BE1031778B1 - Microorganisme biostimulant - Google Patents
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Abstract
Une composition biostimulante comprenant une souche de Bacillus amyloliquefaciens ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1, son utilisation en agriculture, procédé pour accroitre la croissance d'un végétal d'intérêt et procédé pour accroitre la production de cyclopeptides lipidiques tels que la surfactine, l'iturine, et/ou la fengycine par un microorganisme.
Description
MICROORGANISME BIOSTIMULANT
Domaine technique
La présente invention concerne l'utilisation d'une souche de
Bacillus amyloliquefaciens à des fins de biostimulation, ainsi que des méthodes de biostimulation.
L'art antérieur
La biostimulation de la croissance d'un végétal d'intérêt est connue. En particulier, diverses souches du groupe Bacillus subtilis sont commercialisées dans ce but.
Les souches du groupe de Bacillus amyloliquefaciens FZB42,
IT45 ou QST 713 (Serenade®)} sont connues, les deux premières surtout aux fins de contrôle d'organismes pathogènes. De même la souche expérimentale GAI1 a été testée pour son efficacité en biocontrôle d'organismes pathogènes, mais sans qu'elle ne soit commercialisée (Arguelles-Arias et al., 2009).
En outre, le produit RhiZoBas est une souche de Bacillus amyloliquefaciens commercialisée à des fins de biostimulation.
D'autre part, Ia demande de brevet WO 2018/122541 décrit l'intérêt d'un isolat de lipopeptides pour la biostimulation, en particulier pour s'affranchir du métabolisme du microorganisme, qui risque de varier selon les conditions de culture, qui sont difficilement contrôlables.
Ainsi, l'utilisation d'extraits mieux contrôlés d'une souche particulière en biostimulation reflète les difficultés rencontrées : selon les conditions agronomiques, une souche peut avoir un coractère biostimulant, ou pas, voire même avoir des effets délétères au niveau du végétal d'intérêt.
Certes, certaines des conditions sont pilotables ou mesurables avant une éventuelle application du microorganisme, telles que les paramètres physico-chimiques du champ : type de sol, abondance en azote ou en autres nutriments, présence ou absence de pathogènes dans le sol.
Cependant, d’autres paramètres sont plus aléatoires, tels que les conditions météorologiques.
Ceci va influer à la fois au niveau du métabolisme du microorganisme « biostimulant », et de celui du végétal d'intérêt, si bien qu'ily a de nombreux paramètres qui risquent d'affecter les propriétés biostimulantes d'un microorganisme, ou d'en réduire la portée.
Un microorganisme dont l'effet biostimulant est plus robuste et moins dépendant des conditions agronomiques, représente donc un intérêt majeur.
Bref résumé de l'invention
Un premier aspect de la présente invention porte sur une composition biostimulante comprenant une souche de Bacillus amyloliquefaciens ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1.
De préférence, cette souche de Bacillus amyloliquefaciens a au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :5, ladite identité étant calculée sur toute la longueur de ladite SEQ ID NO :5.
Avantageusement, cette souche de Bacillus amyloliquefaciens a incorporé une copie unique du plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1.
De préférence cette souche de Bacillus amyloliquefaciens ayant incorporé le plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID
NO :1, ce plasmide en outre encodant un peptide ayant 100% d'identité avec SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID NO :4.
De préférence, cette composition biostimulante est une huile végétale comprenant la souche de Bacillus amyloliquefaciens ou une émulsion huile dons l'eau comprenant la souche de Bacillus amyloliquefaciens.
Un aspect lié de la présente invention porte sur une graine d'un végétal d'intérêt enrobée par cette composition biostimulante.
Alternativement, de préférence, cette composition biostimulante est sous forme de granules, lesdites granules comprenant au moins 40% en poids de carbonate de calcium et/ou de carbonate de magnésium (poids des carbonates de calcium et/ou de magnésium : poids des granules exempt du Bacillus amyloliquefaciens), de préférence lesdites granules ayant un diamètre compris entre 0,5 mm et 2 mm.
Alternativement, de préférence, cette composition biostimulante est sous forme d'une poudre sèche ré hydratable, comprenant un agent de charge et un agent tensioactif (qui peut être un mélange d'agents tensioactifs).
