BE1029458B1

BE1029458B1 - Complexe pluri-ionique pour la prévention ou le traitement de l'inflammation neurogène

Info

Publication number: BE1029458B1
Application number: BE20215448A
Authority: BE
Inventors: Jean-François Plucker; Wesepoel Philippe Van
Original assignee: Olys Pharma
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2023-01-09
Also published as: JP2024520753A; WO2022254042A1; DK4346847T3; PT4346847T; PL4346847T3; CN117479948A; EP4346847A1; ES3047741T3; BE1029458A1; US20240261323A1; EP4346847B1

Abstract

L’invention concerne un complexe pluri-ionique synergique bioactif apportant des réponses thérapeutiques potentialisées à l'inflammation neurogène, notamment, au niveau du système Neuro-Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE). Il s’agit d’une composition comprenant, des sels minéraux, dont au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium, caractérisée par les ratios molaires suivants: lithium 1 – magnésium [0.15 – 0.30] – potassium [1.55-1.75]. La composition selon l’invention peut également contenir d’autres sels minéraux, des additifs et/ou excipients. Elle peut être utilisée comme médicament, dispositif médical ou agent cosmétique, de préférence par voie topique, pour la prévention et/ou le traitement de l'inflammation neurogène, associée à des pathologies aigues ou chroniques telles des douleurs neuropathiques (diabétiques ou consécutives à un traitement médical), des cicatrices douloureuses, une peau atopique, des maladies cutanées auto-immunes, au pied diabétique et/ou aux plaies (de brulures, chirurgicales ou autres).

Description

Complexe pluri-ionique pour la prévention ou le traitement de l'inflammation neurogène Domaine de l’invention

L’invention s’inscrit dans le domaine d’une réponse thérapeutique pour prévenir et / ou traiter l'inflammation neurogène en restaurant l'homéostasie cellulaire, notamment au sein du système Neuro-Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE) (Douleurs Evaluation - Diagnostic - Traitement (2010) 11, 120- 130)/ Cell Proliferation (2019) 52: e12677). Contexte Lorsqu’une cellule subit des dommages ou est soumise à un stress (d'origine psychique, métabolique, chimique...) il s’en suit une déplétion en magnésium intracellulaire Mg?*, avec des concentrations pouvant chuter de 40 à 60% dans le cas de dommages (Neuropsychiatric Disease and Treatment 2017 :13 275-302). Or, de faibles fluctuations de la concentration intracellulaire de Mg?2t peuvent impacter les processus cellulaires.

La dysrégulation du Mg2t est fréquemment observée chez les patients souffrant de diabète, de maladies neurodégénératives ainsi que de syndrome métabolique… (Magnesium Is a Key Player in Neuronal Maturation and NeuropathologyInt.

J.

Mol.

Sci. 2019, 20, 3439). Le magnésium agit comme cofacteur dans plus de 300 réactions enzymatiques où il est crucial pour le métabolisme de l'adénosine triphosphate (ATP), source d'énergie (Magnesium in Prevention and Therapy Nutrients 2015, 7). Le magnésium a de puissants effets anti-oxydants, anti- nécrotiques et anti-apoptotiques.

Mg? est lui-même largement cytoprotecteur, cardioprotecteur et neuroprotecteur contre un large éventail d'insultes (Neuropsychiatric Disease and Treatment 2017:13 275-302). Le magnésium, quatrième élément minéral le plus présent dans le corps, joue également un rôle essentiel dans la transmission nerveuse et la conduction neuromusculaire. Des niveaux faibles en magnésium sont associés à une élévation de la neurotransmission glutaminergique, menant à un environnement favorable à l'excitotoxicité, qui peut entraîner un stress oxydatif et la mort des cellules neuronales. Ce processus est impliqué dans plusieurs désordres neurologiques, comme la douleur chronique (The Role of Magnesium in Neurological Disorders, Nutrients, 2018, 10,730).

Un déficit en magnésium impacte négativement l’indice de résistance à l'insuline (HOMA-IR). Le magnésium est aussi essentiel pour la synthèse protéique, et notamment, la synthèse de l’ADN et de l’ARN (Magnesium in Prevention and Therapy, Nutrients, 2015, 7). Il régule les flux transmembranaires du potassium et du calcium.

Basé sur des expériences dans lesquelles les animaux sont privés de lithium, le lithium est considéré comme un nutriment essentiel au fonctionnement du corps humain. Contrairement à d'autres ions biologiquement actifs, la concentration en lithium dans les fluides d'animaux pluricellulaires n'est pas étroitement régulée. Sa concentration peut varier largement.

Le lithium, tout en ayant une forte activité biologique, est toléré à des concentrations de liquide corporel très variables. L'absence de régulation biologique du lithium semble due à l'absence de sites de liaison spécifiques au lithium et de filtres de sélectivité. Le lithium exerce donc plutôt sa myriade d'effets physiologiques et biochimiques en rivalisant avec d’autres éléments pour des sites macromoléculaires relativement spécifiques d'autres cations, plus particulièrement le sodium et le magnésium (Towards a unified understanding of Lithium action, Topical Review, 2017, 586).

Le lithium et le magnésium possèdent des rayons ioniques similaires (0,60 et 0,65 À, respectivement) et des propriétés physico-chimiques similaires leur permettant de rivaliser avec succès pour se lier à plusieurs sites d'enzymes magnésium dépendants (Lithium: the pharmacodynamic actions of the amazing ion Ther. Adv. Psychopharmacol. (2013) 3(3) 163-176). Ces rayons ioniques permettent au lithium et au magnésium de traverser aisément les membranes cellulaires.

Ll’ion Lit active les mécanismes de survie et de récupération comme l'inhibition de l'inositol monophosphatase (IMPase) / inositol polyphosphate 1-phosphatase (IPPase, la glycogène synthase kinase 3 (GSK-3))… Le lithium produit ainsi de remarquables réponses protectrices, anti-apoptotiques, anti- anoxiques, de plasticité cellulaire et de résilience. (A fully integrated new paradigm for lithium’s mode of action — lithium utilizes latent cellular fail-safe mechanisms - Neuropsychiatric Disease and Treatment 2017:13 275-302).

La glycogène synthase kinase 3 (GSK-3) cible du lithium est une sérine / thréonine kinase, qui joue un rôle de régulateur du métabolisme cellulaire chez les mammifères. Elle régule la neurogenèse, la polarisation neuronale et la croissance des axones dans le système nerveux central en développement. Elle est constitutivement active dans tous les tissus (Role of glycogen synthase kinase-3b in ketamine induced developmental neuroapoptosis in rats - British Journal of Anaesthesia 110 (Sl): 13-19 (2013)).

Le lithium inhibe la GSK-3, donc améliore l'activité du BDNF (brain-derived neurotrophic factor) comme montré in vitro et in vivo.

Le rôle du lithium dans l'augmentation de l'expression du BDNF plus le rôle du BDNF dans la survie des neurones a conduit à suggérer que le lithium joue un rôle dans le traitement des maladies neurodégénératives.

La voie de signalisation Wnt est impliquée dans les maladies neurodégénératives et le cancer.

Il a été démontré que l'inhibition de la GSK-3 par le lithium inhibe spécifiquement la voie de signalisation Wnt (Towards a unified understanding of Lithium action, Topical Review, 2017, 586). Le traitement préventif au lithium, par l’inhibition de la GSK3B, prévient l’augmentation de l’activité de la GSK38 induite par le taxol chez des rats, celle-ci réduisant simultanément Iles activités AKT (protein kinase B) et mTOR (mechanistic target of rapamycin), ce qui empêche le développement de la douleur neuropathique induite par le taxol (Inhibition of glycogen synthase kinase 3beta activity with lithium prevents and attenuates paclitaxel-induced neuropathic pain Neuroscience. 2013 December 19 ; 254). Le lithium possède des propriétés anti-inflammatoires qui induisent la réduction à la fois des cytokines pro- inflammatoires et de l'interleukine TNF-alpha.

D’autre part, le lithium régule la biosynthèse de différents neurotransmetteurs et / ou récepteurs associés tels la sérotonine et le glutamate.

