BE1030423B1 - Anwendung von Biomarkern zu Diagnose und Behandlung von pulmonaler Hypertonie (PH) - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Anwendung von Biomarkern zu Diagnose und Behandlung von pulmonaler Hypertonie (PH). Aus der vorliegenden Erfindung ist es zu erkennen, dass im Vergleich zu normalen Kontrollen CLEC2L, FAM86B1 bei pulmonaler Hypertonie signifikant nach oben angeglichen und zugleich SPNS3 signifikant nach unten angeglichen wurde, aus Ergebnissen der Testungen Expressionsniveaus von CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 ist eine sensitive und spezifische pulmonaler Hypertonie genau zu diagnostizieren.
Description
" BE2023/5220
Anwendung von Biomarkern zu Diagnose und Behandlung von pulmonaler Hypertonie (PH)
Fachgebiet:
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biomedizin und findet Anwendung von _Biomarkern zu Diagnose und Behandlung von pulmonaler Hypertonie (PH).
Technischer Hintergrund:
Ein beträchtlicher Anteil von LungengefäBbetten ist bereits vor Auftreten von pulmonaler
Hypertonie (im Folgenden PH) Symptomen verschwunden, sogar ein beachtlicher Anstieg von pulmonalem GefäRwiderstand bei PH Patienten mit milderem Verlauf ist zu beobachten. Die aktuellen medizinischen Herzkatheter- und bildgebenden Untersuchungen sind bei PH in früherem Stadium schwer zu diagnostizieren. Deshalb ist die Suche nach neuen Biomarkern klinisch von großer Bedeutung.
Beschreibung der Erfindung
Um die Mängel des aktuellen technischen Stand zu beheben, basierend auf der
Verhaltensweise und Funktionsweise der Gene unter pulmonaler Hypertonie befasst sich die vorliegende Erfindung mit PH-relevanten Biomarkern, um die Behandlung und Diagnose von PH auf neuem technischen Stand zu bringen.
Die vorliegende Erfindung findet Anwendung von Reagenzien zum Nachweis von
Biomarkern bei Herstellung von Produkten zur Diagnose der pulmonaler Hypertonie ist dadurch gekennzeichnet, dass die Biomarker aus CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 bestehen.
Des weiteren wurden im Vergleich zu normalen Kontrollen die Expressionsniveaus von
CLEC2L und FAM86B1 bei Patienten mit PH nach oben angeglichen und zugleich das
Expressionsniveau von SPNS3 bei Patienten mit PH nach unten angeglichen.
Des weiteren, das Reagenz umfasst wie folgt:
Sonden zur spezifischen Identifizierung von den Gene CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1;
Initiatoren zur spezifischen Amplifikation für die Gene CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1;
Bindemitteln, die zum spezifischen Binden der von CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 kodierten
Proteine sind.
Desweiteren 0.g. Probeentnahme aus Geweben und Blut.
Desweiteren 0.g. Probeentnahme aus Blut.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Produkt zur Diagnose der PH zur Verfügung, und das
Produkt umfass ein Reagenz zur Bestimmung der Expressionsniveaus der Biomarker CLEC2L,
SPNS3 und FAM86B1.
Des weiteren umfasst das Produkt ein Reagenz zur Bestimmung vom mRNA-Spiegel durch
Polymerase-Kettenreaktion, quantitative Echtzeit- reverse-Transkriptionspolymerase-
Kettenreaktion, reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion, kompetitive Polymerase-
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Kettenreaktion, Nuklease-Schutzanalyse, In-situ-Hybridisierung, Nukleinsäure-Microarray, RNA-
Blotting oder DNA-Biochip.
Des weiteren umfasst das Produkt ein Reagenz zur Bestimmung von Proteinspiegel durch
Immunblotting, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), RIA (Radioimmunoassay), RID (Radioimmunodiffusion), IME! (Immunelektrophorese), Gewebeimmunfärbung,
Immunpräzipitationsanalyse, CFT (Komplementfixierungsanalyse), FACS (fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung), Massenanalyse oder Protein-Microarray-Verfahren.
Die vorliegende Erfindung findet die Anwendung von Biomarkern bei der
Computermodellierung zur Prognostizierung der PH, es ist dadurch gekennzeichnet, dass die
Biomarker aus CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 bestehen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Instrument zur Frühdiagnose der PH zur Verfügung, zum
Instrument gehôren wie folgt:
Prozessor,
Modul zur Eingabe der Biomarkerspiegel in biologischen Proben, die aus die aus CLEC2L,
SPNS3 und/oder FAM86B1 ausgewählt wurden.
Für Computer lesbares Medium, der Befehl führt den Algorithmus bei Biomarkerausgabe unter Ausführung des Prozessors aus.
