BE1031219A1 - Composition, cellules immunitaires la comprenant et utilisation de ces dernières - Google Patents

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Abstract

L’invention concerne une composition comprenant - une première molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant une région complémentaire d’une cible et des sites de reconnaissance d’une transposase, - une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant une région complémentaire d’une cible et des sites de reconnaissance d’une transposase, et - une troisième molécule simple brin comprenant une séquence codant du CD3ζ du TCR, et des sites de liaison à une transposase.

Description

Description
Titre de l'invention : Composition, cellules immunitaires la comprenant et utilisation de ces dernières
L’invention concerne une composition ainsi que des cellules immunitaires comprenant ladite composition et l’utilisation des cellules comprenant ladite composition.
Les lymphocytes T sont une catégorie de globules blancs qui participent aux défenses immunitaires de l’organisme en détruisant les agents pathogènes et les cellules tumorales.
Cependant, dans le cas de certains cancers, ces cellules tumorales ont la capacité d’inactiver les défenses immunitaires de leur hôte.
Les cellules CAR-T ou Chimeric Antigenic Receptor-T sont une approche d’immunothérapie cellulaire visant à combattre certains cancers, notamment les leucémies à lymphocytes B et certains Iymphomes, en renforçant le système immunitaire du patient.
Cette approche novatrice consiste à modifier génétiquement des lymphocytes T du patient ou d’un donneur compatible à partir d’un prélèvement sanguin afin qu’ils puissent reconnaître et éliminer efficacement les cellules cancéreuses. Cette modification ex vivo (hors de l’organisme du patient) permet un meilleur contrôle de la modification génétique à effectuer, ici l'introduction d’un gène permettant la production de récepteurs de surface (CAR) permettant aux cellules T d’attaquer et de détruire les cellules cancéreuses. Une fois ces cellules produites en quantité suffisante pour combattre la maladie, elles sont injectées dans le système sanguin du patient.
Plusieurs technologies d’édition du génome ont été adaptées pour la production de ces cellules CAR T, comme CRISPR/CASS, Zinc-finger et les TALENS. Néanmoins, ces dernières souffrent d’une efficacité relative quant à l'insertion du gène CAR dans les cellules T.
D’autres systèmes sont également utilisés, comme les vecteurs viraux (AAV, Lentivirus) et le transposon s/eeping beauty, mais l'intégration pseudo spécifique du gène CAR avec ces approches peut entrainer des conséquences en aval de leur utilisation (par exemple la demande WO2017180989A2).
Aussi, au vu de la puissance le ta technologie CAR, il demeure un besoin dans l’efficacité de production des cellules T modifiées CAR-T.
La présente invention a pour but de pallier ces inconvénients.
Un but de l'invention est de proposer une composition capable de permettre la production simple et efficace des cellules T modifiées CAR-T.
Un autre but de l'invention est de fournir une méthode ou un médicament capable de traiter des pathologies par l’intermédiaire desdites cellules T modifiées CAR-T.
L’invention concerne une composition comprenant - une première molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence À permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une première séquence riches en
T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une deuxième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites première et deuxième séquences riches en T comprenant respectivement un premier et un deuxième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du premier domaine étant complémentaire de la séquence du deuxième domaine, ledit premier et deuxième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence
A, ladite première molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, - une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B permettant insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B complémentaire étant liée en 5’ à une troisième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une quatrième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, ladite troisième et quatrième séquence riche en T comprenant respectivement un troisième et un quatrième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du troisième domaine étant complémentaire de la séquence du quatrième domaine, ledit troisième et quatrième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B, ladite deuxième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d'intérêt, la séquence A étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d’intérêt et la séquence B positionnée en 3’ de la région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt, et - une troisième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, * dans sa partie 3’ au moins une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et * une région intermédiaire située entre la séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, ladite région intermédiaire comprenant une séquence codant une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale du domaine activateur du lymphocyte T, c'est-à-dire la chaine CD3Ç du récepteur des cellules
T ou TCR, les première et troisième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les deuxième et troisième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
L'invention repose sur la constatation faite par les inventeurs que l’utilisation d’un complexe molécule tel que décrit ci-dessus, et faisant intervenir une transposase bactérienne permet un remplacement ciblé et efficace d’une cible génomique, et de produite à l’aide d’une séquence d'intérêt des fusions CART, permettant de produire à façon des cellules T ciblant des cellules tumorales spécifiques.
Cela signifie que l’invention concerne un complexe moléculaire comprenant une première molécule d’acides nucléiques simple brin, une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin et une troisième molécule d’acide nucléique simple brin, ladite troisième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou étant constituée essentiellement en son extrémité 5’ d'au moins une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance — deladite transposase, et ladite troisième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou étant constituée essentiellement en son extrémité 3’ d’au moins une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ledit complexe étant tel que les première, deuxième et troisième molécules d'acides nucléiques simple brin sont appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase dans l'extrémité 5’ de la troisième molécule et deux sites double brin de liaison de ladite transposase dans l’extrémité 3’ de la troisième molécule.
L’invention repose sur l’observation inattendue faite par l'inventeur que l’utilisation de guides simples brins spécifiques capables de cibler une région d’un acide nucléique d'intérêt permettent de mobiliser de manière contrôlée et « site spécifique » des transposases, et ainsi utiliser les propriétés de recombinaison desdites transposases pour réaliser du remplacement de séquences dans des molécules d'intérêt.
Le complexe moléculaire susmentionné est en fait l’unité de base de la technologie définie dans l'invention. Cette unité de base sert à guider les recombinases sur un site spécifique où doit avoir lieu la recombinaison, et donc le remplacement de séquence. Contrairement au système CRISPR/Cas9 qui requiert la présence de séquences de type PAM (NGG), l’outil moléculaire défini ici peut être utilisé sur n'importe quelle séquence cible, quelle qu’en soit sa séquence.
Le complexe moléculaire susmentionné est donc l’unité de base qui devra être complétée par : - une région homologie d’une région 5’ de la séquence cible, ladite région d’homologie étant représentée par la séquence A et - une région homologie d’une région 3’ de la séquence cible, ladite région d’homologie étant représentée par la séquence B.
Il s’agit donc ici d’un produit intermédiaire de l’outil tel que décrit ci-après.
Le complexe moléculaire est constitué de trois molécules d’acides nucléiques simples brins, qui peuvent être des molécules d'ADN, des molécules d’ARN ou des molécules mixtes d’ARN et d'ADN.
Ces trois molécules sont partiellement complémentaires entre elles deux à deux, selon la complémentarité des bases d'acides nucléiques définie par Watson et Crick, c'est-à-dire qu’une Adénine s’'apparie à un Thymidine ou un Uracile, et une Cytosine s'apparie à une
Guanine, et réciproquement.
Plus particulièrement les trois molécules formant le complexe susmentionné comprennent chacune la séquence d’un des brins d’une molécule double brin correspondant à la séquence de fixation d’une transposase. Aussi, chaque molécule simple brin comprend donc une — « demie séquence » de fixation de transposase et ne peut donc pas permettre une interaction avec ladite transposase correspondante. En revanche, lorsque les trois molécules du complexe interagissent ensemble, par appariement des bases tel que défini ci-dessus, une molécule double brin est ainsi formée, reconstituant un site de liaison double brin de ladite transposase, celle-ci pouvant ainsi interagir avec la molécule formée.
La première molécule.
La première molécule du complexe est la molécule qui comprendra, une fois modifiée, une séquence d'acide nucléique qui permettra de cibler spécifiquement une région d’intérêt d’une molécule d'acide nucléique d'intérêt. Cette séquence d’intérêt sera choisie par l'utilisateur du système selon la cible choisie. Cette séquence d’intérêt sera insérée dans la première molécule dudit complexe au niveau de la région A. Cette région A correspond a minima à deux acides nucléiques entre lesquels sera inséré la séquence permettant de cibler la molécule cible. Au vu de la structure orientée des acides nucléiques (sens 5-3’), il est important que la séquence permettant de cibler la région d'intérêt soit positionnée dans le bon sens, afin que l’appariement soit possible avec la séquence cible.
Aussi, avantageusement, la région A comprend un ou plusieurs sites reconnaissant des enzymes de restrictions afin de favoriser une insertion orientée. Un ou plusieurs des sites suivants peuvent être présents dans la région A :
[Table 1]
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Évidemment, dans le cadre d’une synthèse chimique de la première molécule, il n’est pas nécessaire de disposer de sites de clonage (ou d'insertion) de la séquence permettant de cibler la région cible, mais de bien prendre la précaution de donner une séquence correctement orientée. Cela est bien évidemment toutefois possible.
La première molécule est en outre constituée de part et d’autre de la région A, de séquences riches en A/T, ou s’il s’agit d’ARN en A/U, afin de permettre une certaine flexibilité de la structure. Par riche en A/T, ou en A/U, on entend dans l’invention une séquence qui comprend plus de 50% de A ou T, ou U, de préférence plus de 50% de T ou de U, par rapport au nombre total de nucléotides constituant la séquence. Ces séquences de part et d’autre de la région À ont une taille en nucléotides variant de 10 nucléotides à 60 nucléotides.
La flexibilité de ces séquences flanquantes de la région A, du fait de la présence de nombreux A, T ou U, peut avoir pour effet de permettre une recombinaison par l’intermédiaire des recombinases trop peu contrôlées, voire même lorsque le complexe n’a pas encore reconnu la molécule cible.
Aussi, afin de pallier ce problème, des séquences riches en G/C sont introduites dans chacune des séquences riches en A/T, notamment riches en T, ou A/U, bordant la région A.
Ces régions riches en G/C sont constituées de 6 à 12 nucléotides, dont la quantité de C ou de
G est supérieure à 50% des nucléotides contenus dans ladite séquence riche en G/C.
Pour stabiliser la structure de la première molécule, et comme décrit ci-dessus éviter une recombinaison intempestive, les régions riches en G/C sont positionnées de 15 à 52 nucléotides par rapport à l’extrémité de la région A.
Pour plus de clarté, si la région A consiste en 3 nucléotides, le nucléotide central correspondant à la position O, la région riche en A/T ou A/U débutera à gauche en position -2, et à droite en position +2. Dès lors, à gauche, la région riche en G/C sera positionnée de la position -17 à la position -54, et du côté droit de la position +17 à la position +54.
Autre élément important, la séquence riche en G/C à droite (ou 5’) de la région A est nécessairement complémentaire (selon le principe d’appariement de Watson et Crick) de la région riche en G/C de la région à droite (ou 3’) de la région A. Aussi, la première molécule simple brin s’apparie-t-elle avec elle-même au niveau des régions riches en G/C, ce qui empêche toute recombinaison par les transposases, tant qu’il n’y aura pas d’interaction avec la séquence cible complémentaire de la région qui sera insérée dans la région A de la première molécule.
Enfin la première molécule comprend à son extrémité 5’ une séquence correspondant à un premier site de liaison à une transposase, et à son extrémité 3’ un deuxième site de liaison à ladite transposase.
