BE1029146B1 - Procede de purification d'une proteine d'interet - Google Patents
Procede de purification d'une proteine d'interetInfo
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Abstract
Méthode de purification d’une protéine d’intérêt à partir d’une culture de bactéries Gram-négatif comprenant l’utilisation de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther pour l’élimination des endotoxines, utilisation du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther pour l’élimination des endotoxines et utilisation en chromatographie d’une solution ayant un pH compris entre 8,0 et 9,0 et une concentration en sels de 2,5 M à 3 M pour le relargage spécifique de contaminants bactériens.
Description
PROCEDE DE PURIFICATION D'UNE PROTEINE D'INTERET
Domaine technique
La présente invention se rapporte à la purification d'une protéine d'intérêt obtenue par fermentation d’une bactérie Gram- négatif, en particulier la purification des endotoxines sans utilisation de solvants phénoliques.
Arrière-plan technologique de l'invention
La fermentation de protéines à partir de bactéries Gram- négatif est couramment utilisée pour des raisons de facilité et de coûts.
Cependant, ces bactéries synthétisent des composants de type lipopolysaccharides, également appelés ‘endotoxines’, qui sont difficiles à éliminer.
Ces composants sont particulièrement problématiques lorsqu'ils sont associés à des protéines destinées à être administrées à un patient, en particulier lorsque de grandes quantités doivent être administrées, par exemple en vaccination thérapeutique, puisque cela signifie la co-administration de quantités plus importantes d'endotoxines au patient.
Etat de la technique
Diverses méthodes de chromatographie et de lavage au moyen de détergents phénoliques, tels que le Triton® X-100 ont été développées, qui permettent de purifier une protéine d'intérêt synthétisée par une bactérie Gram-négatif.
Cependant ces méthodes, soit ne permettent pas une élimination suffisante des endotoxines, soit impliquent l'utilisation de détergents phénoliques, ce qui signifie des problèmes pour l'environnement, soit impliquent ou imposent l'addition d'une chromatographie spécifique sur membrane, par exemple de type
Mustang® ou Sartobind®, ce qui est peu efficace.
Résumé de l'invention :
Un premier aspect de la présente invention est une méthode de purification en endotoxines d'une biomolécule d'intérêt à partir d'une culture de bactéries (ex. Gram-négatif, possiblement
Gram positif) comprenant les étapes suivantes: un conditionnement de la biomolécule d'intérêt dans une solution et une étape de chromatographie dans laquelle (i) la biomolécule d'intérêt est fixée sur un support, (ii) Ia biomolécule d'intérêt fixée sur le support est lavée avec une solution comprenant du
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, puis où la biomolécule d'intérêt fixée sur le support est lavée avec une solution dépourvue de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther et (Ii) la biomolécule d'intérêt fixée sur le support est éluée. De préférence, la biomolécule d'intérêt est de l'ADN, de l'ARN, ou une protéine.
De préférence, entre 0,01% et 1% (w:v) , de préférence entre 0,05 et 0,5% (w:v), de manière favorable de 0,1 à 0,2% (w:v), telle que environ 0,15% (w:v) de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther est utilisé lors de l'étape de lavage comprenant cette molécule.
Un aspect lié de la présente invention est une méthode de purification d'une protéine d'intérêt à partir d'une culture de bactéries (ex. Gram-négatif, possiblement Gram positif) qui comprend la protéine d'intérêt, Ia méthode comprenant les étapes suivantes : (a) un conditionnement de la protéine d'intérêt dans une solution, (b) une série d'étapes de purification pour récupérer la protéine d'intérêt dans une première fraction à conserver et des contaminants dans une ou plusieurs fractions à éliminer, ces contaminants comprenant des endotoxines, dans laquelle l'élimination des endotoxines comprend une étape d'addition d'une solution comprenant du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther.
De préférence, la série d'étapes de purification de cette méthode comprend une chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et/ou une chromatographie d'interaction hydrophobe, avantageusement une première chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et ensuite une deuxième chromatographie d'interaction hydrophobe sont pratiquées, ces première chromatographie et deuxième chromatographie comprenant chacune une étape de charge, une étape de lavage et une étape d'élution.
Avantageusement, l'élimination des endotoxines est réalisée pendant l'étape de lavage de la première chromatographie et/ou de la deuxième chromatographie, chacune des chromatographies comprenant avantageusement une étape de charge, une étape de lavage et une étape d'élution.
De préférence, l'élimination des endotoxines est réalisée au moyen d'une concentration en Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther comprise entre 0,01% et 1% (w:v) , de préférence entre 0,05 et 0,5% (w:v), de manière favorable de 0,1 à 0,2% (w:v), telle que environ 0,15% (w:v).
De préférence, l'élimination des endotoxines de la première chromatographie et/ou de la deuxième chromatographie est réalisée avec un volume compris entre 1 et 10 fois le volume de la colonne, de préférence un volume d'environ 5 fois le volume de la colonne.
Cette méthode est particulièrement avantageuse lorsque la protéine d'intérêt est SEQ ID NO:1 et/ou lorsque la protéine d'intérêt est sécrétée dans l'espace périplasmique d'une bactérie
Gram-négatif.
De préférence, dans cette méthode, la chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions possède un échangeur fort et/ou la chromatographie par interaction hydrophobe est de type phényle. 5 De préférence, l'étape de charge et/ou de lavage de la chromatographie sur support hydrophobe est réalisée à un pH compris entre 8 et 9 et/ou en présence d'une concentration en sels comprise entre 2 et 3 M et/ou présente Un rapport de charge compris entre 0,1 g/L et 5 g/L, préférentiellement entre 0,3 et 2 g/L.
