BE1026703B1 - La méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes - Google Patents
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Abstract
La présente invention révèle une méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes. Après avoir été traitée de la légère rupture de paroi, la cellule se transforme par électrochocs. Le traitement de la rupture de paroi cellulaire s’effectue avec la solution tampon d’électrochocs contenant 5 µgml-1 lysozyme, ou avec la solution tampon d’électrochocs contenant 1% glycine, ou avec la solution tampon d’électrochocs contenant 30 µgml-1 pénicilline G, ou avec la solution tampon d’électrochocs contenant 3 µgml-1 lysozymes et 20 µgml-1 pénicilline G. Les paramètres de transformation par électrochocs comportent l’intensité du champ électrique de 12kV/cm, la densité cellulaire de 1×109 /ml, et la densité plasmidique AND de 2 µg. Après la transformation par électrochocs, les cellules sont incubées à l’aide du milieu de culture YEME et le temps de l’incubation dure 2-3 heures. Cette invention fournit une méthode commode et fiable à la transformation efficace de S. diastatochromogènes et fraie le chemin à l’ingénierie génétique de S. diastatochromogènes.
Description
La méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine de l’ingénierie génétique de microbe, surtout présente une méthode de transformation par chocs électriques de S. diastatochromogènes.
CONTEXTE TECHNIQUE
La toyocamycine est un membre important de la famille antibiotique du nucléoside. En raison de la similitude de la structure au nucléotide, la toyocamycine montre une étendue bioactivité, comme bioactivité antitumorale, antibactérienne, antifongique etc.. Par conséquent, la toyocamycine est considérée comme un antibiotique agricole idéal pour lutter contre la maladie mycélienne d’agriculture. Nous avons sélectionné un Streptomyces dont le produit du métabolisme principal est la toyocamycine dans notre recherche de première étape et après l’identification ce Streptomyces est le Streptomyces diastatochromogènes 1628. Mais la production de la toyocamycine est faible et elle ne peut pas répondre à la demande de la production industrielle à grande échelle. Afin de régler ce problème, le moyen employé souvent est d’adopter la méthode physicochimique habituelle pour stimuler les mutagenèses et puis faire la sélection. Pourtant, l’effet n’est pas évident par suite de la période de sélection longue. Avec le progrès de la technologie de biologie moléculaire, par exemple, le mécanisme de synthèse du métabolite secondaire de Streptomyces
- 2 BE2019/5491 coelicolor, modèle de Streptomyces, de la souche industrielle Streptomyces avermitilis et de etc.ayant déjà été expliqué, sur cette base, on fait la modification moléculaire de S. diastatochromogènes en moyennant le moyen de l’ingénierie métabolique dans le but d'augmenter visiblement sa potentialité d’application. D’ailleurs, l’obtention des semences par l’ingénierie métabolique est utilisée largement pour augmenter la production du métabolite secondaire antibiotique et en même temps l’humain est en mesure de bénéficier de la technologie de synthèse biologique, d’obtenir un substance disposant d’une nouvelle bioactivité. Malgré que nous fassions nombreuses études au sujet de la nature physiologique et biochimique de S. diastatochromogènes, nous ne connaissons pas bien sa particularité génétique, surtout son mécanisme d’ajustement et sa voie de synthèse biologique de toyocamycine. Le plus fondamental problème réside dans le défaut d’une méthode de transformation génétique fiable et efficace. Depuis que la méthode de transformation de bioplaste profitant de la médiation PEG réalise avec réussite la transformation génétique de Streptomyces, la transformation profitant de la médiation PEG est devenue une méthode habituelle pour transformationde de Streptomyces. Il résulte cependant des recherches de première étape que en ce qui concerne la méthode de transformationde bioplaste profitant de la médiation PEG, l’efficacité de la transformation en souche microbienne 1628 est basse et en plus, les rapportages de la recherche connexes ne sont jamais vu en matière de la transformation génétique de la souche 1628.