Le premier site de liaison et le deuxième site de liaison sont avantageusement les mêmes, et surtout correspondent tous les deux au même brin du site de liaison double brin de ladite transposase. Cela signifie que le premier site de liaison à la transposase présent dans la région 5’ de la première molécule ne peut s’apparier intégralement, et donc de manière stable avec le site de liaison à la transposase présent dans la région 3’.
Le premier site de liaison et le deuxième site de liaison sont avantageusement les mêmes, mais correspondent chacun à un brin différent du site double brin de liaison à la transposase.
Aussi, par exemple, si le premier site de liaison à la transposase correspond au brin sens, le deuxième site de liaison à la transposase correspond à la séquence du brin complémentaire.
Il est alors possible d’avoir deux configurations : i) soit le deuxième site de liaison qui correspond au brin complémentaire est orienté dans le sens 3-5’, dans ce cas il pourra s'apparier avec le premier site de liaison à la transposase et former le site double brin, ii) soit le deuxième site de liaison qui correspond au brin complémentaire est orienté dans le sens 5’- 3, et dans ce cas ne pourra pas s’apparier avec la première séquence de liaison à la transposase, les séquences, du fait de leur orientation n’étant pas complémentaires. Dans le cas |) susmentionné, si la première molécule simple brin s’auto-apparie au niveau des premier et deuxième site de liaison, il ne sera pas possible de former le complexe susmentionné, car il n’y aura plus de région complémentaire simple brin disponible pour s’apparier avec la deuxième molécule de sorte à former deux sites de liaison double brin à la transposase.
Aussi, la première molécule, lorsqu’elle est dépourvue de séquence complémentaire de la région cible dans la partie A, ou lorsqu’elle contient une telle séquence cible mais que cette dernière n’interagit pas (ne s’apparie pas) avec ladite séquence cible, forme une structure tridimensionnelle où toute la Molécule est simple brin à l’exception de la région correspondant aux régions riches en G/C qui s’apparient entre elles.
Une représentation schématique de sous forme appariée est représentée aux Figures 1A à 1E.
La deuxième molécule.
La deuxième molécule du complexe est de structure similaire à la première molécule. les explications susmentionnées s'appliquent donc mutatis mutandis. Toutefois, dans la deuxième molécule la région B (ou séquence B) ainsi que les sites de liaison à la transposase sont organisés de manière différente.
Tout d’abord la région B est différente de la région A de la première molécule. En effet, il ne peut, dans l’objectif d’une recombinaison orientée, y avoir de compétition pour la même cible d’intérêt entre la première et la deuxième molécule.
Aussi, est-il nécessaire que la région B corresponde à une deuxième séquence complémentaire de la séquence cible, cette deuxième séquence complémentaire de la séquence cible étant positionnée en 3’ par rapport à la première séquence reconnue par la séquence complémentaire correspondant à la séquence À de la première molécule.
Par conséquent, lorsque la première molécule et la deuxième molécule seront appariées à la séquence cible, la séquence cible sera bordée par ces deux molécules, la première molécule étant localisée en 5’ et la deuxième molécule étant positionnée en 3’. La région de la séquence cible localisée entre la région d'interaction avec la première molécule et la région d'interaction avec la deuxième molécule correspond à la séquence qui sera remplacée par celle de la troisième molécule.
La troisième molécule
La troisième molécule du complexe susmentionné est plus simple que les deux premières (la première et la deuxième molécule). la troisième molécule comprend, dans sa partie 5’, un site de liaison à la transposase qui est complémentaire du site de liaison à ladite transposase present dans la partie 3’ de la première molécule. De ce fait, lorsque le complexe sera formé, le % site de liaison à la transposase (simple brin) localisé en 3’ de la première molécule pourrait s'apparier avec le % site de liaison (simple brin) à la transposase localisé en 5’ de la deuxième molécule de sorte à former un site de liaison double brin à la transposase, site double brin sur lequel la transposase pourra venir se fixer.
Dans la partie 3’ de la troisième molécule se trouve site de liaison à la transposase qui est complémentaire du site de liaison à ladite transposase présent dans la partie 5’ de la deuxième molécule. De ce fait, lorsque le complexe sera formé, le % site de liaison à la transposase (simple brin) localisé en 3’ de la troisième molécule pourrait s'apparier avec le % site de liaison (simple brin) à la transposase localisé en 5’ de la deuxième molécule de sorte à former un site de liaison double brin à la transposase, site double brin sur lequel la transposase pourra venir se fixer.
Entre la partie 5’ qui comprend un % site de liaison à la transposase et la partie 3’ qui comprend un % site de liaison à la transposase, la troisième molécule comprend une séquence de remplacement, c'est à dire la séquence qui à terme remplacera la séquence cible. Cette sequence de remplacement est bordée en 5’ par au moins un site de restriction et en 3’ par au moins un site de restriction ; ces deux sites de restrictions étant distincts. Aussi, la troisième molécule comprend dans le sens 5’ vers 3: un % site de liaison à la transposase complémentaire du site de liaison à la transposase de la première molécule, suivi d’au moins un site de restriction, suivi de la séquence de remplacement, suivi d’au moins un site de restriction différent du site de restriction en amont de la séquence de remplacement, suivi enfin d’un % site de liaison à la transposase complémentaire du site de liaison à la transposase de la deuxième molécule.
La séquence de remplacement correspond quant à la partie de la séquence codante du gène
CD247 codant au moins le domaine intracellulaire de la protéine CD3 € (CD3 zeta).
La chaîne Z (ou CD3 ©) est une protéine transmembranaire qui est l'une des composantes du complexe du récepteur des cellules T (TCR) et participe à la transduction du signal.
Lachaine € présente un petite partie N terminale extracellulaire (9 acides aminés) qui interagit avec les chaines CD3a et CD3B, un seul domaine transmembranaire et une longue chaine cytoplasmique (120 acides aminés). Cette longue chaine cytoplasmique contient trois motifs d'activation des récepteurs immuns basés sur la tyrosine (ITAM), qui participent à son interaction avec le cytosquelette du Iymphocyte T lors de l'activation de ce dernier.
La composition selon l'invention permet d’obtenir le complexe sus-décrit. La Figure 2 illustre schématiquement le complexe formé entre les première, deuxième et troisième molécules selon l’invention.
Le complexe formé à partir des molécules de la composition de l'invention, lorsque les trois molécules sont correctement appariées, comprend deux paires de sites de liaison double brin de reconnaissance d’une transposase : - la première paire étant obtenue par l’hybridation de la première molécule avec la troisième molécule, et - la seconde paire étant obtenue par l’hybridation de la deuxième molécule avec la troisième molécule.
La séquence A contenue dans la première molécule est complémentaire du même brin de l’acide nucléique qui est complémentaire de la séquence B contenue dans la deuxième molécule. En d’autres termes, la séquence A contenue dans la première molécule et la séquence B contenue dans la deuxième molécule sont capables de s'hybrider au même acide nucléique simultanément, car les deux séquences À et B ne reconnaissent pas la même sequence.
Pour clarifier encore plus le propos, l’intérêt dans la présente invention est de proposer une première molécule et une deuxième molécule, toutes deux telles que définies ci-dessus, les séquences A et B respectives étant telles qu’elles sont capables de reconnaître pour l’une, une séquence localisée en 5’ de la séquence cible de l’acide nucléique d’intérêt et pour l’autre, une séquence localisée en 3’ de la même séquence cible de l’acide nucléique d'intérêt. Les séquences A et B sont donc complémentaires de régions bordant la séquence d'intérêt, que l’on souhaite remplacer, de la molécule d’acide nucléique d'intérêt.
Les première et deuxième molécules d'intérêt sont donc essentielles pour cibler spécifiquement la molécule d'intérêt, afin d’encadrer la séquence à remplacer.
La troisième molécule de l’ensemble, quant à elle, est celle qui apporte la molécule d’acides nucléiques qui contient la séquence de remplacement, i.e. une séquence comprenant la partie intracellulaire d'activation du CD3 €.
D’un point de vue mécanistique, le complexe selon l'invention est tel qu’il est constitué de ses trois molécules, la première et la deuxième molécule étant structurellement organisées dans l’espace de sorte que leurs régions riches en G/C soient appariées.
De part et d’autre de la troisième molécule, c’est à dire en 5’ et en 3’, du faite de l’hybridation avec les première et deuxième molécules, deux paires de site de liaison à une transposase permettent, lorsqu’elle est présente, à des dimères de transposases de lier à l’ensemble.
On notera que les sites de liaison à la transposase de la première molécule peuvent être les mêmes que ceux de la deuxième molécule, ou être différents. Dans le cas où les séquences de liaison sont les mêmes, les dimères de transposases en 5’ de la troisième molécule (par hybridation de la partie 5’ de la troisième molécule avec la première molécule), et en 3’ de la troisième molécule (par hybridation de la partie 3’ de la troisième molécule avec la deuxième molécule) seront les mêmes. Aussi, à titre d'exemple, si les sites de liaison sont tous des sites de liaison de la transposase de Tn5, l’ensemble sera associé à 2 dimères de transposases de
Tn5.
Il est également possible que les sites de liaison de la première molécule et de la deuxième molécule ne reconnaissent pas la même transposase. Dans ce cas, et selon la définition donnée ci-dessus, la partie 5’ de la troisième molécule formera par hybridation avec la première molécule deux sites double brin de liaison à une première transposase, et partie 3’ de la troisième molécule formera par hybridation avec la deuxième molécule deux sites double brin de liaison à une deuxième transposase.
Si maintenant le complexe susmentionné, lié à deux dimères de transposases est mis en présence d’une molécule d'acides nucléiques d’intérêt dont la partie 5’ est complémentaire de la séquence A de la première molécule de l’ensemble et dont la partie 3’ est complémentaire de la séquence B de la deuxième molécule de l’ensemble, alors il y aura appariement entre la — molécule d’acide nucléiques d'intérêt et l’ensemble au niveau des régions A et B sus-décrites.
Cette interaction aura pour conséquence de rompre l’interaction des deux séquences riches en G/C de chacune des première et deuxième molécules de l’ensemble. Dès lors, la troisième molécule et la molécule d’acides nucléiques d'intérêt seront rapprochées spatialement et les transposases pourront exercer leur activité de tagmentation, dont le résultat sera le remplacement de la séquence de la molécule d'intérêt, bordée par les séquences complémentaires des séquences A et B, par la séquence de la troisième molécule de l'ensemble, qui se trouve entre les demi-sites de liaison à la /aux transposases en 5’ et en 3’.
Dans l’invention, les premières molécules, deuxièmes molécules et troisième molécule de l'ensemble sont avantageusement des molécules constituées de désoxyribonucléotides, afin de former des molécules d’ADN simple brin.
De manière encore plus avantageuse, les premières molécules, deuxièmes molécules et troisième molécule de l’ensemble sont des molécules hybrides ADN/ARN, où, le « squelette »
des molécules est de l'ADN, et les séquences de reconnaissance A et B de la molécule d’acides nucléiques d'intérêt, et la région centrale de la troisième molécule sont de l'ARN. Ceci est particulièrement avantageux lorsque le remplacement de séquence que permet l'invention doit se faire directement sur une molécule d' ARN.
La Figure 2-A illustre l'interaction entre la molécule d'intérêt et le complexe première/deuxième/troisième molécules selon l’invention.
