 6-(3-(210 pyridyldithio]-propionamido)hexanoate de succinimidyle (LC-SPDP), le 6-(S’-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate de suifosuccinimidyle (sulfo-LC-SPDP), le 4succinimidyloxycarbonyl-a-méthyl-a- (2-pyridyldithio) toluène (SMPT), le 6-[a-méthÿl-a-(2-pyridyldithio)15 toluénamido]hexanoate de sülfosuccinimidyXe (sulfo-LCSMPT), le 4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-1carboxylate de succinimidyle (SMCC), le 4-(N-maléimidomê t hy 1 ) c y c 1 o hex an e - 1 - c a f b o x y 1 a t e de su 1 f o s u cc i nim i dy 1 e (sulfo-SMCC), l'ester d.e m-rnaléim.idobenzoyl-N“ hydroxysuccinimide (MBS), l’ester de m-maléimidobenzoyl‘“N“hydroxysulfosuGcinim.ide (sulfo-MBS) , le (4iodoacêtyl)aminobenzoate de N-succinimidyle (SIAB), le (4-iodoacétyl) aminobenzoate de sulfosuccinimidyle (sulfo-SIAB)f le 4-(N-maléimidophényl)butyrate de ²⁵ succinimidyle (SMPB), le 4-(N-maléimidophényl)butyrate de suifosuccinimidyle (sulfo-SMPB), l’ester de Ν-γmalêiniidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS) , l' ester de Ν-γmal éimidobutyr y.1-oxy sul fosuccinimi.de (sulfö-GMBS)_r le 6-((((4-(iodoacétyl)amino)methyl)cvclohexane-130 carbonyl)amino)hexanoate de succinimidyle (STACK), le 6[ 6- ( ( (iodoacéty1) amino) hexanoy1j amino]hexanoate de

B E2017/5855 succinimidyle (SIAXX), le 4-(( (iodoacétyl) amino) ~ méthyl) cyclohexane-· 1 -carboxylate de succinimidyle (SIAC)i et le 6-[(iodoacétyl)amino]hexanoate de saccinimidyle (SIAX) et 1¹iodoacétate de p-nitrophényle 5 (NPIA).

Dans un autre mode de réalisation, le procédé englobe la possibilité de recycler l'antigène choisi qui n'a pas réagi particulièrement lorsqu’il est sous la forme de polypeptide. De cette façon, il a été découvert 10 que l’antigène qui n'a pas réagi à partir du mélange de conjugaison peut être recyclé de façon pratique dans l’étape de conjugaison, améliorant ainsi l'efficacité globale de la production des conjugués de l'invention, et obtenant des conjugués finals toujours dotés d’une 15 remarquable immunogénicité (voir le présent exemple 6).

Comme il a été expliqué ci-dessus en détail, le présent procédé permet la préparation des conjugués de nOMV de l'invention d’une façon simple et pratique, nécessitant également moins d'étapes comparativement aux 20 procédés antérieurs pour la préparation de dérivés conjugués similaires (par exemple, en démarrant à partir dé dOMV). Ainsi, l'invention se rapporte également à un conjugué de nOMV obtenu (ou pouvant être obtenu) par le procédé de 1'invention, selon les modes de réalisation 25 décrits ci-dessus. En particulier, le présent procédé ne nécessite pas nécessairement l'étape coûteuse de dérivâtisation d'un antigène polypeptidique, ainsi que 1'absence de réalisation d'une extraction (par exemple, en utilisant un détergent) ou d’une dénaturation des 30 vésicales de départ. La production et la purification des nOMV de l'invention sont en fait moins coûteuses que

B E2017/5855 pour les protéines de support classiques et plus robustes et homogènes que la production des dûMV. Les nOMV utilisées dans l’invention peuvent être produites à des rendements élevés en utilisant, par exemple, deux étapes 5 simples de filtration à flux tangentiel, et en évitant des procédures d* extraction par un détergent. En outre, l'antigène choisi qui n'a pas réagi peut être recyclé à partir du mélange de conjugaison pour une utilisation dans le procédé, améliorant l'efficacité de la 10 préparation des conjugués, comme il est illustré dans l'exemple 6. En outre, la présente invention offre: une façon aisée, de préparer un vaccin polyvalent, c’est-àdire, un vaccin gui comprend des immunogènes multiples

	(provenant généralement c	le différents	pathogènes) en
15	choisissant correctement	Les nOMV et IT s	ait i gène cho i s i
	comme il est décrit ici p	lus en détail.	En fait, grâce

â sa versatilité, le présent procédé peut être appliqué de façon pratiqué et efficace aux nOMV de différentes sources (par exemple,· Salmonella _r Shigella et 20 méningococciques), en étant appliqué avec succès aux antigènes à la fois protéiniques et saccharidiques.

Finalement, il. faut noter que le présent procédé ne permet pas seulement la préparation de conjugués hautement immunogènes, mais ils changent également de 25 façon, sensible l'intégrité et la distribution des tailles des nOMV. Ceci est particulièrement apprécié de l'homme du métier, parce que l'absence d'agrégats de nOMV permet un meilleur rendement et une homogénéité globale et une robustesse du présent procédé.

La présente invention est également utile pour la préparation, de conjugués de nOMV fonctionnalisés de

B E2017/5855 diverses façons.·, permettant une présentation multivalente de différents antigènes sur la surface de: la vésicule choisie.

Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, l'invention se rapporte à un conjugué comprenant une vésicule de membrane externe native telle que présentée ci-dessus, comportant au moins une fraction saccharidique de surface connectée à au moins un premier antigène, où ledit premier antigène est connecté à un 10 second antigène différent selon la formule générale (I) nOMV.....—Agi -Ag2 {I )

Dans cette direction, les deux antigènes choisis 15 (indiqués ici par Agi et A<g2) peuvent être couplés ensemble pour donner un dérivé antigène-antigène (AglAg.2), qui peut être ensuite connecté à la fraction, saccharidique de surface de la nOMV choisie par 1 ' intermédiaire d'une procédure d'amination réductrice 20 coxœfte il a été décrit ci-dessus.

En variante, le saccharide de surface de la nOMV peut être d'abord connecté à 1'Agi choisi par l'intermédiaire d'une procédure d'amination réductrice, telle que décrite ci-dessus, pour donner un conjugué 25 nOMV-Agi, et ensuite un second Ag2 est connecté au dit conjugué nOMV-Agi, pour donner le conjugué de la formule générale (1) ci-dessus.

Dans tous les cas, les vésicules de membrane externe natives préférées sont les vésicules GMMA, de façon 30 davantage préférée issues de Neisseria MehB. Les Agi et Ag2 peuvent être choisis parmi les antigènes préférés

B E2017/5855 tels que décrits ci-dessus, étant des fractions protéiniques ou polysaccharidiques. De préférence, les antigènes utilisés pour la multi-fonctionnalisation telle qu'envisagée ici sont tous les deux des protéines 5 ou tous les deux des polysaccharides, voire même une protéine ou un saccharide.

Dans tous les cas, la connexion entre les antigènes et la fraction saccharidique de la nOMV peut être réalisée directement, ou en utilisant des agents 10 d'activation, ou des lieurs appropriés selon le mode de réalisation préféré décrit ici.

Ainsi, selon un mode de réalisation davantage préféré, 1’invention se rapporte à un conjugué de la formule générale (I) ci-dessus, dans lequel Agi comprend 15 l'antigène protéinique (NANP)s, Ag2 comprend l'antigène protéinique Pfs-25, de façon davantage préférée en ayant la particule de nOMV obtenue à partir de S. typhimurium.

De façon plus détaillée, ledit conjugué est préparé de préférence par un procédé comprenant les étapes 20 suivantes :

a) 1’activation de l'antigène Pfs25 en utilisant de .l'EMCS, pour donner 1 ' intermédiaire de Pfs25 activé indiqué ci-dessous ;

r^- i

f:

..M,. .· <>

d« $£$25' av** d* 1<EHCS

b) la connexion dudit intermédiaire de Pi.s25 activé avec (NANP>3 pour donner le dérivé Pfs25-EMCS-(NANP)3

B E2017/5855

c) la réaction de la partie Pfs25 d^Tuh tel dérivé avec 1'intermédiaire de la vésicule de membrane externe native, par .l’intermédiaire d'une reaction d'amination réductrice selon les modes de réalisation décrits cidessus pour donner le conjugué GMMA~Pfs25-(NANP)3.