Le lithium a un effet anti-allodynie ainsi qu'un effet stimulant sur la production de bêta-endorphine cérébrale, un agoniste MOR présentant de fortes propriétés analgésiques. (Lithium reverses mechanical allodynia through a u opioid-dependent mechanism Molecular Pain 2018 Volume 14: 1-8) Le lithium contribue également à l'homéostasie calcique et blogue l'activation calcium dépendante des voies de signalisation pro-apoptotiques qui confirme son action cyto- protectrice (Molecular actions and therapeutic potential of lithium in preclinical and clinical studies of CNS disorders Pharmacol Ther. 2010 November ; 128(2): 281-304).

5 De par le fait que l’ion Lit inhibe l’enzyme GSK-3 qui est une enzyme importante au carrefour de plusieurs systèmes de signalisation, il a un impact sur de multiples cibles en aval, notamment : la signalisation du glutamate ionotrope, de multiples facteurs de transcription et la voie d'intégration liée au Wingless (Wnt) / B caténine. La signalisation Wnt joue un rôle dans les processus cérébraux structurels tels que le développement neuronal, la formation de synapse et la plasticité neuronale. (LITHIUM IN THE TREATMENT OF BIPOLAR DISORDER: PHARMACOLOGY AND PHARMACOGENETICS Mol Psychiatry. 2015 June +; 20(6) : 661-670). Le complexe à deux métaux-phosphate ATP-Mg-Li se forme aux concentrations normales d'ATP et de Mg2+ trouvées dans le plasma ou le cytoplasme. De plus, des niveaux d'ATP élevés correspondant à une activité biologique ou en réponse au stress dans le cytoplasme, les organites (par ex : mitochondries), et la matrice extracellulaire servent de réservoirs potentiels pour accumuler Li+. Le complexe à deux métaux-phosphate ATP-Mg-Li s’avère être la forme bioactive du lithium agissant par co- liaison avec Mg2+ à des phosphates possédant des ligands ou des cofacteurs de récepteurs ou des enzymes. Le complexe ATP-Mg-Li rend possible que Li + puisse agir en modulant la fonction normale de l’ATP en tant que ligand des récepteurs de purine de surface cellulaire, dont il existe deux sous-types: P2X, qui sont des canaux ioniques qui médient l'afflux de Ca2 + extracellulaire dans le cytoplasme, et P2Y, qui sont couplés aux protéines G récepteurs (GPCR) qui activent la deuxième voie messagère de l'inositol trisphosphate pour libérer du Ca2 + à partir des réserves intracellulaires, pour moduler la signalisation dans le système nerveux central et la périphérie. (A Molecular Model for Lithium’s Bioactive Form - Biophysical Journal 111, 294-300, July 26, 2016).

Le potassium est également un élément essentiel. C'est le cation le plus abondant dans le liquide intracellulaire, où il joue un rôle clé dans le maintien de la fonction cellulaire, en particulier dans les cellules excitables telles que les muscles et les nerfs. Une déficience en potassium est associée à une intolérance au glucose et au diabète. L’interaction du K+ avec le Na+ extracellulaire augmente l'énergie d'activation pour le mouvement de l'eau favorisant les échanges et équilibres ioniques, notamment ceux du lithium (Potassium Intake, Bioavailability, Hypertension, and Glucose Control Nutrients 2016, 8, 444). Des dérégulations de l’activité de ces trois ions sont impliquées dans l'inflammation neurogène notamment au niveau du système Neuro-Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE). L'inflammation neurogène est associée aux douleurs neuropathiques ( douleurs neuropathiques périphériques diabétiques, douleurs neuropathiques consécutives à un traitement médical oncologique), à la douleur musculosquelettique (douleur dans le bas du dos, fibromyalgie, ostéoarthrite, syndrome douloureux régional complexe), à la douleur orofaciale, à la douleur post- herpétique, à la rosacée, au psoriasis, à la dermatite atopique, au prurigo noduralis, à l’urticaire, aux cicatrices douloureuses ou non (cicatrices de brûlures, chirurgicales…), au pied diabétique (sécheresse - callosités — ulcères) et aux plaies entre autres. Ces dérégulations sont impactantes individuellement et en conjonction.

Une approche équilibrée simultanée se justifie afin d’apporter une réponse thérapeutique à l'inflammation neurogène notamment au niveau du système Neuro-Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE) et ses répercussions physiologiques telles l’hyperkératose, la xérose, la desquamation, la plaie, et, les sensations de brûlure, de décharges électriques, de fourmillements, de démangeaisons ainsi que la douleur périphérique au niveau neuro-cutané, entre autres...

Solution de l’invention L’invention concerne un complexe pluri-ionique synergétique bioactif apportant des réponses biologiques potentialisées à l'inflammation neurogène notamment au niveau du système Neuro- Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE).

Il s’agit d’une composition pluri-ionique comprenant, des sels minéraux, dont au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium, caractérisée par les ratios molaires suivants : lithium 1 - magnésium [0.15 - 0.30] - potassium [1.55-1.75].

De préférence, les ratios molaires sont lithium 1 - magnésium [0.18 - 0.25] - potassium [1.58-1.72], de préférence encore les ratios molaires sont lithium 1 - magnésium [0.20 - 0.24] — potassium [1.61-1.70].

Un sel minéral selon l’invention désigne un sel ne comprenant pas de carbone, à l’exception des sels de carbonates.

Ce complexe pluri-ionique bioactif est constitué d'une combinaison inédite « magnésium - lithium - potassium » selon un algorithme spécifique de ratios molaires. L’adaptation de l’un des composants, en fonction de la réponse thérapeutique à l'inflammation neurogène notamment au niveau du système Neuro-

Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE), entraîne l’adaptation proportionnelle des concentrations des deux autres éléments. Cette combinaison inédite algorithmique vise, notamment par une application topique, simultanément à briser le cercle vicieux pro-inflammatoire qui s’auto-alimente, à restaurer une homéostasie cellulaire en ces ions que l’on retrouve altérée dans de nombreuses pathologies, à favoriser une compétition dynamique pour les sites de fixation de ces ions afin d’obtenir des réponses physiologiques correctrices (enzymatiques, métaboliques, neurotransmissions…), et à engendrer une réponse synergique potentialisée qui va renforcer la réponse cellulaire face à Jl’insulte afin de gérer 1l'inflammation neurogène rapidement et de manière durable, notamment au niveau du système Neuro-Immuno-Cutanéo-Endocrinien (NICE) sous-jacente aux altérations neuro-immuno-cutanéo-endocriniennes. Son action favorise le rétablissement de l’homéostasie altérée par l'inflammation neurogène, notamment celle du magnésium et sa forme ionique Mg”, dont les concentrations peuvent être impactées de manière considérable, et contribue à rétablir un fonctionnement physiologique cellulaire optimal, améliorer le métabolisme cellulaire et restaurer les {fonctions cyto- protectrices aux niveaux cutané et neuro-cutané, ainsi que l’activité anti-apoptose au niveau neuronal.

Son action favorise le rééquilibrage en potassium et restaure son rôle clé dans le maintien de la fonction cellulaire, notamment dans les cellules excitables telles les cellules nerveuses. De plus, il favorise l’interaction du potassium avec le sodium, sous forme ionique Kt avec Nat extracellulaire et augmente les mouvements liquidiens favorisant les échanges et équilibres ioniques, notamment ceux du lithium. Le Lithium présentant en effet une forte activité biologique, comme il n’a pas de système propre chargé de réguler sa concentration qui peut varier de manière importante dans les liquides intra et extra-cellulaires, son apport externe doit être adapté en fonction du besoin thérapeutique, coordonné et pondéré.

Le complexe pluri-ionique bioactif met en présence du lithium, du magnésium et potassium, qui exercent leurs multiples effets physiologiques et biochimiques, décrits plus haut.

Le lithium allie à ses propriétés anti-inflammatoires importantes des actions régulatrices de la biosynthèse de neurotransmetteurs tels la sérotonine et le glutamate, un effet stimulant sur la production de bêta-endorphine cérébrale réduisant la douleur.

