BE1032653B1 - Die Herstellung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 und ihre Anwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln und Inhibitoren gegen die Pyroptose - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung zeigt die Anwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 bei der Herstellung von Arzneimitteln und Inhibitoren gegen Pyroptose. Insbesondere kann diese Verbindung direkt die Aktivität des GSDMD-Proteins hemmen, um gegen Pyroptose zu wirken und so die myokardiale Ischämie-Reperfusionsschädigung zu verhindern oder zu behandeln. Das genannte Arzneimittel kann aus dem Wirkstoff GI-Y3 mit in der Medizin oder Pharmazie üblichen Hilfsstoffen hergestellt werden. GI-Y3 ist einfach zu synthetisieren und zeigt eine gute entzündungshemmende Wirkung, indem es spezifisch auf die Hemmung von Gasdermin D (GSDMD) abzielt, um die Pyroptose zu hemmen, was zur Behandlung der myokardialen Ischämie-Reperfusionsschädigung eingesetzt werden kann. Die optimale Hemmkonzentration liegt bei 10 μM, was für die Behandlung der myokardialen Ischämie-Reperfusionsschädigung mit bemerkenswerter Wirksamkeit geeignet ist. Die kleinmolekulare Verbindung GI-Y3 bietet eine neue therapeutische Option für die Behandlung der myokardialen Ischämie-Reperfusionsschädigung und ihre potenzielle Anwendung ist vielversprechend.

Description

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Beschreibung

Die Herstellung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 und ihre Anwendung bei der Herstellung von

Arzneimitteln und Inhibitoren gegen die Pyroptose

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der chemischen Biologie, genauer gesagt auf die

Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 bei der Herstellung von Arzneimitteln gegen die

Pyroptose, darüber hinaus wird ein Verfahren zu deren Herstellung ebenfalls bereitgestellt, und ein

GSDMD-Inhibitor auf der Basis von GI-Y3 wird auch offenbart.

Technischer Hintergrund der Erfindung

Obwohl die perkutane Koronarintervention (PCI), bei der die Durchblutung des ischämischen Myokards wiederhergestellt wird, die wirksamste Therapie ist, um das Ausmaß des akuten Myokardinfarkts (AMI) zu begrenzen und die Sterblichkeit der Patienten zu verringern, gibt es Hinweise aber darauf, dass die

Reperfusionstherapie auch die Myokardschädigung auch verschlimmert. Dies wird als myokardiale

Ischämie-Reperfusionsschädigung (I/R) bezeichnet, die hauptsächlich auf oxidativen Stress, intrazelluläre Ca?*-Überladung, myokardialen Zelltod und Entzündung zurückzuführen ist. Bisherige

Interventionen zur Linderung der myokardialen I/R-Schädigung zielen hauptsächlich auf die Hemmung der Ca?-Überlastung, des oxidativen Stresses und der mitochondrialen Dysfunktion ab, doch ihre

Präventionswirkung ist sehr begrenzt. Daher richtet sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf das

Potenzial, den myokardialen Zelltod und die Entzündung gezielt zu bekämpfen. Die I/R-Schädigung umfasst den Tod terminal differenzierter Kardiomyozyten in Form von Apoptose, Nekrose, nekrotischer

Apoptose, Pyroptose und Ferroptose, und mechanistische Studien und Arzneimittelentwicklungen auf der

Grundlage dieser Prozesse sind vielversprechend.

Die Pyroptose ist eine entzündungsfördernde Form des programmierten Zelltods, die durch die

Aktivierung der Gasdermin-Familie (vor allem Gasdermin D) gekennzeichnet ist, was zur Bildung von 10- 14 nm großen Plasmamembranporen führt, aus denen Entzündungsfaktoren, vor allem IL-1ß und andere, freigesetzt werden und eine verstärkte Entzündungskaskade auslösen. Entzündungsfördernde

Cysteinproteasen spalten Gasdermin D (GSDMD) in zwei Proteindomänen, eine davon ist die N-

Proteindomäne (GSDMD-N), die in der Lage ist, an Lipide zu binden und Membranporen zu bilden, und die andere C-Proteindomäne (GSDMD-C), die an GSDMD-N bindet, um die Aktivität von GSDMD-N zu hemmen. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass die Aktivierung von GSDMD und die damit einhergehende Kardiomyozyten-Pyroptose eine Schlüsselrolle bei verschiedenen pathologischen

Zuständen des Herzens spielt, wie zum Beispiel bei I/R-Schädigungen des Myokards, Adriamycin- induzierter Myokardtoxizität, septischer Myokarddysfunktion und Kardiomegalie. Die GSDMD-vermittelte

Kardiomyozyten-Pyroptose verschlimmert die myokardiale Ischämie-Reperfusionsschädung durch die

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Caspase-11/GSDMD-Signalwege. Die Suche nach und die Entwicklung von wirksamen GSDMD-

Inhibitoren könnte eine neuartige Strategie für die Behandlung von GSDMD-bedingten Erkrankungen darstellen, bei denen eine myokardiale Ischämie-Reperfusionschädigung vorherrscht.

GI-Y3, ein kleines Molekül, wird vom Erfinder auf der Grundlage von AQ-390 (Patent Nr.:

ZL202210253238.X) unabhängig rekonstruiert, und die Strukturformel ist in Fig. 1 gezeigt. GI-Y3 übt eine bessere Aktivität gegen die Pyroptose aus als AQ-390, und die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Bislang ist die hemmende Wirkung von GI-Y3 auf die Pyroptose im medizinischen Bereich noch nicht bekannt, und Arzneimittel, die spezifisch die Pyroptose hemmen, werden in der Klinik noch nicht eingesetzt. Die vorliegende Erfindung zeigt einerseits den molekularen Bindungsmechanismus von GI-Y3 und GSDMD und bietet andererseits auch neue Arzneimittel sowie neue theoretische Grundlagen für die Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, einschließlich der myokardialen Ischämie-Reperfusionsschädigung.