L'analyse Western blot a confirmé la formation du conjugué où le Pfs25 est connecté à la fraction saccharidique de surface de GMMA, et aucune agrégation n'es t détectée.

Selon un autre mode de réalisation, la. présente invention se rapporte à un conjugué immunogène comprenant une vésicule de membrane externe native, comportant au moins une fraction saccharidique de surface connectée à un premier antigène (Agi) par 1 ’ intermédia iré d'une procédure d'amination réductrice telle que décrite ci-dessus, et au moins une fraction saccharidique de surface connectée à un. second antigène différent (Ag2) par l'intermédiaire d’une procédure d'amination réductrice telle que décrite ci-dessus pour donner un conjugué indiqué par la formule générale (II) :

Agi —-nOMV—Ag2 (II:)

B E2017/5855

Selon un mode de réalisation préféré, dans la formule générais (UI ci-dessus, la .nOMV est. un GMMA provenant de MenB, Agi est un polysaccharide capsulaire méningococcique du sérogroupe C, et Ag2 est un 5 polysaccharide capsulaire méningococcique du sérogroupe C.

Les conjugués de formule (II) peuvent fournir de façon avantageuse une raulti-fonctionnalisation selective des nOMV, en utilisant un profil de fonctionnalisation

1Q

Spécifique an utilisant la procédure réductrice comprendra, t e c hno1og i e s e1on 1’i nvent i on.

proposée, que être utilisée f one tionnalisat même avec plus la possibilité de

L’homme du métier la versatilité de la la présente invention peut de

..on de de façon appropriée pour la multides nOMV, antigènes choisir des d i f f é ren t e s quant i t é s de préférence des GMMA,.

différents. En dehors d’antigènes, modulant ainsi rapport antigène/nOMV selon, par exemple, choisi ou la nOMV.

Selon un autre aspect, l'invention se conjugué nOMV-antigène- décrit ci-dessus utilisation en tant qu’agent préférée pour de la.

de le

1'antigène rapporte, au pour une tant que médicament, particulièrement en immunogène, de façon un ou plusieurs des pat ho g è n e s te1s qu ' indiqués i.c

1’i nven t i on se rapporte à 1^rutilisation des présents conjugués de nOMV pour la fabrication d’une composition

Selon un autre immunogène.

aspect, l'invention se rapporte ainsi à une composition immunogène, de préférence un

B E2017/5855 vaccin, comprenant un conjugué de 1’invention et au moins 'un support, un excipient ou un adjuvant supplémentaire pharmaueutiquement acceptable. Généralement, le: support ou l’excipient pharmaceutiquement acceptable peut être 5 toute substance qui n'induit pas elle-même la production d’anticorps nocifs envers le patient recevant la composition, et qui peut être administrée sans toxicité excessive. Les supports et les excipients, pharmaceutiquement acceptables sont, ceux utilisés dans 10 l'art, et ils peuvent comprendre des liquides tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol et l’éthanol. Des substances auxiliaires,, telles que dés agents de mouillage ou émulsifiants, des substances tampons du pH> et analogues, peuvent être également présentes dans de 15 tels véhicules, selon l'art antérieur.

L’invention fournit également un procédé pour produire une réponse immunitaire chez un vertébré, de préférence un mammifère, comprenant 1’administration d’un conjugué de l’invention au mammifère ou à un autre 2.0 vertébré. L'invention fournit également des conjugués de l'invention pour une utilisation dans de tels procédés. La réponse immunitaire est de préférence protectrice et de préférence: implique des anticorps. Le procédé peut produire une réponse de rappel. Le .mammifère est de 25 préférence un. être humain. Le sujet chez lequel la maladie est prévenue peut ne pas être le même que le sujet qui reçoit le. conjugué de 1' invention. Par exemple, un conjugué peut être administré à une femme (avant ou durant une grossesse) afin de protéger sa descendance 30 (la dite « immunisation maternelle »). Les conjugués de l'invention peuvent être également utilisés pour

B E2017/5855 immuniser d'autres mammifères, par exemple, des bovins, des moutons et des porcs (spécialement contre Sa.Luionel.La ap.), et d'autres vertébrés non mammifères y compris des poissons et des volailles.

L’invention fournit u t i1isat i on compositions

L^!invention utilisation .immunitaire

L’invention des conjugués (par exemple, en ou en tant que conjugué pour une tant que vaccins).

en thérapie ; immunogènes fournit également un dans un procédé de production d'une réponse chez un vertébré, de préférence un mammifère.

fournit également l'utilisation d’un pour une conjugué dans la fabrication d'un médicament pour produire une réponse immunitaire chez un vertébré, de préférence un mammifère. Les utilisations et les 15 procédés sont particulièrement utiles pour prévenir/ traiter diverses maladies, selon les antigènes et les nOMV au sein des conjugués tels que présentés ci-dessus.

Les conjugués préférés de l'invention peuvent conférer un titre en anticorps chez un patient qui est supérieur 20 .au. critère pour une séroprotection pour chaque composant antigènique pour un pourcentage acceptable de sujets humains. Les antigènes avec un titre en anticorps associé au-dessus duquel un hôte est considéré comme avoir subi une séroconversion contre l'antigène sont bien connus, 25 et de tels titres sont publiés par des organisations telles que l'OMS. De préférence plus de 8.0 % d'un échantillon statistiquement significatif de sujets présente une séroconversion, de façon davantage préférée plus de 90 %, de façon encore davantage préférée plus de 30 93 % et de façon préférée entre toutes de 96 à 100 %.

B E2017/5855

Les composition's immunogènes de 1' g é n é r a1éfflé nt adminis trées di r e c terne n t

L'administration directe peut être injection parentérale (par exemple, voie sous cutanée, i n t r a p é r i t ο n é a 1 e, i ht rave i n e us e, .intramusculaire, ou dans 1 ' espace r e c t a le, o r a .1 e, topique, t r a ns de rmi que, pulmonaire exemple, dans la cuisse ou le peut être effectuée à l'aide d¹ une. aiguille hypodermique) ,

i. n t r a na s al e, ou haut autre oculaire, rriuoosaie.

préférée, par une .aiguillé (par exemple, aiguille peut être utilisée n t ramus e ula ire classique ma i s en es t une injection sans variante» Une dose:

d’environ 0,5 ml

L'invention peut être également utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale. Le traitement peuvent être utilisées dans un. calendrier d’immunisation prima i te et/ou dans un calendrier iinniu n i s a t i on de rappel. Un calendrier de dose primaire d'un calendrier dé dose t e mp s a ppr op r i é entre les doses sensibilisâtion (par exemple, entre

Les infections touchent diverses zones du corps et insi les compositions de l'invention peuvent préparées sous diverses formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous la forme d'injectables, soit des solutions liquides soit, des

B E2017/5855 suspensions. Des formes solides appropriées pour une solution, ou une suspension, dans des véhicules liquides avant une injection peuvent être également préparées. La composition peut être préparée pour une administration 5 topique, par exemple, sous la forme d'une pommade, d'une .crème ou d'une poudre. La composition peut être préparée peur une administration orale, par exemple, sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, ou sous la forme d’un sirop {éventuellement aromatisé). La composition peut 10 être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peutêtre préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. La composition peut être préparée pour une 15 administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de gouttes. Les compositions appropriées pour une injection parentérale sont préférées entre toutes. La composition est de préférence stérile. Elle est de préférence apyrogène. Elle est de 20 préférence tamponnée, par exemple, entre pH 6 et -pH 8, généralement autour de pH 7. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques par rapport aux êtres humains. Les compositions immunogènes. comprennent une quantité immünologiquement efficace d'un conjugué de 25 1’invention, ainsi que l'un quelconque d'autres composants spécifiés, selon les besoins. Le traitement posologique peut être un calendrier d’une seule dose ou un calendrier de doses multiples (par exemple, y compris des doses de rappel) . La composition peut être 30 administrée conjointement avec d’autres agents immunorégulatsurs.