De préférence, l'étape d'élution de la chromatographie par interaction hydrophobe est réalisée avec une solution de conductivité électrique inférieure à 105 mS/cm, de préférence moins de 80 mS/cm et/ou de plus de 40 mS/cm.
De préférence, [létape de charge de la chromatographie d'échange d'anions est réalisée à un ratio de charge compris entre 2,5 et 3,5 g/L (poids des protéines : volume) et/ou dans l'étape d'élution est réalisée en utilisant une solution de conductivité électrique supérieure au double de celle utilisée lors de l'étape de charge et/ou de lavage.
De préférence, cette méthode de purification comprend en outre une étape de passage sur une membrane échangeuse d'anions de type Mustang® Q, Mustang® E ou
Sartobind® Q ou Sartobind® STIC et/ou une étape de filtration stérilisante.
Un autre aspect lié de la présente invention est l’utilisation de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther pour l'élimination des endotoxines d'une composition, de préférence comprenant en outre une biomolécule d'intérêt choisie parmi l'ADN (plasmide), l'ARN(m) et un peptide, de préférence un peptide.
Ceci est avantageux pour une Utilisation pharmaceutique de cette composition comprenant une biomolécule d'intérêt, de préférence pour la vaccination, telle que la vaccination thérapeutique.
Un autre aspect lié de la présente invention est l’utilisation d'une solution de lavage ayant un pH compris entre 8,0 et 9,0 et une concentration en sels de 2,5 M à 3 M pour le relargage spécifique de contaminants bactériens de colonnes d'une chromatographie sur support hydrophobe sur groupement phényle.
De préférence, cette solution de lavage comprend en outre du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther.
Un autre aspect lié de la présente invention est l'Ufilisation d'une solution ayant un pH compris entre 7,5 et 8,5 de préférence 8,0+0,2 et une conductivité de 12,0 mS/cm ou inférieure, de préférence inférieure à 10,0 MS/cm, et/ou supérieure à 7 mS/cm pour la séparation d'une biomolécule d'intérêt d'avec le contaminant bactérien LivK en chromatographie d'échange d'anions, de préférence une chromatographie d'échange d'anions forie.
Description de l'invention
De nombreuses biomolécules d'intérêt, par exemple des peptides, sont produites par fermentation de bactéries Gram-négatif dans lesquelles, par exemple, le peptide d'intérêt est greffé à une séquence d'adressage vers l'espace périplasmique, ce qui permet de simplifier Ia récupération du peptide mature. Un des problèmes inhérents à cette approche ou à d'autres approches de fermentation dans des microorganismes est la présence d'endotoxines (EU), ce qui oblige à procéder à leur élimination, au moins jusqu'à un seuil acceptable. L'utilisation de détergents phénoliques, de type ‘Triton®', permet de réduire la teneur en EU.
Cependant, cette approche pose des problèmes environnementaux. Les inventeurs ont identifié que le
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther pouvait être avantageusement utilisé, bien qu'il soit basé sur une structure centrale insaturée, au contraire du groupement phénol (aromatique) du Triton® X-100, alors que les autres détergents non- phénoliques, ne permettent pas une bonne élimination des EU ou posent des problèmes en aval.
La présente invention a donc trait à une méthode de purification d'une biomolécule (protéine) d'intérêt à partir d'une culture de bactéries Gram-négatif. Cette méthode comprend une élimination des EU par lavage au Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther.
Une protéine particulièrement avantageuse est la CRM 197 (SEQ ID NO :1). Cette protéine est, de préférence, sécrétée dans l'espace périplasmique d'Escherichia coli. Cependant, la présente invention s'applique à la SEQ ID NO :1 obtenue par d'autres moyens (ex. non adressées dans l'espace périplasmique, cytosolique, sécrétée, fermentées par d'autres cellules-hôtes Gram négatif, voire même dans d’autres microorganismes qui produiraient également des endotoxines), ou à d'autres protéines, voire à d'autres biomolécules susceptibles d'être injectées à un patient, produites dans de telles bactéries, par exemple l'ADN (ex. plasmide) ou l'ARN (ex. ARN messager).
La récupération de la protéine d'intérêt, lorsqu'elle est exprimée dans l'espace périplasmigue, peut se faire avaniageusement en provoquant un choc osmotique, ce qui permet de libérer le contenu périplasmique, et ainsi de séparer facilement une grande quantité des produits bactériens contaminants, toujours emprisonnés dans la cellule.
De préférence, la présente méthode comprend une étape préliminaire de récupération de la protéine d'intérêt (ex. SEQ
ID NO :1) dans une solution tampon.
De manière avantageuse, cette méthode de purification comprend une série d'étapes de chromatographie, de préférence, une chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et/ou une chromatographie sur support hydrophobe (chromatographie par interaction hydrophobe).
De préférence, chaque étape de chromatographie comprend (comprennent chacune) une étape de charge, une étape de lavage et une étape d'élution.
Ceci permet de combiner le lavage en présence de
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther avec une ou les deux étape(s) de lavage de chromatographie, la chromatographie par capture sur une résine échangeuse d'anions et/ou la chromatographie sur support hydrophobe (chromatographie par interaction hydrophobe).