Lithium et magnésium sont liés. Le complexe à deux métaux- phosphate ATP-Mg-Li s’avère être la forme bioactive du lithium agissant par co-liaison avec Mg2+ à des phosphates possédant des ligands ou des cofacteurs de récepteurs ou des enzymes. Ce complexe à deux métaux-phosphate se forme aux concentrations normales d'ATP et de Mg2+ trouvées dans le plasma ou le cytoplasme. De plus, dans des situations de stress qui vont élever les niveaux d'ATP dans le cytoplasme, les organites tels les mitochondries, la matrice extracellulaire vont servir de réservoirs potentiels pour accumuler Lit.

De préférence, le lithium est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0.01 et 100 mmol/kg, de préférence entre 0.1 et 50 mmol/kg, de préférence entre 0.5 et 20 mmol/kg, de préférence entre 1 et 10 mmol/kg, de préférence entre 1.1 et 5 mmol/kg.

Dans le cadre d’une application topique, la composition de l’invention, vise simultanément à restaurer une homeostasie cellulaire en ces ions, notamment Mg2+, à {favoriser une compétition dynamique pour les sites de fixation, et à engendrer une réponse synergique potentialisée.

De préférence, la composition aqueuse de l’invention a un pH compris entre 6.0 et 7.5. Le pH est ajusté, si besoin à l’aide de solutions tampons, afin que, en fonction du vecteur d’application topique, qu’il s’agisse d’eau sous forme de spray par exemple, ou d’un gel, crème ou gel-crème, voire un autre vecteur.

Ce pH visera idéalement une acidité modérée de l’ordre de 6,5 + 7,5 afin d’optimiser la pénétration ionique cellulaire et transmembranaire.

La composition de l’invention concerne la prévention et/ou le traitement de l'inflammation neurogène, et notamment au niveau du système Neuro-Immuno-Cutanéo-Endocrinien.

L'inflammation neurogène est associée aux douleurs neuropathiques (douleurs neuropathiques périphériques diabétiques, douleurs neuropathiques consécutives à un traitement médical), à la douleur musculosquelettique (douleur dans le bas du dos, fibromyalgie, ostéoarthrite, syndrome douloureux régional complexe), à la douleur orofaciale, à la douleur post-herpétique, à la rosacée, au psoriasis, à la dermatite atopique, au prurigo noduralis, à l’urticaire, aux cicatrices douloureuses ou non (cicatrices de brûlures, chirurgicales…), au pied diabétique (sécheresse - callosités - ulcères) et aux plaies entre autres.

En effet, ce complexe pluri-ionique bioactif « magnésium - lithium —- potassium » selon l’invention apporte une réponse thérapeutique ajustable aux répercussions physiologiques et cytologiques des pathologies neuro-cutanées, telles que l’hyperkératose, la xérose, la desquamation, la plaie…, au niveau cutané, telles les sensations de brûlure, les décharges électriques, les fourmillements, les démangeaisons ainsi que la douleur périphérique au niveau neuro-cutané, entre autres… De préférence, la composition de l’invention est destinée à la prévention et/ou au traitement de l'inflammation neurogène cutanée en restaurant l'homéostasie du système Neuro-Immuno- Cutanéo-Endocrinien par voie topique.

Au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium signifie que ces espèces sont présentes sous forme ioniques dans l’eau. Les cations Li+, Mg2+ et K+ sont associés à un ou plusieurs anions, c’est-à-dire qu’ils peuvent provenir de sels mixtes et/ou chacun d’un sel différent.

Avantageusement, le lithium est introduit dans la composition sous forme de chlorure de lithium, d’hydroxyde de lithium, de carbonate de lithium et/ou tout autre sel minéral pharmaceutiquement acceptable.

De préférence, pour une utilisation topique, la composition comprend du chlorure de lithium.

Avantageusement, le magnésium est introduit dans la composition sous forme de chlorure de magnésium, de carbonate de magnésium, d’hydroxyde de magnésium, d’oxyde de magnésium, de sulfate de magnésium, de silicate de magnésium et/ou tout autre sel minéral pharmaceutiquement acceptable.

De préférence, pour une utilisation topique, la composition comprend du chlorure de magnésium, sous forme éventuellement hydraté.

Avantageusement, le potassium est introduit dans la composition sous forme de chlorure de potassium, de bromure de potassium, de iodure de potassium, de phosphate de potassium, de carbonate de potassium, d’hydroxyde de potassium, de silicate de potassium et/ou tout autre sel minéral pharmaceutiquement acceptable. De préférence, pour une utilisation topique, la composition comprend du chlorure de potassium.

La composition de l’invention peut comprendre d'autres sels minéraux. La composition peut par exemple comprendre au moins un sel de silicium, de préférence un silicate comme le silicate de sodium (Na25Si03), éventuellement hydraté, le silicate de potassium et/ou tout autre sel minéral pharmaceutiquement acceptable, notamment en application topidue.

Le Silicium est co-facteur de prolyl hydroxylase qui participe à la stimulation des fibroblastes. Il diminue la perméabilité des capillaires, a un effet anti-œdémateux, apaisant et rafraîchissant, raccourcit le temps d'apparition de la granulation dans les brûlures profondes notamment, accélère l'épidermisation et ainsi le processus de guérison.

Il joue un rôle dans la régulation du cycle cellulaire des lymphocytes qui affecte à terme la réponse immunitaire et inflammatoire.

Le silicium diminue le niveau d'expression dans les plaies de 1l'oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS), du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), du facteur de croissance des fibroblastes (FGF), du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur nucléaire kappa-amplificateur de la chaîne légère des cellules B activées (NF-xB), diverses cytokines (TNF-Q et IL-18).

Selon l'inflammation neurogène cutanée sous-jacente à la pathologie envisagée, la proportion du silicium par rapport aux autres sels est adaptée.

La composition peut par exemple comprendre au moins un sel de manganèse, comme du chlorure de manganèse, le sulfate de manganèse, le carbonate de manganèse, et/ou tout autre sel mineral de manganèse pharmaceutiquement acceptable, notamment en application topique. Le manganèse est impliqué dans la physiologie et la biologie des tissus nerveux via son rôle de cofacteur dans de nombreux processus enzymatiques. Il a également un effet bénéfique pour la cicatrisation via la modulation des intégrines engendrant l’accélération de la migration des kératinocytes. Le manganèse joue également un rôle essentiel dans la régulation de la tolérance au glucose en agissant en synergie avec le magnésium, ce qui permet notamment la réduction du stress métabolique nerveux et épidermique. La composition peut par exemple comprendre au moins un sel minéral d’argent, comme du nitrate d’argent pour ses propriétés antibactériennes, pour le traitement de plaies chroniques (ulcères, escarres), plaies aiguës (brûlures, plaies traumatiques, plaies chirurgicales etc…). La composition peut par exemple comprendre au moins un sel minéral de zinc, comme du citrate, de l’oroate, du sulfate de zinc. qui un rôle important dans de nombreux processus enzymatiques vitaux comme la synthèse de l'ADN et des protéines, la cicatrisation des plaies, le métabolisme de l'insuline, le développement et le bon fonctionnement du système nerveux...

La composition peut par exemple comprendre au moins un sel minéral de cuivre, comme du carbonate de cuivre. Le cuivre est le constituant de plusieurs enzymes, qui interviennent dans le métabolisme des glucides, des lipides et du fer. Il a un rôle antioxydant. Une composition topique est une composition destinée à être appliquée directement sur la partie du corps à traiter (curative ou préventive). Il peut s’agir de la peau. Il peut également s’agir d’une muqueuse, telle la muqueuse buccale. La composition de l’invention peut-être à usage cutané, i.e. destinée à l’usage externe sur la peau. De préférence, la composition se présente sous forme de crème ou de gel, c’est-à-dire qu’elle peut contenir les excipients nécessaires à la formation d’un gel ou d’une crème.