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Les adjuvants qui peuvent être éventuellement utilisés dans des compositions de 1'invention comprennent, mais n'y sont pas limités, des sels de métaux insolubles, des émulsions huile dans: l'eau (par 5 exemple, MF'59 ou Α3Θ3, les deux contenant du sgualène) , des saponines, des dérivés non toxiques de LPS (tels que le monophosphoryl-lipide .A ou le MPL 3~O-désacylé) , des oligonucleotides immunostimulants, des toxines ADPribosylantes bactériennes détoxifiées, des microparticules, des liposomes, des imidazoquinolones, ou leurs mélanges. D'autres substances qui agissent comme des agents immunostimulants sont divulguées/ par exemple, clans Watson, Pediatr. Infect. Dis. J. (2000) 19; 331-332. L'utilisation d'un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium et/ou de phosphate d^!aluminium est particulièrement préférée. Ces sels comprennent des oxyhydroxydes et des hydroxyphosphates. Les sels peuvent, prendre toute forme appropriée (par exemple, gel, cristalline, amorphe, etc.).

Les conjugués de l'invention qui comprennent des nOMV provenant d'un pathogène et un antigène choisi provenant d’un second pathogène peuvent être utiles en tant que vaccins multivalents. Les paires de pathogènes gui peuvent être combinés (l'un comme antigène, et 25 l'autre comme vésicule nOMV). comprennent, mais n’y sont pas limitées : N. meningitidis et Salmonella non typhoïde (par exemple, Salmonella typhimurium ou Salmonella enteritidis) ; P. falciparum et Salmonella non typhoïde ; Salmonella typhi et Salmonella non 30 typhoïde ; ETEC et Shigella sp. ; Streptococcus du

B E2017/5855 groupe A (GAS) et N. meningitidis ; et GAS et Salmonella non typhoïde.

Les appariement s préférés de l'invention. sont indiqués dans le tableau A suivant.

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Tableau A

Combinaisons nOMV--antigène préférées

nOMV	Antigène f
Salimone11a t yphimur ium	fHbp de Neisseria meningitidis
Salmone1la typhimurium	CSP de Plasmodium falciparum
Sa1monalla typhimurium	Rfs25 de Plasmodium falciparum
Salmonel 1 a t yphimurium	RO6C de Plasmodium falciparum
Sa 1monalla typhimurium	ROI OC de Plasmodium: falciparuii!
Salmonella typhimurium	CTF1232 d'Escherichia coli
Sa Im on e 11 a t y p h i m u r i. um	Saccharide Vi de S. t yph im uri um
Neisseria meningitidis	fiibp de Neisseria meningi tidis
Ne 1 s s e ri a m e n in g i t i d i s	01igosaecharide palyrhamnose
Shigella, de préférence sonnei	CTF1232 d1 Escherichia coli
Neisseria meningitidis B	Saccharide capsulaire de Men A
Neisseria meningitidis. B	Saccharide capsulaire de Men C

Ainsi, les présents conjugués nOF1V~ antigène sont particulièrement utiles en tant qu’agents immunogènes contre les pathogènes énumérés dans le tableau A.

Les conjugués de. l'invention qui. comprennent des nOMV provenant d’un pathogène et un antigène choisi

B E2017/5855 provenant d’un second pathogène peuvent être utiles en tant que composés immunogènes pour la préparation de vaccins multivalents. Ainsi, 1'invention fournit une composition comprenant un conjugué de: 1'invention et un ou plusieurs des autres antigènes suivants :

- un antigène saccharidique provenant de

N. meningitidis du sérogroupe A, C, W135 et/ou Y,

- un antigène saccharidique provenant de

Streptococcus pneumonia,

- un antigène provenant du virus do 1'hepatite Ά, tel qu'un virus inactivé,

- un antigène provenant du virus de l'hépatite B, tel que les antigènes de surface et/ou core,

- un antigène diphtérique, tel que 1'anatoxine diphtérique, par exemple, le mutant ÇRM197,

- un antigène tétanique, tel que l'anatoxine tétanique, ~ un antigène provenant de Bordetella pertussis, tel que 1'holetoxine pertussique (PT) et

1'hémagglutinine filamenteuse (FHÄ) provenant de

B. pertussis, éventuellement aussi en combinaison avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3,

- un antigène saccharidique provenant d'Haemophilus influenzae Ά ou B,

25. ~ un ou plusieurs antigènes polio tels que l’IPV,

- des antigènes de la rougeole, des oreillons et/ou de la rubéole,

- un ou plusieurs antigènes de la grippe, tels que les protéines de surface hémagglutinine et/ou

3Q ne uramin ida s e,

- un antigène provenant de Moraxella catarrhalis,

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- un antigène protéinique provenant de

Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B},

- un antigène saccharidique provenant de

Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B),

- un antigène provenant de Streptococcus pyogenes (streptocoque du groupe A)_r

- un antigène provenant de Staphylococcus: aureus.

I, ' invention va être à présent décrite par la partie expérimentale suivante, sans poser aucune limitation à son étendue.

Partie expérimentale

Exemple 1 g Product ion de s nOMV

Les nOMV préférées utilisées dans la présente partie- expérimentale sont des GMMA préparés à partir de souches AtolR de S. typhimurium ou S, sonner, par exemple, comme il est divulgué dans Clin Vaccine Immunol. Avril 1016 ; 23(4): 3043-14 et PLoS One. 2015 ; 10(8):

eOl.3447 8 respectivement.

Les caractéristiques desdites nOMV étaient telles qu¹ indiquées dans_: le tableau 2 suivant.

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Tableau 2

Caractéristiques dés nOMV purifiées préparées à partir de souches Δ-tolR de S. typhimurium ou S. sonnei

	||||33|Ι||:ε|1Β333||33^	(ûtplH Ahti-B)
diamètre (h®)	131,5	14i
Charge de surface (mV)	-14,1	-9, 87
Lipide A/ttig de vésicules	172,8	155,4
Rapport pondérai OAg / proté i ne s t-o ta 1 e s	h, Bd ;	(1,.033 :

Exemple 2_: - Oxydation des nOMV

Diverses conditions d'oxydation ont été testées.

Par exemple, pour l'oxydation des nOMV AtolR 1418, des concentrations de NalCq dans la plage de 5 à 20 mM ont 15 été testées. L'effet de l'oxydation sur la longueur de la chaîne de 1'-OAg a été estimé. La longueur de la chaîne a été réduite avec la progression de 1'oxydation.

Des concentrations supérieures de NalO^ ont eu tendance à réduire la taille de l’OAg. Il a été vérifié que 20 l'augmentation de la molarité du NalO4 a non seulement conduit à des taux d'oxydation supérieurs, de 5 à 45 % (avec le rhamnose, sucre principal impliqué dans le procédé), mais a également réduit la longueur de la chaîne de l'-OAg. En même temps, il n'y a eu aucun 25 changement dans la distribution des tailles des vésicules, et l'intégrité des vésicules a été maintenue.

Ceci a été vérifié par la diffusion dynamique de_: la lumière (DLS), l'analyse du suivi individuel de nanopartiouies (ΝΤΆ) et la chromatographie liquide 30 d'exclusion haute performance/diffusion de la lumière selon des angles multiples (HPLC-SEC/MALS ; voir le

B E2017/5855 tableau 2a) . II a été également: vérifié que les groupes N H? sur les nOMV n Ont pas réagi avec les groupes CHO produits dans des conditions d*amination réductrice produisant des particules réticulées plus grosses (tableau 2b).