Ainsi, lorsque la protéine d'intérêt est chargée sur la colonne de chromatographie, l'étape de lavage avec une solution comprenant le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther permet le relargage de la majorité, voire même la quasi-totalité, des EU, sans ajouter une étape spécifique.
De préférence, la série d'étapes de chromatographie est réalisée de manière séquentielle, une première chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et ensuite une deuxième chromatographie sur support hydrophobe (chromatographie par interaction hydrophobe).
De manière avantageuse, la teneur en Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther (utilisé lors de l'étape de lavage d'une ou des deux étape(s) de chromatographie) est comprise entre 0,01% et 0,75% (w:v), de préférence entre 0,05 et 0,3% (w:v), de manière favorable de 0,1 à 0,2% (w:v), telle que environ 0,15% (w:v).
De préférence aucun solvant phénolique n'est utilisé au cours de la méthode, en particulier lors des étapes de lavage et/ou d'élimination des EU.
De préférence, cette élimination des endotoxines se réalise avec un volume de solution (comprenant le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther) de lavage compris entre et 1 et 20 fois le volume de la colonne (CV), préférentiellement entre 2 et 10 CV, ou entre 3 et 7 CV, de manière favorable environ 5 CV.
Avantageusement, cette étape d'élimination des endotoxines est suivie d'une étape de lavage avec la même solution, mais sans le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ; des volumes de 1 à 10 CV, par exemple environ 5CV sont préférés.
Les inventeurs ont choisi de telles valeurs élevées, malgré les conséquences en termes (i) de coût et (ii) de temps de lavage, pour combiner l'application de la solution comprenant le
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, puis d'une solution qui en est dépourvue, de manière à ce que la protéine d'intérêt (SEQ ID
NO :1) soit éluée dans une solution dépourvue de ce détergent.
Vu que le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther n’a pas la propriété d'absorbance spécifique du Triton X 100 à 280 nm, le calcul du volume de lavage nécessaire avec la solution sans détergent peut se faire dans un pré-test où le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther est remplacé par le Triton X-100, et tous les autres paramètres sont constants. Le suivi de l'albsorbance à 280 nm permet de visualiser Ia désorption du Triton X-100, ce qui donne une indication du volume qui sera nécessaire pour la désorption du
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther. Vu que le pré-test n'a pas vocation à être répété, il ne représente pas un problème économique majeur.
Ceci permet la réduction de la teneur en EU à 20%, préférentiellement égale ou inférieure à 10%, plus préférentiellement égale ou inférieure à 5%, encore plus préférentiellement égale ou inférieure à 2%, de manière favorable égale ou inférieure à 1% par rapport à une quantité en EU avant cette étape.
Cette méthode permet également l'obtention de la protéine d'intérêt avec une pureté égale ou supérieure à 65% (poids de la protéine d'intérêt : poids total en protéine), préférentiellement égale ou supérieure à 70%, plus préférentielement égale ou supérieure à 73%, de manière favorable égale ou supérieure à 75%.
Cette méthode permet également l'obtention de la protéine d'intérêt dans une composition ayant une quantité résiduelle d'ADN génomique égale ou inférieure à 5 ng/Mg (poids
ADN génomique : poids en protéine, c'est-à-dire la protéine d'intérêt purifiée), préférentielement égale ou inférieure à 2 ng/mg, de manière favorable égale ou inférieure à 1 ng/mg.
Plusieurs types de résines échangeuses d'anions peuvent être utilisées dans la présente méthode, telles que les fonctions Q (amine quaternaire) et DEAE (Diéthylaminoéthyl) portées sur une résine. Par exemple, une résine échangeuse forte « Q» (en mode positif) a été utilisée avec succès, en particulier dans le cas où la protéine à purifier est celle de SEQ ID NO:1.
La résine échangeuse d'anions peut posséder une taille de billes comprise entre 20 et 150 um, préférentiellement entre 40 et 120 um, de manière préférée entre 60 et 110 um. La nature de la résine est choisie et adaptée selon les protéines à purifier.
L’étape de charge de la chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions peut être réalisée à Un pH compris entre 5,0 et 11,0, préférentiellement entre 7,0 et 10,0, de manière favorable entre 8,0 et 9,0. Lorsque la protéine à purifier est celle de SEQ ID NO :1, l'étape de charge est réalisée de préférence à UN pH compris entre 7,0 et 10, tel que de 8,0 à 9,0.
La solution utilisée pour l'étape de charge présente de préférence une conductivité électrique comprise entre 2,0 et 15,0 mS (mill-Siemens)/cm, préférentiellement entre 5,0 et 10,0 mS/cm. La conductivité électrique de la solution est facilement mesurée et, au besoin, ajustée par addition d'un sel, tel le chlorure de sodium, ou par dilution avec de l'eau déminéralisée.
De préférence, l'étape de charge est réalisée en
Utilisant une composition comprenant un rapport de charge compris entre 1 et 8 g/L, préférentielement entre 2 et 5 g/L, de manière favorable entre 3 et 4 g/L. De bons résultats ont été obtenus avec une charge de 3,3 g/L, en particulier une telle charge a permis de limiter la retenue de la protéine contaminante LivK.
L'étape de lavage (voir ci-dessus) est, de préférence, réalisée avec une solution ayant la même conductivité électrique que cele de l'étape de charge et le même pH; donc, de préférence, une conductivité électrique comprise entre 2,0 et 15,0
MS (mill-Siemens)/cm, préférentiellement entre 5,0 et 10,0 mS/cm.