Ein Ausgabemodul, das angibt, ob die Testperson bereits PH hat oder ein latentes Risiko dafür hat.
Nutzen von der Erfindung:
Durch Testen auf die Expressionsniveaus von CLEC2L, SPNS3 und/oder FAM86B1 kommt eine Frühdiagnose der PH zustand, die Erhöhung der Testungsempfindlichkeit, der Anstieg der
Testung- Effizienz und aktives Eingreifen können nicht nur den Verlauf der PH verzögern, die
Behinderung- und Sterberate senken, sondern auch eine frühere Heilung erzielen.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigt die Unterschiede der CLEC2L Genexpressionen;
Figur 2 zeigt die Unterschiede der SPNS3 Genexpressionen;
Figur 3 zeigt die Unterschiede der FAM86B1 Genexpressionen;
Figur 4 zeigt das ROC Diagramm der CLE2L Gendiagnose der PH;
Figur 5 zeigt das ROC Diagramm der SPNS3 Gendiagnose der PH;
Figur 6 zeigt das ROC Diagramm der FAM86B1 Gendiagnose der PH
Figur 7 zeigt das ROC Diagramm der CLEC2L+ SPNS3 Gendiagnose der PH;
Figur 8 zeigt das ROC Diagramm der CLEC2L+ FAM86B1 Gendiagnose der PH
Figur 9 zeigt das ROC Diagramm der SPNS3+ FAM86B1 Gendiagnose der PH
Figur 10 zeigt das ROC Diagramm der CLEC2L+ SPNS3+ FAM86B1 kombinierte
Gendiagnose der PH.
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Konkrete Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung umfasst der Biomarker CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1.
Biomarker wie CLEC2L (C-Typ Lektin Domänenfamilie 2 Mitglied L, Gen-ID: 154790), SPNS3 (Sphingolipid Transporter 3, Gen-ID: 201305), FAM86B1 (Familie mit Sequenzähnlichkeit 86
Mitglied B1, Gen ID:85002); enthält von ihnen codierte Gene und Proteine, und ihre Homologe,
Mutationen und Äquivalente. Die Nomenklatur umfasst unverarbeitete Biomarker in voller Länge sowie jede Form von Biomarkern, die aus der Verarbeitung in Zellen stammen. Die Nomenklatur umfasst natürlich vorkommende Varianten von Biomarkern (z. B. Spleidosom oder Allele). Gen-
IDs sind https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ verfügbar.
Wie im Text beschrieben, hier können RNA-Transkripte zum Nachweis und Quantifizierung durch Verfahren sowie Hybridisierung, Amplifikation, Sequenzierung realisieren, umfasst/aber nicht beschränkt auf die Verfahren von Hybridisierung von RNA-Transkripten mit Sonden oder
Initiatoren, und durch auf Polymerase-Kettenreaktion(PCR) basierenden verschiedenen quantitativen PCR- und Sequenzierungsverfahren zum Nachweis und Quantifizierung von RNA-
Transkripten und cDNA Produkten. Das Sequenzierungsverfahren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Sanger-Sequenzierung, zweite-Generation-Sequenzierung, Sequenzierung der dritten Generation und einzellige Sequenzierung.
Wie im Text beschrieben, das Polypeptid kann durch Proteomik oder Reagenzien quantifiziert werden. Die demonstrativen Methoden umfassen, jedoch nicht beschränkt auf
Western Blotting Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Immunhistochemie,
Durchflusszytometrie, Durchflusszytometrie, Bead Arrays und Massenspektrometrie. Einige
Arten von ELISA einschließlich direkter ELISA, indirekter ELISA und Sandwich-ELISA werden häufig verwendet.
Anwendungsbereich
Die vorliegende Erfindung findet Anwendung von Reagenzien zum Nachweis von
Biomarkern bei Herstellung von Produkten zur Diagnose der pulmonaler Hypertonie(PH), die
Biomarker bestehen aus CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1.
Das Produkt zur Diagnose der PH umfasst vorrangig Reagenzien zur Bestimmung der
Expressionsniveaus von CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1.
Zu alternativen Ausführungsformen gehören die Reagenzien wie folgt:
Sonden zur spezifischen Identifizierung der CLEC2L, SPNS3 oder FAM86B1 Gene;
Initiatoren zur spezifischen Amplifikation der CLEC2L, SPNS3 oder FAM86B1 Gene;
Bindemitteln zum Binden der von CLEC2L, SPNS3 oder FAM86B1 codierten Proteine
Als alternative Ausführungsform Proteinbinder umfassen/ist aber nicht beschränkt auf Peptid, — Peptid-Mimetikum, Aptamer, Spiegelmer, Darpin, Ankyrin-Repeat, Kunitz-Domâne, Antikörper,
Monodomain-Antikôrper und monovalentes Antikôrperfragment.