Beschreibung der Erfindung

Angesichts der Unzulänglichkeiten bestehender Technologien zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die myokardiale Ischämie-Reperfusionschädigung durch Hemmung der Pyroptose-Entzündung zu behandeln und die therapeutische Rolle der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 im medizinischen

Bereich zu erschließen.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 bei der

Herstellung von Arzneimitteln, die die Pyroptose hemmen, entzündungshemmend wirken und die

Ischämie- Reperfusionschädigung vorbeugen oder behandeln. Insbesondere geht es um die Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der myokardialen Ischämie-Reperfusionschädigung. Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 bei der Herstellung von GSDMD-

Inhibitoren mit Anti-Pyroptose-Aktivität.

Im Folgenden wird das konkrete Ausführungsverfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Es wird ein Arzneimittel zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung der myokardialen Ischämie-

Reperfusionschädigung bereitgestellt, wobei dieses Arzneimittel eine kleinmolekulare Verbindung ist, die die Pyroptose hemmt, um eine entzündungshemmende Wirkung auszuüben, d.h. GI-Y3. GI-Y3 kann in

Form von injizierbaren Injektionen oder als peroralen Kapseln hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Injektion unter Verwendung der genannten kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 zur Prävention oder Behandlung der myokardialen

Ischämie-Reperfusionschädigung in einem Dosisbereich von 10-20 mg/kg pro Tag bereit.

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Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer peroralen Kapsel unter

Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 zur Prävention oder Behandlung der myokardialen

Ischämie-Reperfusionschädigung in einem Dosisbereich von 10-20 mg/kg pro Tag bereit.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines GSDMD-Inhibitors unter

Verwendung der niedermolekularen Verbindung GI-Y3 zur Prävention oder Behandlung der myokardialen

Ischämie-Reperfusionschädigung in einem Dosisbereich von 10-20 mg/kg pro Tag bereit. Der GSDMD-

Inhibitor hat eine Anti-Pyroptose-Aktivität und besteht aus GI-Y3 und pharmazeutisch akzeptablen

Hilfsstoffen.

Zu den akzeptablen sonstigen Bestandteilen gehören unter anderem die folgenden: Träger, Füllmittel,

Bindemittel, Benetzungsmittel, Sprengmittel, Absorptionsverstärker, Tenside, Adsorptionsträger,

Schmiermittel oder 0,9 % Natriumchlorid. Diese Hilfsstoffe sind in der Pharmazie üblich und werden eingesetzt, um die Eigenschaften des Arzneimittels in Bezug auf Stabilität, Zubereitungsfähigkeit und

FlieBfähigkeit zu verbessern. Im Einzelnen handelt es sich um: Träger oder Füllmittel wie Wasser, Stärke,

Saccharose usw., die das Arzneimittel verdünnen oder bilden können; Bindemittel wie Cellulosederivate,

Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon, die das Arzneimittel in Form bringen können; Benetzungsmittel wie Glycerin, die die Benetzungseigenschaften des Arzneimittels verbessern können; Sprengmittel wie

Agar, Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat, die die Freisetzung des Arzneimittels im Körper unterstützen können; Absorptionsverstärker wie quaternäre Ammoniumverbindungen, die die Absorption des Arzneimittels verbessern können; Tenside wie Cetylalkohol, die die Löslichkeit des Arzneimittels verbessern können; Adsorptionsträger wie Kaolin und Bentonit, die das Arzneimittel absorbieren und stabilisieren können; und Schmiermittel wie Talkumpuder, Calcium-/Magnesiumstearat, Polyethylenglykol usw., die die Reibung zwischen dem Arzneimittel und der Form oder Vorrichtung verringern können. Das

Formulierungsverhältnis kann je nach Bedarf angepasst werden, z. B. beträgt das Verhältnis von

Butylphthalid zu 0,9 % Natriumchlorid 1:20, was bedeutet, dass jede Einheit Butylphthalid 20 Einheiten 0,9 % Natriumchlorid in einem Präparat enthält. Die Auswahl und das Verhältnis dieser Hilfsstoffe müssen je nach den Eigenschaften des Arzneimittels, den Anforderungen an die Zubereitung und der klinischen

Anwendung angepasst werden, um die Sicherheit, Stabilität und Wirksamkeit des Arzneimittels zu gewährleisten.

Nach Masse beträgt das Massenverhältnis von GI-Y3 und pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen 1:20.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zubereitung bereitzustellen, die den GSDMD-

Inhibitor enthält, der eine entzündungshemmende Wirkung ausübt, indem er die Pyroptose hemmt, wodurch eine Ischämie-Reperfusionschädigung verhindert oder behandelt wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Tabletten, Pillen, Suspensionen, Granulate und Emulsionen.

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In der vorliegenden Erfindung wird eine neue kleinmolekulare Verbindung, GI-Y3, durch eine unabhängige

Rekonstruktion der Verbindung AQ-390, entwickelt. Im THP-1-Makrophagen-Pyroptose-Modell, das durch die Co-Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) und Nigericin erstellt wird, wird zunächst bestätigt, dass

GI-Y3 die Zellviabilität der von PMA-induzierten differenzierten THP-1-Zellen signifikant erhôht, die

Freisetzung von LDH und den Anstieg des PI-Spiegels hemmt, was darauf hindeutet, dass GI-Y3 in vitro eine signifikante anti-Pyroptose-Aktivität besitzt, und dass GI-Y3 im Vergleich zu AQ-390 eine überlegene anti-Pyroptose-Aktivität besitzt. Darüber hinaus wird eine hohe Affinität und kinetische Stabilität zwischen