L'étape d'élution est, de préférence, réalisée avec une solution ayant une conductivité électrique supérieure à deux fois celle de l'étape de charge et/ou entre 9,0 et 200 mS/cm, de préférence entre 12,0 et 17,0 mS/cm.
La chromatographie sur support hydrophobe (chromatographie par interaction hydrophobe) peut être pratiquée en utilisant différentes résines, dérivatisées avec des groupements d'hydrophobicité à choisir parmi le phényl, le butyl et l'hexyl. Des bons résultats ont été obtenus en utilisant une résine phényl 650M. Le pH pour la charge est, de préférence, compris entre 5,0 et 11,0, préférentiellement entre 7,0 et 10,0, de manière favorable entre 8,0 et 9,0. Dans le cas de la SEQ ID NO :1, la résine est de préférence une résine-phényl, telle que la résine phényl 650M, et le pH est de préférence compris entre 7 et 10, de préférence entre 8,0 et 9,0.
De préférence, l'étape de charge sur résine hydrophobe (chromatographie par interaction hydrophobe) est réalisée au moyen d'une concentration en sels (ex. le chlorure de sodium) comprise entre 0,5 et 6 M, préférentiellement entre 2 et 3 M.
En particulier, lorsque la protéine à purifier est SEQ ID NO :1, et que la résine hydrophobe est de type phényl (phényl 650M), de bons résultats ont été obtenus à des concentrations élevées en sels, telles que de 2,0 à 3,0 M.
De préférence, le rapport de charge de la résine hydrophobe est compris entre 0,1 g/L et 5 g/L, préférentiellement entre 0,3 et 2 9/L.
Lorsque la protéine à purifier est SEQ ID NO:1, et/ou une protéine exprimée dans l'espace périplasmique, l'étape de lavage de la chromatographie hydrophobe est avantageusement pratiquée en utilisant UN volume important (ex. de 5 à 20 CV (volume de colonne), telle que environ 15 CV) à pH élevé (entre 8,0 et 9,0, par exemple 8,5) et à une concentration en sels élevée (entre 2,3 et 3 M NaCl, par exemple environ 2,6 M en NaCl). Ceci permet de relarguer la protéine de l'espace périplasmique LivK, mais pas la SEQ
ID NO :1 ou une autre protéine d'intérêt exprimée dans l'espace périplasmique. En outre, comme pour la chromatographie par échange d'anions, un lavage prolongé, malgré son coût, permet d'insérer une sous étape comprenant le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, suivie d'une sous étape qui en est dépourvue, de manière à éluer la protéine d'intérêt dans une solution dépourvue de ce détergent.
Après les étapes de chromatographie, ou même entre les deux étapes de chromatographie, la solution peut être filtrée sur membrane. Des membranes (cartouches) de type « Mustang E» peuvent être utilsées après la chromatographie par interaction hydrophobe, ce qui permet de réduire (davantage) la teneur en endotoxines. Cependant, les inventeurs ont remarqué que cette étape n'était d'habitude pas nécessaire, puisque le lavage lors d'une ou des deux chromatographies permettait d'obtenir des compositions avec un contenu en EU qui soit compatible avec un
Usage clinique.
Enfin, avantageusement, une (dernière) étape de filtration stérilisante sur filtre de porosité de 0,22 um est pratiquée, de manière à obtenir une composition injectable à un patient.
Un aspect lé de la présente invention est une composition injectable à un mammifère, en particulier à un être humain (ou à un chien, ou à un cheval ou à Un lapin ou à un caméldé ou à un singe), comprenant une protéine d'intérêt obtenue en mettant en œuvre la méthode de purification ci-dessus.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Exemples
La protéine de la SEQ ID NO :1 a été produite par fermentation au moyen d'une souche d'Escherichia coli, sous le contrôle d'un peptide d'adressage dans l'espace périplasmique, ceci dans des conditions contrôlées par exemple selon ce qui est décrit dans la demande de brevet BE2021/5137 déposée le 26 février 2021, de manière à maximiser la quantité de la SEQ ID NO :1 dans l’espace périplasmique.
La méthode d'extraction choisie pour extraire la SEQ ID
NO:1 implique un choc osmotique, ce qui a permis d'extraire avec un rendement élevé les protéines du compartiment périplasmique,
en limitant le plus possible la libération de contaminants membranaires ou cytoplasmiques (protéines dont certaines protéases, endotoxines et DNA résiduels).
Les conditions d'extraction ont impliqué successivement une première re-suspension des cellules dans un tampon hypertonique suivie d'une dilution dans une solution hypotonique.
Les conditions expérimentales (nature et rapport des tampons hyper- et hypotoniques) ont été testées à petite échelle en mode discontinu («batch») puis transposées dans un réacteur continu de type tubulaire.
La solubilité des protéines extraites du compartiment périplasmique, et plus particulièrement de SEQ ID NO:1, a été testée dans des concentrations salines croissantes de façon à vérifier l'absence de précipitation dans les conditions généralement rencontrées en chromatographie liquide et/ou à définir les bornes opérationnelles. Il a été montré que la SEQ ID NO:1 ne montre aucun signe de précipitation dans des gammes de NaCl de O à 3 M, à pH 8,5. Grâce à cette étape, les inventeurs ont réussi à obtenir SEQ ID
NO :1 avec déjà une pureté d'environ 30% ; SDS PAGE avec dilutions successives de 2 en 2 des échantillons, coloration de l'ensemble des protéines.