CONTENU DE L’INVENTION
Afin de surmonter les inconvénients de la technologie du moment, la présente invention a pour but d’offrir une méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes.
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Une méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes, c’est-à-dire, les cellules sont converties par électrochocs après le traitement de la légère rupture de paroi.
Le traitement décrit plus haut de la légère rupture de paroi s’effectue avec la solution tampon d’électrochocs contenant 5 pgml-1 lysozyme.
Le traitement décrit plus haut de la légère rupture de paroi s’effectue avec la solution tampon d’électrochocs contenant 1% glycine.
Le traitement décrit plus haut de la légère rupture de paroi s’effectue avec la solution tampon d’électrochocs contenant 30 pgml-1 pénicilline G.
Le traitement décrit plus haut de la légère rupture de paroi s’effectue avec la solution tampon d’électrochocs contenant 3 pgml-1 lysozyme et 20 pgml-1 pénicilline G.
Les paramètres de transformation par électrochocs ci-dessus ont l’intensité du champ électrique de 12KV/cm, la densité cellulaire de 1x109 /ml, et la densité de plasmide ADN de 2pg.
Après la transformation par électrochocs, les cellules sont incubées à l’aide du milieu de culture YEME.
Le temps de l’incubation sur le milieu de culture dure 2-3 heures
L’effet bénéfique de cette invention consiste à fournir une méthode commode et fiable à la transformation efficace de S. diastatochromogènes et à frayer le chemin pour l’ingénierie génétique de
S. diastatochromogènes.
DESSINS ANNEXES :
Dessin 1 est le graphique des résultats du taux de survie et de l’efficacité de transformation de bioplaste de S. diastatochromogènes 1628 sous l’influence de l’intensité du champ électrique différente. Sur le graphique, les autres paramètres de la transformation par électrochocs sont 100 pl de bioplaste 1628, 0,1 pg de plasmide ADN pIJ702, 25 pF, et 200Ω. △ représente le taux de survie de bioplaste et représente l’efficacité de transformation.
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Dessin 2 est le graphique des résultats du taux de survie et de l’efficacité de transformation de cellule de S. diastatochromogènes 1628 sous l’influence de l’intensité du champ électrique différente. Sur le graphique, les autres paramètres de la transformation par électrochocs sont 100 pl de bioplaste 1628, 0,1 pg de plasmide ADN pIJ702, 25 pF,et 200Ω. △ représente le taux de survie de cellule et représente l’efficacité de transformation.
Dessin 3 est le graphique des résultats de l’efficacité de transformation de cellule de S. diastatochromogènes 1628 sous l’influence des additifs différents pour traiter la cellule dans la solution tampon PGS. Sur le graphique, les autres paramètres de la transformation par électrochocs sont 2 pg d’ADN, la densité cellulaire de 1 x109, 25 pF, et 200Ω.
Dessin 3A est le graphique des résultats de l’efficacité de transformation sous l’influence de la densité differente de lysozyme.
Dessin 3B est le graphique des résultats de l’efficacité de transformation sous l’influence de la densité differente de glycine.
Dessin 3C est le graphique des résultats de l’efficacité de transformation sous l’influence de la densité differente de pénicilline G.
Dessin 3D est le graphique des résultats de l’efficacité de transformation sous l’influence de la densité differente de PEG.
METHODE CONCRETE D’EXECUTION
Matériaux et méthode
Matériaux
Extrait de malt de la société Oxoid, peptone et extrait de levure de la société Difco, lysozyme, pénicilline G, glycine et PEG 1000 de la société Sigma.
Souche microbienne et plasmide
Streptomyces diastatochromogènes 1628 est un actinomycète antagoniste (CGMCC No. 2060), et sa boisson fermentée possède un fort effet d’inhibition sur plusieurs fungus pathogéniques végétaux. Après
- 5 BE2019/5491 la séparation et l'extraction, il est prouvé que le composant actif principal de la boisson fermentée est la toyocamycine.