De manière avantageuse, l’invention concerne le complexe susmentionné, où ladite première molécule ou ladite deuxième molécule, ou les deux est/sont couplée(s) à une enzyme, notamment par le biais d’un nucléotide modifié. Cette enzyme a pour but de favoriser le remplacement de la molécule d’intérêt. II peut s'agir - d’une hélicase, enzyme capable d'ouvrir une molécule double brin qui serait superenroulée ou encore associée à des protéines telles que des histones, - une topoisomérase, enzyme agissant sur la structure topologique de l'ADN en générant des coupures transitoires, - une ligase qui permet de former une liaison phosphodiester entre une extrémité 5’ phosphate d’un nucléotide et l’extrémité 3’ OH d’un autre nucléotide, - une polymérase, qui synthétisera une molécule d'acides nucléiques à partir d’un site d'initiation, 3S’OH libre, dans le sens 5’-> 3’, notamment en recopiant un brin complémentaire antiparallèle selon le modèle de Watson et Crick.
Illest également possible de combiner deux ou plusieurs desdites enzymes pour disposer de tout le matériel enzymatique nécessaire pour permettre le remplacement de séquences prévu dans le cadre de l'invention.
Dans un aspect particulier, de l’invention, la première molécule de l’ensemble peut contenir dans sa partie 5’, plus précisément entre le premier site de liaison à la transposase et la région
A, un ou plusieurs nucléotides modifiés. De la même manière la troisième molécule de l'ensemble peut contenir dans sa partie 3’, plus précisément entre le premier site de liaison à la transposase et la région 3, un ou plusieurs nucléotides modifiés.
Ce nucléotide modifié est notamment modifié par greffage d’une chaine carbonée substituée avec une étiquette protéique, ou tag en anglais, ou encore une molécule permettant une interaction spécifique telle que la streptavidine ou la biotine.
De telles modifications permettent alors de lier spécifiquement, à la première molécule de l'ensemble, des enzymes qui peuvent servir à favoriser la tagmentation, et le remplacement de séquence. || sera particulièrement avantageux d’avoir par exemple un greffage streptatvidine, qui permettra de greffer une hélicase biotinylée (inversement hélicase greffée à la streptavidine et nucléotide biotinylé) servant à ouvrir une molécule double brin. Il est également possible d’envisager le greffage avec une ligase biotinylée (ou couplé à la streptavidine), afin de relier le brin recombiné coté 3’.
Il est également possible d’associer à la première molécule ou à la deuxième molécule de l'ensemble un oligonucléotide, de sorte que ledit oligonucléotide s’appariera sur une région prédéterminée de la dite première ou deuxième molécule. Cet oligonucléotide est alors avantageusement couplé à une molécule de greffage comme expliqué ci-dessus.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée, où ladite protéine de fusion comprend le peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule, fusionné à une partie transmembranaire d’une protéine membranaire, ce dernier fusionné à la chaine CD3C du TCR.
Dans ce mode de réalisation avantageux, la troisième molécule comprend une séquence qui code une protéine de fusion dont l’organisation dans le sens N-terminal vers C-terminal est la suivante : un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule, généralement une cellule tumorale comme cela sera développé ci-après, ce peptide étant suivit d’un domaine transmembranaire, lui-même suivit par la partie intracellulaire de la chaine
CD3Z du TCR.
Il est notamment avantageux que la partie transmembranaire de la protéine de fusion suscitée soit celle de la chaine CD3Z du TCR, mais tout autre domaine transmembranaire peut être utilisé, à partir du moment où une fois synthétisée dans une cellule la protéine de fusion est telle que : le peptide de liaison se retrouve exposé à l’extérieur de la cellule (extracellulaire), et la chaine CD3Z du TCR est exposée à l’intérieur de la cellule (intracellulaire) afin de permettre la transduction d’un signal.
Si aucun autre domaine n’est présent dans ladite protéine de fusion, on parlera alors de récepteur chimérique ou CAR de première génération.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée, où ladite protéine de fusion comprend le peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule, fusionné à une partie transmembranaire d’une protéine membranaire, le domaine transmembranaire de la protéine membranaire étant fusionné à un domaine de coactivation, ce dernier étant fusionné à la chaine CD3€ du TCR.
Avantageusement, la protéine de fusion susmentionnée comprend en outre, entre le domaine transmembranaire et le domaine d’activation (i.e. le domaine intracellulaire) de la chaine CD3C du TCR, un domaine de coactivation d’une autre protéine que le CD3Z. Cette configuration est basée sur le mécanisme d'activation normale du TCR.
Le double signal intracellulaire est la caractéristique typique de l'activation des cellules T. Trois types de récepteurs différents, dont les récepteurs antigéniques des cellules T, les récepteurs des cytokines et les récepteurs co-stimulateurs, sont inclus dans cette progression. Le premier signal est le signal spécifique qui est déclenché par le TCR lorsqu’il reconnaît le complexe peptide antigénique-Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) à la surface des cellules présentatrices d'antigènes. Le second signal est le signal co-stimulateur, produit par une molécule co-stimulatrice telle que CD28/B7, qui favorise la synthèse d'IL-2 pour achever l'activation des cellules T et éviter l'apoptose.
Les cellules T naïves ne peuvent pas jouer leur rôle normal si le signal co-stimulateur est absent, et il en va de même si les cellules T sont stimulées par l'antigène.
Les CAR qui ne comprennent que la séquence CD3Z ne peuvent pas activer les cellules sans signal co-stimulateur endogène qui devra être recruté, ce qui peut différer la réponse cellulaire.
Pour éviter cet inconvénient, il est préférable de regrouper à la fois le signal d'activation d la chaine CD37 et le signal de co-activation sur une même protéine de fusion. Lors de l’activation du TCR après avoir reconnu le CMH présentant l’antigène, les deux signaux seront activés simultanément. La prolifération, la cytotoxicité et la réponse soutenue, ainsi que la survie des cellules exprimant cette protéine de fusion seront donc accrues.
Il est également possible d’inclure en outre un troisième domaine d’activation permettant la production de cytokines stimulatrices de la production d’IL-12. Ce troisième signal peut être généré, par exemple, à l’aide du domaine de liaison aux facteurs STAT3 du récepteur de l’IL- 2.
D’autres exemples sont envisageables, et l'homme du métier saura adapter les domaines de co-activation à son gré et selon les besoins et l’évolution de la technologie des cellules CAR.
De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, - où ladite séquence À comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC et - où ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions du locus TRAC encadrant avantageusement une région 5’ région du locus du gène codant la protéine TRAC.
Comme expliqué ci-dessus, afin d'opérer le remplacement du gène cible par la troisième molécule, il est avantageux que les séquences de la partie À de la première molécule et de la partie B de la deuxième molécule soient capables : - de reconnaître la même molécule cible, et - d’encadrer la région cible à remplacer, ce qui signifie que la première molécule doit, par l’intermédiaire de sa région A, reconnaître une séquence en amont de la séquence à remplacer de la molécule cible et la deuxième molécule doit, par l'intermédiaire de sa région B, reconnaître une séquence en aval de la séquence à remplacer de la molécule cible, ou l'inverse, i.e. la première molécule doit, par l’intermédiaire de sa région A, reconnaître une séquence en aval de la séquence à remplacer de la molécule cible et la deuxième molécule doit, par l'intermédiaire de sa région B, reconnaître une séquence en amont de la séquence à remplacer de la molécule cible.
Il est ainsi possible de remplacer n'importe quelle séquence cible par n'importe quelle séquence de remplacement, du moment que les séquences À et B respectivement des première et deuxième molécules reconnaissent la région cible et l’encadrent.
Dans l’invention, il est particulièrement avantageux d'insérer la fusion codée par la troisième molécule à un locus qui permette son expression de manière équivalente à la chaine CD3Z du
TCR, sans pour autant remplacer la chaine CD3€ du TCR endogène qui est nécessaire pour l’activité des cellules T.
Il est donc possible d'insérer la fusion (i.e. la séquence de la troisième molécule codant la protéine de fusion) n’importe où dans le génome cible, du moment que cette insertion ne génère aucune mutation (interruption d'un gène ou d’un élément de régulation). Plus particulièrement, il est intéressant de proposer une insertion de la fusion au niveau du locus du gène TRAC, gène qui code la partie constante du domaine a du TCR. Encore plus particulièrement, il est avantageux de réaliser une insertion au niveau du premier exon du locus TRAC, et encore plus avantageusement, immédiatement en 5’ du premier exon.
Une telle insertion au locus TRAC permet non seulement d’obtenir une expression basale similaire à celle des chaines du TCR, et offre une meilleure efficacité antitumorale.
En outre une telle insertion au locus TRAC : - réduit la signalisation d'activation tonique et le développement d'une internalisation efficace et d'une réexpression équilibrée du CAR lors d'une exposition unique ou répétée à un _ antigène. - permet de conserver un phénotype de mémoire naïf/central, de retarder la différenciation et l'épuisement des cellules T effectrices, ce qui en fait de meilleures cellules effectrices. - améliore le profil de sécurité. (Parce que l'absence de TCR réduit le risque d'alloéactivité et d'auto-immunité induites par le TCR, et que l'insertion précise de la séquence codante du CAR réduit le risque d'oncogenèse insertionnelle).
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et où la deuxième molécule comprend son extrémité 5’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase.
De manière plus avantageuse, l’invention concerne la composition telle que définie ci-dessus, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée
5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance de ladite transposase, ladite deuxième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’- 3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence _ orientée 5’-3’ de reconnaissance de ladite transposase, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et en son extrémité 3’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule.
Ici il est défini une possibilité de format de première et deuxième molécules de l’invention.
Cette configuration est schématisée en figure 1B. Bien évidemment, dans le cadre de cet exemple de configuration des première, deuxième et troisième molécules, entre les deux demis sites de transposases des parties 5’ et 3’ de la troisième molécule se trouve la séquence de remplacement, ici, la séquence codant la protéine de fusion contenant la chaine CD34 du
TCR.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition telle que définie ci-dessus, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, suivie d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase et où la deuxième molécule comprend son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase.
De manière encore plus avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, suivie d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, la deuxième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite première séquence de reconnaissance de ladite — transposase de l’extrémité 5’ étant précédé d’une deuxième séquence complémentaire de la ladite deuxième séquence reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et en son extrémité 3’ une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule. lciilest défini une autre possibilité de format de première et deuxième molécules de l'invention.
Cette configuration est schématisée en figure 1C et en figure 1D. Bien évidemment, dans le cadre de cet exemple de configuration des première, deuxième et troisième molécules, entre les deux demis sites de transposase des parties 5’ et 3’ de la troisième molécule se trouve la séquence de remplacement, la séquence codant la protéine de fusion contenant la chaine
CD3€ du TCR.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ d'une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivi d’une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule.
De manière encore plus avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivie d’une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, la deuxième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ d'une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, ladite première séquence étant suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et en son extrémité 3’ une séquence complémentaire de la première séquence de reconnaissance de la transposase de la deuxième molécule.