Ensuite, différents supports chromatographigues ont été testés. Parmi les échangeurs d'anions, des échangeurs forts et faibles (fonctions Q et DEAE), différents types de matrices (agarose, méthacrylate), de structure (bille et structure tentaculaire), ou encore de conditions physico-chimiques (pH et conductivité de la fraction « load ») ont été testées. Cinq matrices présentant une hydrophobicité croissante (fonctions phényl, butyl et hexyl) ont également été testées en comparant deux concentrations en sel pour l'élution.
Les résines Capto Q et Phényl 650M ont été retenues pour leur capacité de liaison de la SEQ ID NO:1 supérieure aux autres résines et ont ensuite été validées en mode dynamique. Ces tests ont permis d'affiner les paramètres de la chromatographie (pH, conductivité, quantité de protéine chargée par volume de résine).
La séquence de purification a été développée de façon mettre en place un procédé en deux étapes chromatographiques permettant d'obtenir un rendement élevé et une pureté de la protéine d'intérêt supérieure à 95%. Ces recherches ont été menées sur les deux types de résines sélectionnées lors du criblage. 1. Capture par une résine échangeuse d’anions. 2. Polissage par une resine hydrophobe.
Différents facteurs susceptibles d’influencer la purification de la SEQ
ID NO:1 sur résine échangeuse d'anions ont été étudiés et mis en relation avec les résultats du criblage afin d'établir une séquence chromatographique optimale, soit un compromis entre le rendement, la pureté et la durée de l'opération. La mise à l'échelle a également été testée afin de vérifier Ia reproductibilité du procédé dans des conditions représentatives des conditions industrielles.
Les résultats obtenus ont permis d'optimiser l'étape de capture en retenant les meilleures conditions :
Résine : échangeur fort Capto Q (meilleur que DEAE), billes de 90 um «normale » en termes de calibration. Ces choix ont permis de maintenir une haute capacité de fixation de la SEQ ID NO:1 malgré le degré de résolution de la chromatographie plus faible comparativement à une résine caliborée de type « Jetted ». Quatre hauteurs de colonne ont été testées : 10, 12, 15 et 20 cm ; la hauteur de 12 cm a été préférée et quatre diamètres (1,6 ; 2,6 ; 10 et 14 cm) ont été testés ; le diamètre de 14 cm a été préféré dans le cadre de l'échelle de purification envisagée.
Charge : les conditions physicochimiques de l'étape de charge de la résine ont été testées, à savoir une conductivité entre 3,0 et 9,0 mS/cm et un pH de 8,5. Ces conditions permettent à la protéine d'exposer à sa surface une forte densité de charges négatives nécessaire pour la fixation à la résine (mode positif), tout en évitant la fixation de certains pigments et protéines de l'hôte. Le ratio de charge a également été fixé 3,3 g/L de résine (légère surcharge ; 2,5 g/l et 4,2 g/l ont également été testés) et le débit à 90 cm/h, afin d'entraîner une compétition pour les sites de fixation entre SEQ ID
NO:1 et la protéine LivK (pl 5.2 vs 5,9), une protéine périplasmique présentant Un point isoélectrigue et une hydrophobicité proche de la protéine d'intérêt. Cette compétition limite l'accroche de cette protéine de l'hôte.
Lavage: l'étape de lavage est caractérisée par un volume de 10 CV ou de 15 CV (Volume de Colonne ; 5 et 20 CV ont également été testés) de tampon (ce tampon va parfois comprendre 0,15% (w:v) de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ; voir ci-dessous) à pH 8,5 et 7,0 mS/cm, à un débit de 300 cm/h. Elle a pour but d'éliminer la majorité des impuretés non-fixées sur la résine, en ce compris les endotoxines, immédiatement après le chargement.
Elution : cette étape a pour but de décrocher la protéine d'intérêt tout en minimisant la co-élution des impuretés fixées sur la résine. Une proportion de la protéine LivK étant toujours présente sur la résine et ayant une tendance à co-éluer avec SEQ ID NO:1, l'élution se déroule donc en deux étapes. La première étape consiste en un lavage prolongé de 15 CV à pH 80 avec une solution de conductivité proche de celle de la solution de l'étape de lavage (ex. 9 MS/cm), à un débit de 300 cm/h. La légère différence de charge du LivK permet de l'éluer à Une conductivité légèrement inférieure à celle provoquant l'élution de la SEQ ID NO:1. L'élution de la SEQ ID
NO:1 à proprement parler est isocratique (l'élution par gradient a également été testée) et réalisée à pH 8,5, avec une conductivité électrique nettement supérieure à celle de la solution de lavage (des valeurs de 9,0 à 20,0 mS/cm ont été testées), à 300 cm/h. Ainsi, les inventeurs ont remarqué que la SEQ ID NO:1 éluée est débarrassée des protéines de faible et haut poids moléculaire (analyse en SDS
PAGE), mais aussi de la plupart des pigments et endotoxines.
Tableau 1 : Comparaison de l'impact de différents paramètres utilisés pour le premier tampon d'élution appliqué avant l'étape d'élution de la CRM (SEQ ID NO:1) en chromatographie d'échange d'ions sur
Capto Q.
Conductivité ms/em[ 90 105 120 90 90
SS
CRMElution 8 0,263 0191 0094 0229 0,133
LivK Elution 8 | 0022 0,004 0 0,007 0,0016 _
RdtCRM 6 705125 TL A
Ratio LivK/CRM | % 8,4 21.00 ; 31 12
NB. Le ratio LivK/CRM est le ratio de la fraction éluée (voir ci-dessous).