Proteinbinder wird vorzugsweis zum Antikörper ausgewählt.
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Als alternative Ausführungsform enthält die Probe Plasma, Serum oder Blutextrakt,
Bürstenwäsche, Biopsie oder chirurgische Entfernung von Gewebe- oder Flüssigkeitsproben der
Testperson. (Diagnose-)Produkte
Die vorliegende Erfindung findet Anwendung von Reagenzien zur Identifizierung von
Biomarkern bei Herstellung von Produkten zur Diagnose der pulmonaler Hypertonie(PH), die
Biomarker bestehen aus CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1.
Das Reagenz dient zur Bestimmung des Expressionsniveaus der Biomarker.
Das genannte Diagnostikum hat die Charakter eines in-vitro-Diagnostikums.
Das s.g. diagnostische Produkt ist Test-Kit
Das Reagenz ist zum Nachweis der RNA-Transkripte der Biomarker und zur Quantifizierung der mRNA, Bei einer anderen Ausführungsform wird das Reagenz zur Quantifizierung der cDNA, die komplementär zur MRNA steht, eingesetzt.
Die diagnostischen Produkte umfassen unter anderen Reagenzien für die gesamte RNA-
Extraktion, Reagenzien für die reverse Transkription und oder Sequenzierungsreagenzien der zweiten Generation.
Reagenzien für die gesamte RNA-Extraktion dienen als allgemein gebrauchte gesamte RNA-
Extraktion Reagenzien.
Das reverse Transkriptionsreagenz kann als allgemein gebrauchtes Transkriptionsreagenz dienen, und umfasst vorrangig eine dNTP-Lösung und RNA-Reverse-Transkriptase.
Das Sequenzierungsreagenz der zweiten Generation ist ein Reagenz, das allgemein auf dem
Gebiet eingesetzt wird, sobald die Anforderungen der Sequenzierung der zweiten Generation erfüllt werden können. Beispiele sind unter anderem Illuminas MIseq Reagent Kit v3 (150cycle) (MS-102-3001), TruSeq® Targeted RNA IndexKitA-96lndices (384Proben) (RT-402-1001).
Zweit-Generation-Sequenzierung ist allgemein auf dem Gebiet eingesetzte zweit-Generation-
Sequenzierung z.B. das Zielscheibe RNA Custom Panel Kit (96Proben) (RT-102-1001).
Das Reagenz dient als Sonde oder Initiator.
Das Reagenz dient zur Quantifizierung der von Biomarker codierten Polypeptide.
Das Reagenz ist Antikôrper, Antikôrperfragment, affinitätgestütztes Protein. „Testkit“ wird gebraucht, um die Sonden zum spezifischen Nachweis der Gene von
Biomarkern oder Protein aufzubewahren (z.B. Packungen oder Behältnisse). Bei einigen
Ausfürhrungsformen wird Test-kit bei Verkauf, Vertrieb, oder Vermarktung der Erfindung als
Werbegeschenk benutzt.
Diese Arten von Test-Kits kann durch Partitionierung die Trägermedium auf eine oder mehrere Behälter (sowie Gefässchen, Röhre) zu beschränken, jeder Behälter umfasst die
Komponenten der Aufschlüsse.
Test-kit umfasst normalerweise ein 0.g. Behältnis oder mehrere andere Behältnisse, die die von Kunden gewünschten Komponenten enthalten, z.B Pufferlösung, Verdünnungslösung, Filter,
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Nadel, Injektor, und eine Packungsbeilage mit der inliegenden Gebrauchsanweisung. auf dem
Behältnis ist ein Etikett angebracht, um auf das Anwendungsbereich bestimmter therapeutischen
Behandlung oder nicht-therapeutischen Behandlung hinzuweisen, auBerdem kann es auch darauf In-vivo oder In-vitro Diagnostika angegeben werden. Die anderen Komponenten umfassen eine oder mehrere Pufferlösungen (z.B. Blockierpuffer, Waschpuffer, und Bodensubstratpuffer usw.), andere Reagenzien (z.B. Bodensubstrate, die durch enzymatische Markierung chemisch verändert wurden), Epitopreparaturlösung, Kontrollproben (Positiv- und/oder Negativkontrollen),
Kontrollabschnitte usw.
Comuptermodellierung
Die vorliegende Erfindung findet die Anwendung von Biomarkern bei der
Computermodellierung zur Prognostizierung der PH, es ist dadurch gekennzeichnet, dass die
Biomarker aus CLEC2L, SPNS3 und/oder FAM86B1 bestehen.
Die mathematische Kombination der Proteine und Konzentrationsmessung von einem und mehreren Biomarkern, und eine Verbindung zwischen den kombinierten Werten und grundliegenden diagnostischen Problemen herstellen. Durch dafür geeignete mathematische
Methoden nach jetzigem technischen Stand können die kombinierten Werte von Biomarkern bestimmt werden.