Un autre aspect lié de la présente invention porte sur un procédé pour accroitre la croissance de végétaux comprenant l'étape d'administrer auxdits végétaux cette composition biostimulante.
De préférence, dans ce procédé, la composition biostimulante est appliquée dans ou sur le sol avant que ledit végétal ne soit planté ou que la graine dudit végétal ne soit semée ou, avantageusement, substantiellement en même temps que la graine dudit végétal est semée.
De préférence, alternativement ou en plus, dans ce procédé, la composition biostimulante est appliquée sur le sol après que ledit végétal ait été planté ou que la graine dudit végétal ait été semée.
De préférence, dans ce procédé, le végétal est choisi parmi les poacées, les légumineuses, les cucurbitacées, les astéracées, les solanacées, le colza, la betterave, la carotte, la fraise, la banane, le kiwi, le géranium, le pélargonium, le chrysanthème, le pommier, le poirier, l'abricotier, le pêcher et la vigne, de préférence la tomate, le mais, le blé la chicorée ou le concombre.
Avantageusement, dans ce procédé, la croissance accrue est celle des racines, de la tige et/ou le poids du végétal, de préférence cette croissance accrue étant mesurée au moins 40, 45, 50, 55, 60, 65 jours après l'administration de la souche de Bacillus.
Un autre aspect de la présente invention porte sur un procédé pour accroitre la production, par une souche choisie parmi
Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, de cyclopeptides lipidiques, de préférence choisis parmi la surfactine, l'iturine, la fengycine et les mélanges de ceux-ci, comprenant l'étape de transfecter ladite souche avec un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1.
De préférence, dans ce procédé, la souche choisie parmi
Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, comprend au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :5, ladite identité étant calculée sur toute la longueur de ladite SEQ ID NO :5.
Un autre aspect de la présente invention porte sur une
Utilisation d'une souche choisie parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1 pour accroitre la croissance de végétaux.
De préférence, dans cette utilisation, le plasmide encode
SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID NO :4. 5 De préférence, dans cette utilisation, Ia souche a au moins 90% d'identité avec la SEQ ID NO :5, ladite identité étant calculée sur toute la longueur de ladite SEQ ID NO :5.
Brève description des dessins
Les figures 1-4 sont une comparaison entre Ia souche AG002/2 et le produit SERENADE (hauteur des plants: maïs, blé, tomate, concombre).
Les figures 1-4 sont une comparaison entre la souche AG002/2 et le produit RhiZoBas (hauteur des plants: maïs, blé, tomate, concombre).
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
Les inventeurs ont remarqué que leur souche AG002/2 possède des propriétés biostimulantes supérieures. Ceci les a encouragés à caractériser davantage cette souche de Bacillus amyloliquefaciens : génétique, métabolisme et interaction avec le végétal d'intérêt.
Ainsi, un premier aspect de la présente invention porte sur une composition biostimulante comprenant une souche vivante de
Bacillus amyloliquefaciens ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1. Avantageusement, il s'agit de la souche de Bacillus ayant au moins 90% d'identité avec la SEQ ID NO :5, de préférence au moins 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 voire même au moins 99% d'identité avec SEQ ID NO :5.
Dans le contexte de la présente invention, la mesure de cette identité de séquence se réalise, de préférence, par comparaison d'une séquence à tester par rapport à SEQ ID NO :1 et/ou à SEQ ID NO :5 complètes.
Ainsi, les algorithmes de comparaison de séquence ou d'alignement global entre deux séquences peuvent avantageusement être utilisés. De préférence, dans cette comparaison, Un « gap » sera comptabilisé comme une absence d'identité pour le nucléotide en question. De même, en ce qui concerne la comparaison avec SEQ ID
NO:5, dans le contexte de la présente invention, de préférence, une réorganisation d'opérons au niveau du chromosome bactérien sera comptabilisée comme une absence d'identité, même si les gènes en question sont hautement similaires. Ceci implique qu'une valeur de 90%, au niveau d'une comparaison entre deux séquences nucléotidiques, est très élevée.