Milieu de culture
S. diastatochromogènes 1628 est cultivé dans le milieu de culture CP ( glucose 1%, peptone 0,2%, extrait de levure 0,4%, MgSO4-7H2O 0,05%, K2HPO4 0,05%, NaCl 0,05%, pH 7,2) ou YEME médium ( extrait de levure de Difco 0,3%, peptone de Difco 0,5%, extrait de malt d’Oxoid 0,3%, glucose 1%, saccharose 34%, glycine 0,5%, MgCl2·6H2O 5 mM ). Le milieu de culture R2YE sert du milieu de régénération de bioplaste et le transformant positif est sélectionné dans le milieu de culture R2YE auquel on a ajouté 20 pgml-1 bryamycine. Et la solution de saccharose 10% est appliqué à la transformation par électrochocs. Les chercheurs ajoutent des substances différentes à la solution de glycérine 15% afin de cultiver et laver les souches microbiennes au cours d’électrochocs. La solution tampon PGS ( PGS buffer) contient PEG 10%, glycérine 10% et saccharose 6,5% et vise à la remise en suspension des souches pendant la transformation d’électrochocs.
Exemple pratique 1
La préparation de bioplaste et la transformation par électrochocs
Des spores de S. diastatochromogènes sont mises dans une fiole d’oscillation de 250 ml renfermant 50 ml du milieu de culture CP et y sont cultivées deux jours à température de 28%. Et puis on reprend la fluide microbienne de 1,5 ml et la remet dans une autre fiole d’oscillation de 250 ml renfermant 50 ml du milieu de culture CP frais et ajoutée de glycine 0,5%. Après 28-32 heures, recueillir le mycélium, le laver deux fois avec la solution de saccharose 10%, et le remettre en suspension dans 5 ml de la solution tampon P (P buffer) avec la densité finale de lysozyme de 1 mgml-1, laisser réagir une heure à température ambiante, appliquer l’ouate hydrophile à filtrer les bioplastes acquis, 8 minutes de la centrifugation avec 2000rpm, les recueillir, les relaver dans la solution tampon P (P buffer) et les conserver en réserve à température de moins
- 6 BE2019/5491 de 70%. 100 μΙ de bioplaste et une quantité appropriée de plasmide ADN se mélangent, et après 10 minutes de pose sur la glace, le mélange est disposé dans le verre d'électrochocs avec 1000 V (25 μF et 200Ω). Après les chocs électriques, le mélange est dilué avec la solution tampon P (P buffer) , appliqué dans le milieu de culture de régénération R2YE, puis cultivé 24 heures à température de 28% et couvert de 5 ml d'agar mou contenant l'antibiotique. Selon dessin 1, quand l'intensité du champ électrique dépasse 12 kV/cm, le taux de survie et l'efficacité de transformation de bioplaste s'abaisse notablement à la suite de l'augmentation de l'intensité du champ électrique. L'efficacité de transformation la plus haute est de 122±15^g ADN avec l'intensité du champ électrique de 8 kv/cm. Toutefois, sous l'influence de la densité de bioplaste différente et de la densité cellulaire différente, comme tableau 1, l'efficacité de transformation la plus haute est de 302±6^g ADN Tableau 1 montre l'influence sur l'efficacité de transformation en raison de la densité plasmidique différente et de la densité cellulaire différente. Exemple pratique 2
La transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes traité d'après divers façons
S. diastatochromogènes 1628 est précultivé 28 heures dans le milieu de culture CP et puis remis dans le milieu de culture frais CP un jour. Le centrifugation à température 4% (10 000 rpm, 10 min ), recueillir les bactéries, les laver deux fois avec 15 ml de la solution de préréfrigération de saccharose 10%, laver deux fois les cellules avec 15 ml de la solution de préréfrigération de glycérine 15%, traiter les cellules avec quatre additifs différents, et enfin remettre les cellules de compétence en suspension dans la solution tampon PGS (PGS buffer) dans le but d'obtenir une densité cellulaire près de 2x109 cellules /ml. 100 μl de cellules de compétence et une quantité appropriée de plasmide ADN se mélangent. Poser le mélange sur la glace 10 minutes, le donner les chocs électriques avec paramètres de 1200 V (25 μF et 200Ω), après les
- 7 BE2019/5491 chocs, y ajouter rapidement 1 ml du milieu de culture CP, laisser réagir une heure, à température 28°C, et finalement l'appliquer sur le milieu de culture de régénération R2YE contenant l'antibiotique, à température 28°C, 3-4 jours.