Mise à l'échelle : la mise à l'échelle de la séquence de purification a été étudiée sur différents types de supports (colonnes HiScale et
Axichrom) pour différentes géomértries de lit (hauteur du lit de résine, diamètre de colonne), mais également avec différentes techniques de packing (Dynamic Axial Compression ou DAC, incrémentation du débit de consolidation). Comme écrit ci-dessus, la hauteur de la résine a été déterminée à 12 cm pour un diamètre de 14 cm, soit un volume de résine de 1,846 L, permettant de traiter l'équivalent de la production de 5 L de culture issue d’un bioréacteur. La méthode de packing choisie consiste à incrémenter le débit au cours de l'étape de consolidation en utilisant de l'eau comme phase mobile. Ce protocole permet d'obtenir des critères de performance (résolution et asymétrie) répondant aux critères du fabriquant pour cette résine.
La conductivité électrique des différentes solutions se mesure facilement et est adaptée par l'ajout de NaCl ou par dilution. La conductivité électrique a été fixée avec précision pour toutes les solutions utilisées. Grâce à cette étape, les inventeurs ont réussi à augmenter la pureté de la SEQ ID NO :1 à 80% ; SDS PAGE avec dilutions successives de 2 en 2 des échantillons, coloration de l'ensemble des protéines. Un rendement de 71% a été obtenu dans les meilleures conditions
Développement d'une étape de polissage sur support hydrophobe
Phényl 650M
Différents facteurs susceptibles d'influencer la purification de la SEQ
ID NO:1 sur supports hydrophobes ont été étudiés et mis en relation avec les résultats du criblage afin d'établir une séquence de chromatographique optimale, soit un compromis entre le rendement, la pureté et la durée de l'opération. La mise à l'échelle a également été testée afin de vérifier Ia reproductibilité du procédé dans des conditions représentatives des conditions industrielles.
Les différents paramètres de la chromatographie ont été testés et optimisés. Trois hauteurs de lit (10 cm, 18,5 cm et 20 cm) ainsi que quatre diamètres (de 1,6 cm à 14 cm) ont été testés. Les valeurs de
18,5 cm de hauteur et de 14 cm de diamètre ont été préférées pour l'échelle de production envisagée.
Résine : résine hydrophobe, billes de 65 um non-calibrées. Cette résine a été choisie lors du criblage et placée en étape de polissage au vu de sa capacité de fixation réduite comparée à la Capto Q.
Charge : les conditions physicochimiques de l'étape de charge de la résine sont un pH de 8,5 et une concentration de 2,6 M en NaCl; des valeurs de 2,2, 2,4, 2,8 et 3M ont été testées. Ces conditions permettent à la protéine d'exposer les groupements hydrophobes nécessaire pour la fixation à la résine (mode positif), tout en évitant la fixation de certains pigments et protéines de l'hôte.
Différents ratios ont été testés, tels que 0,5 g/l et 1,5 g/l. Le ratio de charge a été fixé 0,8 g/L (très légère surcharge) afin de maintenir un haut rendement de purification. Plusieurs débits ont été testés, tels que 60 cm/h et 150 cm/h.
Lavage : l'étape de lavage consiste en un lavage prolongé de 15
CV à pH 85 et à une concentration de 26 M en NaCl afin de déstabiliser l'accroche de la LivK tout en minimisant le décrochage de la SEQ ID NO:1 ; ce tampon va parfois comprendre 0,15% (w:v) de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ; voir ci-dessous. Les mêmes concentrations en NaCl et débits que pour Ia charge ont été testés. Quatre volumes de lavages ont été testés : 5 CV, 10 CV, 15 CV et 20 CV. 15 CV offre le meilleur résultat.
Elution : cette étape a pour but de décrocher la protéine d'intérêt tout en minimisant la co-élution des impuretés fixées sur la résine.
Parmi les différentes conductivités testées, une élution isocratique à
DH 8,5 et avec un fort saut de conductivité a été retenue car elle permet une élution d'un volume faible (1 CV), ce qui a eu un impact positif sur la pureté de la SEQ ID NO:1 mais également sur Ia durée de la chromatographie et de l'étape suivante d'ultrafiltration. En pratique, de nombreuses solutions d'élution ont été testées, de 155 mS/cm à moins de 60 MS/cm.
Grâce à cette étape, les inventeurs ont réussi à augmenter la pureté de la SEQ ID NO :1 à 98% ; SDS PAGE avec dilutions successives de 2 en 2 des échantillons, coloration de l'ensemble des protéines. Un rendement de 77% de récupération de SEQ ID NO :1 a été obtenu dans les meilleures conditions.
Mise à l'échelle : la mise à l'échelle de la séquence de purification a été étudiée sur différents types de supports (colonnes HiScale et
Axichrom) pour différentes géomértries de lit (hauteur du lit de résine, diamètre de colonne), mais également avec différentes techniques de packing (Dynamic Axial Compression, incrémentation du débit de consolidation). La hauteur de la résine a été déterminée à 18,5 cm pour un diamètre de 14 cm, soit un volume de résine de 2,846 L, permettant de traiter l'équivalent de la production de 5 L de culture issue d'un bioréacteur en deux sous-lots. La méthode de packing choisie consiste à utiliser un très haut débit constant (-450 cm/h) au cours de l'étape de consolidation en utilisant de l'eau comme phase mobile. Ce protocole permet d'obtenir des critères de performance (résolution et asymétrie) répondant aux critères du fabriquant pour cette résine. Cependant, le scale-up ne permet pas de conserver un débit opérationnel de 150 cm/h : ce dernier a été abaissé à 60 cm/h afin d'éviter l'effondrement du lit de résine lors du passage des solutions à fortes concentrations salines.