Dans le contexte de la présente invention, de préférence, la nomenclature des nucléotides est celle établie par IUPAC. Ainsi, « R» signifie «A» OU « G » ; « Y » signifie « C » OU «T » ; « S » signifie « G » OU «C » ; «W » signifie «A» ou «T » ; «K» signifie « G » ou «T » ; «M » signifie « A » OU «C»...Ainsi, de préférence, dans le contexte de la présente invention, l'identité à une position donnée entre un nucléotide d'une séquence cible, par rapport à un caractère renseignant plusieurs possibilités pour la position correspondante (ex. de la SEQ ID NO :5}, sera considérée comme vérifiée si Un des nucléotides couvert parle caractère en question (de SEQ
ID NO :5) correspond à celui de la séquence cible (ex. « Y » à la position en question de SEQ ID NO :5 et «T» à la position correspondante d'une séquence cible).
Les inventeurs ont remarqué des homologies significatives avec le génome d'autres bactéries du groupe Bacillus sp. (c'est-à-dire regroupant Bacillus amyloliquefaciens, ou Bacillus velezensis) Cependant, ces autres bactéries procurent un effet biostimulant moindre, ou erratique (variant selon les conditions). Les inventeurs attribuent donc ceci à la synergie entre le génome de la souche en question, y compris de souches très proches, avec le plasmide en question.
De préférence, cette souche de Bacillus a incorporé une copie unique du plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID
NO:1. Il s'agit avantageusement d'une incorporation stable du plasmide, mais pas de son intégration dans le chromosome bactérien.
En outre, ou alternativement, de manière avantageuse, ce plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1 permet l'expression d'un peptide ayant au moins 95 %, au moins 96%, 97, 98, 99, voire 100% d'identité avec SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID NO :4.
De préférence, ou alternativement, une protéine qui ne serait pas totalement identique à ces SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID
NO :4 reste avantageuse si la protéine en question en conserve l'activité.
Par exemple, des substitutions dites « conservatives » sont tolérées, telles que l'acide aspartique avec l'acide glutamique, l'asparagine avec la glutamine, Ia phénylalanine avec la tyrosine, la sérine avec la thréonine oulacystéine, l'isoleucine avec la leucine, l'arginine avec la lysine, … Une manière avantageuse de déterminer si une substitution est conservative est d'effectuer la comparaison entre les séquences sur base d'un alignement en utilisant l'algorithme BLASTp avec les paramètres par défaut tels qu'une matrice BLOSUM62, une «taille de mot » de 5 et une pénalité «de Gap » de 10, pour une pénalité d'extension de Gap de 1.
Les résidus marqués par un symbole « + », suite à un tel alignement, sont de préférence considérés comme correspondant à une substitution conservative.
Selon une alternative avantageuse, la composition biostimulante est une poudre sèche ré hydratable comprenant le microorganisme selon l'invention (sous forme de spores), un agent de charge ou un mélange d'agents de charges, et un ou plusieurs agent(s) tensioactifs.
Le ou les agent(s) tensioactif(s) permet(tent) une mise en solution facile dans l’eau.
De préférence, au moins un agent tensioactif « mouillant » et/ou au moins un agent tensioactif « dispersant », de préférence un tensioactif anionique, est présent.
Dans le contexte de la présente invention, l'on entend de préférence par tensioactif «mouillant » une molécule ayant une valeur selon l'échelle HLB comprise entre 7 et 9.
Typiquement, le ou les agents tensioactifs sont incorporés en une teneur pondérale comprise entre 1 et 10%, de préférence entre 2 et 9%, de préférence entre 5 et 8% en poids (poids des tensioactifs : poids total de la poudre sèche ré hydratable).
Avantageusement, la poudre sèche ré hydratable a une teneur (pondérale) en eau inférieure à 10%, de préférence inférieure à 5%, de préférence inférieure à 2%.
Un agent de charge préféré est un silicate, un aluminosilicate et/ou un polysaccharide, par exemple du talc, du kaolin ou une maltodextrine.
Une maltodextrine avantageuse a une teneur équivalente en dextrose (DE) comprise entre 15 et 25.
Avantageusement, le microorganisme selon l'invention est présent dans cette poudre sèche ré hydratable en une teneur d'au moins
108 CFU/g, de préférence d'au moins 10? CFU/g, de préférence d'au moins 5*10? CFU/g, de préférence d'au moins 1010 CFU/g.