Die Aufstellung der logarithmischen Funktion zur Modellierung von Markerkombination, korrelierend mit jeweiliger Erkrankung erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines Algorithmus, der den statistischen Methoden zugrunde liegt. Zum Beispiel sind geeignete statistische
Methoden Diskriminanzanalyse (DA) (d. h. lineare, quadratische, reguläre DA), Kernel-Methoden (d.h SVM), nichtparametrische Methoden (d.h., k-Nearest-Neighbor-Klassifikatoren), PLS (partielle kleinste Quadrate), baumbasierte Methoden (d.h. logarithmische Regression, CART,
Random-Forest-Methoden, Boost/Bagging-Methoden), verallgemeinerte lineare Modelle (d.h. logarithmische Regression), Hauptkomponenten-basierte Methoden (d.h. SIMCA), verallgemeinerte Superpositionsmodelle, Fuzzy-Logik-basierte Methoden, Methoden, die auf neuronalen Netzwerken und genetische Algorithmen basieren. Fachpersonal wird dazu in der
Lage sein, dafür geeignete statistische Methoden auszuwählen, um die Kombination von Markern der vorliegenden Erfindung auszuwerten und letztendlich in einem dafür geeigneten mathematischen Algorithmus zusammenzufassen. In einer Handhabung ist die statistische
Methode, die verwendet wird, um zur Auswertung der PH in einem mathematischen Algorithmus zusammenzufassen, ausgewählt aus DA (d.h. lineare, quadratische, regeldiskriminante Analyse),
Kernel-Methode (d.h. SVM), nichtparametrische Methode (d.h. k-Nearest Neighbor-Klassifikator),
PLS (partielle kleinste Quadrate), baumbasierte Methode (d.h. logarithmische Regression,
CART, Random-Forest-Methode, Booster-Methode) oder verallgemeinertes lineares Modell (d.h. logarithmische Regression).
Die unter dem Betriebsdiagramm der Testperson liegende Fläche (=AUC) ist ein Indikator für die Leistung oder Genauigkeit des Diagnoseverfahrens. Die Genauigkeit des
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Diagnoseverfahrens lässt sich am besten durch seine Betriebseigenschaften der Testperson (ROC) beschreiben. ROC-Diagramme sind Liniendiagramme, die von allen Sensitivitäts-bzw.
Spezifitätspaaren, deren Entscheidungsschwelle über das gesamten zu beobachtenden
Datenbereich kontinuierlich zu ändern ist, hergeleitet werden.
Die klinische Leistung eines Labortests hängt von seiner diagnostischen Genauigkeit oder seiner Fähigkeit ab, Testpersonen korrekt in klinisch relevante Untergruppen einzuordnen. Der
Test auf die diagnostische Genauigkeit ist dazu in der Lage, die Zustände der Testpersonen unter zwei verschiedenen Bedingungen korrekt zu unterscheiden. Solche Zustände sind zum Beispiel
Gesundheit, Krankheit oder das Fortschreiten der Krankheit oder Krankheit mit milderem Verlauf.
In jedem Fall stellt das ROC-Liniendiagramm die Überlappung zwischen den beiden
Verteilungen dar, indem die Sensitivität gegenüber 1-Spezifität auf das gesamte Bereich der
Entscheidungsschwelle gezeigt wurde. Auf der y-Achse ist die Sensitivität oder der wahre positive
Bruch [definiert als (Anzahl der wahren positiven Testergebnisse) / (Anzahl der wahren positiven
Testergebnisse + Anzahl der falschen negativen Testergebnisse)]. Dies wird auch als positiv für das Vorhandensein einer Erkrankung oder eines Zustands bezeichnet. Sie wird nur unter
Beeinflussung der Untergruppen berechnet. Auf der x-Achse befindet sich ein falsch-positiver
Bruch oder eine 1-Spezifität [definiert als (Anzahl der falschen positiven Ergebnisse)/(Anzahl der wahr negativen Ergebnisse + Anzahl der falschen positiven Ergebnisse)]. Er ist ein Indikator für die Spezifität und wird vollständig aus der nicht betroffenen Untergruppe berechnet. Da wahre und falsch positive Werte vollständig getrennt berechnet werden, indem Testergebnisse aus zwei verschiedenen Untergruppen genommen werden, hängt das ROC-Liniendiagramm nicht von der
Prävalenz der Erkrankung in der Stichprobe ab. Jeder Punkt im ROC-Liniendiagramm stellt ein
Sensitivitäts-1-Spezifitätspaar dar, das einem bestimmten Entscheidungsschwellenwert entspricht. Ein Test mit perfekter Unterscheidung (die beiden Ergebnisverteilungen überlappen sich nicht) hat ein ROC-Liniendiagramm, das die obere linke Ecke passiert, wobei der wahre positive Wert 1,0 oder 100% (perfekte Sensitivität) und der falsch positive Wert 0 (perfekte
Spezifität) ist. Das theoretische Liniendiagramm eines wahllosen Tests (die Ergebnisverteilungen beider Gruppen sind gleich) ist eine 45°-Diagonale von der unteren linken zur oberen rechten
Ecke. Die meisten Liniendiagramme liegen zwischen diesen beiden Extremen. (Wenn das ROC-
Liniendiagramm vollständig unter die 45°-Diagonale fällt, kann dies leicht korrigiert werden, indem das Kriterium für „positiv“ von „größer als“ zu „kleiner als“ oder umgekehrt umgestellt wird.) Je näher das Liniendiagramm an der oberen linken Ecke liegt, desto höher ist die
Gesamtgenauigkeit des Tests.