GI-Y3 und GSDMD-Proteinen durch die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Technik nachgewiesen, und die direkte Bindung zwischen GI-Y3 und den GSDMD-Proteinen wird ebenfalls durch die Protein-

Pull-Down-Technik bestätigt. Darüber hinaus wird die Arzneimittelsicherheit von GI-Y3 in neonatalen

Kardiomyozyten laktierender Ratten weiter verifiziert, und es ist in der Lage, den durch die Hypoxie-

Reoxygenierung induzierten Zellschaden in neonatalen Kardiomyozyten laktierender Ratten in einem sicheren Konzentrationsbereich des Arzneimittels signifikant zu verbessern. Die signifikanten kardioprotektiven Effekte von GI-Y3 im adulten System von Mäusen mit der myokardialen Ischämie-

Reperfusionschädigung sind ebenfalls offensichtlich, die Ergebnisse der entsprechenden Experimente zeigen, dass GI-Y3 eine dosisabhängige hemmende Wirkung auf die durch I/R-verursachte Fläche des

Myokardinfarkts hat, und die Ergebnisse von Serum-Troponin, Kreatin-Kinase und Laktat-Dehydrogenase zeigen, dass GI-Y3 die I/R-induzierte Myokardschädigung dosisabhängig verbessert, darüber hinaus hemmt GI-Y3 auch signifikant die Kardiomyozyten-Pyroptose und verbessert die myokardiale Ischämie-

Reperfusionschädigung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GI-Y3 spezifisch auf GSDMD abzielt und die durch Pyroptose hervorgerufenen Entzündungseffekte hemmt, wodurch die myokardiale

Ischämie-Reperfusionsschädigung gemildert wird.

Für konkrete Anwendungen wird das genannte Arzneimittel GI-Y3 mit pharmazeutisch akzeptablen

Hilfsstoffen gemischt und formuliert, um verschiedene Präparate herzustellen. Bevorzugte Zubereitungen sind Injektionen und perorale Kapseln. Das Präparat der vorliegenden Erfindung ist in Einzeldosisformen wie Injektionen, Kapseln (einschließlich Formen mit kontinuierlicher oder verzögerter Freisetzung),

Tabletten, Pillen, Suspensionen, Granulaten, Tinkturen, Sirupen, Emulsionen, Suspensionen usw. sowie in verschiedenen Formen mit verzögerter Freisetzung erhältlich. Die Präparate eignen sich daher für eine

Vielzahl von Verabreichungsformen, einschließlich peroral, parenteral, mukosal, intramuskulär, intravenös, subkutan, intraokular, intradermal oder transdermal (Bevorzugt sind injizierbare Injektionen und perorale

Kapseln).

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der Wirkstoff des Arzneimittels leicht zu synthetisieren ist und eine spezifische Zielhemmung von Gasdermin D (GSDMD) aufweist, wodurch die

Pyroptose wirksam gehemmt wird und eine gute entzündungshemmende Wirkung aufweist, um die myokardiale Ischämie-Reperfusionschädigung zu vorbeugen und behandeln. Die optimale

Hemmstoffkonzentration liegt bei 10 UM und eignet sich für die Behandlung der myokardialen Ischämie-

Reperfusionschädigung, der septischen Kardiomyopathie, der Atherosklerose und der anderen verwandten Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems. Die therapeutische Wirkung dieses Arzneimittels ist bemerkenswert und gibt neue Hoffnung für die Behandlung verwandter Krankheiten.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die molekulare Strukturformel der in der vorliegenden Erfindung genannten kleinmolekularen

Verbindung Gl-Y3.

Fig. 2 zeigt das Verfahren zur Rekonstruktion und Synthese der in der vorliegenden Erfindung genannten kleinmolekularen Verbindung GI-Y3.

Fig. 3 zeigt die Wirkungsergebnisse der in der vorliegenden Erfindung genannten kleinmolekularen

Verbindung GI-Y3 auf das Pyroptose-Modell der Makrophagen-Zelllinie THP-1.

Fig. 4 zeigt die Ergebnisse des molekularen Bindungsmechanismus der in der vorliegenden Erfindung genannten kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 mit GSDMD.

Fig. 5 zeigt die Wirkungsergebnisse der in der vorliegenden Erfindung genannten kleinmolekularen

Verbindung GI-Y3 auf die Hypoxie-Reoxygenierungsschädigung in neonatalen Kardiomyozyten.

Fig. 6 zeigt die Wirkungsergebnisse der in der vorliegenden Erfindung genannten kleinmolekularen

Verbindung GI-Y3 auf die myokardiale Ischämie-Reperfusionschädigung der Mäuse.

Verfahren zur Herstellung

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Zeichnungen näher beschrieben.

Experimentelle Zellen: Die menschliche monozytäre Leukämiezelllinie THP-1 wird vom Shanghai

Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, erworben. Und die THP-1-Zellen werden in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin/ Streptomycin (P/S) kultiviert. Die in dieser

Erfindung verwendeten neonatalen Kardiomyozyten (NRPCs) werden aus dem linken Herzventrikel neonataler Sprague-Dawley (SD)-Ratten gewonnen. Als Medium wird Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, USA) mit 10% Fötus-Rinderserum (FBS, Thermo Fisher

Scientific) und 1% Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die verwendeten Medien,

Seren und Penicillin-Streptomycin stammen alle aus kommerzieller Beschaffung und werden gemäß der

Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet. Die Zellen werden in der Regel in einem Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO: kultiviert, wobei die neonatalen Kardiomyozyten an der Wand adhärent und die

THP-1-Makrophagen in Suspension kultiviert werden. Die THP-1-Zelllinien, die in den oben genannten

Experimenten verwendet werden, sind alle weniger als 6 Monate alt, gerechnet vom Tag der Wiedergeburt bis zum Ende des Experiments

Versuchstiere: Die Versuchstiere, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, unterliegen alle strengen Tierschutz- und Versuchsverfahren. Die in den Experimenten verwendeten Mäuse des Stammes