En cas du traitement de lysozyme, laver deux fois les cellules avec 15 ml de la solution de préréfrigération de glycérine 15%, et puis les remettre en suspension dans les solutions de glycérine 15% contenant la densité de lysosome différente (1, 3, 5, 7, 9 pg /ml). laisser réagir 20 minutes à température 37°C,
En cas du traitement de glycine, laver deux fois les cellules avec 15 ml de la solution de préréfrigération de glycérine 15%, et puis les remettre en suspension dans les solutions de glycérine 15% contenant la densité de glycine différente (0,5%, 1%, 1,5%, 2%). Laisser réagir 20 minutes à température ambiante.
En cas du traitement de pénicilline G, laver deux fois les cellules avec 15 ml de la solution de préréfrigération de glycérine 15%, et puis les remettre en suspension dans les solutions de glycérine 15% contenant la densité de pénicilline G différente (10, 20, 30, 40 pg /ml). Laisser réagir 30 minutes à température ambiante.
En cas du traitement de PEG, laver deux fois les cellules avec 15 ml de la solution de préréfrigération de glycérine 15%, et puis les remettre en suspension dans les solutions de glycérine 15% contenant la densité de PEG différente (10%, 20%, 30%).
A l'égard d'état de croissance de cellulaire, on a découvert que quand les cellules se trouvent dans la phase moyenne logarithmique, recueillir les bactéries, la plus haute efficacité par électrochocs est de 40 transformants /pg ADN . En parallèle, on a examiné l'influence de l'intensité du champ électrique différente sur la transformation de S. diastatochromogènes pas traité. Selon dessin 2, quand l'intensité du champ électrique atteint 10 kV/cm, le taux de survie cellulaire est de 100%. Quand l'intensité du champ électrique augmente 16kV/cm, le taux
- 8 BE2019/5491 de survie atteint encore 75%. Mais l’efficacité de transformation est basse (55 transformants/pg ADN), et cette efficacité est inférieure à celle de transformation de bioplaste en tant que l’objet d’électrochocs. L’optimisation d’autres paramètres de transformation d’électrochocs n’amène pas l’augmentation visible de l’efficacité de transformation. Il en résulte que la perméabilité de la paroi cellulaire joue un rôle vital pour la transformation efficace.
Examiner l’influence de cellule prétraitée dans la solution tampon ajoutée de quatre auditifs différents sur l’efficacité de transformation. Les résultats se présentent comme dessin 3: quand lysozyme 5 pg/mL, glycine 1% et pénicilline G 30 pg/mL sont ajoutés respectivement à la solution tampon pour le prétraitement cellulaire, l’efficacité de transformation augmente relativement 30 fois, 12 fois et 28 fois. Cependant, l’ajout de PEG n’a pas un effet notable sur l’efficacité de transformation. Lorsque les cellules sont traitées par 3 pg/ml de lysozyme et 20 pg/mL de pénicilline G, l’efficacité de transformation inespérée présente et peut atteindre 3x103 transformants /pg ADN .
Simultanément exanimer l’influence de la densité différente cellulaire et plasmidique sur l’efficacité de transformation. D’après les recherches, quand 2 pg de ADN et 1x109 cellules se mélange au cours d’électrochocs, la plus haute efficacité de transformation peut atteindre 5x103 transformants /pg ADN .