Tableau 2a

Analyse des nOMV oxydées (obtenues par réaction avec 10 et 20 mM de NalOi) par DLS et HPLC-SEC/MALS

Echantillon	(z-moyon) (Pdl) J ( nm par : DLS ): : l·	(nm par. : MALS)
nOMV 14.18 Λ toi R	131,5 (0,219) 1	30, 5
nOMVox 141.8 AtolR	129, 5 (0,27.3)	27,4
3.0 mM
nOMVox 1418 AtolR 20 mM	135,8 (0,224) |	30,5

Tableau 2b

Aucune réaction des nOMV dans des conditions d'amination réductrice, vérifié, par DLS et HPLCSEC/MALS

p'· Echantillon	Diamètre (z“moyeu) (Pdl) nm par uiiS	(nm pa r MALS )· .
j nOMVox 1418 AtolR. 1 20 mM de Na10«	135,8 (0,224)	30,5
1 nOMVox 1418 AtolR j 20 mM de NaIGu après î réaction avec du 1 NaBHaCN	131,7 (0,291)	31,2

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Dans des conditions d’amination réductrice, sans nOMV, l’antigène etranger à conjuguer ne donne aucune agrégation, vérifié pour plusieurs antigènes (par 5 exemple, fHbp, Pfs25 et CTF1232) .

En. outre, il a été vérifié, que le NaBHsCN ne réduit pas les liaisons S—S, ce qui pourrait autrement affecter la conformation des protéines telles que la Pfs25, La Pfs25 a été traitée avec du NaBHaCN dans des conditions 10 mimant une conjugaison, et la même réaction a été effectuée avec du DTT en tant qu'agent réducteur pourune comparaison. Après mélange pendant une nuit à température ambiante, l'analyse par SDS-PAGE et HPLC~SEC de la Pfs2 5 traitée avec du NaBHsŒ, au contraire de la 15 Pfs25 traitée avec du DTT, n’a montré aucun changement de la protéine comparativement à la Pfs25 fraîche. Les mêmes résultats ont été confirmés par une analyse MAL.DIMS, lorsque la protéine a été traitée avec de l’iodoa-cétamide (IAA) en présence de NABfhCN ou de DTT.

20- D'autres expériences sur des nOMV de S. typhimurium triple mutant (nOMV de S, typhimurium 2192 ÛtolR ûPagP /ImsbB) ont montré que de faibles concentrations de NalO^ (3 à 5 mM) étaient également suffisantes pour obtenir de bons taux d'oxydation. Des exemples de résultats sont 25 présentés dans le. tableau 2c, en utilisant une concentration de nOMV dans la plage de 0, 2 à 4 mg/ml, un pH dans la plage de 5 à 8, et une concentration de NalO« dans la plage de 0, 5 à 5 mM. Les vésicules résultantes ont été estimées pour le % de récupération des nOMV, le % d'oxydation du rhamnose, la taille des nOMV, et la. taille dé 1'OAg.

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Tableau 2c

Oxydation des riOMV de S. typhimariiim triple mutant

iilll	Facteur ||||:i|||:|	7iFâc:teuÎi<2i:	Facteur l||s:3:sssi|i	RépC-iJS# l||llillll|i|	: Réponse :	Réponse	Répons#
	Ά: inOMV]	B rJWXW	etpH	* rie récupération des nOMV {Micro BOA)	%: â* oxydation de Rha : fjîpÂFC- Fàii)	Taille des. nOMV (r Moyen par ÖLS)	Taille: ds i OAg :(Me ·4Ηΐ):
	ng/nfl	tril··		îl	ï	ΠίϊΙ	koa
	2100	2,7 5	6,5	72	ίο	50,28-	20907
oTss/tsis	: O®	2,15	B	75·	6	50,77	2421,5
	«me	0,5	5	7§	0	51,52	31148
SB®»:	aies	2/75	5	80	13	48,09	17935
	2W	5	5	8 7:	58.	42,39	682 b
yyTOll	2100	2, 75	6/5	77	'7	50:,:4 ::	20276
yyiSei	• W0:0:	Λ >5	6, 5	; .8:1·	3	50, 89	25221
oee	: 2100:	§	6,5.	82	2.3	47,56	10170
:10 :	:2100:	2,75	vf5	80	10	4 9, 8	184 93
s/ssSlssss	2®«	0,5	' 15 F	85	d.	50, 3 9	3:0592
	2.00	0,5	5	83	: '7'	50,19	25131
IgMg	tioo	2 75	h. 5	82	9	SO, 88	'18:493:
itie	2100	2,75	6, 5	78	1.Ö:	4 9,07	20589
	20Ö	0,5	8	77	A	51,42	: 30347 ·
ygie	200	Ç.	• 8::	72	20>	47, es	1.0980
011701	2100	2, 75	b, 5	83	B	49, 09	20536

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j J	fit ......	4ÖÖÖ !	5	a	80	11	j 4 8 f 4 4	3 8.212
		4000	®>:5	'8		1	j 50,.8-6· t	30208
§ M i.................. ..................	i 1	4000 j		5	86	15:		16611

5:

Des taux similaires de récupération de nOMV ont été observés pour toutes les conditions réactionnelles, testés par le micro-dosage des protéines à l’acide bicinchoninique (micro BCA). Il a été en outre vérifié θ qu'aucune des conditions réactionnelles testées ne donnait naissance à la réticulation ou à 1 * agrégation des nOMV.

Le pourcentage d'oxydation du rhamnose a été affecté à la fois par la. concentration des nOMV et la _r concentration du NaTCu, avec une concentration 5 inférieure de n-üMV et une concentration supérieure de NalO« ayant tendance à donner des taux supérieurs

d'oxydation du rhamnose. Par corn	séquent, en général., la
concentration des nOMV et/ou la	concentrat ion du NalCM
peuvent être manipulés pour obt	:enir le taux souhaité
d'ox y dat i οn du rhamnose (ou d'un	autre sucre).
Pour comparer les vésicules	avec une taille d'-OAg
et des taux d'oxydation du rhi	ïmnose- différents, les
vésicules des séries 5, 14 et 1<	6 du tableau 5 ont été

traitées avec du NaBH« pour éliminer les groupes aldéhyde (CHO) et stabiliser les vésicules nOMV, et le taux d'oxydation du rhamnose et la taille de l'-OAg ont été estimés à nouveau après traitement. Les résultats sont présentés ci-dessous dans le tableau 2d.

Tableau 2d

Traitement avec du NaBEU des séries 5, .1.4 et 16

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Conditions pmi 1’ôxydatio	S: d1 oxydâtio n de Rha attendu	Taille da 1 ' OAg attendu e	Pré-ré duction	Pö st.“ ré du et i ©n
%: d1oxydatio n de Rha attendu	Taille de i>oag attendu e	% d’oxydatio n Un Xhx attendu	Taille de 11 oag attendu e
Série 5	58	6826 Da	58	7431 De	53	6031 Da
Serin 16	rs	30^80 p a	14,4	18162 0	16	16528: D a
Sérié 14	10	20589 » a	13	24224 D a	12	21163 P A

Les résultats. montrent que l'étape de réduction n'a pas affecté la longueur de 1 ’-OAg ou le degré d'oxydation des nOMV. Des résultats similaires ont été obtenus dans une expérience séparée.

Exemple 3 - Etape de conjugaison nOMV-Ag______( fVi-nOMV.....de

S. typhimurium ; conjugaison_____indirecte par

1^rintermédiaire d'un lieur)

Le fVi a été modifié par réaction avec un lieur d’.ADH, soit de façon aléatoire (r) soit de façon sélective (s) . Le fVi modifié a été ensuite conjugué: à des nOMV de S. typhimurium oxydées en utilisant une amination réductrice. Lorsque le fVi a été activé de façon aléatoire avec .1 ’A DH, un rapport pondéral fVi :sur nOMV de .1/1 a été utilisé dans la conjugaison, alors qu'un rapport pondéral de 3/1 a été utilisé lorsque le fVi a été dérivatisé à son extrémité avec l’ADH. Les conjugués ont été caractérisés en utilisant le test micro BCA/Lowry pour déterminer la teneur en protéines totales (récupération des nOMV) ; la chromatographie avec échange d'anions haute .performance avec détection par ampéroraétrie pulsée (HPAEC-PAD) a été utilisée pour déterminer la teneur en Vi total (aucune interférence

B E2017/5855 des nOMV) ; la chromatographie liquide haute performance-chromatographie d'exclusion' (HPLC-SEC en utilisant une colonne de gel TSK 3000 PWx.1) a été utilisée pour estimer le % de Vi libre en utilisant 5 l'indice de réfraction différentiel (dRI) et la diffusion dynamique de la lumière-chromatographie, liquide haute performance-chromatographie d'exclusiondiffusion statique de la lumière selon des angles multiples (DLS/HPLÇ-SEC-MALS) a été utilisée pour déterminer la taille. L'effet des conditions de conjugaison de ce procédé de conjugaison sur le nombre final des chaînes de fVi par nOMV a été estimé en considérant les données recueillies par HPAEC-PAD ainsi que le nombre des nOMV par l'analyse du suivi individuel 15 de nanoparticules (NTAj.