Les sels minéraux de la composition de l’invention sont dissouts dans de l’eau, c’est-à-dire que le solvant principal de la composition est de préférence de l’eau. L’eau représente au moins 50% en poids de la composition, de préférence au moins 75% en poids, au moins 80%, et de préférence encore au moins 90%. La composition peut comprendre d’autres ingrédients liquides, notamment pour favoriser l’absorption cutanée des sels minéraux, comme des substances grasses, émollientes, émulsifiantes, tensio-actives, de la glycérine, ou tout autre agent jugé utile par l’homme du métier.

La composition de l’invention peut également comprendre d’autres molécules, additifs ou excipients, par exemple des conservateurs, des antibiotiques, des agents stabilisateurs, des épaississants, des antioxydants. Ces additifs peuvent être utiles pour la conservation de la composition de l’invention, ainsi que pour la texture finale de la composition.

Par exemple, des gélifiants peuvent être utilisés pour formuler la composition sous forme de gel à étaler sur la peau. Pour une formulation sous forme de spray, la viscosité restera de préférence plutôt basse. La composition peut par exemple comprendre une ou des vitamines, comme de la vitamine E. La vitamine E est un antioxydant puissant et module la fonction immune.

L’invention concerne également une méthode de préparation de la composition comprenant les étapes de : - On ajuste le pH d’une solution aqueuse entre 6.5 et 7.5 ; — On ajoute à la solution aqueuse une ou plusieurs solutions concentrées comprenant au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium, pour obtenir les ratios molaires suivants : lithium 1 - magnésium [0.15 — 0.30] - potassium [1.55-1.75]. Lorsque la composition contient un sel de silicium, il est préalablement dissout dans une solution aqueuse isolée. Le pH de cette solution est ajusté, à l’aide de chlorure d’hydrogène par exemple, éventuellement tamponné par de l’hydroxyde de sodium par exemple, pour atteindre des valeurs comprises entre 6.5 et

7.5 et ensuite ajouté à la composition contenant du lithium, du magnésium et du potassium.

Une solution concentrée comprenant au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et/ou de potassium est de préférence concentrée 100 à 1000 fois par rapport à la concentration finale de la composition, de préférence 300 à 800 fois.

La limite de solubilité des sels utilisés détermine la concentration maximale potentielle de cette solution concentrée. L’utilisation d’une solution concentrée en minéraux permet d’éviter la re-précipitation de ces minéraux. Pour cela, l’ajustement du pH est essentiel.

L’invention concerne également une composition topique comprenant, dans de l’eau, au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium, caractérisée par les ratios molaires suivants : lithium 1 — magnésium [0.15 — 0.30] — potassium [1.55-1.75], pour un traitement par voie cutanée. La composition topique est de préférence une solution, un gel, une crème ou un spray.

L’invention concerne l’utilisation de la composition comme médicament, à usage humain ou vétérinaire.

Elle concerne également l’utilisation de la composition selon l’invention comme dispositif médical.

Elle concerne également l’utilisation de la composition selon l’invention comme cosmétique.

Le traitement par voie cutanée peut être la prévention ou le traitement des pathologies neuro-immuno-cutanéo-endocriniennes dans lesquelles intervient une inflammation neurogène.

Le traitement par voie cutanée peut être destiné à la réparation cutanée ou réparation des plaies, notamment des plaies de brûlures. Dans ce cas, la présence de silicium est souhaitée, car il confère un effet refroidissant, il permet de diminuer la perméabilité capillaire et de réguler le passage des médiateurs et cellules immunitaires pro inflammatoires, d’accélérer une granulation et une ré-épithélialisation structurée.

La composition topique de l’invention pour la réparation cutanée peut avantageusement être absorbée sur un pansement, conditionné de préférence de façon stérile.

L’invention sera mieux comprise à l’aide de la description suivante. Exemple 1 - Solution 1 concentrée en Sodium métasilicate 45 g de Sodium métasilicate pentahydraté (212 mmol ; CAS 10213- 79-3, VWR produit n° 28092) sont dissout dans 500 g d’eau pure (milliQ)pour donner la solution 1.

Exemple 2 - Solution 2 concentrée en lithium, magnésium et potassium

36.7 g de chlorure de lithium (866 mmol ; CAS 7447-41-8 ; VWR AnalaR NORMAPUR® Reag. Ph. Eur. pour analyses), 38.5 g de chlorure de magnésium hexahydraté (189,4 mmol ; CAS 7791-18-56, AMRESCO produit N° 0288)et 104.84 g de chlorure de potassium (1406 mmol ; CAS 7447-40-77 ; VWR Potassium chlorure GPR RECTAPUR® ) sont dissout dans 500 g d’eau pure (milliQ) pour donner la solution 2. Exemple 3 - Solution 3 concentrée en manganèse 550 mg de Manganèse (II) chlorure tétrahydraté (2.78 mmol ; CAS 13446-34-9, VWR NORMAPUR® ACS pour analyses) est dissout dans 500 g d’eau pure (milliQ) pour donner la solution 3. Exemple 4 - Solution 4 Dans un récipient, on introduit 10.05 kg de glycérine végétale,

2.01 kg de ethylhaxanoate de cétéaryle (MassocaremM CO), 1.00 kg d’émulsifiant MontanovmM L et 0.67kg de LipociremM A SG (Gattefossé) et on chauffe à 82 °C.

Exemple 5 - Composition 1 Dans une cuve DUMEK de 100kg équipée d’agitation, on introduit

50.527 kg d’eau osmosée. On ajoute 72.76 g de solution 1 (soit

28.3 mmol d’élément Si). La solution est chauffée à 80 °C + 2°C et mise sous agitation. Pendant la montée en température de la solution, on ajuste le pH par ajout d’acide chlorhydrique concentré (5.9 g) pour atteindre un pH de 7.13.

On ajoute ensuite 68.71 g de la solution 2 (soit 87.5 mmol de Li, 19.1 mmol de Mg et 142.0 mmol de K) et 50.52g de solution 3 (soit 0.3 mmol de Mn) et on homogénéise.

On ajoute alors la solution 4 à 82 °C et on homogénéise.

On refroidit ensuite à 65 °C + 2°C et on ajoute 737 g de polylacrylate de sodium (Safit Care T SP) avant une ici une fonction d’épaississant puis on homogénéise.

On refroidit ensuite la solution à 55 °C, puis on introduit 670 g de diméthicone (Xiameter PMX 1503 Fluid) et on homogénéise. La diméthicone est utilisée ici pour son effet filmogène, réduisant la déshydratation et procurant un effet apaisant.

On introduit ensuite 804 g de Mikrokill* COS (Lonza) comme conservateur, puis on homogénéise.

On refroidit ensuite la solution à 27 °C et on ajoute 335 g de vitamine E acétate et on homogénéise pour obtenir 67.00 kg de la composition finale caractérisée par un pH de 6.1 et une densité de 1.018 (soit un volume 65.81L).

La concentration finale en éléments minéraux de la composition 1 (gel —- crème) est donc de :

- 0.42 mmol/kg de Si - 1.31 mmol/kg de Li - 0.28 mmol/kg de Mg - 2.12 mmol/kg de K —- 0.004 mmol/kg de Mn. Exemple 6 - Activité biologique Les propriétés neuroprotectrices préventives et curatives du complexe pluri-ionique bioactif ont été étudiés sur des cultures in vitro de neurones sensitifs. Les neurones sensitifs font partie du système nerveux périphérique. Leurs corps cellulaires sont situés dans les Ganglions Rachidien Dorsaux (« Dorsal Rooth Ganglia » D.R.G.) le long de la moelle épinière et vont émettre des prolongements jusqu’ aux extrémités les plus distales. Une des propriétés des neurones sensitifs est leurs capacités à régénérer leurs prolongements après section des nerfs. Cette propriété est liée à la présence des cellules de Schwann, cellules nourricières et myélinisantes du système nerveux périphérique qui libèrent des facteurs de croissances spécifiques pour la pousse des axones. Le modèle in vitro utilisé est une culture de neurones sensitifs myélinisés par les cellules de Schwann (Callizot et al.,2011, Exp Cell Res 317:2374-2383) . Ce modèle, miniaturisé en 96 puits, permet d’analyser les effets de molécules sur le développement des neurones sensitifs et sur la myélinisation des axones par les cellules de Schwann.