Ein praktisches Ziel bei der Quantifizierung der diagnostischen Genauigkeit eines Labortests besteht darin, seine Leistung in einem einzigen numerischen Wert auszudrücken. Das gebräuchlichste globale Maß ist die Fläche unter der ROC-Kurve (AUC). Normalerweise ist diese
Fläche immer = 0,5 (wenn nicht, können die Entscheidungsregeln umgekehrt werden, um es zu realisieren). Der Wertebereich liegt zwischen 1,0 (die Testwerte, die die beiden Gruppen perfekt
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Liniendiagramms ab, z. B. von dem Punkt, der der Diagonale am nächsten liegt oder eine
Spezifität von 90% aufweist, sondern auch vom ganzen Liniendiagramm. Dies ist eine quantitative, beschreibende Darstellung, wie sich das ROC-Liniendiagramm dem perfekten nähert (Fläche = 1,0).
Beispiel 1: Identifizierung von Biomarkern, die PH-relevant sind. 1. Probenentnahme
Blutproben von 7 Patienten mit chronisch thromboembolischer pulmonaler Hypertonie (CTEPH) und 5 gesunden Bevölkerungskontrollgruppen wurden gesammelt, und die grundlegenden Informationen von Patienten und gesunden Kontrollgruppen, einschließlich Alter,
Geschlecht, BMI usw., wurden bei der Probenentnahme detailliert erfasst, unter denen es keine signifikanten Unterschiede zwischen Krankheitsgruppe und gesunder Gruppe in Alter,
Geschlecht, BMI usw. gab.
Einschlusskriterien für die Krankheitsgruppe: CTEPH-Diagnose durch
Rechtsherzkathetereinführung, Lungenbeatmungsperfusionsuntersuchung oder CT-
Lungenangiographie (CTPA). Die Diagnose von CTEPH erfordert die folgenden 3 Punkte gleichzeitig: (1) wirksame Antikoagulationstherapie für mindestens 3 Monate, um subakute PTE auszuschließen; (2) Die V/Q-Szintiographie zeigte mindestens einen Lungenperfusionsdefekt, oder die Computertomographie Pulmonaryangiographie (CTPA), MRT oder direkte
Lungenangiographie und andere Untersuchungen ergaben spezifische Anzeichen einer CTEPH, wie Ringstenose, Gitterzeichen und Lückenzeichen und arterielle Verschlüsse; 3) Der durch
Rechtsherzkatheterisierung gemessene hämodynamische Lungenkreislaufindex erfüllte die diagnostischen Kriterien der pulmonaler Hypertonie [mittlerer Lungenarteriendruckz 25 mm Hg (1 mm Hg = 0,133 kPa), pulmonaler arterieller Keildruck <15 mm Hg)].
Ausschlusskriterien für die Krankheitsgruppe: Vorhandensein von Durchblutungsstörungen wie Malignität, Bluthochdruck, Diabetes, koronare Herzkrankheit oder zerebrovaskuläre
Erkrankung.
Einschlusskriterien für gesunde Gruppen: einschließlich gesunder Kontrollen, die auf das
Alter und Geschlecht der CTEPH-Gruppe abgestimmt sind, normale
Blutroutine/Urinroutine/biochemischer Test/karzinembryonales Antigen (CEA)/Alpha-Fetoprotein (AFP)/ Erythrozytensedimentationsrate (ESR)/ Thoraxröntgen.