Dans le but de formuler la protéine, des membranes d'ultrafiltration de différentes porosités (30, 50 et 70 kDa) ont été testées.
La première étape du procédé d'ultrafiltration consistait à concentrer la protéine d'intérêt à environ 4,5 mg/mL et la seconde étape à diafiltrer le rétentat de concentration contre un volume 10 fois plus important de tampon de formulation. La fibre creuse de 30 kDa a été retenue pour ses meilleures capacités de rétention de la protéine d'intérêt (SEQ ID NO :1).
Le débit opérationnel fixé à 20 L/m2/h est appliqué tout au long de la méthode car il limite le facteur de cisaillement lors de la méthode.
Une fibre creuse de 0,16 M2 permet la formulation d'une quantité de protéine équivalente à 5 L de culture en bioréacteur sur une durée de 3 à 4h.
Elimination des endotoxines (lors de l'étape de lavage des colonnes chromatographiques ; déjà mentionné ci-dessus).
Les résultats ont permis de démontrer une bonne efficacité dans l'élimination des endotoxines pour au moins 3 conditions testées :
Capto Q ; implémentation d'une étape de lavage au
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther 0,15% v/v après la charge et divisée en 3 étapes successives : 5CV de tampon (pH et conductivité, voir ci-dessus ; ex. entre 3,0 et 9,0 mS/cm). Cette étape a pour but d'éliminer la majorité des impuretés non-fixées sur la résine immédiatement après le chargement. 5 CV du même tampon + Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther1,5%. Le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther permet ici d'éliminer les endotoxines en les réduisant très fortement (<1
EU/Mg dans la fraction d’élution de la SEQ ID NO:1 comparé aux >1000 EU/mg sans lavage au Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther), soit une réduction de 3 Log, voire plus, par comparaison à la même étape sans ce détergent. De plus, l’utilisation de ce détergent ne perturbe pas l'accroche de la protéine d'intérêt sur la résine.
CV du même tampon, mais sans le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther. Cette étape permet l'élimination du 5 Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther. En pratique, l'élimination du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther est évaluée dans un pré-test de suivi de l'atosorbance, toutes conditions identiques, sauf la présence du Triton X-100 à la place du du
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, ce qui permet Un suivi à280nm.
Phenyl 650M ; similairement à la Capto Q : 5 CV de tampon à une conductivité élevée, ex. à 150-200 mS/cm et pH 8,5. Cette étape a pour but d'éliminer la majorité des impuretés non-fixées sur la résine immédiatement après le chargement. 5 CV de tampon à 150-200 mS/cm et pH 8,5 + Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther 1.5%. Le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther permet ici d'éliminer les endotoxines en les réduisant très fortement (<1 EU/mg dans la fraction d'élution de la
SEQ ID NO:1 comparé aux >1000 EU/mg sans lavage au
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther). De plus, l'utilisation de ce détergent ne perturbe pas l'accroche de la protéine d'intérêt sur la résine. 5 CV de tampon à 150-200 mS/cm et pH 8,5. Cette étape permet l'élimination du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther (pré- test avec suivi de | Absorbance à 280 nm ; cfr ci-dessus).
D'autres détergents ont été testés, tant pour la chromatographie par échange d'ions et la chromatographie par interaction hydrophobe, tels que le Brij 35, le Tween 20 ou le Tween 80 (plages testées : 0,016 à 3% ; w:v). Cependant ces détergents, soit éliminent moins bien les endotoxines, soit sont incompatibles avec un usage à grande échelle.
Les inventeurs ont également tenté une méthode alternative d'élimination des endotoxines par filtration sur matrice Mustang E: ce type de matrice contient dans son enrobage des groupements d'ammonium quaternaire ayant une forte affinité pour les endotoxines. La SEQ ID NO:1 n'a que peu, voire pas d'affinité avec ce type de support dans les conditions testées (pH, conductivité, débit). Cette étape montre la même efficacité d'élimination des endotoxines lorsqu'elle est placée après la formulation par ultrafiltration ou après la purification sur Capto Q (16 EU/Mg après filtration) sans affecter significativement le rendement de purification. Un filtre de 10 ML permet de traiter une quantité de produit purifié équivalente à 5 L de culture en bioréacteur. Cette alternative n'est toutefois pas aussi efficace que l'usage du
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther mais peut être utilisée en complément.
Claims (21)
1. Une methode de purification en endotoxines d'une biomolécule d'intérêt à partir d'une culture de bactéries comprenant les étapes suivantes : - un conditionnement de ladite biomolécule d'intérêt dans une solution et - une étape de chromatographie dans laquelle (i) ladite biomolécule d'intérêt est fixée sur Un support, (ii) ladite biomolécule d'intérêt fixée sur le support est lavée avec une solution comprenant du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, puis oU ladite biomolécule d'intérêt fixée sur le support est lavée avec une solution dépourvue de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther et (ii) ladite biomolécule d'intérêt fixée sur le support est éluée, ladite biomolécule d'intérêt étant de l'ADN ou de l'ARN, ou une protéine et dans laquelle ladite étape de fixation sur le support est réalisée sans Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, dans laquelle un volume de la solution de lavage comprenant le Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther compris entre 3 et 20 volumes de colonne sont appliqués sur ledit support.