Protocole de la coculture de neurones sensitifs et de cellules de Schwann :

Des rats femelles ayant 15 jours de gestation ont été tués par luxation cervicale (Rats Wistar; Janvier Lab) et les fœtus ont été retirés de l'utérus.

Les DRG embryonnaires ont été prélevés et placés dans un milieu glacé de Leibovitz 15 (L15; PanBiotech, Réf P04-27055, Lot: 4590720) contenant 2% de Pénicilline- Streptomycine (PS; PanBiotech, ref: P06-07100, Lot: 2620121 ) et 1% d'albumine sérique bovine (BSA; PanBiotech, Réf: P06-1391100, Lot: H200403). Les DRG ont été dissociés par trypsinisation pendant 20 minutes (min) à 37 ° C (Trypsin EDTA 1X; PanBiotech, Ref: P10-023100, Lot: 3590720). La réaction a été stoppée par l'ajout du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM; PanBiotech, Réf: P04-03600, Lot: 4080720) contenant de la DNase I grade II (0,1 mg / ml; PanBiotech, Réf: P60-37780100, Lot: H181015) et 10% de sérum de veau foetal (FCS; Invitrogen, Réf: 10270106, Lot: 2232584). Les cellules ont ensuite été dissociées mécaniquement par 3 passages à travers une pipette de 10 ml.

Les cellules ont ensuite été centrifugées à 180 x g pendant 10 min à + 4 ° C sur une couche de BSA (3,5%) dans du milieu L15. Le surnageant a été jeté et les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un milieu de culture défini constitué de Neurobasal (Invitrogen, Réf: 21103049, Lot: 2242402) supplémenté avec 2% de B27; (Invitrogen, réf: 17504-044, Lot: 2234271), L- glutamine (2 mM; PanBiotech, Réf: P04-80100, Lot: 3301019), 2% de PS et 50ng / mL de NGF (Sigma, Réf: N1408, Lot: SLCG1641). Les cellules viables ont ensuite été comptées dans un cytomètre Neubauer en utilisant le test d'exclusion au bleu trypan.

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 12000 cellules / puits dans des plaques à 96 puits (pré-enduites de poly-D-lysine; Greiner, Réf: 655940, Lot: E20093UL) et ont été cultivées à 37 ° C dans un air humidifié (95%) / CO2 (5%) atmosphère.

La moitié du milieu a été changée tous les 2 jours avec du milieu frais.

Les cellules sont maintenues pendant 7 jours pour permettre la prolifération des cellules de Schwann et des neurones sensoriels.

Au jour 8, le milieu est supplémenté avec 50 ug / mL d'acide ascorbique (AA; Sigma, Réf 092902, Lot: 05316HJ-438) afin d'initier la différenciation des cellules basales de Schwann en cellules de Schwann myélinisantes.

Dans ces conditions, après 5 jours de culture avec AA, les gaines de myéline sont détectées avec un anticorps anti-MAG (Myelin antigen glycoprotein), un marqueur précoce de la myéline.

A. Étude des propriétés neuroprotectives d'un complexe multi- ionique, à 3 concentrations différentes sur des neurones sensitifs myélinisés après intoxication par du Cisplatine : protocole curatif (Mai 2021) Le but de cette étude est d’évaluer l’effet neuro protecteur d'un complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes après intoxication à du cisplatine de neurones sensitifs myélinisés en culture. Dans cette culture, le complexe pluri- ionique sera incubé en même temps que le cisplatine.

A.1. Protocole A.1.1. Préparation, exposition et traitement médicamenteux au cisplatine: protocole curatif Du dichlorure de cis-diammineplatine (II) (cisplatine; Sigma, réf: P4394, lot: MKCLO026) a été reconstitué dans du milieu à 10 mg / ml (solution mère). Le milieu témoin a été préparé dans les mêmes conditions. Après 12 jours de culture avec AA, les neurones sensoriels primaires ont été traités pendant 24 heures avec un complexe multi-ionique à 3 concentrations, préalablement déterminées, en présence ou en l'absence d'intoxication au cisplatine. La préparation de cisplatine a été utilisée sur des neurones à une concentration finale de 12 uM diluée dans du milieu témoin pendant 24h d'incubation. Le complexe multi-

ionique est décliné à 3 concentrations différentes dans de l’eau:

1. KY21400 : Li 10,37 mmol/kg, Mg 2,27 mmol/kg, K 16,88 mmol/kg

2. KY21310 : Li 5,76 mmol/kg, Mg 1,26 mmol/kg, K 9,38 mmol/kg

3. KY21200 : Li 1,73 mmol/kg, Mg 0,38 mmol/kg, K 2.81 mmol/kg Les conditions suivantes ont été testées : + Milieu de contrôle * Contrôle + cisplatine (12uM, 24h) * Complexe multi-jonique décliné à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 ou KY21200 + cisplatine (12uM, 24h) + Complexe multi-ionique décliné à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 ou KY21200 Une culture a été réalisée avec 6 puits par condition.

A.1.2. Critère principal d'évaluation : mesure du nombre total de neurones sensoriels et évaluation de la longueur des neurites et de la gaine de myéline sur les neurones sensoriels après une intoxication au cisplatine et sans intoxication.

Après 24h de traitement en présence ou en absence de cisplatine, les cellules ont été fixées par une solution d'acide acétique / éthanol (5/95) pendant 5 min à -20 ° C, les conditions témoins ont également été fixées en suivant le même mode opératoire. Les cellules ont ensuite été perméabilisées et les sites non spécifiques ont été bloqués avec une solution de tampon phosphate salin (PBS; PanBiotech; ref: P04-36500, Batch: 2620121) contenant 0,1% de saponine (Sigma; ref: S7900, Batch: BCBL8667V) et 1% FCS pendant 15 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées avec un anticorps polyclonal anti-

neurofilament de lapin (NF; 1/500, Sigma; ref: N0142, Batch: 083M4833) et avec un anticorps monoclonal de souris anti-MAG (1/400, Sigma; ref: MAB1567, Batch : 3227322) dans une solution de PBS contenant 1% de FCS, 0,1% de saponine, pendant une nuit à 4 °C. Ces anticorps ont été révélés avec une IgG anti-souris de chèvre Alexa Fluor 488 (1/400, sonde moléculaire, réf: A11001, lot: 2247988) et une IgG anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 568 (1/400, sonde moléculaire, réf: A11011, lot: 2017252) dans du PBS avec 1% de FCS, 0,1% de saponine, pendant 1 heure à température ambiante. Les noyaux de cellules ont été marqués par un marqueur fluorescent (solution de Hoechst, Sigma; réf: H-33258, lot: 046M4048V) dans la même solution.

Pour chaque condition, 20 images par puit ont été prises à l'aide d'InCell AnalyzerTM 2200 (GE Healthcare) avec un grossissement de 20x. Les images de chaque puit de culture ont été prises dans les mêmes conditions. L'analyse a été réalisée à l'aide du logiciel Developer (GE Healthcare). Un total de 6 données par condition expérimentale a été fourni. A.1.3. Statistiques Les données ont été exprimées en moyenne + s.e. (sur 6 données par condition, 1 culture). Une analyse globale des données a été réalisée en utilisant une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suite au test de Dunnett. Le niveau de signification est fixé à p <0,05.

A.2. Résultats A.2.1. Effet du complexe multi-ionique sur la survie des neurones sensoriels

Le traitement avec complexe multi-ionique seul, aux 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200 pendant 24h ne module pas la survie cellulaire (respectivement 95%, 96% et 101% du témoin). Le cisplatine à 12 uM induit une diminution importante et significative de la survie des neurones sensoriels (61% de mort cellulaire avec p <0,001).

Le traitement avec complexe multi-ionique, aux 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200, pendant les 24h de lésion du cisplatine, est capable de prévenir partiellement et significativement la mort cellulaire des neurones (respectivement 32% avec p <0,05, 31% avec p <0,05 et 32% de cellules mortes avec p <0,05).