Cette configuration est schématisée en figure 1E. Bien évidemment, dans le cadre de cet exemple de configuration des première, deuxième et troisième molécules, entre les deux — demis sites de transposase des parties 5’ et 3’ de la troisième molécule se trouve la séquence de remplacement, la séquence codant la protéine de fusion contenant la chaine CD3Z du TCR.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite transposase est une transposase bactérienne, notamment une transposase choisie parmi Tn5, Tn9, Tn10 ou Tc1/mariner.
De manière avantageuse, la transposase susmentionnée est une transposase de type bactérienne choisie parmi la transposase du transposon Tn5, la transposase du transposon
Tn9, la transposase du transposon Tn10, Tn903, Tn602 ou encore la transposase du transposon Tc1, ou plus généralement de la superfamille des transposons mariner.
D’autres exemples de transposases qui peuvent être utilisés dans le cadre de l’invention sont : la transposase de Vibrio harveyi (transposase caractérisée par Agilent et utilisée dans le produit SureSelect QXT), la transposase MuA et un site de reconnaissance de la transposase
Mu comprenant les séquences terminales R1 et R2, la transposase du transposon Tn552 de
Staphylococcus aureus, la transposase du transposon Tn7, la transposase Tn/O et IS10, la transposase du transposon Tn3.
La transposase de Tn5 est la plus connue. Elle est codée par le gène Tnp du transposon Tn5.
Latransposase initie la transposition en formant un dimère de transposases qui se fixe sur ses séquences cibles. Dans le contexte de ce complexe, la transposase catalyse ensuite quatre réactions de transfert de phosphoryle (coupure d'ADN, formation en épingle à cheveux d'ADN, résolution en épingle à cheveux et transfert de brin dans l'ADN cible) entraînant l'intégration du transposon dans son nouveau site d'ADN : il s’agit de la tagmentation.
C'est sur le principe de cette tagmentation que l’invention repose. En utilisant les propriétés de tagmentation des transposases, il est possible d’insérer une séquence dans une autre de manière ciblée, grâce au complexe susmentionné.
Aussi dans le cadre de l'invention, lorsqu’il est fait référence à une transposase, il est fait référence à l’une des transposases susmentionnées, à savoir les transposases des transposons Tn5, Tn9, Tn10 ou Tc1/mariner (ou transposases mutées afin d’augmenter leur activité de transposition ou de tagmentation).
Dans l’invention, lorsque plusieurs transposases sont utilisées simultanément, l’une se liant au complexe formé par la première molécule et à la troisième molécule, et l’autre se liant au complexe formé par la deuxième molécule et la troisième molécule, on privilégiera les couples detransposases issus de transposons Tn5 et Tn10.
De manière avantageuse, la première et la deuxième séquence de reconnaissance de la transposase est une séquence de reconnaissance de la transposase de Tn5 ayant l’une des séquences suivantes : - CTGICTCTTataCAcAtcT (SEQ ID NO : 29), -CTGACTCTTataCACAagT (SEQ ID NO : 30), et - CTGICTCTTgatCAgATCT (SEQ ID NO : 31).
En conséquence les séquences complémentaires correspondantes sont les suivantes :
- AgaTgTGtatAAGAGaCAG (SEQ ID NO : 32), complémentaire de la sequence SEQ ID NO: 29, - ActTGTGtatAAGAGTCAG (SEQ ID NO : 33), complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 30, et -AGATcTGatcAAGAGaCAG (SEQ ID NO : 34), complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 31.
D’autres séquences de reconnaissance d’une transposase sont les suivantes :
Tn5MErev, 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3' (SEQ ID NO : 35)
Tn5ME-A (lllumina FC-121-1030),
S'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'; (SEQ ID NO : 36) et TN5ME-B (lllumina FC-121-1031), 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO : 37)
Encore d’autres séquences de reconnaissance de la transposase sont les suivantes - séquence sens SEQ ID NO : i - séquence antisens SEQ ID NO : i+1, où i varie de 38 à 192.
Cela signifie par exemple que les couples de séquences sens et antisens respectifs suivants sont envisagés : SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO: 41, SEQ
ID NO: 42 et SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID
NO: 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO : 52 et SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO : 56 et SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO : 60 et SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO : 62 et
SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO : 66 et SEQ ID NO: 67, SEQ
ID NO : 68 et SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO : 70 et SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO : 72 et SEQ ID
NO: 73, SEQ ID NO : 74 et SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO : 76 et SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO : 78 et SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO : 80 et SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO : 82 et SEQ ID NO: 83,
SEQ ID NO : 84 et SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO : 86 et SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO : 88 et
SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO : 90 et SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO: 93, SEQ
IDNO: 94 et SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO : 96 et SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 98 et SEQ ID
NO: 99, SEQ ID NO : 100 et SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 102 et SEQ ID NO: 103, SEQ ID
NO : 104 et SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO : 106 et SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO : 108 et SEQ
ID NO: 109, SEQ ID NO : 110 et SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO : 112 et SEQ ID NO: 113, SEQ
ID NO : 114 et SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO : 116 et SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO : 118 et
SEQID NO: 119, SEQ ID NO : 120 et SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 et SEQ ID NO: 123,
SEQ ID NO : 124 et SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO : 126 et SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO : 128 et SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO : 130 et SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO : 132 et SEQ ID NO:
133, SEQ ID NO : 134 et SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO : 136 et SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 et SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO : 140 et SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO : 142 et SEQ ID
NO: 143, SEQ ID NO : 144 et SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO : 146 et SEQ ID NO: 147, SEQ
ID NO : 148 et SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO : 150 et SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO : 152 et
SEQID NO: 153, SEQ ID NO : 154 et SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO : 156 et SEQ ID NO: 157,
SEQ ID NO : 158 et SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO : 160 et SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO : 162 et SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO : 164 et SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO : 166 et SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO : 168 et SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO : 170 et SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 et SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO : 174 et SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO : 176 et SEQ ID
NO: 177, SEQ ID NO : 178 et SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO : 180 et SEQ ID NO: 181, SEQ
ID NO : 182 et SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO : 184 et SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO : 186 et
SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO : 188 et SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO : 190 et SEQ ID NO: 191, et SEQ ID NO : 192 et SEQ ID NO: 193.
De manière avantageuse, le premier domaine riche en G/C de la première molécule (ou de la deuxième molécule) correspond à la séquence suivante GGCGATCGC (SEQ ID NO : 194) de sorte que le deuxième domaine riche en G/C sera le même. En effet, du fait du repliement de la molécule sur elle-même, le deuxième domaine riche en G/C sera dans une orientation complémentaire et antiparallèle par rapport à au premier domaine riche en G/C, et interaction se fera au niveau de la région palindromique (souligné dans la séquence ci-dessus).
Le premier et le deuxième domaine riches en G/C peuvent également être la séquence suivante GCGGCGATCGGC (SEQ ID NO: 195). Les explications ci-dessus s'appliquent mutatis mutandis.
D'autres séquences des domaines riches en G/C de la première molécule ou de la deuxième molécule, peuvent être les suivantes : - premier domaine riche en G/C de séquence GGTCGC (SEQ ID NO : 196) et le second domaine riche en G/C de séquence GCGACC (SEQ ID NO : 197).
Ces exemples sont donnés à titre illustratif seulement et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
Dans un mode de réalisation avantageux, les séquences riches en A/T de la première — molécule dudit complexe sont constituées essentiellement, ou constituées de A ou de T.
De manière encore plus avantageuse, la séquence riche en A/T de la première molécule dudit complexe est constituée de T.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée, où la région intermédiaire de la troisième molécule comprend la séquence SEQ ID NO : 3 ou la séquence
SEQID NO: 1134.
Comme mentionné ci-dessus, la troisième molécule comprend une séquence codant la partie intracellulaire de la chaine CD3 € du TCR. Cette séquence est préférentiellement orientée dans le sens 5'-3’.
La séquence complète de la protéine CD3 Z du TCR est représentée par la séquence SEQ ID
NO:1, où - la partie peptidique de 1 à 21 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 correspond au propeptide, qui est clivé lors de la maturation du CD3 Z, - la partie peptidique de 22 à 30 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 correspond au domaine extracellulaire du CD3 Z, - la partie peptidique de 31 à 51 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 correspond au domaine transmembranaire du CD3 CZ, et - la partie peptidique de 52 à 164 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 correspond au domaine intracellulaire du CD3 €, c’est à dire le domaine transduisant le signal.
La séquence SEQ ID NO : 3 correspond à l'ADN codant la partie intracellulaire de séquence
SEQIDNO:2.
La séquence SEQ ID NO : 1134 correspond à l’ADN codant le domaine transmembranaire et la partie intracellulaire du CD3 Z.
De manière avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où le peptide capable de se lier à une protéine membranaire est un fragment variable simple chaîne (scFv pour Single-chain variable fragment en anglais) reconnaissant une protéine membranaire, notamment la partie extracellulaire d’une protéine membranaire.
La technologie des scFv est particulièrement adaptée à la fusion telle que décrite dans l'invention, car elle permet de reproduire la partie variable des anticorps en fusionnant la partie variable de la chaine légère à la partie variable de la chaine lourde, les deux parties variables étant reliées entre elles par un lien (ou /inker en anglais), la protéine ainsi générée conserve la spécificité de l'mmunoglobuline originale, malgré l'élimination des régions constantes et l'introduction du lien. II est alors possible de créer une molécule d’acides nucléiques permettant de synthétiser le peptide correspondant et donc d'obtenir un « anticorps court » de manière simplifiée. Le lien ou linker a généralement une taille de 10 à 25 acides aminés (soit 30 à 75 — nucléotides) et est généralement riche en glycine pour la flexibilité, ainsi qu'en sérine ou en thréonine pour la solubilité. Le lien peut relier l'extrémité N-terminale de la partie variable de chaine lourde (VH) à l'extrémité C-terminale de la partie variable de la chaine légère (VL), ou inversement.
Les scFv d'intérêt dans le cadre de l'invention sont notamment les scFv dirigés contre des protéines membranaires largement exprimése dans les tumeurs, telles que CD19, BCma,
CD123, CD20, CD22, CD38, LeY, ROR1, c-MET, CD133, CD171, CD70, CEA, EGFR-VIII,
EpCAM, EphA2, FAP, c-KIT, FIt3, VEGFR2, PSMA, PSCA, MUC1, IL13Ra2, HER2, FAP,
GD2, GPC3, Mésothéline, EllIB, gp100/HLA-A2, HLA-A2-WT1Db126, HA-1 H/HLA-A2, HLA-
A*02:01, PD-1, PD-L1, CTLA-4 and TGFB. Cette liste n’est bien évidemment pas limitative.
De manière avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où le peptide capable de se lier à une protéine membranaire est un peptide fusionné à la streptavidine. De cette manière lorsque le peptide de fusion (peptide streptavidine extracellulaire et partie intracellulaire d’activation comprenant la chaine CD3€ du TCR), il est possible de venir coupler à façon des anticorps spécifiques dont la chaine lourde est associée à de la biotine. La streptavidine et la biotine vont alors interagir de manière spécifique, ce qui reproduira une chimère hybride permettant de reconnaître la cible cellulaire par l'intermédiaire de l’anticorps et d'activer le signal recherché par l’intermédiaire de la chaine CD3C du TCR.