Ausschlusskriterien für gesunde Gruppen: Menschen mit Vorerkrankungen, Kopftraumata und Operationen, Herzoperationen oder neurologischen Störungen in der Vorgeschichte ausschließen. 2. Experimentelle Methoden 2.1 Extraktion der gesamten Blut-RNA
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Extrahieren Sie die gesamten Blut-RNA mit dem PAXgene Blood RNA Kit von BD und folgen
Sie den Anweisungen. 2.2 Probenerkennung
Verwenden Sie den Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit), um die
Konzentration, den RIN-Wert, 28S/18S und die Fragmentgröle der Gesamt-RNA zu bestimmen. 2.3 Datensammlung und Transkriptomsequenzierung 1) DNase-Verdauung zur Entfernung von DNA: DNase | wurde verwendet, um die in der gesamten RNA-Probe vorhandenen DNA-Fragmente zu verdauen, und die
Reaktionsnebenprodukte wurden durch magnetische Perlenreinigung aufbereitet und schließlich in DEPC-Wasser gelöst; 2) Entfernung der rRNA: Nehmen Sie die verdaute gesamte RNA-Probe, verwenden Sie das
Kit, um rRNA zu entfernen, und führen Sie nach der Entfernung eine Agilent 2100-Detektion durch, um den rRNA-Entfernungseffekt zu überprüfen. 3) RNA-Unterbrechung: Nehmen Sie die vorherige Probe, fügen Sie den
Unterbrechungspuffer hinzu und legen Sie ihn zur thermischen Unterbrechung in das PCR-
Instrument und unterbrechen Sie auf 130-160nt; 4) Synthese des ersten Strangs der reversen Transkription: Fügen Sie der unterbrochenen
Probe eine geeignete Menge an Initiator hinzu, Lassen Sie sie nach gründlicher Homogenisierung bei der Thermomixertemperatur für einen bestimmten Zeitraum reagieren, so dass die
Sekundärstruktur geöffnet und mit den Initiatoren kombiniert wird, und dann wird das im Vorfeld vorbereitete einsträngige Synthesereaktionssystem hinzugefügt und die einsträngige cDNA wird auf dem PCR-Instrument nach dem entsprechenden Verfahren synthetisiert; 5) Synthese der zweisträngigen reversen Transkription: Herstellung eines zweisträngigen
Synthesereaktionssystems, bei einer geeigneten Temperatur auf Thermomixer für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen, Synthese von zweisträngiger cDNA und die
Reaktionsnebenprodukte werden gereinigt und mit magnetischen Kügelchen aufbereitet. Das
Produkt wird gereinigt und mit magnetischen Perlen gereinigt und wiederverwertet; 6) Endreparatur: das Endreparaturreaktionssystem vorbereiten, es bei einer geeigneten
Temperatur im Thermomixer für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen, und das klebrige
Ende der cDNA reparieren, das durch umgekehrte Transkription unter Einwirkung von Enzymen erhalten wurde. Das Endprodukt wurde gereinigt und mit magnetischen Kügelchen aufbereitet, und schließlich wurde die Probe in EB-Lösung gelöst; 7) Hinzufuegung der „A“ an das Ende der cDNA: das Reaktionssystem mit „A“ vorbereiten, es für eine bestimmte Zeit bei einer geeigneten Temperatur im Thermomixer reagieren lassen, und unter Einwirkung von Enzymen A-Basen zum 3'-Ende des Produkts hinzufügen. 8) cDNA-Adapterverbindung: das Linkerligationsreaktionssystem vorbereiten, bei einer geeigneten Temperatur im Thermomixer für eine bestimmte Zeit reagieren lassen, unter der
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Einwirkung von Enzymen den Linker und mit A-Base binden, und das Produkt wird gereinigt und mit magnetischen Perlen wiederverwertet; 9) PCR-Reaktion und Produktrückgewinnung: das PCR-Reaktionssystem vorbereiten, das geeignete PCR-Reaktionsprogramm aussuchen, und die im vorherigen Schritt erhaltenen
Produkte amplifizieren. magnetische Perlenreinigung von PCR-Produkten. Das aufbereitete
Produkt wird in EB-Lösung gelöst. Beschriftung, Datensammlungsvorbereitung ist abgeschlossen; 10) Qualitätsprüfung der Datensammlung: den Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent DNA 1000Reagents) verwenden, um die Größe und Konzentration von Fragmenten in der Sammlung zu erkennen. 11) Cyclisierung von PCR-Produkten: Nach der Denaturierung der PCR-Produkte in
Einzelstränge, ein Cyclisierungsreaktionssystem vorbereiten, nach gründlicher Homogenisierung bei der richtigen Temperatur für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen, einzelsträngige