A.2.2. Effet des complexes multi-ioniques sur la longueur des neurites des neurones sensoriels Le traitement avec complexe multi-ionique, aux 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200 pendant 24h, induit une augmentation légère mais non significative de la longueur des neurites sur les neurones sensoriels (respectivement 31%, 34% et 54% du contrôle).

Le cisplatine à 12 UM induit une diminution significative de la longueur des neurites sur les neurones sensoriels (65% de perte de neurites avec p <0,01).

Un traitement avec complexe multi-ionique, aux 2 concentrations KY21310 et KY21200 est capable de préserver efficacement la longueur des neurites des neurones sensoriels des lésions du cisplatine pendant 24h (respectivement 19% avec p <0,05 et 11% de perte de neurites avec p <0,05).

Cependant, un traitement avec le complexe multi-ionique à la concentration KY21400 est capable de préserver partiellement mais pas de manière significative la longueur des neurites des neurones sensoriels de la lésion du cisplatine pendant 24h (28% de la perte de neurites). A.2.3. Effet du complexe multi-jonique sur la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels Le traitement avec complexe multi-ionique, aux 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200 pendant 24h ne module pas la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels (respectivement 89%, 97% et 89% du contrôle).

Le cisplatine à 12 UM induit une diminution significative de la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels (78% de la perte de myéline avec p <0,001).

Le traitement avec complexe multi-ionique, à 2 concentrations différentes KY21310 et KY21200 permet de préserver de manière significative la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels des lésions du cisplatine pendant 24h (respectivement 46% avec p <0,05 et 34% de perte de myéline avec p <0,01).

Cependant, le traitement avec le complexe multi-ionique KY21400 induit une augmentation légère mais non significative de la longueur de la gaine de myéline après une lésion du cisplatine pendant 24h (66% de la perte de myéline).

B. Effet neuroprotecteur d’un complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes sur les neurones sensoriels primaires myélinisés de rat après une lésion au cisplatine : protocole de protection (avril-mai 2021)

Le but de cette étude était d'étudier l'effet neuroprotecteur d'un complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes, après une lésion du cisplatine sur des neurones sensoriels myélinisés de rat. B.1. Protocole B.1.1. Préparation, exposition et traitement médicamenteux au cisplatine Du dichlorure de cis-diammineplatine (II) (cisplatine; Sigma, réf: P4394, lot: MKCLO026) a été reconstitué dans du milieu à 10 mg / ml (solution mère). Le milieu témoin a été préparé dans les mêmes conditions. Après 12 jours de culture avec AA, les neurones sensoriels primaires ont été prétraités pendant 2 heures avec un complexe multi-ionique à 3 concentrations puis intoxiqué par le cisplatine. La préparation de cisplatine a été utilisée sur des neurones à une concentration finale de 12 uM diluée dans du milieu témoin pendant 24h d'incubation. Les concentrations du complexe multi-ionique étaient :

1. KY21400 : Li 10,37 mmol/kg, Mg 2,27 mmol/kg, K 16,88 mmol/kg

2. KY21310 : Li 5,76 mmol/kg, Mg 1,26 mmol/kg, K 9,38 mmol/kg

3. KY21200 : Li 1,73 mmol/kg, Mg 0,38 mmol/kg, K 2.81 mmol/kg Les conditions suivantes ont été évaluées : « Milieu de contrôle + Contrôle + cisplatine (12uM, 24h) + Complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 ou KY21200 + cisplatine (12uM, 24h) + Complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 ou KY21200.

Cette étude a été réalisée avec 6 puits par condition et dupliquée pour validation des résultats. Les données reprises et analysées sont les résultats poolés des 2 études.

B.1.2. Critère principal d’évaluation : mesure du nombre total de neurones sensoriels et évaluation de la longueur des neurites et de la gaine de myéline sur les neurones sensoriels après une intoxication au cisplatine et sans intoxication Après 24h de traitement en présence ou en absence de cisplatine, les cellules ont été fixées par une solution d'acide acétique / éthanol (5/95) pendant 5 min à -20 ° C, les conditions témoins ont également été fixées en suivant le même mode opératoire. Les cellules ont ensuite été perméabilisées et les sites non spécifiques ont été bloqués avec une solution de tampon phosphate salin (PBS; PanBiotech; ref: P04-36500, Batch: 2620121) contenant 0,1% de saponine (Sigma; ref: S7900, Batch: BCBL8667V) et 1% de FCS pendant 15 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées avec un anticorps polyclonal anti- neurofilament de lapin (NF; 1/500, Sigma; ref: N0142, Batch: 083M4833) et avec un anticorps monoclonal de souris anti-MAG (1/400, Sigma; ref: MAB1567, Batch : 3227322) dans une solution de PBS contenant 1% de FCS, 0,1% de saponine, pendant une nuit à 4 °C. Ces anticorps ont été révélés avec une IgG anti-souris de chèvre Alexa Fluor 488 (1/400, sonde moléculaire, réf: A11001, 2247988) et une IgG anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 633 (sonde moléculaire 1/400, réf: A21070, Lot: 1700326) dans du PBS avec 1% de FCS, 0,1% de saponine, pendant 1 heure à température ambiante. Les noyaux de cellules ont été marqués par un marqueur fluorescent (solution de Hoechst, Sigma; réf: H-33258, lot: 046M4048V) dans la même solution.

Pour chaque condition, 20 images par puits ont été prises à l'aide d'InCell AnalyzerTM 2200 (GE Healthcare) avec un grossissement de 20x.

Les images de chaque puits de culture ont été prises dans les mêmes conditions.

L'analyse a été réalisée à l'aide du logiciel Developer (GE Healthcare). Un total de 6 données par condition expérimentale a été fourni pour chacune des 2 études.

B.1.3. Statistiques Les données ont été exprimées en moyenne + s.e. (sur 6 données par condition par culture pour 2 cultures). Une analyse globale des données a été réalisée en utilisant une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suite au test de Dunnett.

Le niveau de signification est fixé à p <0,05. B.2. Résultats B.2.1. Effet du complexe multi-ionique sur la survie des neurones sensoriels Un traitement par le complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200 pendant 24h ne module pas la survie cellulaire (respectivement 91%, 89% et 95% du témoin). Le cisplatine à 12 uM induit une diminution importante et significative de la survie des neurones (64% de la mort cellulaire avec p <0,0001). Le prétraitement par le complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200, deux heures avant et pendant les 24 heures de lésion du cisplatine, permet de sauver partiellement et de manière significative les neurones de la mort cellulaire (respectivement 35% avec p <0,0001, 30% avec p <0,0001 et 30% de mort cellulaire avec p <0,0001). B.2.2. Effet du complexe multi-ionigue sur la longueur des neurites des neurones sensoriels Un traitement au complexe multi-ionigue à la concentration KY21400 pendant 24h, n'a pas d'impact significatif sur la longueur des neurites des neurones sensoriels (111% du contrôle). Un traitement avec le complexe multi-ionique à la concentration KY21310 pendant 24h induit une augmentation légère mais non significative de la longueur des neurites (129% du témoin). Un traitement avec le complexe multi-ionique à la concentration KY21200 pendant 24h augmente significativement la longueur des neurites des neurones sensoriels (140% du contrôle avec p <0,01). Le cisplatine à 12 UM induit une diminution significative de la longueur axonale de neurones sensoriels (51% de perte de neurites avec p <0,0001). Un prétraitement de deux heures avec le complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200 est capable de préserver efficacement la longueur des neurites des neurones sensoriels de la lésion du cisplatine pendant 24h (respectivement 83% avec p <0,01, 100% avec p <0,0001 et 102% du contrôle avec p <0,0001). B.2.3. Effet du complexe multi-ionique sur la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels Un traitement par le complexe multi-ionique, à 3 concentrations différentes KY21400 et KY21200 pendant 24h induisent une augmentation légère mais non significative de la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels (respectivement, 138% et 129% du contrôle). Le traitement au complexe multi-ionique à la concentration KY21310 pendant 24h n'a pas d'impact significatif sur la longueur de la gaine de myéline (111% du témoin).