Les résultats sont donnés dans le tableau 3.

Tableau 3

Influence de la concentration du NaIOx et du pH sur les conj a gu 6s fVi-nOMV

Série		r/s	î dé .i«;		: i d·; : dé lé f	///////:s//âë:/44Sfi	/fRäppöit:/	ffstSâsJïéS///
	moyenne		de fVi	iiiiiii^chx/ji/////</	canji>9't3i.5 on	récupération	Ill/ëlp/s//	//idésrvi/s/s
	gäU/:f®i7:/:		slëtiyéëS·/	d·'1 càydà-ii oa		des FxCW	571/	pa , t e
	////»Be:////		(r) / %	:///Ρίΐίί/ρ0θ:///			////S®sss	6|6vï<ie;6é6iî/
Tl/////////// /////</12·//////			^►3 / / <					nOMV
			chaînes
			6///<ifô-'l:ilVÎ:/ lli
			activées
			//////Îy///////'
îi/z/i/vé////	48,5' j >·	24,4	20	1,5.	30, 7	/ 0γ·.45:'	97
	48, fi	i:	24,4	ä h	6	43, 8	Û, 35	/7.6; ,
//:/||///	48,5	r	30, Ί	20	7,2	58, S	0,2	as ;
////s/:////	48,5	/g	> 95	10	7,2	69	épm	17
:s//SÎis//	48,5	<5	> 95	3®:	4,5	48, 9	0, 44	95
ΐ//ΐΐ:δυ////ϊι	48,5	S	>: 95:	10	4,5	80	0, 43	93
/·ϊ·/·1·;·/:/·/·	23 ! r	,11	20	4 / 5	80	0, 08	37

B E2017/5855

gps	23	X	1.1	: 10:	4, 5	89,4	: 0,07	32
SssV;::::::::::::	23	r	II	10'	:è	37	< :ß,04	18
sssla,::ss	ß	r	23,8	1Ö	4,3	10Æ :	0, 12	158
gpgg	3, 8	r	15, 5	20	4, 5	100	.0,05	138
	3,8	r	15,-7	: 1Ö	Li............	67, 6	0,0'7	:
01300	3, 8	r	15,5	1C	.6	82	0,02	05:
i .	3,8	r	16,2	10	1,0	: ' 74	: :-0,01	30-

r : introduction aléatoire d'u îieur (Aßii) le long de ï * antigène fVI.

s : introduction sélective du lieur (ÄßH) à l'extrémité terminale de l'antigène fvi.

RO : unités répétitives.

W Moyenne uesLipe pi' 4! IΓ VC en rus Ctâ,OP*î U 4 't'ai».

La réalisation de l'amination réductrice à pH 4,5 avec du fVi à 48,5 kDa, a produit des rapports supérieurs de fVi/nOMV et plus de chaînes de fVi par nOMV à la fois à 10 mM et 2.0 mM de iCi, par rapport à un pH supérieur·. Avec le fVI modifié de façon aléatoire, la précipitation est survenue à p-H 4,5 ; la précipitation a. été évitée en travaillant avec le fVi modifié sélectivement. En général, la chimie sélective a été identifiée comme moyen pour améliorer la récupération des nOMV et pour éviter la précipitation. Il n’a pas été observé de précipitation pour le fVi avec une MM moyenne < 2'3 kDa à. pH bas avec des charries de fVi modifié de façon aléatoire.

L'oxydation des nOMV avec 10 mM de NaIO,₃ à la place de 20 mM a abouti à une récupération améliorée des conjugués. L'augmentât ion. de la concentration du NaLOa n'a pas eu d'impact sur les caractéristiques des conj ugués finel.s .

Lors de 1 ' utilisât ion. de fVi à 23 kDa, des rapports inférieurs de fVi sur nOMV ont été obtenus, qui ont pu être associés au pourcentage de dérivât.isation inférieur de fVi-ADH utilisé pour la conjugaison (11 % d'unités répétitives de fVij ...

B E2017/5855

Le pH et lé degré d^!activation de fVi-ÀDH ont été identifiés comme des variables pour la modulation du nombre des chaînes de fVi liées par nOMV,

Exemple 3a - Conjugués Vi-nOMV de S. typhimuxiiim (conjugaison indirecte par 1'intermédiaire d'un 1leur) Les conjugués 1 et 5 selon le tableau 3 ci-dessus, ayant des rapports Vi/nOMV p/p de 0,45 et 0,44 respectivement ont été testés chez des souris. Pour 10 comparaison, le CRM197 a été également utilisé en tant que support, et un mélange simple de fVi + nOMV a été également testé.

Des souris ont été immunisées par voie sous-cutanée aux jours 0 et 28 avec les conjugués (dose de 1 pg de 15 Vi) et un adjuvant Alhydrogel. Les titres en IgG.· antiVi ont été mesurés aux jours 0, 14, 28 et 42, et les résultats sont présentés sur la figure 2A. La nOMV n'a pas été inférieure au CRM 19'7,. mais elle a été significativement meilleure que le mélange non conjugué.

Les titres en IgG contre 1’-OAg ont été également estimés. La figure 2B représente les titres anti-OAg pour la vésicule seule ou conjuguée au Vi. La conjugaison a réduit la réponse à 1'-OAg d'une petite quantité, mais les réponses sont demeurées significatives.

Exemple 4. - Etape de conjugaison de nOMV-Ag (CTF1232 d'ETEC-nOMV.....de S. typhïmuriurn AtolR 1418 ou S, sonnei

1790 ; conjugaison directe sans lieux)

CTF1232 est un antigène d'E. coll (SEQ ID NO : 14

3.0 avec un marqueur C-t-errainal d’hexa-histidine qui a été conjugué aux deux types de vésicules nOMV. Le polypeptide

B E2017/5855 comprend cinq résidus de .lysine qui peuvent être utilisés pour la liaison aux saccharides oxydés dans les vésicules.

Pour la conjugaison à CTF1232, les vésicules ont été oxydées dans 100 mM d¹ acétate de sodium (pH. 5) avec

du periodate de sodium (20 mM pour S.

typh1muri um_f 40 mM pour S. sonnei) pendant 2 heures dans l’obscurité à température ambiante. L'oxydation dans S. typhimurium a. été pcef érentieI l e dans Lu. résidus de rhamnose (Rha), avec environ 30 % des unités Rha oxydées (calculé par rapport au mannose). L’oxydation dans S. sonnei a eu un impact sur la région du noyau des molécules de_: LPS.

500 pg des vésicules oxydées (pro té ines t o tales mesurées) provenant de nOMV soit de S. typhimurium AtolR

1418 soit dé S. sonnei 1790 ont été mis à réagir avec

500 pg de CTF12 32 avec 1 à 2 mg de NaBlbCN à température ambiante sur un week-end.. En. s-é basant sur la quantification de l'antigène qui ri'a pas réagi après la conjugaison, Ici présence de l’antigène sur la surface des nOMV a été calculée comme étant < 36 % âaiis

5'. typhimurium et < 31 % dans S. sonnei.

Les résultats ont montré que la chimie de .1 ' amination réductrice est appropriée pour la conjugaison d’antigènes polypeptidiques aux vésicules. L’antigène CTF1232 a été conjugué au LPS oxydé des deux vésicules.

Des souris ont été immunisées avec la protéine seule,

un mélange de la protéi	ne et des nOMV de	Shigella f ou
les conjugués. L'adjuvar	it Alhydrogel a été	utilisé dans
tous les groupes. Les iim	muni.satiens ont été	adrainistrees
par voie intranasale e	iux jours 0, 21 e-	t 38 et les

réponses immunitaires ont été estimées aux jours 0, 14,

B E2017/5855 et 52. Les titres en IgG anti-CTFl232 sent présentés sur la figure 3.