Ringprodukte erhalten und die linearen DNA-Moleküle verdauen, die noch nicht zyklisiert werden, d.h. die endgültige Datensammlung ist zustande gekommen; 12) On-Machine-Sequenzierung: Einzelsträngige zirkuläre DNA-Moleküle werden durch
Walzringe repliziert, um eine DNA-Nanokugel (DNB) mit mehr als 200 Kopien zu bilden. Die resultierenden DNBs werden den Netzporen auf dem Chip mittels der High-Density-DNA-
Nanochip-Technologie hinzugefügt. Durch Sequenzierung während der Synthese wurde die
Sequenzierungsleselänge von 50bp/100bp erhalten. 2.4 Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten die ursprünglichen Sequenzierungsdaten filtern wie folgt, um qualitativ hochwertige
Sequenzierungsdaten (saubere Daten) zu erhalten: die Adaptersequenz in Lesevorgängen entfernen; vor dem Schneiden Nicht AGCT-Basen am 5'-Ende entfernen; das Lese-ende mit niedrigerer Sequenzierungsqualität abschneiden (Sequenzierungsqualitätswert kleiner als Q20);
Lesevorgänge entfernen, die 10% N enthalten. den Adapter verwerfen und kleine Fragmente mit einer Länge von weniger als 25 bp abschneiden. 2.5 Abgleich mit Referenzgenomen
Die Preissequenzierungsdaten wurden mit Hilfe der HISTAT2-Analysesoftware mit einem
Referenzgenom verglichen. Das Referenzgenom stammt aus der Ensembl-Datenbank, die
Genomversion ist GRCh38 und die Genannotationsinformationen sind Ensemble 92. 2.6 Analyse des Genexpressionsniveaus
Das Expressionsniveau eines Gens wird berechnet, indem die Anzahl der Sequenzen (Clean
Reads) mit der Referenzgenomregion verglichen wird. Mit Hilfe von Stringenz, basierend auf den — abgeglichenen Ergebnissen der Hisat2-Software, den FPKM-Wert jedes Gens / Transkripts in der
Probe berechnen und diesen Wert als Expressionsmenge des Gens / Transkripts in der Probe verwenden. 2.7 MRNA differentielle Expressionsanalyse
Unter Verwendung von DESeq2 zum Vergleich der Expressionsunterschiede von MRNA zwischen der Kontrollgruppe und der Krankheitsgruppe sind die Differenzanalyseschritte wie folgt: Zuerst wird die ursprüngliche Lesezahl normalisiert, hauptsächlich um die
Sequenzierungstiefe zu korrigieren; Die Wahrscheinlichkeit des Hypothesentests (P-Wert) wurde durch statistisches Modell berechnet, eine Mehrfachhypothesentestkorrektur (BH) vorgenommen und der Padj-Wert (Falschentdeckungsrate) wurde erhalten, und die Screening-Kriterien für differentiell exprimierte Gene waren: P-Wert<0,05 und |log 2 foldchange|>1. 3. Ergebnisse und Analyse 3.1 statistische Erfassung des Datenvolumens der Sequenz nach der
Datenqualitätskontrolle, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Statistik der Sequenzierungsdaten
Erfassungen Basenpaare (1) Proben-ID: Probeninformationen; (2) gesamte Erfassungen: die Anzahl der ursprünglichen Sequenzdaten; (3)gesamte Basenpaare: Die Anzahl der Spalten wird mit der
Länge multipliziert und in G umgerechnet; (4) Q20 und Q30: Berechnung des Prozentsatzes der
Basen mit PH-red-Werten größer als 20 bzw. 30 an der Gesamtbasenpaaren; (5) GC-Gehalt:
Berechnen Sie die Summe der Anzahl der Basen G und C als Prozentsatz der Gesamtzahl der
Basenpaare. 3.2 Differentiell exprimierte Genanalyse
Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen wurden an allen Proben der Krankheitsgruppe und der gesunden Kontrolle durchgeführt, und im Vergleich zur gesunden Kontrolle gab es 437 Gene mit signifikanten Unterschieden, darunter 233 nach oben angeglichene Gene und 204 nach unten angeglichene Gene.
" BE2023/5220
Unter ihnen war die Expression von FAM86B1 und CLEC2L bei Patienten mit pulmonaler
Hypertonie signifikant nach oben angeglichen, und die Expression von SPNS3 bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie war signifikant nach unten angeglichen, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 differentielle Expressionen von Genen
EE Tr Ta
Basen Faltenwechsel
Beispiel 2 Nachweis und diagnostische Effizienztests von unterschiedlichen Genen 1. Daten und Vorverarbeitung
Die Genexpressionsdaten des GRE33463-Datensatzes der pulmonaler Hypertonie und ihrer
Kontrolle wurden aus der GEO-Datenbank heruntergeladen und durch Annotationsdateien annotiert, und mehrere Sonden sollten auf dasselbe Gen wie ihre Expressionsmenge gemittelt werden, und dann wurde die Genexpressionsmatrixdatei erhalten. 2. Differentielle Expressionsanalyse
Expressionsanalyse differentieller Gene mit dem Packet „limma“ in der R-Software.