Typiquement, 100 grammes de cette poudre sèche ré hydratable sont appliqués sur une surface d’1 Ha.
En d'autres termes, ceci implique une quantité du microorganisme selon l'invention d'au moins 1019 CFU/Ha, de préférence moins 1011 CFU/Ha, de préférence au moins 5*101! CFU/Ha, de préférence au moins 1012 CFU/Ha.
Selon une outre alternative avantageuse, dans la composition biostimulante selon l'invention, mais également dans les procédés de biostimulation (qui sera décrit ultérieurement), les spores du microorganisme de l'invention sont formulées dans une dispersion huileuse (huile végétale), de préférence en conditions anhydre (moins de 10% en poids d'eau, de préférence moins de 2% en poids en eau).
Ceci permet le maintien du microorganisme selon l'invention sous forme sporulée, ce qui augmente la durée de conservation, de préférence au moins 6 mois.
Ceci permet également une formulation homogène pour le produit destiné à être appliqué, sans devoir varier la concentration : selon les besoins, une dilution plus ou moins forte de la composition huileuse comprenant le microorganisme selon l'invention sera pratiquée avant l'application. En outre, ceci permet l'application de volumes réalistes, compatibles avec les instruments agricoles ou horticoles, par unité de surface.
De préférence, dans cette formulation huileuse, le microorganisme selon l'invention est présent en une teneur d'au moins 108
CFU/MI, de préférence d'au moins 2*108 CFU/ml, de préférence d'au moins 5*108 CFU/mI, de préférence d'au moins 107 CFU/ml.
Les inventeurs ont remarqué qu'une application de 100 ml de cette suspension (après dilution) sur Une surface d'un hectare permettait un effet biostimulant.
En d'autres termes, ceci implique une quantité d'au moins 1010 CFU/Ha, de préférence au moins 2* 1010 CFU/Ha, de préférence au moins 5*1010 CFU/Ha, de préférence au moins 101! CFU/Ha.
Ainsi, une forme avantageuse de la composition biostimulante est une suspension du microorganisme dans l'huile en présence d'agents tensioactifs, de manière à permettre une dilution dans l'eau sous forme d'une émulsion (huile dans l'eau), et un volume de cette émulsion, qui est le multiple de la dilution réalisée, sera appliqué au champ (facteur de dilution *100 mI/Ha).
Selon une variante de cette alternative, la formulation (suspension) huileuse est appliquée directement pour l'enrobage des graines ou de tubercules, soit telle quelle, soit sous forme d'une émulsion dans l’eau.
Les inventeurs ont remarqué que des teneurs du microorganisme selon l'invention dans l'enrobage d'au moins 10? CFU/Ha fonctionnent bien, de préférence des teneurs comprises entre 107 CFU/Ha et 1012 CFU/Ho, de préférence entre 1010 CFU/Ha et 1011 CFU/Ha.
Avantageusement, cette teneur est définie par unité de surface. Ainsi, dans ce cadre, la quantité de microorganisme par graine du végétal à semer est adaptée, selon la densité de graines à l'hectare.
En effet, les inventeurs ont remarqué que, selon les végétaux (ex. la chicorée), des teneurs trop fortes du microorganisme selon l'invention risquent de ralentir la germination.
La composition biostimulante est ainsi avantageusement adsorbée à la graine du végétal d'intérêt, ou appliquée sur le tubercule du végétal d'intérêt (pomme de terre, topinambour), ce qui permet à la fois d'assurer la proximité entre le microorganisme biostimulant selon l'invention et le végétal d'intérêt, mais également de ne pas dupliquer les travaux agricoles (i) d'application de la composition biostimulante et (ii) des semailles. En effet, l'enrobage des graines d'un végétal d'intérêt est une pratique répandue. L'addition du microorganisme selon l'invention se fera donc avantageusement à l'occasion de cette étape, tout en s'assurant que cette technique soit pratiquée dans des conditions compatibles avec la survie du microorganisme. Un enrobage préféré comprend l'application d'une formulation huileuse comprenant le
Mmicroorganisme selon l'invention (voir ci-dessus). De préférence, l'enrobage augmente la résistance des spores, même dans des conditions extrêmes (acidité, alcalinité, stress hydrique prolongé, toxicité au niveau du sol), tout en permettant le passage en forme végétative dès que les conditions sont favorables à la germination.