Au jour 14,- le conjugué nOMV 1418-CTF12 32 a été capable d'induire une réponse significativement 5 supérieure à la protéine seule (p - 0,0.005) ou mélangée physiquement avec des nOMV (p - 0,042) (test de KruskalWallis avec analyse post-hoc de Dunn). En plus de 1'amélioration des titres anti-CTF1232, le conjugué a présenté l'avantage supplémentaire d'être un vaccin XQ bivalent. Il n’a été observé aucune différence majeure entre les conjugués nOMV 17.90-CTF1232 et nOMV 1418CTF12 32, signifiant, que les nOMV à la fois de Salmonella et de Shigella peuvent fonctionner comme de bons supports pour l’antigène d'ETEC.

Exerap1e 5 - Etape de conjugaison de nOMV-Ag (conjugaison de P f s 2 5 - nOMV de S. typhimurium en présence de NagSOg)

L’antigène paludéen Pfs25 a été conjugué aux vésicules nOMV de S, typhimurium par deux chimies 20 différentes : aux protéines par l’intermédiaire de groupes SH-maléimido ou chirale click ƒ ou à l'OAg oxydé par le WIO4. Pour la liaison à 1 '-OAg oxydé, un rapport de 1/1 de nOMV/Pfs25 a été utilisé, à une concentration de Pfs25 de 2,6 mg/ml dans du PBS avec une incubation 25 pendant une nuit à température ambiante. La formation de conjugués a été également obtenue lorsque l'excès de NalO/j a ét.é neutralisé avec du NaoSQa (une concentration de 10 mM a été utilisée dans cette expérience, pendant 10 minutes), ceci suivi de l’addition directe de Pfs25 3 0 dans le même récipient (concentration finale de 0,2 mg/ml). La figure 4A représente les titres en IgG

B E2017/5855 ànti-Pfs.25 éii réponse à : les trois conjugués ; la Pfs.25 seule ; ou la Pfs25 mélangée physiquement avec les vésicules. Toutes les constructions ont été formulées avec de 1-’Al hydrogel. Les s ou.ri s ont été immunisées par 5 voie sous-cutanée aux jours 0 et 28 à 0,1 pg de

Pfs25/dose. Les titres en IgG anti—Pfs25 ont été mesurés aux jours 0, 14, 28 et 42,

La Pfs25 seule a induit une réponse en anticorps

IgG anti-Pfs25 significativement inférieure aux 10 conjugués nOMV-SH-Pfs25 (p ~ 0,001) et nOMV-ox-Pfs25 (p = 0,00-95) . La Pfs25 mélangée physiquement avec des nOMV a induit de façon similaire une réponse inférieure par rapport aux nOMV-SR~Pfs25 et nOMV~ox~Pfs25 (p ~ 0, 0038 et p ™ 0, 0282 respectivement) (test de Kruskal15 Wallis avec analyse post~hoc de

Dunn) . De façon ici Pfs25 liée par

1’intermédiaire du composant de sucre sur les nOMV (conjugué nOMV~ox.~P.fs25) a induit une réponse en anticorps similaire à la Pfs25 .liée aux protéines sur les nOMV (nOMV-SH-Pfs25 et nOMV20 click-Pfs25) et supérieure à la Pfs25 seule ou mélangée physiquement aux nOMV.

Les sérums issus des conjugués Pfs.2.5-nOMV ont montré une activité de blocage de la transmission lorsqu’ils ont été analysés par le test SFMA (standard 25 membrane-feeding assay ; activité de réduction de la transmission > .90 % à une dilution au 1/8 et maintenue à une dilution au 1/16 pour les nQMV-SH-Pfs25 et nOMVox-Pfs25).

La liaison à la Pfs25 sur les nOMV n'a pas eu d’impact sur la réponse en IgG anti-OAg. En outre, le conjugué obtenu par amination réductrice, où la chimie

B E2017/5855 utilisée a un impact sur la structure et la longueur de l'-OAg, a maintenu des titres élevés en IgG anti-OAg. Par conséquent, la présence d’un antigène étranger sur les nOMV de S. typhiraurium. n'a pas d'impact sur Les réponses en IgG anti-OAg (voir la figure 4C).

Dans une seconde étude, 1'immunogénicité, du conjugué Pfs25-~nOMV (produit par amination réductrice) a été comparée à la Pts2.b mélangée physiquement aux nOMV à une dose de 1 pg de Pfs25 sans Alhydrogel.

La figure 4B représente la réponse en IgG antiPfs25 induite chez des souris par le conjugué Pfs25~nOMV comparativement à la Pfs25 mélangée physiquement aux nOMV sans Alhydrogel, en utilisant le même calendrier d'-immunisation que pour la figure 4A.

Le conjugué a été capable d’induire une réponse en

IgG anti-Pfs25 significativement supérieure à la protéine mélangée avec les nOMV (p = 0,0002 ; analyse bilatérale de Mann-Whitney).

Exemple 6 - Conjugués RO6C-nOMV de S. typhimurium (étape de recyclage)

L'antigène RÓ6C de Plasmodium a été conjugué à des vésicules nOMV oxydées de S. typhimurium en utilisant 1'-amination .réductrice. Un autre conjugué a été_: produit 25 en recyclant le RO6C qui n'a pas réagi à partir du premier lot de conjugaison et en le réutilisant pour la conjugaison. Le rapport du RQ6C sur les protéines totales a été mesuré par un test ELISA de compétition, et il a été de 7,2 % pour le conjugué non recyclé et de 11,1 % 30 pour le conjugué recyclé. Pour comparaison, le RO6C seul

B E2017/5855

a. été Utilisé. Toutes; les constructions ont été formulées avec de 1. ' Alhydrogel.

Des souris ont été immunisées par voie sous-cutanée aux jours 0 et 28,, et des doses de 1, 4 et 20 pg de RO6C ont été utilisées. Le conjugué recyclé a été testé à une dose de .4 pg de RO6C. Les titres en IgG anti-R06C ont été mesurés aux jours 0,· 14, 28 et 42, et les résultats sont présentés sur la figure SA. Au jour 42, une réponse supérieure en IgG anti-R06'C a été induite par le conjugué nOMV-RO6C comparativement au RO6C seul (test de MannWhitney, p - 0,05 à la dose de 1 pg, p = 0,03 à la dose de 4 pg et p ^:::: 0,04 à la dose de 20 pg) . En outre, le conjugué nOMV-RO6C a déclenché une réponse en IgG antiRQ6C d’une façon dépendante de la: dose (rang de Spearman, p === 0,001, jour 42). Toutes les constructions (à toutes les doses) ont montré la capacité de stimuler la réponse (jour 14 à jour 42) . Les conjugués non recyclés et recyclés à la dose de 4 pg ont été comparés par le test bilatéral de Mann-Whitney, montrant la capacité du conjugué recyclé à induire une réponse qui n’est pas inférieure au non recyclé.