C57BL/6 werden von GemPharmatech Co, Lt. in Jiangsu zur Verfügung gestellt, und die

Überlebensbedingungen für die verwendeten Tiere sind ein zirkadianer Rhythmus von 12 h:12 h, eine konstante Temperatur von 22 + 2,0 °C und eine Luftfeuchtigkeit von 50 % + 5 % in der

Überlebensumgebung, alle mit freiem Zugang zu gereinigtem Wasser und sterilem Futter. Mindestens eine Woche vor Beginn des Experiments werden die Mäuse an die Umgebung akklimatisiert, um sicherzustellen, dass sie in einer Umgebung aufwachsen, die den Anforderungen des Experiments entspricht. Die Gruppeneinteilung erfolgt nach dem Zufallsprinzip. Alle Tierversuche werden von einer/ einem Einblind-Experimentator: in durchgeführt und ausgewertet.

Konfiguration und Dosierung von GI-Y3: Die kleinmolekulare Verbindung GI-Y3 wird selbstständig synthetisiert, wobei alle Rohstoffe von Bide Pharmatech Co., Ltd. in Shanghai gekauft werden. Für

Zellexperimente wird GI-Y3 in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und als entsprechende 20 mM

Stammlösung hergestellt und gelagert und dann schließlich in 10 uM und 20 uM Endkonzentrationen für

In-vitro-Zellexperimente konfiguriert; für In-vivo-Experimente wird GI-Y3 in Kochsalzlösung gelöst (die

Lösung wird kurz vor der Verwendung frisch zubereitet) und den Versuchstieren intraperitoneal verabreicht. Die Dosis von GI-Y3 beträgt 10 mg/kg bzw. 20 mg/kg.

Die in dieser Erfindung verwendeten gereinigten GSDMD-Proteine werden von HUABIO in Hangzhou gekauft. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten LPS-Medikamente werden von Sigma-Aldrich gekauft und Nigericin (Nig) von Aladdin gekauft. AQ-390 wird auch von Bide Pharmatech Co., Ltd. gekauft.

AQ-390 wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und als entsprechende 20 mM Stammlösung hergestellt und gelagert, und schließlich auf die Endkonzentration von 20 HM für In-vitro-Zellexperimente konfiguriert.

Alle anderen Reagenzien und Materialien werden ebenfalls kommerziell beschafft und gemäß der

Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet.

Ausführungsbeispiel 1: In diesem Ausführungsbeispiel wird die neue kleinmolekulare Verbindung Gl-

Y3 hergestellt, 3-Morpholinopropyl-3-(N-{1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl)-N-(3- morpholinopropyl)sulfamoyl)benzoat; die Schritte sind wie folgt: ï EN À x

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Schritt 1: 3-(N-(1,5-Dimethyl-3-ox0-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl) sulfamoyl)benzoesäure

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In einem 25-mL-Rundkolben wird 4-Aminoantipyrin-Hydrochlorid (400 mg, 1,67 mmol) in Dichlormethan (5 ML) gelöst, anschließend wird 3-(Chlorsulfonyl)benzoesäure (368 mg, 1,67 mmol) in mehreren

Portionen über einen bestimmten Zeitraum bei 25 °C zugegeben und die Reaktion wird über Nacht bei

Raumtemperatur durchgeführt. Dichlormethan wird unter vermindertem Druck eingedampft, um die

Reaktionsprodukte zu erhalten, die dann mit Wasser gelöst werden, und die wässrige Schicht wird mit

Ethylacetat extrahiert. Die bis zu diesem Zeitpunkt des Experiments entstandenen Produkte werden Über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Ethylacetat wird dann unter vermindertem Druck eingedampft, und anschlieBend werden die noch vermischten Reaktionsprodukte durch Säulenchromatographie (Petrolether: Ethylacetat=4: 1) getrennt, um 3-(N-(1,5-Dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4- yl)sulfamoyl)benzoesäure zu erhalten, und die Ausbeute liegt bei 70%.

Schritt 2: —3-Morpholinopropyl-3-(N-(1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl)-N-(3- morpholinopropyl)sulfamoyl)benzoat

In einem 25-mL-Rundkolben werden 3-(N-(1,5-Dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl) sulfamoyl)benzoesäure (60 mg, 0,15 mmol), die im Schritt 1 synthetisiert werden, N-(3-

Chlorpropyl)morpholin (35 mg, 0,22 mmol) und Cäsiumcarbonat (100 mg, 0,31 mmol) nacheinander zu 5 mL wasserfreiem Acetonitril gegeben, das dann 4 Stunden lang bei 82 °C refluxiert wird. Nach der

Reaktion wird das Acetonitril unter vermindertem Druck eingedampft, mit Ethylacetat extrahiert und die organische Schicht dreimal mit Sole gewaschen und mit wasserfreiem Magnesium-Sulfat getrocknet. Das

Ethylacetat wird unter vermindertem Druck eingedampft und durch Säulenchromatographie (Dichlormethan: Methanol = 20: 1) getrennt, um 3-Morpholinopropyl-3-(N-(1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl- 2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl)-N-(3-morpholinopropyl)sulfamoyl)benzoat zu erhalten, und die Ausbeute liegt bei 90% (Fig. 2).

Ergebnisse der Identifizierung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 mittels

Kernspinresonanzspektrometer (NMRS): 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) à 8.51 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.17 — 8.12 (m, 1H), 7.58 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.40 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.72 (dt, J = 10.0, 4.6 Hz, 9H), 3.55 (dt, J = 13.2, 6.0 Hz, 1H), 3.20 (s, 3H), 2.54 — 2.44 (m, 7H), 2.43 (s, 7H), 1.96 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.72 (dtd, J = 31.5, 17.2, 15.6, 6.7 Hz, 2H). 13C

NMR (100 MHz, Chloroform-d) à 165.23, 156.27, 139.72, 133.74, 131.71, 131.02, 129.32, 129.28, 128.96, 127.24, 124.57, 107.72, 67.00, 66.95, 63.87, 55.87, 55.41, 53.76, 53.72, 46.66, 35.72, 26.00, 25.85, 11.49.