Ainsi, avantageusement, Ie microorganisme selon l'invention est incorporé dans l'enrobage de graines de poacées (graminées), par exemple le mais, le blé dur, le blé tendre, l'orge, le seigle, le triticale, l'avoine ; dans l'enrobage de graines de légumineuses, par exemple le soja, le haricot, le petit pois, la fève des marais, la cacahuète, la lentille ; dons l'enrobage de graines de cucurbitacées, par exemple la courge, le melon, la pastèque, le potiron, le potimarron ; dans l’enrobage de graines de astéracées, par exemple, la salade, la chicorée, le tournesol, l’artichaud, le cordon ; dans l'enrobage de graines de solanacées, par exemple la tomate, l'aubergine, le piment ; dans l'enrobage de graines de crucifères, par exemple le colza ou le choux ; ou dans l'enrobage de graines de betterave, de carotte et de fraise.
En outre, de manière similaire, les tubercules, par exemple de pomme de terre ou de topinambour, sont avantageusement combinés au microorganisme selon l'invention lorsqu'ils sont placés en terre, par exemple par aspersion directe dans les sillons.
Selon l'autre alternative, le microorganisme selon l'invention est avantageusement formulé en granules, en particulier des microgranules, où des spores du microorganisme selon l'invention sont mélangées et/ou incorporées à des particules comprenant au moins 40% en poids de carbonate de calcium et/ou de magnésium (ex. calcite et/ou dolomie), de préférence au moins 60% en poids de carbonate de calcium et/ou de magnésium. Une teneur avantageuse en poids de carbonate de calcium et/ou de magnésium est ainsi comprise entre 40 et 80% en poids. Dans le contexte de la présente invention, la teneur en poids de carbonate de calcium et/ou de magnésium dans les granules signifie de préférence le ratio entre le poids de carbonate de calcium et/ou de magnésium dans les granules divisé par le poids total des constituants des granules, hormis Ie microorganisme selon l'invention.
Les granules (microgranules) selon l'invention ont avantageusement un diamètre compris entre 0,5 et 2 mm, de préférence entre let 1,5 mm.
Ceci permet, avantageusement, l'application des microorganismes directement dans le sillon du semis : les granules selon l'invention peuvent être appliqués en même temps que les graines du végétal d'intérêt.
De préférence ces granules permettent l'application d'une quantité d'au moins 1010 CFU/Ha, de préférence au moins 101! CFU/Ho, de préférence au moins 5*101! CFU/Ha, de préférence au moins 1012
CFU/Ha de microorganismes selon l'invention.
Ainsi, ces granules ont une teneur en microorganismes selon l'invention, avantageusement, d'environ 108 CFU/ gramme de granule.
Ainsi, comme cela sera décrit plus loin, l'application d'au moins 1, au moins 2, au moins 5 kg de ces granules par Ha permet une teneur suffisante en microorganismes que pour obtenir l'effet biostimulant, par exemple une quantité comprise entre 1 et 20 kg, de préférence entre 2 et 10 kg est avantageusement appliquée à un Ha de culture.
En outre, de préférence, les produits incorporés via les granules sont essentiellement naturels (carbonate de calcium et/ou de magnésium comme décrit ci-dessus et à une teneur d'au moins 40% en poids, voir un hydrogéno-carbonate de potassium, aluminosilicates, polymères naturels tels que des polysaccharides (ex. maltodextrines, dérivés de l'amidon, des dérivés de la chitine, des arabinoxylans, des glucosaminoglycans, des beta glucans), des dérivés de lignine, des polyols (ex. le mannitol}, des disaccharides, des trsaccharides, des biostimulants naturels, des oligoéléments, des acides aminés), ce qui est totalement compatible avec la biologie du sol.
De plus, ces bactéries restent sous forme de spore jusqu'à ce qu'une teneur en eau dans l’environnement dépasse un certain seuil, ce qui va correspondre avec la croissance des racines du végétal d'intérêt et donc assurer une bonne synergie, vu la concordance temporelle.
Avantageusement, grâce à cette formulation, la viabilité des spores est longue, de préférence au moins 9 mois.