2. La méthode selon la revendication 1 dans laquelle un volume de la solution de lavage avec une solution dépourvue de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther compris entre 3 et 10 volumes de colonnes sont appliqués avant l’'élution.
3. Une méthode de purification d'une protéine d'intérêt à partir d'une culture de bactéries qui comprend ladite protéine d'intérêt, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : (a) UN conditionnement de ladite protéine d'intérêt dans une solution, (b) Une série d'étapes de purification pour récupérer ladite protéine d'intérêt dans une première fraction à conserver et des contaminants dans une ou plusieurs fractions à éliminer, lesdits contaminants comprenant des endotoxines, caractérisée en ce que l'élimination des endotoxines comprend une étape d'additon d'une solution comprenant du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther, dans laquelle la série d'étapes de purification comprend une chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et/ou une chromatographie d'interaction hydrophobe.
4. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon la revendication 3 comprenant une chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et une chromatographie d'interaction hydrophobe.
5. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon la revendication 4, dans laquelle une première chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions et ensuite une deuxième chromatographie d'interaction hydrophobe sont pratiquées, lesdites première chromatographie et deuxième chromatographie comprenant chacune une étape de charge, une étape de lavage et une étape d'élution.
6. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3 à 5, dans laquelle l'élimination des endotoxines est réalisée pendant l'étape de lavage de la première chromatographie et/ou de la deuxième chromatographie.
7. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3 à 6, dans laquelle l'élimination des endotoxines est réalisée au moyen d'une concentration en Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther comprise entre 0,01% et 1% (wv), de préférence entre 0,05 et 0,5% (w:v), de manière favorable de 0,1 à 0,2% (w:v), telle que environ 0,15% (w:v).
8. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3 à 7, dans laquelle l'élimination des endotoxines de la première chromatographie et/ou de la deuxième chromatographie est réalisée avec un volume compris entre 1 et 10 fois le volume de la colonne, de préférence un volume d'environ 5 fois le volume de la colonne.
9. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3 à 8, dans laquelle la protéine d'intérêt est SEQ ID NO:1.
10. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3à9, dans laquelle la protéine d'intérêt est sécrétée dans l’espace périplasmique d'une bactérie Gram-négatif.
11. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3 à 10, dans laquelle la chromatographique par capture sur une résine échangeuse d'anions possède un échangeur fort.
12. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon l'une quelconque des revendications précédentes 3 à 11, dans laquelle la chromatographie par interaction hydrophobe est de type phényle.
13. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon la revendication 12 dans laquelle l'étape de charge et/ou de lavage de la chromatographie sur support hydrophobe est réalisée à un pH compris entre 8 et 9 et/ou en présence d'une concentration en sels comprise entre 2 et 3 M et/ou présente Un rapport de charge compris entre 01 g/L et 5 g/L, préférentiellement entre 0,3 et 2 g/L.
14. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle l'étape d'élution de la chromatographie par interaction hydrophobe est réalisée avec une solution de conductivité électrique inférieure à 105 mS/cm, de préférence moins de 80 mS/cm et/ou de plus de 40 mS/cm.
15. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon une quelconque des revendications précédentes 3 à 14, dans laquelle l'étape de charge de la chromatographie d'échange d'anions est réalisée à Un ratio de charge compris entre 2,5 et 3,5 g/L (poids des protéines : volume) et/ou dans laquelle l'étape d'élution est réalisée en utilisant une solution de conductivité électrique supérieure au double de celle utilisée lors de l'étape de charge et/ou de lavage.
16. La méthode de purification d'une protéine d'intérêt selon une quelconque des revendications précédentes 3 à 15 comprenant en outre une étape de passage sur une membrane échangeuse d'anions de type Mustang® Q, Mustang® EouSartobind® Q ou Sartobind® STIC.
17. La méthode selon une quelconque des revendications précédentes 3 à 16 comprenant en outre une étape de filtration stérilisante.
18. Utilisation de Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther pour l'élimination des endotoxines d'une composition, dans laquelle la teneur en endotoxines (EU) a été réduite à 20%, de préférence à 10%, à 5%, à 2%, de manière favorable égale ou inférieure à 1% par rapport à une quantité en EU initiale.
19. Utilisation selon la revendication 18, dans laquelle la composition comprenant des endotoxines à éliminer comprend en outre une biomolécule d'intérêt choisie parmi l'ADN (plasmide), l'ARN(m) et un peptide, de préférence un peptide.
20. Utilisation selon la revendication 18 ou 19, dans laquelle la composition est pour utilisation pharmaceutique, de préférence pour la vaccination, tele que la vaccination thérapeutique.
21. Utilisation d'une solution de lavage ayant un pH compris entre 8,0 et 9,0 et une concentration en sels de 2,5 M à 3 M pour le relargage spécifique de contaminants bactériens de colonnes d'une chromatographie sur support hydrophobe sur groupement phényle dans laquelle la solution de lavage comprend en outre du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20220926 |
|
| HC | Change of name of the owners |
Owner name: SARTORIUS XPRESS BIOLOGICS; BE Free format text: DETAILS ASSIGNMENT: CHANGE OF OWNER(S), CHANGE OF OWNER(S) NAME; FORMER OWNER NAME: XPRESS BIOLOGICS Effective date: 20250404 |