Ausführungsbeispiel 2: In diesem Ausführungsbeispiel wird die hemmende Wirkung von GI-Y3 auf die

Pyroptose-Schädigung im klassischen Makrophagen-Pyroptose-Modell untersucht.

THP-1-Zellen werden mit 100 nM Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) stimuliert und induziert, um sich

’ BE2024/5766 in adhärente Makrophagen zu differenzieren. Das Makrophagen-Pyroptose-Modell wird dann nach der

Co-Stimulation mit 1 ug/ML LPS für vier Stunden und 10 HM Nigericin für 30 Minuten erstellt. Die Zellen werden in folgende Gruppen eingeteilt: (1) Kontrollgruppe (Lôsungsmittel-Träger), (2) nur mit Arzneimittel behandelte Gruppe (GI-Y3 20 uM), (3) Modellierungsgruppe (LPS+Nig+ Lösungsmittel-Träger), (4) mit

AQ-390 behandelte Modellierungsgruppe (LPS+Nig+AQ-390 20 UM) und (5) mit GI-Y3 behandelte

Modellierungsgruppe mit niedriger Dosis (LPS+Nig+GI-Y3 10 uM) (©) mit GI-Y3 behandelte

Modellierungsgruppe mit hoher Dosis (LPS+Nig+GI-Y3 10 uM). Die Ergebnisse zeigen, dass GI-Y3 die

Zellviabilität der von PMA induzierten und differenzierten THP-1-Zellen signifikant erhöht (Fig. 3A), die

Freisetzung von LDH (Fig. 3B) und IL-1B (Fig. 3C) sowie den Anstieg des PI- Spiegels (Fig. 3D) hemmt, und die Anti-Pyroptose-Aktivität von GI-Y3 ist signifikant besser als die von AQ-390 (Fig. 3A-D).

Fig. 3 zeigt die Wirkungen der beiden kleinmolekularen Verbindungen AQ-390 und GI-Y3 auf den Zelltod von THP-1-Makrophagen. THP-1-Zellen, die durch PMA differenziert werden, werden zunächst mit AQ- 390 20 UM oder GI-Y3 10 UM oder 20 UM für eine Stunde vorbehandelt, und dann mit LPS (1 HM /ml) für vier Stunden behandelt und anschließend mit Nigericin (10 UM) für 30 Minuten stimuliert, um das

Makrophagen-Pyroptose-Modell zu erstellen. Fig. 3A zeigt die Makrophagenaktivität nach der LPS+Nig-

Modellierung mittels CCK8-Assay (Cell Counting Kit-8) -Test, Fig. 3B zeigt die Freisetzung von

Laktatdehydrogenase nach der Bildung von Makrophagen-Zellmembranporen mittels LDH-Kit-Methode;

Fig. 3C zeigt den Gehalt des Entzündungsfaktors IL-18 nach der Bildung von Makrophagen-

Zellmembranporen mittels ELISA-Methode; Fig. 3D zeigt die Membranpermeabilität von Makrophagen mittels PI (Propidium iodide)-Färbemethode. Die Werte sind ausgedrückt als Mean + SEM, n = 3; *, P< 0,05; **, P < 0,01, ***, P < 0,001; ns bedeutet keine statistische Bedeutung, P > 0,05.

Ausführungsbeispiel 3: In diesem Ausführungsbeispiel wird die hohe Bindungsaffinität und kinetische

Stabilität von GI-Y3 an GSDMD-Proteine untersucht.

Die Bindungsaffinität von GI-Y3 an GSDMD wird mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz-Technik (SPR) untersucht. Es werden ein Gerät Biacore T200 und ein Sensorchip CM5 verwendet. Zunächst werden rekombinante Proteine mit Hilfe des Amin-Kopplungs-Kits auf den Sensor geladen, um erkennbare Zielproteine für das Experiment bereitzustellen. Anschließend wird eine Serie von GI-Y3-

Proben mit Konzentrationsgradienten (40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 uM) in Laufpuffer hergestellt.

Während des Experiments werden die Sensoren und die Probenplatten auf dem Gerät platziert, und die

GI-Y3-Proben werden anschließend auf dem Zielsensor fließen gelassen. Sieben Proben mit verschiedenen Konzentrationen werden kontinuierlich mit einer kontrollierten Flussrate von 30 ml/min injiziert und die Bindungsphase dauert 300 Sekunden. Es folgt eine Dissoziationsphase von 80 Sekunden bei Raumtemperatur. Schließlich werden die Daten verarbeitet, d.h. die entsprechenden Referenzwerte des Blindsensors und der Blindprobe werden subtrahiert, um die endgültigen Diagramme zu erstellen.

Die experimentellen Daten werden mit der Biacore T200 Software EV analysiert. Die Datenanalyse aus

SPR-Assay ergibt, dass die Affinität von GI-Y3 zu den GSDMD-gereinigten Proteinen hoch (KD=8,92e- 006 M) und kinetisch stabil ist (Fig. 4A).

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Die Bindung von GI-Y3 an die GSDMD-Proteine wird dann mit der Pull-Down-Technik weiter untersucht.

Zunächst wird GI-Y3 biotinyliert (Fig. 4B). GI-Y3 im biotinylierten Zustand hemmt immer noch signifikant die Makrophagen-Pyroptose, schwächt die deutlich Makrophagenaktivität und hemmt die LDH-

Freisetzung aus Makrophagen (Fig. 4C). Anschließend wird ein Pull-Down-Assay durchgeführt.