Enfin, les spores, faisant partie des granules, vont être activées de manière progressive, du fait de la résorption de ces granules au cours du temps.
Tout ceci permet une activation robuste, durable et à un moment offrant une synergie avec le métabolisme du végétal d'intérêt.
Un autre aspect lié de la présente invention porte sur un procédé pour accroitre la croissance d'un végétal comprenant l'étape d'administration de la composition biostimulante décrite ci-dessus (ayant un plasmide ayant au moins 95%, 96, 97, 98, 99% d'identité avec SEQ ID
NO :1, voire 100% d'identité).
Dans ce procédé, avantageusement, la souche a au moins 90% (de préférence au moins 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%) d'identité avec SEQ ID NO :5, voire 100% d'identité.
Avantageusement, la croissance accrue est celle des racines, de la tige et/ou du poids du végétal.
De préférence, dans ce procédé, la croissance accrue est mesurée au moins 40, 45, 50, 55, 60, 65 jours après l'administration de la composition biostimulante au végétal.
Avantageusement, selon une alternative de ce procédé, la composition biostimulante est appliquée sur le sol lors des semailles (via l'enrobage des graines ou via l'addition des granules).
Avantageusement, outre l'application concomitante, ou selon l’autre alternative de ce procédé, Ia composition biostimulante est appliquée sur le sol après que ledit végétal ait été planté ou que la graine dudit végétal ait été semée.
Ainsi, comme décrit ci-dessus, le microorganisme selon l'invention est appliqué dans l'enrobage de la graine du végétal, ou par aspersion du tubercule et/ou est appliqué lors des semailles via les granules décrites ci-dessus, et/ou est ensuite appliqué au végétal, postémergence, via pulvérisation de la suspension huileuse ou de l'émulsion comprenant la suspension huileuse décrites ci-dessus, voire via l'irrigation.
Les inventeurs ont remarqué que ceci permet de réduire la charge en microorganisme selon l'invention qui est appliquée à l'enrobage de la graine (ou du tubercule), tout en administrant une quantité suffisante de microorganismes. Ainsi, cela permet d'offrir l'effet biostimulant maximal.
De préférence, le végétal est choisi parmi :
Les poacées (graminées), par exemple le mais, le blé dur, le blé tendre, l'orge, le seigle, le triticale, l'avoine ;
Les légumineuses, par exemple le soja, le haricot, le petit pois, la fève des marais, la cacahuète, la lentille ;
Les cucurbitacées, par exemple la courge, le melon, la pastèque, le potiron, le potimarron, le concombre ;
Les astéracées, par exemple, la salade, la chicorée, le tournesol, le topinambour, l’artichaud, le cordon ;
Les solanacées, par exemple la tomate, la pomme de terre, l’aubergine, le piment ;
Les crucifères, par exemple le colza ou les choux ;
La betterave, la carotte, la fraise, Ia banane, le kiwi ;
Les plantes d'horticulture (géranium, pélargonium, chrysanthème), et
Les plantes d'arboriculture (pommier, poirier, abricotier, cerisier, pêcher, vigne). Le gozon (graminées, trèfle; production fourragère ou horticole) bénéficie également de la composition selon l'invention, de préférence via pulvérisation.
Ainsi, dans ce procédé, l'application de la formulation liquide, donc de la suspension huileuse ou de l'émulsion décrites ci-dessus, peut se faire avantageusement via pulvérisation ou via l'irrigation.
Comme décrit ci-dessus, Ia formulation du microorganisme dans l'huile est avantageuse, et cette formulation peut ensuite être diluée dans l'eau (y compris pour y former une émulsion).
Dans ce procédé, de préférence, la souche en suspension dans l'huile (voir ci-dessus) ou diluée dans l'émulsion huile dans l'eau (voir ci-dessus) est appliquée au végétal (enrobage de la graine et/ou pulvérisation) à la concentration de au moins 10? CFU/millitre, de préférence au moins 1010 CFU/millitre, au moins de au moins 10!!
CFU/millitre, par exemple à une concentration d'environ 1012 CFU/militre.
Avantageusement, selon une alternative, ou en outre, une quantité de 0,1 à 20 kg/Ha de la composition biostimulante sous forme de granules (voir ci-dessus} est appliquée par hectare, de préférence de 0,5 à 10 kg/Ha, de préférence de 1 à 5 kg/Ha.