Les titres des IgG dirigées contre l’-OAg ont été également estimés, La figure SB représente les titres en IgG anti—OAg pour les vésicules non recyclées et 25 recyclées. Les doses des nOMV correspondant aux doses du RO6C de '1, 4 et 20 pg ont été de 13 pg, 52 pg et 2 58 pg, respectivement. Pour le conjugué recyclé, la dose de nOMV a été de 32 pg (correspondant à une dose de R06C de 4 pg) ·

Exemples la à c - Exemples comparatifs

B E2017/5855 'Exemple ?a - Réaction de dOMV (issues de Neisseria meningit.idis B)avec le v3, de fHbp (aucune réactiοn)

Les dOMV du présent exemple ont été préparées par un procédé d'extraction par un détergent, où le désoxycholate est utilisé comme détergent choisi. Les vésicules extraites par un détergent -ainsi obtenues ont été mises à réagir avec l'antigène choisi (fHbp) selon le procédé de la présente invention. En particulier, des 10 dOMV, à la concentration de 0,96 mg/ml, ont été incubées avec du Naicp à 10 mM pendant 30 minutes: à température ambiante, dans 1 ' obscurité. L'excès de NalO/, a été neutralise avec du NaaSCg à une concentration finale: de 20 mM, pendant .15 minutes à température ambiante. La 15 fHbp (rapport p/p des dOMV sur la fHbp de 1/1 et avec une concentration de dOMV de 0,335 mg/ml) et le NaBïbCN (3 mg) ont été ajoutés directement au mélange réactionnel. Après mélange délicat pendant une nuit à température ambiante, le conjugué a été purifié par 20 ultracentrifugation (110 000 tr/min à 4 °C pendant 1 h), remis en suspension dans du PBS et analysé par S DS PAGE / We s t e r n b 1 Ot

Exemple 7b - Réaction __des nOMV (issues de ètefsserfa 25 meningitidis B) avec le v3 de fHbp (formation du conjugué nOMV~fHbp de 1 ' invention)_

Les nOMV du présent exemple ont été préparées sans utiliser un détergent quelconque, comme il est décrit dans Koeberling et al. Vaccine (2014): 32: 2688. Les

3.0 vésicules extraites ainsi obtenues ont été mises à réagir avec l’antigène choisi (fHbpj selon, le procédé de la

B E2017/5855 présenté invention. En particulier^. des nOMV à la concentration de 0,96mg/ml ont été incubées avec du NalOi à 5 mM pendant 30 minutes à température ambiante, dans l'obscurité. L'excès de NaTOs a été neutralisé avec 5 du NaiSOa à une concentration, finale, de 20 mM, pendant .minutes à température ambiante. La fHbp (rapport p/p des dOMV sur la fHbp de 1/1 et avec une concentration de dOMV de 0, 335 mg/ml) et le NaBH^CN (3 mg) ont été ajoutés directement au mélange réactionnel. Après mélange 10 délicat pendant une nuit à température ambiante, le conjugué a été purifié par ultracentrifugation (110 000 tr/min à 4 ^:'C pendant 1 h) , remis en suspension dans du P.BS et analysé par SDS PAGE/Western blet.

L’analyse SDS PAGE/Western blot: anti-fHbp a confirmé la 15 formation du conjugué par la chimie de. l'amination réductrice uniquement avec des nOMV, mais pas avec des dOMV. Gel de SDS page à 10 %.

Exemple 7c - Réaction des nOMV (issues de Salmonella)

20 avec le vl	de fHbp, en	suivant la procédure de
l'exemple 7b
La même expérience que l'exemple 7b a été effectuée en utilisant des nOMV provenant de Salmonella typhiwurium, et des résultats similaires ont été 25 recueillis, en obtenant le conjugué nOMV-fHbp de 1'invention.
Exemple 8 -	Préparation de	nOMV multi- fond ionnalisées

en utilisant le (NANP)3-SH-Pfs25, selon 1'invention

3;q La protéine Pfs2.5 a été dérivatisée avec le lieur

EMCS selon la procédure suivante. La Pfs25, dans du

B E2017/5855 tampon PBS à la concentration de 2,6 mg /ml, a été additionnée du lieur EPICS (rapport molaire du lieur EMCS sut les résidus Lys de la Pfs25: de 0,3) . La réaction a été mélangée a température ambiante pendant 4 h. La 5 protéine dérivatisés résultante (Pfs25~EMCS) a été purifiée par colonne PD10 contre du NaHzPCU à 10 mM pH 6.

L'analyse par MAL DT-TOF MS a révélé une moyenne de 4 lieurs EMCS introduits par molécule de Pfs25. Le (ΝΑΝΈΉ a été ajouté à la solution de Pfs25-EMCS pour XQ avoir un rapport molaire de (NANPH sur les lieurs EMCS de 3/1 et une concentration de Pfs25 de 0,7 rng/rnl. La réaction a été mélangée à température ambiante pendant une nuit. Après ce temps, le dérivé Pfs25-(ΝΆΝΡ)3 a été purifié par Vivaspin 10K contre du tampon PBS. L'analyse par SDS PAGE/Western falot et 'MALDI-TOF MS a confirmé la formation, du produit. Des nOMV de S. typhimuriuin a la concentration de 2,1 mg/ml dans du NaHaPCLi â 100 mM pH 6,5 ont été incubées avec du Nal'Oa à 5 m.M pendant minutes à 25 °C, dans l'obscurité. L’excès de NaIO< a 2Q été neutralisé avec du NasSOi à une concentration finale de 10 mM, pendant 10 minutes a température ambiante, Le

P.f s25-(NANP) 3 (rapport p/p des nOMV sur le Pfs25-(NANP) 3 de 1/1 et avec une concentration de nOMV de 0,45 mg/ml) et le NaBHjCN ont été ajoutés directement au mélange:

réactionnel. Après mélange, délicat pendant une nuit à température ambiante, le conjugué a été purifié par ultracentrifugation (110 000 tr/min à 4 °C pendant min) , remis en suspension dans du PBS et aria lysé par

SDS PAGE/Western blot, .qui a confirmé la formation du 3q: conjugué.

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Exemple 9 - Données in vivo des conjugués de 1’invention

obtenus par	conj ugaison	d'une particule	nOMV	de
S. t yphimuri um	à 1’antige	ne Pfs25 avec	ou	sans
neutraUsâ t ion,	selon les	modes de realisation	de
1'invention
Des souris	CD1 femelles	ont été immunisées	par	voie

sous-cutanée aux jours 0 et 28 avec 2,5 pg de protéines totales des particules nOMV de S. typhimurium conjuguées à 1'antigène Pfs25 avec ou sans l'étape de neutralisation (voir 1' exemple 5} , Les deux conjugués ont montré un rapport p/p de Pfs25 sur les protéines totales proche de % par un test ELISA de compétition et ils ont été adsorbés sur de l'Alhydrogel (0,7 mg/ml d'AI³⁴) , Les titres en IgG anti-Pfs5 et anti-OAg ont été mesurés aux 15 jours 0, 14, 27 et 42. A tous les points de temps, les deux conjugués ont induit une réponse similaire en IgG anti-Pfs25 (test de Mann Whitney), comme il est représenté sur la figure 6a. En outre, les conjugués ont été capables d’induire une réponse similaire en IgG anti™ 20 OAg, comme il est indiqué sur la figure 30b. L'étape de neutralisation dans la conjugaison par amination réductrice peut être introduite sans aucun impact sur la réponse immunitaire induite chez dés souris, évitant ainsi la purification des intermédiaires d'oxydation des 25 GMMA.

Exemple 10 - Réaction des.......nOMV______(issues.......de.......Nei s séria meningitidis B) avec MenC (formation du conjugué nOMVMenC de 1'invention)

3q: Le polysaccharide de MenC a été solubilisé dans de l'AcONa à 100 mM pH 4,5 à la concentration, de 40 mg/ml.

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Le lieur ADH et le NaBHsCN ont été ajoutés dans un rapport p/p de 1/1,2/1,2 de MenC/ADH/NaBHaCN respectivement, Le mélange a été chauffé à 30 °C pendant une nuit, et ensuite dessalé par une colonne G10. La caractérisation 5 par le procédé colorimétrique au TNBS et la HPAEC-PAD ont montré 100 % de dérivatisation.

Les GMMA de MenB surexprimant la fHbp, à la concentration de 8,5 mg/ml dans du NaHaPCq à 100 mM pH 6, ont été incubés avec du KlälO« à 5 mM pendant 3.0 minutes 10 à température ambiante, dans l'obscurité. L’excès de NalCd a été neutralisé avec du NagSOs à une concentration finale de 10 mM, pendant 15 minutes à température ambiante. L’oligosaccharide de MenC, dérivatisé auparavant à son extrémité par le lieur ADH (rapport, p/p 15 des GMMA sur MenC de 1/10 et avec une concentration de GMMA de 7,7 mg/ml) et le NaBHsCN ont été ajoutés directement au mélange réactionnel. Après mélange délicat pendant une nuit à température ambiante, le conjugué a été purifié par ultracentrifugation. 20 (110 000 tr/min à 4 °C pendant 1 h) et remis en suspension dans du PBS. L'analyse par SDS PAGE/Western blot a confirmé la formation du conjugué et l’analyse par micro BCA et .HPAEC-PAD. a .révélé un rapport pondéral de polysaccharide de MenC sur la protéine égal à 0,11.