Die Analyseergebnisse zeigten, dass die Expression von FAM86B1 und CLEC2L bei
Patienten mit pulmonaler Hypertonie signifikant hochreguliert war und die Expression von SPNS3 bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie signifikant herunterreguliert war, und seine Expression wurde in Bild 1-3 gezeigt, wobei *: P<0,05;**: P<0,01;****: P<0,001. 3. Analyse der diagnostischen Leistung
Die R-pack „pROC“ ROC-Kurve wurde verwendet, um den AUC-Wert, die Sensitivität und die Spezifität differentiell exprimierte Gene als Nachweisvariablen zu analysieren, und um ihre diagnostische Wirksamkeit zu beurteilen. Bei der Beurteilung der diagnostischen Wirksamkeit jedes Gens wird die Expression des Gens direkt für die Analyse verwendet. zuerst das pROC-
Paket abrufen, dann die Expressionsmatrix der Zielgenkonstruktion einlesen und den Befehl ausführen, um die ROC-Diagramm zu zeichnen unter Einbeziehung von AUC, thres (Schwellenwert), glatt (Kurve) Befehl. Bei der Beurteilung der diagnostischen Wirksamkeit von
Genkombinationen ist zunächst glmnet zur logistischen Regression von Genen zu verwenden, mithilfe von aufgestelltem logistischem Regressionsmodell wird dabei helfen, die Predictfunktion (prognostiziere Funktion) zu bestimmen, und um den Einfluss einer Prädiktorvariablen auf die
Ergebniswahrscheinlichkeit auf verschiedenen Ebenen zu beobachten, die prognostizierte
Wahrscheinlichkeit zu berechnen und die ROC-Kurve des prognostizierten Ergebnisses zu zeichnen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Bild 4-10 dargestellt, aus denen ersichtlich ist, dass
CLEC2L, SPNS3, FAM86B1 und ihre Kombinationen bei der Diagnose der pulmonaler
Hypertonie eine hohe Genauigkeit aufweisen, insbesondere die Kombination der drei, mit hoher
Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität.
Tabelle 3 Diagnostische Wirksamkeitsanalyse differentiell exprimierter Gene
Claims (8)
1. Die Anwendung von Reagenzien zum Nachweis von Biomarkern in Proben zur Herstellung von Produkten zur Diagnose der pulmonaler Hypertonie, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomarker aus CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 bestehen.
2. Anwendung nach Schutzanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es im Vergleich zu den normalen Kontrollen das Expressionsniveau von CLEC2L, FAM86B1 bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie nach oben anzugleichen und das Expressionsniveau von SPNS3 bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie nach unten anzugleichen ist.
3. Anwendung nach Schutzanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz folgende umfasst : Sonden zur spezifischen Identifizierung von den Gene CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1; Initiatoren zur spezifischen Amplifikation für die Gene CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1; oder Bindemitteln, die zum Binden von CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 kodierten Proteinen sind.
4. Anwendung nach einem der Schutzanspruch 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben aus Blut entnommen sind.
5. Anwendung nach Schutzanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz ein Reagenz zur Bestimmung der Expressionsniveaus der Biomarker CLEC2L, SPNS3 und FAM86B1 auf mRNA- oder Proteinspiegel umfasst.
6. Anwendung nach Schutzanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt ein Reagenz zur Identifizierung des mRNA-Spiegels durch Polymerase-Kettenreaktion, quantitative Echtzeit- reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion, reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion, kompetitive Polymerase-Kettenreaktion, Nuklease-Schutzanalyse, In-situ-Hybridisierung, Nukleinsäure-Microarray, RNA-Blotting oder DNA-Biochip umfasst.
7. Anwendung nach Schutzanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt ein Reagenz zur Bestimmung von Proteinspiegeln durch Immunblotting, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), RIA(Radioimmunoassay), RID (Radioimmunodiffusion), ImEI (Immunelektrophorese), Gewebeimmunfärbung, Immunpräzipitationsanalyse, CFT (Komplementfixierungsanalyse), FACS (fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung), Massenanalyse oder Protein-Microarray-Verfahren umfasst.
8. Anwendung von Biomarkern bei der Computermodellierung zur Prognostizierung der pulmonaler Hypertonie, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomarker CLEC2L,SPNS3 und FAM86B1 umfassen.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| DE102010013555A1 (de) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | Christian Hamm | Verwendung der Biomarker sFlt und PIGF in der Diagnose und Therapie der pulmonalen Hypertonie |
| CN113493829A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-10-12 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 生物标志物在肺动脉高压诊疗中的应用 |
-
2023
- 2023-03-22 BE BE20235220A patent/BE1030423B1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
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| CN113493829A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-10-12 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 生物标志物在肺动脉高压诊疗中的应用 |
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