Le cisplatine à 12 UM induit une diminution significative de la longueur de la gaine de myéline d'extensions de neurones sensoriels (69% de la perte de myéline avec p <0,0001). Un prétraitement de deux heures avec par le complexe multi- jonique, aux 3 concentrations différentes KY21400, KY21310 et KY21200 permet de préserver de manière significative la longueur de la gaine de myéline des neurones sensoriels de la lésion du cisplatine pendant 24h (respectivement 29% avec p <0,001, 37% avec p <0,01 et 29% de perte de myéline avec p <0,001). C. Analyse des bénéfices du traitement par le complexe multi- ionique KY21400 de kératinocytes humains cultivés dans des conditions stimulées par Th2 sur un modèle de peau sensible en 2D par screening transcriptomique de 93 gènes Objectif : évaluer les effets protecteurs et réparateurs du composé KY21400 (Li 10,37 mmol/kg, Mg 2,27 mmol/kg, K 16,88 mmol/kg) sur un modèle de kératinocytes 2D in vitro soumis à un cocktail de cytokines pour imiter un environnement de type Th2 au moyen d’une analyse transcriptomique (TLDA; TagMan Low Density Array) de la régulation de l'expression génique de 93 cibles épidermiques (par RT-gPCR ). Ce modèle, adapté d'un modèle 3D décrit dans le document de recherche Hubaux et al. 2018, permet de reproduire des perturbations in vivo telles que retrouvées dans les dermatites atopiques cutanées et les peaux sensibles à tendance atopique. Cela comprend une légère hyperprolifération et la modification d'un panel de gènes liés à l'inflammation, à l'homéostasie des lipides, à la barrière cutanée et aux démangeaisons.

Le modèle in vitro utilise des cultures de kératinocytes épidermiques dérivés du prépuce humain normal (NHEKs, Lonza, 00192906). Les cellules ont été cultivées dans du milieu Epilife (Fisher Scientific, M-EPI-500-A) complété avec un supplément de croissance de kératinocytes humains (HKGS, Fisher Scientific, S- 001-5) et des antibiotiques (Gentamycin, Fisher Scientific, 15710-049). Les cellules ont été maintenues dans un incubateur humidifié à 37°C avec une atmosphère de 5 % de CO2. C.1.Protocole C.1.1. Induction du modèle enflammé avec Th2 Les cellules ont été stimulées avec trois cytokines liées à Th2 (IL-4, IL-13 et IL-25), connues pour jouer un rôle important dans le développement de la dermatite atopique et pour altérer la fonction de la barrière épidermique. Les trois interleukines ont été appliquées sur une monocouche cellulaire sous confluente à des concentrations de 50 ng / ml pour IL-4 et IL-13, et 20 ng / ml pour IL-25, pendant 48h pour induire des modulations d'expression génique rappelant la dermatite atopique et une peau sensible.

C.1.2. Traitement avec le complexe multi-ionique, à la concentration KY21400 Simultanément à la stimulation avec Th2, les cellules ont été incubées avec le complexe multi-ionique, à la concentration KY21400, diluées dans du milieu de culture, puis filtrées et appliquées pendant 48 h.

C.2. Analyse des modifications de l'expression génique C.2.1. Extraction totale de l’ARN A la fin du traitement de 48h avec stimulation par Th2 et KY21400, l'ARN total a été extrait à l'aide du kit Qiagen RNeasy (Qiagen; 74106). Les cellules ont été rincées avec du PBS froid et lysées dans le tampon ad hoc fourni dans le kit.

L'extraction a été réalisée selon les recommandations du fournisseur.

L'ARN collecté a été stocké à -80 ° C.

C.2.2. Analyse de l’intégrité de l’ARN La concentration en ARN a été déterminée par mesure spectrophotométrique (QIAxpert, Qiagen) et la qualité de l'ARN a été analysée par électrophorèse capillaire (Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000 Nano Kit, 5067-1511). L'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation de bandes d'ARN ribosomique intactes.

Pour l'ARN total des eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomiques doit être de 1,9 kb pour l'ARN 18S et de 4,7 kb pour l'ARN 28S.

L'intensité de la bande correspondant à l'ARN 28S doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant à l'ARN 18S.

De petites bandes diffuses représentant un ARN de faible poids moléculaire (ARNt et ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes.

La dégradation de l'ARN sera apparente sous la forme d'un maculage des bandes d'ARN ribosomique et d'un bruit de fond de poids moléculaire élevé.

C.2.3. Synthèse de l’ADNC La transcription inverse a été réalisée avec le kit RNA-to-cDNA de grande capacité (Applied Biosystems; 438706) à partir d'ARN total selon les instructions du fabricant.

L'ADNc a ensuite été stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation dans des réactions en chaîne par polymérase. C.2.4. Validation du système de test par des dosages TaqMan individuels Afin de vérifier l'impact de la stimulation Th2 et de valider le système de test, une amplification de cibles sélectionnées qui sont signalées dans la littérature à réguler en réponse au défi spécifique ou à réguler dans la dermatite atopique a été réalisée. Les 5 gènes cibles sont : ABCAI (ATP-binding cassette Al), CA2 (Carbonic anhydrase 2), CCL2 (C-C motif chemokine ligand 2), NELL2 (Neural EGFL like 2) et POSTN (Periostin).

Les séquences cibles des gènes d'intérêt ont été amplifiées en utilisant les tests d'expression génique TagMan (Applied Biosystems). Ces kits contiennent une sonde TagMan et deux amorces spécifiques qui ont été pré-mélangées à une concentration de 18 uM pour chaque amorce et 5 uM pour la sonde. Ce mélange est 20x concentré. Les sondes TagMan ont été greffées avec un fluorophore (FAM) à leur extrémité 5' et avec un quencher de fluorescence en 3'. Les PCR ont été exécutées avec le système de PCR en temps réel Quantstudio7 (Applied Biosystems). En bref, 4 ul d'ADNc (4 ng) ont été mélangés avec 10 ul de TagMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems; 4444557), 1 ul de TagMan Gene Expression Assay et 5 ul d'eau sans ARNse. Les cycles thermiques ont été programmés avec une première étape de dénaturation à 95°C pendant 20s. Le protocole d'amplification a été suivi de 40 cycles (1 s à 95°C et 20 s à 60°C).

Afin de normaliser les résultats, un gene de ménage, YWHAZ (Tyrosine 3-Monooxygenase) a été utilisé sur les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a été réalisé en parallèle comme contrôle négatif d'amplification. Cela a permis de vérifier l'absence de contaminant. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés par la méthode comparative Ct (AACt).

2.5. Gestion des matrices TagMan, analyse qPCR et Ct Les puces microfluidiques TagMan qPCR (ou puces basse densité TagMan ; TLDA). Parmi les gènes représentés, 3 gènes de contrôle interne ou gènes de ménage, et 93 gènes d'intérêt ont été étudiés.

Les puces TagMan ont été traitées conformément aux instructions du fabricant (Micro Fluidic Card Getting Started Guide, Applied Biosystems).

L'ADNc a été mélangé avec un tampon spécifique (TagMan Fast Advanced Master Mix, 4444557, Applied Biosystems) avant d'être injecté dans les puces et dispersé dans les puits par centrifugation. Les puces ont été scellées et la qPCR a été exécutée à l'aide du système de PCR en temps réel Quantstudio/7 (Applied Biosystems) et de son logiciel (logiciel QuantStudio PCR en temps réel v1.3., Applied Biosystems).

Des cycles seuils (Ct) ont été obtenus pour chaque gène. Les fichiers de résultats ont été exportés à partir du dispositif qPCR et analysés à l'aide du logiciel DataAssist (v3.01, Applied Biosystems) conçu pour effectuer une quantification relative de l'expression génique à l'aide de la méthode comparative Ct (AACt), via une combinaison d'analyses statistiques.