Streptavidin-Agarose-Magnetperlen werden mit GI-Y3 oder Bio-Gl-Y3 für zwei Stunden bei

Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit werden unbehandelte Magnetperlen, Biotin allein und unbiotinyliertes GI-Y3 als Kontrollen verwendet. Anschließend werden die rekombinanten GST-hGSDMD-

Proteine zu Bio-GI-Y3 und Streptavidin-Agarose-Magnetperlen gegeben und sechs Stunden lang bei

Raumtemperatur leicht geschüttelt. Anschließend werden die Proben dreimal mit PBS gewaschen. Die mit dem Elutionsmittel eluierten Proteinproben werden für die Western-Blotting-Analyse verwendet, und die Gesamtlysate dienen als Eingangskontrolle für den Nachweis der Bindung von GI-Y3 an GSDMD. Die

Ergebnisse mittels Pull-Down-Technik zeigen, dass GI-Y3 direkt an GSDMD-Proteine bindet (Fig. 4D).

Fig. 4A zeigt die analytischen Ergebnisse der Bindung von GI-Y3 an GST-hGSDMD mittels Technik

Oberflächenplasmonenresonanz (SPR); Fig. 4B zeigt die chemische Strukturformel von biotinyliertem GI-

Y3 (Bio-Gl-Y3); und Fig. 4C-D zeigen die Wirkung von biotinyliertem GI-Y3 (Bio-GI-Y3) auf die Pyroptose in Makrophagen. THP-1-Zellen, die durch PMA differenziert werden, werden zunächst mit Bio-GI-Y3 20

HM für eine Stunde vorbehandelt, und dann mit LPS (1 HM) für vier Stunden behandelt und anschließend mit Nigericin (10 UM) für 30 Minuten stimuliert, um das Makrophagen-Pyroptose-Modell zu erstellen.

CCK8-Assay wird durchgeführt, um die Makrophagenaktivität zu testen (C) und LDH-Kit-Assay wird durchgeführt, um die Menge der von den Makrophagenzellen freigesetzten Lactatdehydrogenase zu testen (D); Fig. 4E zeigt die Bewertung der Bindung von GSDMD an GI-Y3 mittels Pull-Down-Assay (PD:

Pull-Down). Die Werte sind ausgedrückt als Mean + SEM, n = 3; **, P < 0,01, ***, P < 0,001.

Ausführungsbeispiel 4: In diesem Ausführungsbeispiel wird untersucht, dass GI-Y3 durch die gezielte

Hemmung von GSDMD-Proteinen die Kardiomyozyten-Pyroptose, die durch die Hypoxie-

Reoxygenierungsschädigung verursacht wird, abmildern kann.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zunächst untersucht, ob GI-Y3 in verschiedenen

Wirkstoffkonzentrationen schädliche Wirkungen auf Kardiomyozyten hat, und es wird festgestellt, dass

GI-Y3 in jeder Konzentration zwischen 0 und 100 uM die Kardiomyozytenaktivität selbst nicht verändert, und somit arzneimittelsicher ist (Fig. 5A). Anschließend werden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRPCs) verwendet und in eine kontrollierte hypoxische Arbeitsstation gebracht, in der die Luft durch ein

Gasgemisch aus 0,1 % O2, 95 % Na und 5 % CO: ersetzt wird, und das Medium wird für vier Stunden durch serum- und glukosefreies DMEM ersetzt, um Hypoxie zu induzieren. Anschließend wird das

Medium durch normales DMEM ersetzt und für sechs Stunden unter normoxischen Bedingungen (21 %

O2, 74 % N2 und 5 % CO») reoxygeniert. Die Kontrollgruppen werden unter normoxischen Bedingungen mit dem entsprechenden Medium für die gleiche Zeit kultiviert, um das myokardiale Hypoxie-

Reoxygenierungsschädigung-Modell zu erstellen. Die NRPCs werden eine Stunde vor der Hypoxie mit

9 BE2024/5766 verschiedenen Konzentrationen von GI-Y3 vorbehandelt. Die NRPCs werden 1 Stunde vor der Hypoxie mit GI-Y3 in unterschiedlichen Konzentrationen vorbehandelt. Die Zellen werden in folgende Gruppen eingeteilt: (1) Kontrollgruppe (Ctrl), (2) nur mit Arzneimittel behandelte Gruppe (20 uM GI-Y3), (3) Hypoxie-

Reoxygenierungs-Modellierungsgruppe (H/R), (4) Hypoxie-Reoxygenierungs-Modellierungsgruppe mit niedriger Dosis (H/R+GI-Y3 10 UM) und (5) Hypoxie-Reoxygenierungs-Modellierungsgruppe mit hoher

Dosis (H/R+GI-Y3 20 HM). Zunächst wird festgestellt, dass GI-Y3 die H/R-induzierte

Kardiomyozytenaktivität signifikant verbessert (Fig. 5B) und die LDH-Freisetzung hemmt (Fig. 5C), wobei die Wirkung dosisabhängig ist. Anschließend wird festgestellt, dass nach der GI-Y3-Vorbehandlung die

GSDMD-Aktivierung in H/R-induzierten Kardiomyozyten signifikant abschwächt (Fig. 5D), und die

Plasmamembranbindung von GSDMD-N hemmt (Fig. 5E). Darüber hinaus zeigt GI-Y3 auch einen dosisabhängigen hemmenden Effekt auf die H/R-induzierte erhöhte IL-1ß-Freisetzung (Fig. 5F-G), was darauf hindeutet, dass GI-Y3 spezifisch GSDMD hemmt, um die durch Hypoxie-

Reoxygenierungsschädigung verursachte Kardiomyozyten-Pyroptose abzuschwächen.