Le peptide capable de se lier à une protéine membranaire peut également être le ligand d’un récepteur membranaire retrouvé sur la cellule cible. II peut s’agir par exemple d’une cytokine, comme par exemple l’IL-13 qui reconnaitra le récepteur IL13ra, mais aussi le ligand des récepteurs FIt3, c-Kit, c-Met, VEGFR2, PD1, HER2, EGFR, TNFRs, NKG2, CD116 (récepteur du GM-CSF)... ici encore cette liste n’est pas limitative.
De manière avantageuse, l’invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, OÙ le domaine de coactivation correspond au domaine de co-activation d’une protéine choisie parmi CD28, 4-1BB, OX40 ou ICOS.
Tel qu'utilisé dans la présente description, le terme « domaine de coactivation » « "région de signalisation costimulatoire » se réfère à la partie du récepteur chimérique des cellules T comprenant le domaine intracellulaire d'une molécule costimulatoire. Les molécules costimulatrices sont des molécules de surface cellulaire autres que les récepteurs d'antigènes ou leurs ligands qui sont nécessaires pour une réponse efficace des lymphocytes à l'antigène.
Des exemples de telles molécules comprennent CD28, 4-1BB, DAP-10 et ICOS. Par exemple, des TCR chimériques contenant le domaine intracellulaire de - CD28 (SEQ ID NO : 1135), - 4-1BB (séquence complète donnée dans Seq ID No : 1136), - ICOS (séquence complète donnée dans Seq ID No : 1137) et - DAP-10 (Seq ID No : 1138) sont employés de manière appropriée dans le cadre de la présente invention.
De manière encore plus avantageuse, l'invention concerne la composition telle que définie ci- dessus, où les première, deuxième et troisième molécules sont choisies parmi les triplets tels que définis dans le tableau 2 ci-dessous.
De manière avantageuse, l’invention concerne une composition comprenant l’un des triplets de première deuxième et troisième molécules décrits dans le tableau 2 suivant : [Table 2]
Triplet Première molécule | Deuxième molécule | Troisième molécule
OO Gano ao | aoe
EE. | 8 | 8 | æ æ | #æ | æ | #æ # | æ | = | =æ
[B
EE | 08 108 | 8
HM SE
Ow | @æ | æ | #æ [a | æ@ powæ | æ | 8 | #8 me [
La
Lee pos [a To [B ee
Oe [a power | @ 1er | 8 ee
[
Ow | @ 1m | me [ne
[A
Oe 18
HM
Om [
Oe 18 TE
Oe RE A
Aussi, avantageusement l'invention concerne la composition susmentionnée, ladite composition comprenant un triplet choisi parmi les triplets #1 à #312 susmentionnés.
De manière avantageuse, l’invention concerne la composition telle que décrite ci-dessus,
comprenant en outre
* une quatrième molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence A’ permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d'un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une cinquième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une sixième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites cinquième et sixième séquences riches en T comprenant respectivement un cinquième et un sixième domaine de 6 à 12 nucléotides riches enG/C, la séquence du cinquième domaine étant complémentaire de la séquence du sixième domaine, ledit cinquième et sixième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence A’, ladite quatrième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientés 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase,
* une cinquième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B’ permettant l'insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B’ complémentaire étant liée en 5 à une septième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une huitième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, ladite septième et huitième séquence riche en T comprenant respectivement un septième et un huitième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G-C, la séquence du septième domaine étant complémentaire de la séquence du huitième domaine, ledit septième et huitième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B’, ladite cinquième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première sequence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B’ étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d'intérêt, la séquence A’ étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt et la séquence B’ positionnée en 3’ de la région d’intérêt dudit acide nucléique d'intérêt, et
** une sixième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule,
* dans sa partie 3’ au moins une séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et
* une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxieme molecule, une sequence complementaire de ladite sequence codant ladite proteine de fusion contenue dans la troisième molécule, c’est à dire une séquence complémentaire de la séquence codant la chaine CD3€ du TCR, les quatrième et sixième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les cinquième et sixième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
De manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend 6 molécules, soit deux triplets qui permettent un remplacement double brin d’une molécule cible. Ce remplacement pourra se faire seulement si les régions A, Bet A’ et B’ sont correctement choisies de sorte que la région d'intérêt à remplacer soit correctement encadrée.
Bien évidemment, toutes les définitions données pour la composition comprenant 3 molécules s'appliquent mutatis mutandis pour une composition comprenant 6 molécules.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée, où - ladite séquence A comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC, - ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions encadrant avantageusement une région 5’ région du locus du gène codant la protéine TRAC, et où - ladite séquence A’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une troisième region du locus du gène codant la protéine TRAC, - ladite séquence B’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une quatrième région du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite séquence A’ et la dite séquence B’ étant deux séquences différentes, lesdites troisième et quatrième régions du locus du gène codant la protéine TRAC, encadrant avantageusement une séquence complémentaire de ladite région 5’ du locus du gène codant la protéine TRAC, et où la séquence A et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence A et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence B et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, et la séquence B et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires.
Par « au plus en partie complémentaires » on entend dans l’invention que les séquences possèdent des séquences qui sont capables de s’apparier selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick, mais pas sur la totalité des séquences. En d’autres termes, seule une parte des séquences est complémentaire. De manière avantageuse les séquences A, A’,
Bet B’ sont en partie complémentaires sur moins de 50% des séquences, notamment moins de 30% des séquences, en particulier moins de 10% des séquences , notamment ne sont pas du tout complémentaires entre elles.
De cette manière il est possible d’encadrer la partie 5’ du locus TRAC (juste en amont du premier exon) de manière spécifique et orienté, pour les deux brins, afin d'éviter des recombinaisons (i.e. des tagmentations) désordonnées ou incohérentes de sorte que le résultat ne serait pas celui escompté.
Il est également envisageable de créer une molécule comprenant la séquence de fusion et l’exon 1 du gène TRAC, de sorte que l'insertion se fait par remplacement de l’exon 1 par une séquence contenant la séquence codante de la fusion contenant le CD3C du TCR, suivi d’une séquence de terminaison de la transcription, elle-même suivie de la séquence de l’exon 1 de
TRAC. Un exemple de recombinaison au locus de TRAC est représenté schématiquement à la figure 6.
De manière encore plus avantageuse, la composition susmentionnée comprend l’un au moins des sextuplets mentionnés dans le tableau 3 suivant : [Table 3]
Première | Deuxième | Troisième | Cinquième | Quatrième | Sixième molécule | molécule | molécule | molécule | molécule | molécule
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO : NO : NO : NO : NO: NO: [=| ==] ==] [| #8 | æ | æ n= | 8 | # | æ | æ | m | #
pe 1e 18 18 18 [| ST =| | | | |E a pe | | | | [en [en ma | | oi
A | | | | [en [en a jo
© | #8 | a | a | [Te 8 | | 7e [Om [Te IR a | 8 | ew | a [Oe [Te [Te us |E #5 | | ww [we
#8 | || |E pra 1e | | [oe pre | || A au | a Tes | [ee | Ee
La composition selon l'invention, propose ainsi de manière avantageuse, 156 sextuplets de molécules permettant l’insertion au locus du gène TRAC d’une séquence hybride codant une protéine de fusion comprenant la chaine CD3€ du TCR, et comprenant dans sa partie N- terminale une séquence protéique reconnaissant un peptide exprimé à la surface d’une cellule cible.
Cela permet donc en fonction de la cellule cible de restaurer une fonction perdue par la mutation, et de réaliser une complémentation fonctionnelle.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une cellule immunitaire, notamment un Iymphocyte
T, comprenant une composition telle que définie ci-dessus. La cellule immunitaire susmentionnée est isolée et purifiée, hors de son contexte naturel.
La cellule immunitaire dont il est question est dans état où la recombinaison, c’est à dire l'insertion n’a pas encore été réalisée. La cellule contient dans son cytoplasme ou son noyau, ou les deux, le complexe moléculaire tel qu’il est formé par les triplets de première, deuxième et troisième molécules, et éventuellement les sextuplets comprenant en outre les quatrième, cinquième et sixième molécules, susmentionnées.
La cellule immunitaire est encore plus avantageusement une cellule immunitaire infiltrante d’une tumeur, en particulier une cellule T infiltrante.
S'il est escompté de réaliser une insertion simple brin, par exemple pour réaliser une insertion de sorte que la cellule résultante possèdera deux allèles différents : un allèle possédant une insertion, et un allèle ne possédant pas insertion, il sera avantageux d’utiliser la composition comprenant les première, deuxième et troisième molécules. II en sera de même si un remplacement est réalisé sur un ARN, et en particulier un ARN messager.
En revanche si une insertion double brin est souhaitée, il sera avantageux d’utiliser les première, deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième molécules.
La composition selon l'invention est introduite dans la cellule immunitaire selon des techniques de transfection bien connues de l’homme du métier, et notamment l’électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. L'homme du métier saura choisir la meilleure technique selon la nature de la cellule immunitaire ciblée.
Il est d’ailleurs avantageux que la cellule comprenne une composition comprenant l’un — quelconque des triplets du tableau 2, ou l’un quelconque des sextuplets du tableau 3.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la composition susmentionnée, ou encore une cellule immunitaire susdécrite, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition susmentionnée, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être utilisée dans le cadre du traitement de pathologies. Le véhicule est un véhicule communément admis et connu de l’homme du métier, par exemple de l’eau distillée, ou encore un tampon physiologique. Ce véhicule doit permettre la formation d’un complexe comme mentionné ci-dessus, mais aussi être acceptable pour une cellule ou un être vivant.
Il en est de même pour la cellule. Celle-ci est mise en contact avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable qui a pour propriété de la maintenir en vie (ne pas affecter la membrane, et ne pas induire des phénomènes de mort cellulaire) et être compatible avec un organisme vivant.
Dans un autre aspect, l’invention concerne la composition susmentionnée, ou la cellule immunitaire susmentionnée, en tant que médicament.
Il est d’ailleurs avantageux que la composition comprenant l’un quelconque des triplets du tableau 2, ou l’un quelconque des sextuplets du tableau 3 soit utilisée en tant que médicament.
Dans encore un autre aspect, l'invention concerne la composition susmentionnée, ou la cellule immunitaire susmentionnée, pour son utilisation pour le traitement du cancer.
Dans la mesure ou la composition susmentionnée a pour objectif de fournir des cellules CAR, il est particulièrement pertinent d'utiliser cette composition pour traiter le cancer.
La composition sera adaptée à la cellule cancéreuse cible, en choisissant la partie extracellulaire de la protéine de fusion de manière à cibler une cellule tumorale déterminée.
L'expression par les lymphocytes modifiés par la composition selon l’invention assure ainsi la spécificité vis-à-vis de l'antigène tumoral. || suffit alors d'injecter au patient quelques dizaines _ oucentaines de millions de lymphocytes exprimant le CAR. Enfin, comme ils prolifèrent in vivo, les lymphocytes modifiés persistent pendant des semaines, voire des mois, et participent ainsi à la réduction voire la destruction de la tumeur en tuant les cellules cancéreuses.