Les données obtenues pour l'état non traité stimulé par Th2 ont été comparées à l'état non traité, non stimulé. La condition stimulée par Th2 et traitée avec le complexe multi-ionique, à la concentration KY21400 a été comparée à la condition non traitée / stimulée par Th2. Les valeurs de Ct ont été normalisées à la moyenne des Ct de deux gènes de ménage présents sur la puce (YWHAZ et B2M). La valeur seuil maximale de Ct a été fixée à 36 cycles, ce qui signifie que les gènes présentant des valeurs de Ct supérieures à 36 n'ont pas été pris en compte dans l'analyse.

C.2.6. Analyse statistique Pour les résultats statistiques, l'analyse a été effectuée par un test t de Student apparié pour la comparaison des conditions traitées par rapport à la condition de contrôle spécifique avec * : 0,01<P<0,05 ; ** : 0,001<P<0,01 et ***P<0,001. C.3. Résultats C.3.1. Effet du complexe pluri-ionique KY21400 sur les marqueurs géniques de l’inflammation Un traitement avec le complexe KY21400 a permis de contrer significativement les augmentations d'expression induites par la stimulation Th2 pour les gènes TNFAIP6 (p=0,0006), CXCL10 (p= 0,009) et CxXCL11 (p=0, 0271) impliqués dans la réponse inflammatoire. C.3.2. Effet du complexe pluri-ionique KY21400 sur les marqueurs géniques de l’homéostasie lipidique de la peau humaine Le traitement par KY21400 induit une modification globale de l'homéostasie lipidique par des modulations différentielles dans l'expression des gènes impliqués dans la synthèse des céramides, des acides gras / triacylglycérols et des cholestérols, leur métabolisme et leur transport au sein des kératinocytes.

Un traitement avec le complexe KY21400 a permis d'inverser significativement les effets de la stimulation Th2 sur l'expression du gène ABCG1 (p=0,0211), une diminution du gène

GPAT3 (p=0,0188), une augmentation des expressions des gènes SULT1E1 (p=0,0096), FA2H (p=0,0385), NR1H2 (p=0,0045) impliqués dans l’homéostasie lipidique de la peau.

C.3.3. Effet du complexe pluri-ionique KY21400 sur les marqueurs géniques de la différenciation terminale des kératinocytes et du métabolisme de l'acide hyaluronique Le traitement par KY21400 restaure significativement l'expression de deux gènes de différenciation terminale des kératinocytes et du métabolisme de l'acide hyaluronidue, suggérant un impact favorable sur les propriétés barrières et la spongiose rencontrées dans la dermatite atopique et l'eczéma.

HAS3 et CASP14, gènes impliqués dans l'hydratation épidermique et la différenciation terminale des kératinocytes ont montré respectivement une régulation négative (p=0,0422) et positive (p=0,0346) significatives de l'expression des gènes avec le traitement KY21400. KY21400 induit une régulation négative "salvatrice”" inattendue de l’expression des deux gènes SPRRIA (p=0,0025) et IVL (p=0,0054), impliqués dans la formation de l'enveloppe cornée.

KY21400 a régulé à la baisse le gène codant pour le récepteur de l'acide hyaluronique CD44 (p = 0,0378). C.3.4. Effet du complexe pluri-ionique KY21400 sur les marqueurs géniques d'hypersensibilité et de démangeaisons

Le traitement des kératinocytes avec le complexe KY21400 a inversé l'effet observé suite à une stimulation avec un cocktail de cytokines de type Th2 signe d’un effet préventif du développement potentiel d’hypersensibilité et de démangeaisons.

Parmi les gènes étudiés, trois d'entre eux voient leur expression revenir au niveau basal avec le traitement : NGF (p=0,0141), ANOS1 (p=0,0294) et SEMA3A (p=0,0034). C.3.5. Effet du complexe pluri-ionique KY21400 sur les marqueurs géniques spécifiques de la dermatite atopique Le traitement avec KY21400 a régulé à la baisse l'expression de CA2 (p=0,0064) suggérant un effet anti dermatite atopique spécifique de ce complexe.

Claims

Revendications

1. Composition pluri-ionique comprenant des sels minéraux, dont au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium, caractérisée par les ratios molaires suivants : lithium 1 - magnésium [0.15 - 0.30] — potassium [1.55-

1.75].

2. Composition —pluri-ionique selon la revendication 1, comprenant au moins 50% en poids d’eau.

3. Composition pluri-ionique selon l’une des revendications 1 et 2, dont le pH est compris entre 6.0 et 7.5.

4. Composition selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant du lithium sous forme de chlorure de lithium, de carbonate de lithium et/ou d’hydroxyde de lithium.

5. Composition selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant du magnésium sous forme de chlorure de magnésium, de carbonate de magnésium, d’hydroxyde de magnésium, d’oxyde de magnésium et/ou de silicate de magnésium.

6. Composition selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant du potassium sous forme de chlorure de potassium, de bromure de potassium, d’iodure de potassium, de phosphate de potassium, de carbonate de potassium, d’hydroxyde de potassium, de silicate de potassium et/ou de sulfate de potassium.

7. Composition selon l’une des revendications 1 à 6, comprenant en outre au moins un sel de silicium, de préférence un silicate comme du silicate de sodium du silicate de potassium et/ou tout autre sel minéral pharmaceutiquement acceptable de silicium.

8. Composition selon l’une des revendications 1 à 7, comprenant en outre un sel minéral de manganèse.

9. Composition selon l’une des revendications 1 à 8, comprenant en outre un sel minéral de cuivre.

10. Composition selon l’une des revendications 1 à 9 comprenant en outre au moins un additif choisi parmi les stabilisateurs, les émulsifiants, les conservateurs, les antioxydants et/ou les gélifiants.

11. Composition selon l’une des revendications 1 à 10, dans laquelle la concentration molaire en lithium est comprise entre 0.01 mmol/L et 100 mmol/L.

12. Méthode de préparation de la composition selon l’une des revendications 1 à 11, comprenant les étapes de : - On ajuste le pH d’une solution aqueuse entre 6.0 et 7.5 ; — On ajoute à la solution aqueuse une ou plusieurs solutions concentrées comprenant au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium, pour obtenir les ratios molaires suivants : lithium 1 — magnésium [0.15 - 0.30] — potassium [1.55-

1.75].

13. Méthode selon la revendication 12, selon laquelle on ajoute une ou plusieurs solutions concentrées comprenant au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et de potassium à une température supérieure à 50 °C.

14. Méthode selon l’une des revendications 12 et 13, selon laquelle, lorsque la composition contient en outre des sels de silicium, ils sont préalablement dissouts dans une solution aqueuse concentrée isolée, ajoutée préalablement à l’ajustement du pH.

15. Méthode selon l’une des revendications 12 à 14, selon laquelle, la solution concentrée comprenant au moins un sel minéral de lithium, de magnésium et/ou de potassium est concentrée 100 à 1000 fois par rapport à la concentration finale de la composition.

16. Composition selon l’une des revendications 1 à 11 pour utilisation comme médicament à usage humain.

17. Composition selon l’une des revendications 1 à 11 pour utilisation comme médicament à usage vétérinaire.

18. Composition selon l’une des revendications 1 à 11 pour utilisation comme dispositif médical.

19. Composition selon l’une des revendications 1 à 11 pour utilisation cosmétique.

20. Composition selon l’une des revendications 1 à 10, 16 à 19 pour utilisation topique.

21. Composition selon l’une des revendications 15 à 20 pour utilisation dans la prévention et/ou le traitement par voie topique de l'inflammation neurogène.

22. Composition selon la revendication 21, où l'inflammation neurogène est associée aux douleurs neuropathiques ( douleurs neuropathiques périphériques diabétiques, douleurs neuropathiques consécutives à un traitement médical), à la douleur musculosquelettique (douleur dans le bas du dos, fibromyalgie, ostéoarthrite, syndrome douloureux régional complexe), à la douleur orofaciale, à la douleur post-herpétique, à la rosacée, au psoriasis, à la dermatite atopique, au prurigo noduralis, à l’urticaire, aux cicatrices douloureuses ou non (cicatrices de brûlures, chirurgicales…), au pied diabétique (sécheresse - callosités - ulcères) et aux plaies entre autres.