Un autre aspect lié de la présente invention porte sur une utilisation d'une souche choisie parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1 pour accroitre la croissance de végétaux.
Un autre aspect lié de la présente invention porte sur une utilisation d'une souche choisie parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, ayant incorporé un plasmide encodant SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID
NO :4 pour accroitre la croissance de végétaux.
Un autre aspect lié de la présente invention porte sur un procédé pour accroître la production, par une souche choisie parmi
Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, de cyclopeptides lipidiques, de préférence choisis parmi la surfactine, l'iturine, la fengycine et les mélanges de ceux-ci, comprenant l'étape de transfecter cette souche avec un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront tirés de la description non limitative qui suit, et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
Exemples.-
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sorti du cadre des revendications annexées.
Exemple 1 :
Les inventeurs ont identifié une souche de Bacillus amyloliquefaciens qui présente des propriétés intéressantes en termes de biostimulation et l'ont dénommée AG002/2.
Les inventeurs ont réalisé une analyse génétique. Cette souche comporte le plasmide de SEQ ID NO :1, et ce plasmide est stable.
Les inventeurs considèrent ceci comme un événement rare, les plasmides pouvant plutôt être soit incorporés dans le génome, soit être perdus, ce qui est plus fréquent lorsqu'il n’y a qu'un faible nombre de copies par cellule.
En outre, les inventeurs ont démontré qu'il n'y avait qu’un seul plasmide par cellule.
Example 2 :
Les inventeurs ont formulé la souche selon l'invention à 1012
CFU/kg. Ensuite, entre 0,25 et 4 kg de cette formulation ont été appliqués par hectare, et comparé à l'effet de 1 L/Ha du produit Serenade® {également 1012 CFU/l), qui est une autre souche spécifique de Bacillus amyloliquefaciens.
Les plantes testées ont été le maïs (variété LG30258), le blé (variété Quintus}, le concombre (variété Sonja) et la tomate (variété
Prestige F1).
Différents paramètres de la croissance des végétaux ont été mesurés, tels que la hauteur, la vigueur ou la teneur en chlorophylle.
Les résultats sont montrés aux Figures 1-4 par rapport au produit SERENADE, et 5-8 par rapport au produit RhiZoBas (dose, 1 kg/Ha ; hauteur des plants en cm).
La composition selon l'invention a causé l'accroissement de la taille des végétaux testés (maïs, Figures 1 et 5; blé, Figures 2 et 6, tomate, Figures 3 et 7 ; concombre Figures 4, 8), de 10 à 50% pour la dose à 4% (moins pour les doses plus faibles). Cet accroissement est plus marqué pour la souche AG002/2 que pour le produit Serenade®.
En outre, la vigueur des végétaux a été mesurée, et est fortement accrue par la souche AG002/2, et un accroissement marginal, seulement, a été observé dans le contrôle où le produit biostimulant est le
Serenade®.
Les mêmes formulations ont été testées en synergie avec une composition fertilisante minérale comprenant de l'azote, du phosphore et du potassium. Le contrôle est la formulation Rhizobas (à 1 kg/Ha). L'effet bénéfique sur la croissance se retrouve pour les végétaux testés, mais l'effet spécifique de la souche AG002/2 est réduit. Il y a également un effet bénéfique de la souche AG002/2 pour la vigueur du blé.
Cependant, l'effet dose-réponse est moins évident.
Exemple 3:
Un test en condition réelles a été pratiqué sur la chicorée en mesurant l'émergence (%) et la croissance (exprimée en % de la croissance désirée). A nouveau, la composition à base d'AG002/2 a permis une augmentation de l'émergence (par exemple de 51,5 à 56% à 22 jours, puis de 54 à 59% à 29 jours), ainsi que de la croissance (de 42 à 46% à 22 jours et de 39 à 47% à 29 jours).
Claims (21)
1. Une composition biostimulante comprenant une souche de Bacillus amyloliquefaciens ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1.
2. La composition biostimulante selon la revendication 1 dans laquelle la souche de Bacillus a au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :5, ladite identité étant calculée sur toute la longueur de ladite SEQ ID NO :5.
3. La composition biostimulante selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle la souche de Bacillus a incorporé une copie unique du plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO 11.