Exemple 11 - Réaction des nOMV_______(issues de Neisseria meningitidis B) avec MenA (formation du conjugué nOMVMenA de l'invention)

LOS de MenA a été solubilisé dans de l'AcONa à 30 100 mM pH 6,5 à la concentration de 40 mg/ml. Le lieur

ADH et ie NaBihCN ont été ajoutés dans un. rapport p/p de

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1/1,2/1,2 de MenA/ADH/NaBHaCN respectivement. Le mélange a été chauffé à 30 °C pendant 5 jours, puis dessalé par une colonne G10. La caractérisation par le procédé colorimétriqûe au TUBS et. la HPAEC-PAD ont montré 90 % de dérivatisation. La conjugaison aux GMMA de MenB surexprimant la fHbp a été effectuée comme il a été décrit pour le polysaccharide de MenC.

Exemple _ _ 11 - Préparation des conjugués de nOMV (is sues 10 de Neisseria meningitidis B) avec MenA et MenC

Les mêmes conditions de conjugaison décr.i.tes. pour la synthèse des conjugués MenA et MenC-MenB-GMMA ont été utilisées pour la conjugaison des deux polysaccharides sur la même particule de. GMMA. Les GMMA ont été oxydés 15 comme il a été décrit auparavant et, après neutralisation avec du NazS'Oj, les MènA-ADH et MenC-ADH ont été ajoutés simultanément dans un rapport. p/p de 8/8/1 de Me nA/MenC /GMMA re s pe et i vente nt.

0

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Liste des séquences >SEQ ID NO : I [v2 dé fHbp]

VAADIGAGLADALÏAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKN DKVSRFDFiRQIEVDGQLlTLESGEFQlYkÔDHSAWALQlEKiNNPÙKIDSLINQRSFRVSGLGG 5 EHTAFNQLPDGKAEYHGKÄFSSDDAGGKLTYTIDFAÄKQGHGK!EHS.KTPEQNVELÄAAELKA

DEKSHAViLGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEtAGSATVKIGEKVHElGiAGKO >SEQ ID NO : 2 [NHBÄ]

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B E2017/5855 >SEQ I'D NO ; 6 [App]

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GYRW >SEQ ID NO : 7 [fragment dé NadA]

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B E2017/5855 >SEQ ID NO : 10 [Pfs25]

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BE2017/5855

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Conjugué immunogène comprenant une vésicule de membrane externe native (nOMV), comportant au moins une fraction saccharidique de surface connectée à au moins un antigène.

2. Conjugué immunogène selon la revendication 1, comprenant une nOMV comportant au moins une fraction saccharidique de surface connectée à un premier antigène, dans lequel ledit premier antigène est connecté à un second antigène différent.

3. Conjugué immunogène selon la revendication 1, comprenant une nOMV comportant au moins une fraction saccharidique de surface connectée à un premier antigène, et au moins une autre fraction saccharidique de surface connectée à un second antigène différent.

4. Conjugué immunogène selon les revendications 1 à 3, dans lequel ladite nOMV est obtenue par un procédé dépourvu de détergent, étant libérée dans le bouillon de fermentation et purifiée en utilisant une centrifugation et une filtration subséquente ; ou étant libérée dans le bouillon de fermentation et purifiée en utilisant deux étapes consécutives de filtration à flux tangentiel (FFT).

5. Conjugué immunogène selon les revendications précédentes, dans lequel ladite nOMV est produite à partir de bactéries de type sauvage ou à partir de souches bactériennes modifiées génétiquement qui sont mutées pour amplifier la production de vésicules, et éventuellement aussi pour éliminer ou modifier des antigènes et/ou pour surexprimer des antigènes

BE2017/5855 homologues ou des antigènes provenant d'autres organismes.

6. Conjugué immunogène selon les revendications précédentes, dans lequel ladite nOMV est obtenue à partir d'une bactérie choisie parmi : Neisseria, Shigella, des sérovars de Salmonella enterica, Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae, Bordetella pertussis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis BCG, Escherichia coli, Bacteroides, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylori, Brucella melitensis Campylobacter jejuni, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Xenorhabdus nematophilus, Moraxella catarrhalis, ou Borrelia burgdorferi.

7. Conjugué immunogène selon les revendications précédentes, dans lequel l'antigène est un polypeptide immunogène ou un polysaccharide capsulaire.

8. Conjugué immunogène selon les revendications précédentes, dans lequel ladite nOMV et l'antigène sont dérivés de la même souche bactérienne ou de souches bactériennes différentes.

9. Conjugué immunogène selon les revendications précédentes, dans lequel ladite nOMV et au moins un antigène sont choisis comme suit :

nOMV Antigène choisi Salmonella typhimurium fHbp de Neisseria meningitidis Salmonella typhimurium CSP de Plasmodium falciparum Salmonella typhimurium Pfs25 de Plasmodium falciparum Salmonella typhimurium RO6C de Plasmodium falciparum

BE2017/5855

Salmonella typhimurium ROIOC de Plasmodium falciparum Salmonella typhimurium CTF1232 d'Escherichia coli Salmonella typhimurium Saccharide Vi de S. typhimurium Neisseria meningitidis fHbp de Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Oligosaccharide poly- rhamnose Shigella CTF1232 d'Escherichia coli Neisseria meningitidis B Saccharide capsulaire de MenA Neisseria meningitidis B Saccharide capsulaire de MenC

10. Conjugué immunogène selon la revendication 9, dans lequel ladite nOMV et au moins un antigène sont choisis comme suit :

nOMV Antigène choisi Neisseria meningitidis B Saccharide capsulaire de MenA Neisseria meningitidis B Saccharide capsulaire de MenC

11. Conjugué immunogène selon la revendication 2, dans lequel ledit premier antigène est la Pfs25, et ledit second antigène est le (NANP)3.

12. Conjugué immunogène selon la revendication 11, dans lequel la nOMV est obtenue à partir de Salmonella typhimurium.

BE2017/5855

13. Conjugué immunogène selon la revendication 2, dans lequel ledit premier antigène est un saccharide capsulaire issu de MenA, et ledit second antigène est un saccharide capsulaire issu de MenC.

14. Conjugué immunogène selon la revendication 13, dans lequel la nOMV est obtenue à partir d'une souche de Meningococcus du sérogroupe B, exprimant de préférence les vl et 2 de fHbp.

15. Conjugué immunogène selon les revendications 1 à 14, dans lequel la fraction saccharidique de la nOMV et le au moins un antigène sont connectés ensemble par l'intermédiaire d'un lieur bivalent.

16. Conjugué immunogène selon les revendications précédentes, dans lequel ladite nOMV est une vésicule GMMA.

17. Procédé de préparation du conjugué immunogène selon les revendications 1 à 16, comprenant les étapes suivantes :

i) l'activation d'au moins une fraction saccharidique de surface de la nOMV, et ii) la connexion du saccharide activé ainsi obtenu à au moins un antigène, éventuellement par l'intermédiaire d'un lieur bivalent.

18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel l'étape d'activation i) comprend l'oxydation d'un ou de plusieurs groupes hydroxyle de ladite fraction saccharidique de ladite nOMV en fonctionnalité aldéhyde.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18 en présence d'un bisulfite alcalin.

BE2017/5855

20. Composition immunogène comprenant un conjugué immunogène selon les revendications 1 à 16 et au moins un support ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

21. Conjugué ou composition immunogène selon l'une 5 quelconque des revendications 1 à 16 ou 20, pour une utilisation en tant que médicament.

22. Conjugué ou composition immunogène pour une utilisation selon la revendication 21 pour induire une réponse immunitaire chez un vertébré.

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23. Vaccin comprenant le conjugué ou la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou 20.

24. Utilisation de nOMV pour la préparation de conjugués immunogènes.

15 25. Utilisation de nOMV selon la revendication 24, où lesdits conjugués immunogènes sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 16.