Les chocs électriques peuvent endommager les cellules et après les chocs nous ajoute immédiatement le milieu de culture à la solution d’électrochoc en faveur de la réparation de cellule et l’augmentation de l’efficacité de conversion. Les résultats montre que après les chocs l’effet de l’ajout du milieu de culture YEME est mieux que celui du milieu de culture CP, que l’efficacité de transformation est à même d’atteindre (3±0,3) transformants /pg ADN après 2-3 heures de culture. En cas du temps trop long, des colonies microbiennes fausses positives surgissent et ça amène la difficulté de sélection de transformant positif (tableau 2).
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Tableau 2 montre après les chocs électriques l'influence de l'ajout du milieu de culture et le temps de culture sur l'efficacité de transformation.
| Milieu de culture | Temps de culture (h) | Transformant /pg ADN |
| CP | 0.5-1 | (5±0,2)x103 |
| 2-3 | (l±0,1)x104 | |
| Dépasser 4h | >(3±0,3)x104 | |
| YEME | 0.5-1 | (l±0,l)x104 |
| 2-3 | (3±0,4)x104 | |
| Dépasser 4h | >(6±0,3)x104 |
Exemple pratique 3
Les résultats de l'optimisation de diverses conditions de la transformation d'électrochocs pour différents types cellulaires de S. diastatochromogènes se présente comme tableau 3, dont la cellule prétraitée est les souches qu'on recueille quand les cellules de souche complète entre dans la phase logarithmique moyenne et qui réagissent un moment dans la solution tampon de transformation d'électrochocs à laquelle on ajoute simultanément lysozyme 3 pg/ml et pénicilline 20 pg/ml et puis les cellules servent de matériaux de transformation par électrochocs. Après les chocs électriques, on y ajoute immédiatement 1 ml du milieu de culture, laisse réagir 2-3 heures à température de 28°C et ensuite enduit les cellules dans le milieu solide de culture R2YE contenant l'antibiotique.
Tableau 3 montre l'optimisation de diverses conditions de transformation d'électrochocs pour différents types cellulaires de S. diastatochromogènes.
- 10 BE2019/5491
| Type de souche | Intensité du champ | Densité | Densité | de | Transformant |
| 1628 | électrique (kV/cm) | cellulaire (ml) | plasmideADN (pg) | /pg ADN | |
| Bioplaste | 8 | 1x109 | 1 | 302±6 | |
| Cellule complète | 18 | 1x109 | 1 | 55±6 | |
| Cellule prétraitée | 12 | 1x109 | 2 | (3±0,4) x104 |
Claims (1)
- REVENDICATIONS1. Une méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes est caractérisée par le fait que S. diastatochromogènes décrit plus haut est streptomyces diastatochromogènes 1628 et les cellules sont converties par électrochocs après le traitement d'une légère rupture de paroi ;Le traitement de la légère rupture de paroi s'effectue avec la solution tampon d'électrochocs contenant 3pgml-1 lysozyme et 20pgml-1 pénicilline G ;Les paramètres de transformation d'électrochocs ci-dessus comptent l'intensité du champ électrique de 12kV/cm, la densité cellulaire de 1x109 /ml, et la densité de plasmide ADN de 2pg ;Après la transformation par électrochocs, les cellules sont incubées à l'aide du milieu de culture YEME et le temps de l'incubation sur le milieu de culture dure 2-3 heures.
Priority Applications (1)
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| BE20195491A BE1026703B1 (fr) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | La méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes |
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| BE20195491A BE1026703B1 (fr) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | La méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes |
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| BE20195491A BE1026703B1 (fr) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | La méthode de transformation par électrochocs de S. diastatochromogènes |
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|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103333909A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-10-02 | 中国计量学院 | 淀粉酶产色链霉菌电击转化方法 |
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2019
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103333909A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-10-02 | 中国计量学院 | 淀粉酶产色链霉菌电击转化方法 |
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|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20200511 |
|
| MM | Lapsed because of non-payment of the annual fee |
Effective date: 20210731 |