De manière avantageuse, l’invention concerne une méthode de traitement du cancer chez un patient dans le besoin, la méthode comprenant l’administration d’une dose efficace de composition telle que décrite ci-dessus. En particulier, la méthode susmentionnée comprend l’administration d’une quantité efficace de cellules immunitaires comprenant ladite composition telle que décrite ci-dessus.
De manière avantageuse, le cancer peut être de tout type et concerner des tumeurs solides et des tumeurs hématopoïétiques de tout type. Le cancer peut donc notamment être - de type hématopoïétique : la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), la leucémie lymphoïde chronique (LLC), le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL), le lymphome folliculaire (FL), lymphome à cellules du manteau (MCL), le myélome multiple (MM), le lymphome non hodgkinien (NHL), la leucémie multiple aiguë (LMA), les cancers CD19 positifs, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la leucémie aigüe myéloïde (LAM), la leucémie lymphocytaire de petite taille (SLL), et les malignités CD20 positives, ou de type solide : le neuroblastome (NB), le gliome, le mésothéliome, le cancer du poumon, le cancer de l'ovaire (OC), le cancer du sein (BC), le sarcome, l’ostéosarcome (OS), le carcinome hépatocellulaire (HCC), le cancer HER2 positif, le cancer EGFRVIII positif, le glioblastome (GBM), le cancer du pancréas (PC), le cancer positif pour MUC1, le cancer de la prostate (PCa), l’adénocarcinome colorectal (COADREAD), le cancer colorectal (CRC), le mélanome (MEL), le méduloblastome (MB), le cancer gastrique (GC), le cancer du foie, le cancer du cou, le cancer de la tête, le cancer de la peau, le cancer des os, le cancer du cerveau, le cancer colorectal, le cancer de l'estomac, la tumeur de la vessie associée, le cancer des testicules, le cancer de la thyroïde, le cancer de l'endomètre, le cancer du col de l'utérus et endocervical.
Dans un autre aspect, l'invention concerne l’utilisation d’une composition susmentionnée, pour insérer, dans une cellule lymphocytaire T, une séquence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR, sous réserve que l’utilisation ne comprenne pas un procédé pour la modification de l'identité génétique germinale d’êtres humains et que ladite utilisation ne soit pas une méthode pour le traitement du corps humain ou animal par une chirurgie ou une thérapie.
Cette insertion est préférentiellement localisée au locus TRAC comme décrit ci-dessus.
Comme expliqué ci-dessus la composition permet de cibler spécifiquement une région cible et de la remplacer par une séquence d'intérêt, en utilisant les propriétés de tagmentation des transposases.
La composition selon l’invention est notamment avantageuse pour des cellules CAR in vitro, c’est à dire des cellules T modifiées exprimant outre le récepteur T (TCR), un récepteur T chimérique qui permet le ciblage cellulaire spécifique de tumeurs.
L’invention concerne en outre une méthode d’insertion, notamment in vitro, d’une séquence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la …— chaine CD3€ du TCR, ladite méthode comprenant : - la mise en contact, afin d’obtenir un complexe de remplacement, d’une composition telle que définie ci-dessus, avec un acide nucléique cible comprenant au moins une région 5’ du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite composition étant telle que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, et la troisième molécule comprend la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ladite composition, pour obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la séquence codant la protéine de fusion insérée dans l’acide nucléique cible entre la première et la deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC.
De manière avantageuse, l’invention concerne une méthode d'insertion in vitro d’une sequence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR, ladite méthode comprenant : - la mise en contact, afin d’obtenir un complexe de remplacement, d’une composition avec un acide nucléique cible comprenant au moins une région 5’ du locus du gène codant la protéine
TRAC, ladite composition comprenant un triplet tel que défini dans le tableau 2 ou un sextuplet tel que défini dans le tableau 3 - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ladite composition, pour obtenir un complexe de recombinaison, et -larecombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la séquence codant la protéine de fusion insérée dans l’acide nucléique cible entre la première et la deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode de production de cellules T à récepteur antigénique chimérique ou CAR T cell comprenant la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD34 du TCR, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie ci-dessus, avec une cellule T purifiée, l'ADN génomique de ladite cellule T purifiée comprenant le locus du gène codant la protéine
TRAC, ladite composition ou ledit ensemble étant tel que la séquence À de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, et la troisième molécule comprend la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir une cellule CART, VADN génomique de ladite cellule CART comprenant la séquence codant ladite protéine de fusion au locus du gène codant la protéine TRAC, et - la purification de la cellule CAR T.
Avantageusement, l'invention concerne une méthode de production de cellules T à récepteur antigénique chimérique ou CAR T cell comprenant la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3C du TCR, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition avec une cellule T purifiée, l'ADN génomique de ladite cellule T purifiée comprenant le locus du gène codant la protéine TRAC, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir une cellule CART, l'ADN … génomique de ladite cellule CART comprenant la séquence codant ladite protéine de fusion au locus du gène codant la protéine TRAC, et - la purification de la cellule CAR T.
L'invention concerne également une cellule Iymphoïde T modifiée susceptible d’être obtenue par la méthode susmentionnée, ladite cellule lymphoïde T modifiée comprenant dans son génome une insertion d’une séquence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR, ladite insertion étant localisée au locus du gène codant la protéine TRAC.
Du fait de la recombinaison par « tagmentation » opérée par les transposases, et de la signature moléculaire qu’une telle recombinaison engendre, c’est-à-dire une modification génique au niveau des zones de clivage de l'ADN par les transposases, ces cellules lymphocytaires ne peuvent être définie plus précisément que par leur méthode d’obtention.
Ces cellules sont reconnaissables par les zones de reconnaissance des régions A, B, et éventuellement A’ et B’, qui différeront des séquences originelles.
Ces cellules sont nouvelles, et diffèrent de celles qui pourraient être obtenues par exemple avec les technologies modernes d’édition du génome, comme CRISPR/Cas9.
Brève description des figures
L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples ci-après et des figures suivantes : [Fig. 1A] est une première représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 1B] est une deuxième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 1C] est une troisième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 1D] est une quatrième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 1E] est une cinquième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 2] est un schéma montrant le principe et les étapes du remplacement simple brin en utilisant les première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. — [Fig. 3] est un schéma montrant le principe et les étapes du remplacement double brin en utilisant les première, deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 4] est un schéma montrant l’association des molécules contenues dans le tube 1 de l'exemple 1. La boule noire représente la biotine. [Fig. 5] est un schéma montrant l’association des molécules contenues dans le tube 2 de l'exemple 1. La boule noire représente la biotine. [Fig. 6] est un schéma montrant l’insertion d’une fusion ScFV-domaine co-activateur-CD3C. A. illustre le locus TRAC à proximité des locus TRAV et TRAJ, et la zone de reconnaissance autour de l’exon 1 du complexe formé de la première, la troisième molécule (qui contient la sequence de fusion et l’'exon 1 de TRAC) et la deuxième molécule. B. représente la tagmentation en présence des transposases. C. représente le résultat de l’insertion au locus
TRAC de la séquence de fusion. D. représente schématiquement la protéine codée par la séquence de fusion insérée au locus TRAC. * représente le scFv exposé à l’extérieur de la cellules T, ** représente le domaine coactivateur (par exemple CD28), et *** représente le domaine intracellulaire activateur de CD3C.
Exemples
Exemple 1 - Obtention de cellules B exprimant une fusion CAR
Afin de traiter les patients atteints de cancer exprimant le marqueur CD19, il peut être avantageux de proposer une thérapie cellulaire visant à greffer chez des patients des cellules
CART CD19 scFv- CD3Z + ayant été modifiées à l’aide d’une composition selon l’invention, notamment pour insérer la séquence codant la protéine de fusion au locus TRAC, dans des lymphocytes T du patients (afin de limiter les rejets).
A- Isolation des cellules T à partir de sang
Des échantillons de sang de donneurs sains sont collectés, frais ou congelés.
Les échantillons sont centrifugés à 1000g pendant 8min sans frein sur milieu de centrifugation à gradient de densité stérile (par exemple Ficoll en présence d’EDTA) pour isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (en anglais PBMC pour Peripheral Blood Mononuclear
Cells);
Les anneaux de globules blancs sont collectés et lavés au tampon phosphate PBS (en anglais pour Phosphate Buffered Saline) -
Les globules blancs sont cultivées 12h à 37°C et 5% CO: en milieu spécifiquement dédié à la culture des cellules hématopoiétiques supplémenté en IL-2 (20ng/mL) et en sérum humain 5%.
Les lymphocytes T sont ensuite isolés au trieur cellulaire par sélection positive grâce à un marquage par anticorps anti-CD3 ou par sélection négative grâce à un cocktail d’anticorps anti-CD2, anti-CD34, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD24, anti-CD56n anti-CD66b et anti-CD61 ;
Les cellules T purifiées sont ensuite cultivées à 37°C et 5% CO2 pendant 72h sous un cocktail …— d'activation CD3/28 et IL-2 (40ng/mL).
Les cellules sont ainsi prêtes à être transfectées avec la composition selon l’invention.
B- Préparation des molécules de la composition selon l’invention
Afin de cibler le gène TRAC, et vérifier l’insertion au locus TRAC Chr14: 22,547,500- 22,552,358 HG38GR, une construction comprenant la GFP a été préparée.
Deux tubes ont été préparés comme suit : * Tube 1 (10pL) : - Voligo Great X1 (10uM) correspondant à la molécule 1 de séquence SEQ ID : 198 suivante 5.
AgaTgTGtatAAGAGaCAGGTAGTGTATTTTTTTTTTTTTTTTTATCATCCTGtCTCTTataCAcA teTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGACATCCAGC
TGGATCCAAAACCAAATTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTGATACATTT
AgaTgTGtatAAGAGaCAGGATGAT-3 - l’oligo Great X3 (10uM) correspondant à la molécule 4, de séquence SEQ ID : 201 suivante
BL
CACGTGCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTCTCGATCATTATTATTTTTTGGCGATCGCTTTTTTT
TTTTTTTTTCATTGCCGAGGCCACCAGGGCTGGCTCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATC
GCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGCACGTGTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTCAGCTATACTGtCTCTTataCAcAtcT-3' - l’oligo reverse GREAT X1 Rev (10uM) correspondant à la partie 5’ de la molécule 3 de séquence SEQ ID NO : 1139 suivante 5.
TACACTACCTGtCTCTTataCAcAteTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTggttacGCGGCCGCCGT
ACA-3’ - l’oligo reverse GREAT X3 Rev (10uM) correspondant à la partie 3’ de la molécule 6 de séquence SEQ ID NO : 1140 suivante 5
TGTACGGCGGCCGCgtaaccTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGTAT
AGCTG-3’ - l’oligo Reverse Helix Rev correspondant à un brin additionnel permettant de lier une hélicase par l'extrémité 3’ biotinylée, l’oligo ayant la séquence SEQ ID NO : 1141 suivante 5’-ATAATAATGATCGAGAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[Biot]-3 * Tube 2 (10pL) : - l’oligo Great X2 (10uM) correspondant à la molécule 2, de séquence SEQ ID NO : 199 suivante 5-
CACGTGCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTCTCGATCATTATTATTTTTTGGCGATCGCTTTTTTT
TTTTTTT
TTGTTGGAGCCACTGACCCTGCCAGAATATGGTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGCACGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAC
GAATACTGtCTCTTataCAcAtcT-3' - l’oligo Great X4 (10pM) correspondant à la molécule 5, de séquence SEQ ID NO : 202 suivante : 5
AgaTgTGtatAAGAGaCAGAGTATGAATTTTTTTTTTTTTTTTTATCATCCTGtCTCTTataCAcA tcTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTCTGCATGACTCACT
AGCACTCTATCACGGCTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTGATACATT
TAgaTgTGtatAAGAGaCAGGATGAT-3
- l’oligo reverse GREAT X2 Rev (10uM) correspondant à la partie 3’ de la molécule 3 de séquence SEQ ID NO : 1142 suivante 5.
CGATACGGTACCatgtteTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGTATTCG
TC-3 - l’oligo reverse GREAT X4 Rev (10uM) correspondant à la partie 5’ de la molécule 6 SEQ ID
NO : 1143 suivante 5.
TTCATACTCTGtCTCTTataCAcAteTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTgaacatSGTACCGTATCG -3 - Voligo Reverse Helix Rev correspondant à un brin additionnel permettant de lier une hélicase par l’extrémité 3’ biotinylée, l’oligo ayant la séquence SEQ ID NO : 1142.
Les deux tubes sont alors chauffés à 95°C pendant 5 min puis laissés 1h à température ambiante puis chaque tube est alors digéré avec les enzymes de restriction correspondantes : Tube 1 : Not! et Tube 2 : Kpnl puis purifié par PCR purification kit (élution 20uL).
Les figures 4 et 5 représentent schématiquement le contenu des tubes 1 et 2 respectivement avant la digestion enzymatique.
En parallèle, la séquence anti-CD19-CD3€-P2A-GFP a été obtenue via amplification directe par bactéries DH5a du plasmide pSLCAR-CD19-CD3 €. Cette séquence est amplifiée (oligos avec architecture de site de restriction Notl et Kpnl digérés après PCR) puis digérée avec les enzymes de restriction correspondantes et purifiée par kit PCR purification élué à un volume de 20uL. La fusion GFP- CD19-CD3Z est alors à bouts flanquants (i.e. demi-site Notl et Kpnl libres) dans le tube 3.
Le contenu des 3 tubes (tube 1, tube 2 et tube 3) est alors mélangé et de la ligase de phage
T4 est ajoutée au mélange (4uL, 100 U) en présence de tampon approprié (tampon T4 ; 5uL 10X) et 11uL d’eau distillée. Le mélange est laissé 1h à température ambiante. Puis le mélange est purifié sur gel (3OUL d’élution) afin d’isoler le fragment le plus important GFP-CD19-CD3Z, supérieur à 1Kb, et comportant les quatre sarcophages X1, X2, X3 et X4 à ses extrémités 5’ et 3’. Le fragment purifié est prêt à être utilisé et comprend les première, deuxième, quatrième et cinquième molécules aux extrémités, les troisième et sixième molécules correspondant à la fusion GFP-CD19-CD3€ (tube 4).
Le fragment GFP- CD19-CD3Z de remplacement avec ses quatre sarcophages positionnés aux extrémités 5’ et 3’ est alors prêt à recevoir les dimères de transposases.
A ce stade, l’oligonucléotide simple brin modifié complémentaire d’une partie des première et quatrième molécules, la partie 3’ de l’oligonucléotide simple brin modifié complémentaire étant couplée à de la biotine (oligo biotinylé), a été ajouté. Cette molécule biotinylée n’est pas obligatoire.
C- Transfection de lymphocytes T avec la composition selon l’invention.
Le contenu du tube 4, contenant l’oligo biotinylé ou non, est alors utilisé pour transfecter par électroporation les cellules lymphocytes T isolées.
Les cellules sont centrifugées à 300g pendant 5min et lavées au PBS avant d’être suspendues dans du tampon électrolytique à une densité cellulaire de 75 000 à 100 000 cellules par chambre d’électroporation. Le contenu du tube 4, ainsi qu’un plasmide codant la protéine Tn5, et éventuellement un plasmide codant une fusion hélicase-streptavidine (UVRD-mSA) est ajouté dans la chambre d’électroporation selon le protocole « Episomal iPSC Reprogramming
Vectors » du système de transfection Neon® Transfert System proposé par Thermofisher.
Le mélange est électroporé à 1650V par trois séquences de 10 ms.
Les cellules sont ensuite immédiatement centrifugées à 300g pendant 5min et suspendues dans du milieu de culture pour cellules hematopoïétiques supplémenté pendant 48 à 96h à 37°C et 5% de CO».
La tagmentation (ie. le remplacement génique) est alors possible. Les cellules sont entretenues dans un milieu de culture approprié.
D- Vérification de la transfection
Les cellules transfectées ayant inséré au locus la molécule d’intérêt sont sélectionnées au moyen de la sélection par un antibiotique dont le gène de résistance est contenu dans la séquence de remplacement (par exemple la néomycine, la bléomycine, blasticidine S etc…).
Une simple PCR en utilisant un oligonucléotide sens en 5’ de l’insertion et un oligonucléotide antisens en 3’ de l’insertion est réalisée (Sing/e-Tail Adapter/Tag (STAT)-PCR based method).
Le produit de PCR est alors séquencé selon les techniques classiques, afin de détecter dans la région d'intérêt au moins la présence de la GFP, signe de de l’insertion de la fusion.
Les cellules transfectées peuvent également être détectées par cytométrie afin de détecter "expression de la GFP.
Il peut également être réalisé une transcription inverse sur cellules isolées afin d’obtenir une banque d’ADNc. Une amplification de la séquence de fusion est alors réalisée par PCR Oligos pour la PCR et le séquençage antiCD19 : AGGAGTCCCATCAAGGTTCAGT (SEQ ID NO: 1144) et GFP Rev: CACGAACTCCAGCAGGACCATG (SEQ ID NO : 1145) et le fragment amplifié est sequence en séquençage de Sanger mais aussi migré sur gel d’agarose. Comme attendu, après analyse (NCBI blast), on retrouve une similitude très proche avec le fragment
GFP-CD19-CD3€ théorique au locus TRAC.
E- Analyse fonctionnelle des cellules T modifiées par la composition selon l’invention
Afin de vérifier que les cellules ont été transfectées efficacement et que l’insertion est fonctionnelle, plusieurs tests sont réalisés : 1- Test de prolifération des cellules CAR T
Les cellules T produites sont cultivées en plaque 24 puits en milieu non supplémenté en IL-2 et en présence de cellules de Raji irradiées (ratio 1:1) à 37°C et 5% CO; ;
Une fraction des cellules T est récoltée au bout de 4, 7 et 10 jours afin de les compter par cytométrie en flux. 2- Test de cytotoxicité des cellules CAR T
Les cellules T produites sont cultivées en plaque 12 puits en milieu non supplémenté en IL-2 et en présence de cellules de Raji exprimant un fluorochrome (ratio 3:1) à 37°C et 5% CO» ;
Apres 24h d’incubation, une fraction des cellules est récoltée pour quantifier la présence du fluorochrome par cytométrie en flux et le reste des cellules est remis en culture avec un ratio additionnel de cellules de Raji ;
Cette étape est reproduite à 36h et à 48h d’incubation.
Exemple 2 - Autre format de fusion CD3Z.
Il est également possible de réaliser une autre fusion en suivant le protocole décrit ci-dessus dans l’exemple 1.
Le tube 1 est préparé comme décrit dans l’exemple suf pour les séquences suivantes - l’oligo reverse GREAT X1 Rev (10uM) correspondant à la partie 5’ de la molécule 3 de sequence SEQ ID NO : 1146 suivante 5.
TACACTACCTGtCTCTTataCAcAteTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTggttacACCGGTCGTACA -3 - l’oligo reverse GREAT X3 Rev (10uM) correspondant à la partie 3’ de la molécule 6 de sequence SEQ ID NO : 1147 suivante 5.
TGTACGACCGGTgtaaccTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGTATAGC
TG-3’
Le tube 2 est préparé comme suit - l’oligo reverse GREAT X2 Rev (10uM) correspondant à la partie 3’ de la molécule 3 de séquence SEQ ID NO : 1148 suivante 5.
CGATACCCGCGGatgtteTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGTATTCG
TC-3’ - l’oligo reverse GREAT X4 Rev (10uM) correspondant à la partie 5’ de la molécule 6 SEQ ID
NO : 1149 suivante 5.
TTCATACTCTGtCTCTTataCAcAteTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTgaacattCGCGGGTATC
G-3’ - l’oligo Reverse Helix Rev correspondant à un brin additionnel permettant de lier une hélicase par l’extrémité 3’ biotinylée, l’oligo ayant la séquence SEQ ID NO : 1142.
Les deux tubes sont alors chauffés à 95°C pendant 5 min puis laissés 1h à température ambiante puis chaque tube est alors digéré avec les enzymes de restriction correspondantes : Tube 1 : Agel et Tube 2 : Sacll puis purifié par PCR purification kit (élution 20uL).
En parallèle, la séquence anti-CD19-CD3€-P2A-GFP a été obtenue via amplification directe par bactéries DH5a du plasmide pSLCAR-CD19-CD3 €. Ce plasmide est alors digéré via les sites de restrictions Agel et Sacll puis la séquence CD19- CD3Z-P2A-GFP est alors purifiée par kit de gel purification à un volume de 20pL. La fusion CD19-CD3Z-P2A-GFP est alors à bouts flanquants (i.e. demi-site Agel et Sacll libres) dans le tube 3.
Le contenu des 3 tubes (tube 1, tube 2 et tube 3) est alors mélangé et de la ligase de phage
T4 est ajouté au mélange (4pL, 100 U) en présence de tampon approprié (tampon T4 ; 5uL 10X) et 11pL d’eau distillée. Le mélange est laissé 1h à température ambiante. Puis le mélange est purifié sur gel (30uL d’élution) afin d’isoler le fragment le plus important CD19-CD3Z-P2A-
GFP, supérieur à 1Kb, et comportant les quatre sarcophages X1, X2, X3 et X4 à ses extrémités 5’ et 3’. Le fragment purifié est prêt à être utilisé et comprend les première, deuxième, — quatrième et cinquième molécules aux extrémités, les troisième et sixième molécules correspondant à la fusion CD19-CD3Z-P2A-GFP (tube 4).
Le fragment CD19-CD3Z-P2A-GFP de remplacement avec ses quatre sarcophages positionnés aux extrémités 5’ et 3’ est alors prêt à recevoir les dimères de transposases.
Ace stade, l’oligonucléotide simple brin modifié complémentaire d’une partie des première et quatrième molécules, la partie 3’ de l’oligonucléotide simple brin modifié complémentaire étant couplée à de la biotine (oligo biotinylé), a été ajouté. Cette molécule biotynylée n’est pas obligatoire.
La transfection est réalisée comme décrit à l’exemple 1.
La vérification de la transfection est réalisée comme décrit à l’exemple 1, sauf pour la détection par transcriptase inverse. Une amplification de la séquence de fusion est alors réalisée par
PCR Oligos pour la PCR et le séquençage antiCD19 : AGGAGTCCCATCAAGGTTCAGT (SEQ ID NO : 1144) et GFP Rev : CACGAACTCCAGCAGGACCATG (SEQ ID NO : 1145) et le fragment amplifié est séquencé en séquençage de Sanger mais aussi migré sur gel d’agarose. Comme attendu, après analyse (NCBI blast), on retrouve une similitude très proche avec le fragment CD19-CD3€-P2A-GFP théorique au locus TRAC.