Fig. 5A zeigt die Wirkung von GI-Y3 zwischen 0 und 100 HM auf die Aktivität von NRPCs mittels CCK8-

Assay. Fig. 5B-F zeigt die Vorbehandlung von H/R-stimulierten NRPCs (vier Stunden Hypoxie + sechs

Stunden Reoxygenierung) mit GI-Y3 (10 oder 20 HM, eine Stunde vor H/R). Fig. 5B zeigt die Wirkung von

GI-Y3 auf die Aktivität von NRPCs nach H/R-Stimulation mittels CCK8-Assay; Fig. 5C zeigt die Wirkung von GI-Y3 auf die LDH-Freisetzung aus NRPCs nach H/R-Stimulation mittels LDH-Assay; Fig. 5D zeigt die Darstellung von GSDMD und GSDMD-N und deren quantitative statistische Ergebnisse der Grauwerte in NRPCs mittels Immunoblotting-Assay; und Fig. SE zeigt die Darstellung von GSDMD-N in der

Zellmembran von NRPCs und deren quantitative statistische Ergebnisse der Grauwerte mittels

Immunoblotting-Assay; Fig. 5F zeigt die Darstellung von IL-1B, dem Überstandsprotein von NRPCs und deren quantitative statistische Ergebnisse der Grauwerte mittels Immunoblotting-Assay; Fig. 5G zeigt den

Gehalt an IL-1B im Kulturmedium von NRPCs mittels Elisa-Methode. Die Werte sind ausgedrückt als

Mean + SEM, n = 3; *, P < 0,05; **, P < 0,01, ***, P < 0,001; ns bedeutet keine statistische Bedeutung, P > 0,05.

Ausführungsbeispiel 5: In diesem Ausführungsbeispiel wird untersucht, dass GI-Y3 durch die gezielte

Hemmung von GSDMD-Proteinen die Kardiomyozyten-Pyroptose, die durch die myokardiale Ischämie-

Reperfusionschädigung verursacht wird, abmildern kann.

In der vorliegenden Erfindung wird der linke anteriore absteigende Ast der Koronararterie (LAD) ligiert, um ein Myokard-l/R-Modell zu erstellen. Gesunde männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen werden ausgewählt und nach einer Isofluran-Anästhesie mit einem MiniVent-Beatmungsgerät (Modell: 845, Hugo Sachs Elektronik, Deutschland) beatmet. Die Mäuse werden auf die rechte Seite gelegt, und der Brustkorb zwischen der dritten und Vierten Rippe auf der linken Seite des Brustbeins wird eröffnet, und ein Brustexpander wird verwendet, um das Herz freizulegen, und die Slipknot-Ligatur wird mit einer 7-0 chirurgischen Naht in einem Abstand von zwei mm vom Ursprung der Maus-LAD durchgeführt; eine erfolgreiche Ligatur ist angezeigt, sobald das LAD-Perfusionsbett eine blasse Farbe aufweist. Nach 30- minütiger Ligatur-Ischämie wird der Slipknoten zur Reperfusion gelöst, um eine myokardiale Ischämie-

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Reperfusionschädigung in der Klinik zu simulieren. Nach der Modellierung werden die Mäuse unter

Natrium-Pentobarbital-Anästhesie euthanasiert. Die Seren und Herzgewebe aus dem Infarktgebiet werden für weitere Analysen entnommen. Die Mäuse erhalten zwei Stunden vor der Modellierung (vor der

Ischämie) einmal die intraperitoneale Injektion von GI-Y3 10 mg/kg oder 20 mg/kg oder die entsprechende

Menge Kochsalzlösung. Die Gruppen sind (1) die scheinoperierte Gruppe (Sham + Lösungsmittel-Träger), (2) die scheinoperierte Gruppe, die nur mit Arzneimitteln (20 UM GI-Y3) behandelt wird, (3) die I/R-

Behandlungsgruppe (I/R + Lösungsmittel-Träger), (4) die /R-Behandlungsgruppe mit niedriger Dosis (I/R + GI-Y3 10 mg/kg) und (5) die I/R-Behandlungsgruppe mit hoher Dosis (/R + GI-Y3 20 mg/kg). Die Größe der Myokardinfarktfläche wird mit der Doppelfärbemethode, Evans Blue und TTC, bestimmt, und GI-Y3 zeigt eine dosisabhängige Hemmwirkung auf die I/R-induzierte Myokardinfarktfläche (Fig. GA-C). Darüber hinaus zeigen die Werte von CK-MB und LDH im Serum, dass die GI-Y3-Vorbehandlung die |/R-induzierte

Herzschädigung in einer dosisabhängigen Weise signifikant verbessert (Fig. 6D-E). Die GI-Y3-

Vorbehandlung reduziert auch den IL-1B-Spiegel im Myokardgewebe des durch IR induzierten

Infarktbereichs (Fig. 6F) und hemmt die Kardiomyozyten-Pyroptose.

Fig. 6 zeigt das Modell der akuten |/R-Schädigung (30-minütige Ischämie, gefolgt von vier Stunden

Reperfusion) bei Mäusen, die (zwei Stunden vor Beginn der Ischämie) mit GI-Y3 (10 bzw. 25 mg/kg, intraperitoneal injiziert) vorbehandelt werden. Fig. 6A zeigt die repräsentativen Bilder der mit Evans Blau (EB) und TTC gefärbten Schnitte; Fig. 6B-C zeigen die statistischen Daten der Infarktfläche (INF) und der

Risikofläche (AAR) in EB/TTC-gefärbten Herzschnitten; Fig. 6D zeigt die Werte von CK-MB im Serum;

Fig. 6E zeigt die Werte von LDH im Serum; und Fig. 6F zeigt den IL-1B-Spiegel im Herzmuskelgewebe aus dem Infarktgebiet mittels Elisa-Assay. Die Werte sind ausgedrückt als Mean + SEM, n = 3; *, P < 0,05; ** D<0,01, ***, P < 0,001; ns bedeutet keine statistische Bedeutung, P > 0,05.