4. La composition biostimulante selon une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la souche de Bacillus a incorporé le plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1 et ledit plasmide en outre encodant un peptide ayant 100% d'identité avec SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID NO :4.
5. La composition biostimulante selon une quelconque des revendications précédentes, étant une huile végétale comprenant la souche de Bacillus amyloliquefaciens ou une émulsion huile dans l'eau comprenant la souche de Bacillus amyloliquefaciens.
6. La composition biostimulante selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 4 étant sous forme de granules, lesdites granules comprenant au moins 40% en poids de carbonate de calcium et/ou de carbonate de magnésium (poids des carbonates de calcium et/ou de magnésium : poids des granules exempts du Bacillus amyloliguefaciens), de préférence lesdites granules ayant un diamètre compris entre 0,5 mm et 2 mm.
7. La composition biostimulante selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 4 étant sous forme d'une poudre sèche ré hydratable, comprenant en outre un agent de charge et un agent tensioactif.
8. La composition biostimulante selon la revendication 7 dans laquelle l'agent de charge est choisi parmi un silicate, de préférence le talc ou le kaolin, et/ou un polysaccharide, de préférence une maltodextrine.
9. Une graine d'un végétal d'intérêt enrobée par la composition biostimulante selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 5.
10.Un procédé pour accroître la croissance de végétaux comprenant l'étape d'administrer auxdits végétaux Ia composition biostimulante selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 8, ou la graine enrobée selon la revendication 9.
11.Le procédé selon la revendication 10 dans lequel la composition biostimulante est appliquée dans ou sur le sol avant que ledit végétal ne soit planté ou que la graine dudit végétal ne soit semée ou, avantageusement, substantiellement en même temps que la graine dudit végétal est semée.
12.Le procédé selon la revendication 10 ou 11 dans lequel la composition biostimulante est appliquée sur le sol après que ledit végétal ait été planté ou que la graine dudit végétal ait été semée.
13.Le procédé selon une quelconque des revendications 10 à 12 dans lequel le végétal est choisi parmi les poacées, les légumineuses, les cucurbitacées, les solanacées, les astéracées, les crucifères, la betterave, la carotte, la tomate, la fraise, Ia banane, le kiwi, le géranium, le pélargonium, le chrysanthème, le pommier, le poirier, l'abricotier, le pêcher et la vigne, de préférence la tomate, le maïs, le blé la chicorée ou le concombre.
14.Le procédé selon une quelconque des revendications 10 à 13 dans lequel la croissance accrue est celle des racines, de la tige et/ou le poids du végétal.
15.Le procédé selon une quelconque des revendications 10 à 14 dans lequel la croissance accrue est mesurée au moins 40, 45, 50, 55, 60, 65 jours après l'administration de la souche de Bacillus.
16.Procédé pour accroitre la production, par une souche choisie parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, de cyclopeptides lipidiques, de préférence choisis parmi la surfactine, l'iturine, la fengycine et les mélanges de ceux-ci, comprenant l'étape de transfecter ladite souche avec un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1.
17.Le procédé selon la revendication 16 dans lequel la souche comprend au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :5, ladite identité étant calculée sur toute la longueur de ladite SEQ ID NO :5.
18.Utilisation d'une souche choisie parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, ayant incorporé un plasmide ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO :1 pour accroitre la croissance de végétaux.
19.Utilisation d'une souche choisie parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, et Bacillus licheniformis, ayant incorporé un plasmide encodant SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et/ou SEQ ID NO :4 pour accroitre la croissance de végétaux.
20.Utilisation d'une souche selon la revendication 18 ou 19 dans laquelle la souche a au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO :5, ladite identité étant calculée sur toute la longueur de ladite SEQ ID NO :5.
21 Utilisation selon une quelconque des revendications précédentes 18 à 20, dans laquelle le végétal est choisi parmi les poacées, les légumineuses, les cucurbitacées, les solanacées, les astéracées, les crucifères, la betterave, la carotte, la tomate, la fraise, la banane, le kiwi, le géranium, le pélargonium, le chrysanthème, le pommier, le poirier, l'abricotier, le pêcher et la vigne, de préférence la tomate, le mais, le blé la chicorée ou le concombre.
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