Exemple 3 — Obtention de cellules T exprimant le la fusion contenant le CD37 à partir de cellules souches pluripotentes.
Dans la mesure où il peut être difficile d’obtenir des cellules T chez le patient, il est possible d'utiliser la technologie des cellules pluripotentes induites (iPSc).
Les cellules iPSc peuvent être issues de banques de de cellules, dont le profil immunologique est compatible avec les patients.
Il est possible également de prélever des cellules différenciées chez le patient (par exemple des fibroblastes ou encore des cellules épithéliales), et de forcer la dédifférenciation par expression des gènes Oct4 et Socs2, ainsi que d’autres gènes tels que KIf4, Dub3, c-Myc,
Nanog. De telles techniques sont désormais bien connues de l'homme du métier, et il pourra adapter les protocoles décrits dans l’art antérieur selon le type cellulaire qu’il souhaitera engager dans un modèle de dédifférenciation.
A ce stade il est possible de de transfecter les cellules iPSc avec de la lipofectamine en présence du tube 4 comme décrit à l'exemple 1 ou à l’exemple 2.
Les cellules transfectées sont sélectionnées par utilisation de l’antibiotique approprié, et l'insertion est vérifiée comme décrit à l’exemple 1.
Les cellules iPSc sont cultivées sur plaques enduites de gel de matrice cellulaire, en coculture avec des fibroblastes embryonnaires murins inactivés pendant 24h, en milieu de culture complet pour les cellules souches et supplémenté en bFGF et d’inhibiteur de ROCK.
Les cellules iPSc sont ensuite cultivées pendant 7jours dans milieux de culture de 24h contenant des cocktails de différentiation distincts chaque jour : o J0-1: milieu supplémenté en hBMP-4, hVEGF, hWnt3a et KOSR ; oO J2: milieu supplémenté en hBMP-4, hVEGF et KOSR ;
Oo J3: milieu supplémenté en hBMP-4, hVEGF et bFGF ; o J4-5: milieu supplémenté en hVEGF et bFGF ;
o J6: milieu IMDM supplémenté en F 12, B27, N2, BSA, hVEGF, bFGF, human stem cell factor et hFIt3 ligand ; o J7: milieu IMDM supplémenté en F12, B27, N2, BSA, hVEGF, bFGF, human stem cell factor, hFIt3 ligand, TPO, IL-6, hEPOgen, et FICZ (6-formylindolo [3,2-b]carbazole)
Au bout de 7 jours, les cellules sont ensuite maintenues en culture pendant 3 à 7 jours supplémentaires avant de poursuivre les expérimentations sur les cellules non adhérentes récoltées. Ces cellules sont testées pour vérifier qu’elles expriment le marqueur CD34+, par cytométrie de flux en utilisant un anticorps anti-CD34.
Siles cellules n’ont pas été transfectées au stade iPSc, elles peuvent dès lors être transfectées au stade CD34+ comme décrit à l'exemple 1.
Leur différenciation en cellules T est alors induite comme suit : - Différentiation en cellules progénitrices de la lignée lymphoiïde :
Les cellules CD34+ obtenues sont cultivées sur plaques enduites de gel de matrice cellulaire spécifiquement conçu pour la culture de progéniteurs lymphoïdes sans cellules nourricières, dans un milieu de culture pour cellules hématopoïétiques supplémenté en cytokines humaines recombinantes pour promouvoir spécifiquement la différentiation en cellules progénitrices T
CD7+CD5+ (pro-T cells).
Les cellules sont maintenues en culture à 37°C 5% CO: pendant 14 jours en rafraichissant la moitié du milieu tous les 3-4 jours. - Maturation des cellules progénitrices en cellules T CD4+CD8+ :
A J14, les cellules pro-T sont collectées, transférées dans de nouvelles plaques enduites de gel de matrice cellulaire et cultivées dans un nouveau milieu de culture pour cellules hématopoïétiques supplémenté en cytokines humaines recombinantes pour promouvoir spécifiquement la maturation des cellules pro-T en cellules T matures.
Les cellules sont maintenues en culture à 37°C 5% CO» pendant 14 jours en rafraichissant la moitié du milieu tous les 3-4 jours.
Maturation des cellules T en CD8+ :
Les cellules obtenues à l’étape précédente sont collectées, transférées dans de nouvelles plaques enduites de gel de matrice cellulaire et cultivées dans le même milieu de culture que précédemment supplémenté notamment en IL-15 recombinante humaine et en cocktail d'activation CD3/28.
Les cellules sont maintenues en culture à 37°C 5% CO: pendant 7 jours en rafraichissant la moitié du milieu à J3-4.

Claims (19)

Revendications
1. Composition comprenant - une première molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence A permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une première séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une deuxième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites première et deuxième séquences riches en T comprenant respectivement un premier et un deuxième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du premier domaine étant complémentaire de la séquence du deuxième domaine, ledit premier et deuxième domaine étant positionnés de à 52 nucléotides de ladite séquence A, ladite première molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite 15 transposase, - une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B complémentaire étant liée en 5’ à une troisième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une quatrième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, ladite troisième et quatrième séquence riche en T comprenant respectivement un troisième et un quatrième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du troisième domaine étant complémentaire de la séquence du quatrième domaine, lesdits troisième et quatrième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B, ladite deuxième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d’intérêt, la séquence A étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt et la séquence B positionnée en 3’ de la région d'intérêt dudit acide nucléique d’intérêt, et - une troisième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule,
* dans sa partie 3 au moins une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et * une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, ladite région intermédiaire comprenant une séquence codant une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale du domaine activateur du lymphocyte T, c'est-à- dire la chaine CD3Z du récepteur des cellules T ou TCR, les première et troisième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les deuxième et troisième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
2. Composition selon la revendication 1, où ladite protéine de fusion comprend le peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule, fusionné à une partie transmembranaire d’une protéine membranaire, ce dernier fusionné à la chaine CD3Ç du
TCR.
3. Composition selon la revendication 1, où ladite protéine de fusion comprend le peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule, fusionné à une partie transmembranaire d’une protéine membranaire, le domaine transmembranaire de la protéine membranaire étant fusionné à un domaine de coactivation, ce dernier étant fusionné à la chaine CD3C du TCR.
4. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, - OÙ ladite séquence A comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC et - OÙ ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions du locus TRAC encadrant avantageusement une région 5’ région du locus du gène codant la protéine TRAC.
5. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance d'une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance de ladite transposase et où la deuxième molécule comprend son extrémité 5’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase suivi d’une une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase.
6. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, suivie d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase et où la deuxième molécule comprend son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase.
7. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, où ladite transposase est une transposase bactérienne, notamment une transposase choisie parmi Tn5, Tn9, Tn10 ou Tc1/mariner.
8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, où la région intermédiaire de la troisième molécule comprend la séquence SEQ ID NO : 3 ou la séquence SEQ ID NO : 1134.
9. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, où les première, deuxième et troisième molécules sont choisies parmi les triplets tels que définis dans le tableau 2.
10. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 comprenant en outre, ** une quatrième molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence A’ permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une cinquième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une sixième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites cinquième et sixième séquences riches en T comprenant respectivement un cinquième et un sixième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du cinquième domaine étant complémentaire de la séquence du sixième domaine, ledit cinquième et sixième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence A’, ladite quatrième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientés 5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ** une cinquième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B’ permettant l'insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B’ complémentaire étant liée en 5’ à une septième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une huitième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, ladite septième et huitième séquence riche en T comprenant respectivement un septième et un huitième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G-C, la séquence du septième domaine étant complémentaire de la séquence du huitième domaine, lesdits septième et huitième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B’, ladite cinquième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B’ étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d'intérêt, la séquence A’ étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt et la séquence B’ positionnée en 3’ de la région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt, et ** une sixième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, * dans sa partie 3 au moins une séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et * une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, une séquence complémentaire de ladite séquence codant ladite protéine de fusion contenue dans la troisième molécule, les quatrième et sixième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les cinquième et sixième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
11. Composition selon la revendication 10, où - ladite séquence A comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC, - ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions encadrant avantageusement une région 5’ région du locus du gène codant la protéine TRAC, et où - ladite séquence A’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une troisième région du locus du gène codant la protéine TRAC, - ladite séquence B’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une quatrième région du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite séquence A’ et la dite séquence B’ étant deux séquences différentes, lesdites troisième et quatrième régions du locus du gène codant la protéine TRAC, encadrant avantageusement une séquence complémentaire de ladite région 5’ du locus du gène codant la protéine TRAC, et où la séquence A et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence A et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence B et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, et la séquence B et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires.
12. Cellule immunitaire, notamment une cellule lymphocytaire T, isolée et purifiée, comprenant une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Composition pharmaceutique comprenant : - une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, ou - une cellule immunitaire selon la revendication 12, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, pour son utilisation en tant que médicament.
15. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, pour son utilisation pour le traitement du cancer.
16. Utilisation d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, pour insérer, dans une cellule Iymphocytaire T, une séquence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR, sous réserve que l’utilisation ne comprenne pas un procédé pour la modification de l’identité génétique germinale d’êtres humains et que ladite utilisation ne soit pas une méthode pour le traitement du corps humain ou animal par une chirurgie ou une thérapie.
17.Méthode d’insertion in vitro d’une séquence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR, ladite méthode comprenant : - la mise en contact, afin d’obtenir un complexe de remplacement, d’une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 11, avec un acide nucléique cible comprenant au moins une région 5’ du locus du gène codant la protéine TRAC, ladite composition étant telle que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, et la troisième molécule comprend la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ladite composition, pour obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la séquence codant la protéine de fusion insérée dans l’acide nucléique cible entre la première et la deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC. —
18. Méthode de production de cellules T à récepteur antigénique chimérique ou CAR T cel! comprenant la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3€ du TCR, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 11, avec une cellule T purifiée, l'ADN génomique de ladite cellule T purifiée comprenant le locus du gène codant la protéine TRAC, ladite composition ou ledit ensemble étant tel que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire d’une première région du locus du gène codant la protéine TRAC, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire d’une deuxième région du locus du gène codant la protéine TRAC, et la troisième molécule comprend la séquence d’une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3Z du TCR située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir une cellule CART, l'ADN génomique de ladite cellule CART comprenant la séquence codant ladite protéine de fusion au locus du gène codant la protéine TRAC, et - la purification de la cellule CAR T.
19. Cellule lymphoïde T modifiée susceptible d’être obtenue par la méthode selon la revendication 19, ladite cellule Iymphoïde T modifiée comprenant dans son génome une insertion d’une séquence codant une protéine de fusion comprenant, dans la partie aminoterminale un peptide capable de se lier à une protéine membranaire d’une cellule et dans la partie carboxyterminale la chaine CD3€ du TCR, ladite insertion étant localisée au locus du gène codant la protéine TRAC.
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