Die vorstehenden Ausführungsbeispiele stellen lediglich bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden

Erfindung dar und sollen die vorliegende Erfindung nicht einschränken, und alle Änderungen, gleichwertigen Ersetzungen, Verbesserungen usw., die im Rahmen des Designkonzepts der vorliegenden

Erfindung vorgenommen werden, fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.

Claims (10)

Ansprüche BE2024/5766

1. Die Verwendung der kleinmolekulare Verbindung GI-Y3 zur Herstellung von Arzneimitteln gegen die Pyroptose ist dadurch gekennzeichnet, dass: Das genannte GI-Y3 zur Herstellung eines Arzneimittels wird verwendet, das eine entzündungshemmende Wirkung durch Hemmung der Pyroptose ausübt, wodurch die myokardiale Ischämie-Reperfusionsschädigung verhindert oder behandelt wird; und die Strukturformel vom genannten GI-Y3 ist wie folgt: DRE ax 9 î oa

2. Verfahren zur Herstellung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3, die im Anspruch 1. genannt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass: Der Syntheseweg vom genannte GI-Y3 umfasst: Schritt (1): Herstellung des GI-Y3-Zwischenprodukts; Schritt (2): Herstellung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3 aus dem GI-Y3-Zwischenprodukt; Die Einzelheiten sind wie folgt: Ak \ N 5 9 Oo Y er Ÿ DCM, RT. N°5 On # 0 * ee 9 GI-Y3-Zwischenprodukt en

N . N ° ON ee 50 cs ode A TV OT MoCN, 85 °C eu, Lo @ GHY3 in Schritt (1) sind die Dosierungsverhältnisse von 4-Aminoantipysin-Hydrochlorid, 3- (Chlorsuifonyl)benzoesäure, N,N-Diisopropylethylamin und Dichlormethan jeweils 1,4-2 mmol, 1,4-2 mmol, 1,4-2 mmol, 2-8 mL; die Temperatur der genannten Reaktion ist 10-35°C und die Reaktionszeit beträgt 5-15 Stunden. In Schritt (2) sind die Dosierungsverhältnisse von GI-Y3-Zwischenprodukt, N-3-Chloropropyi} morpholin,

Cäsiumcarbonat und wasserfreiem Acetonitril jeweils 0,1-0,2 mmol, 0,1-0,3 mmol, 0,2-0,4 mmol, 2-8 mL; BE2024/5766 die Temperatur der genannten Reaktion ist 70-90°C und die Reaktionszeit beträgt 1-10 Stunden.

3. Verfahren zur Herstellung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3, die im Anspruch 2. genannt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass: In Schritt (1) sind die Dosierungsverhältnisse von 4-Aminoantipyrin-Hydrochlorid, 3 (Chlorsulfonyl)benzoesäure, N,N-Diisopropylethylamin und Dichlormethan jeweils 1,6-1,8mmol, 1,6- 1,8mmol, 1,6-1,8mmol, 4-6mL; die Temperatur der genannten Reaktion ist 20-30°C und die Reaktionszeit beträgt 8-12 Stunden. In Schritt (2) sind die Dosierungsverhältnisse von GI-Y3-Zwischenprodukt, N-(3-Chloropropyl) morpholin, Cäsiumcarbonat und wasserfreiem Acetonitril jeweils 0,12-0,18 mmol, 0,15-0,28 mmol, 0,25-0,35 mmol, 36 mL; die Temperatur der genannten Reaktion ist 75-85°C und die Reaktionszeit beträgt 2-8 Stunden.

à. Verfahren zur Herstellung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3, die im Anspruch 2. genannt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass: In Schritt (1) beträgt die Temperatur der genannten Reaktion 25°C und die Reaktionszeit 10 Stunden. In Schritt (2) sind die Dosierungsverhältnisse von GI-Y3-Zwischenprodukt, N-(3-Chloropropyl) morpholin, Cäsiumcarbonat und wasserfreiem Acetonitril jeweils 0,14-0,16 mmol, 0,2-0,25 mmol, 0,3-0,32 mmol, 5- 6 mL; und die Temperatur der genannten Reaktion ist 80-82°C und die Reaktionszeit beträgt 4-6 Stunden.

5. Die Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3, die im Anspruch 1. genannt wird, zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Pyrolyse, ist dadurch gekennzeichnet, dass: Das genannte Arzneimittel wird zur Herstellung einer Injektion verwendet.

6. Die Verwendung der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3, die im Anspruch 1. genannt wird, zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Pyrolyse, ist dadurch gekennzeichnet, dass: Das genannte Arzneimittel wird zur Herstellung von peroralen Kapseln verwendet.

7. GSDMD- Inhibitor ist dadurch gekennzeichnet, dass: Der genannte GSDMD- Inhibitor besteht aus der kleinmolekularen Verbindung GI-Y3, die im Anspruch 1. genannt wird, und den pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstofen.

8. Der GSDMD-Inhibitor, der im Anspruch 7. genannt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass: Die pharmazeutisch akzeptablen Hifsstoffe umfassen akzeptable Träger, Fülmittel, Bindemittel, Benetzungsmitte!l, Sprengmittel, Absorptionsverstärker, Tenside, Adsorptionsträger, Schmiermittel und 0,9 % Natriumchlorid.

9. Der GSDMD-Inhibitor, der im Anspruch 7. genannt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass: Das genannte GI-Y3 und die pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffe sind in einem Massenverhältnis von 1:20 bereitgestelit.

10. Der GSDMD-Inhibitor, der im Anspruch 7. genannt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass: Der GSDMD-Inhibitor kann in Form von Tabletten, Pillen, Suspensionen, Granulaten oder Emulsionen hergestellt werden.