BE1032676A1

BE1032676A1 - Méthode de production d'un exosome à partir d'une culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage par filtration à flux tangentiel

Info

Publication number: BE1032676A1
Application number: BE20245304A
Authority: BE
Inventors: Denis Dufrane; Hara Episkopou
Original assignee: Novadip Biosciences
Priority date: 2024-05-26
Filing date: 2024-05-26
Publication date: 2026-01-12
Also published as: WO2025247734A1; BE1032676B1

Abstract

Procédé de production d'une composition comprenant des vésicules extracellulaires, comprenant les étapes suivantes : ▪ Culture de cellules souches, de préférence de cellules souches adipeuses ; ▪ Différencier les cellules souches, de préférence les différencier de manière ostéogénique ou chondrogénique ; ▪ Ajout d'un matériau particulaire, de préférence des billes de gélatine, pour obtenir une culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage ; ▪ Collecte du liquide contenant les vésicules extracellulaires de la culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage ; ▪ Soumettre le liquide contenant les vésicules extracellulaires à une filtration à flux tangentiel (TFF). La composition obtenue comprenant des vésicules extracellulaires est utile pour le traitement du cancer, en particulier pour l'induction de l'apoptose dans les cellules cancéreuses.

Description

METHODE DE PRODUCTION DUN EXOSOME À PARTIR DUNE CULTURE

CELLULAIRE MULTIDIMENSIONNELLE SANS ÉCHAFAUDAGE PAR FILTRATION

À FLUX TANGENTIEL

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention conceme une méthode de production d'exosomes, en particulier de vésicules extracellulaires, à partir d'un biomatériau comprenant une matrice extracellulaire néosynthétisée à l'aide de la cytométrie en flux tangentiel (TFF).

CONTEXTE

Lafiltration à flux tangentiel a déjà été décrite en relation avec l'isolement de l'exosome à partir de cultures cellulaires dérivées de cellules souches.

SZENE de l'Université John Hopkins et de l'Université de Washington divulgue des agents à base de vésicules extracellulaires utiles pour le traitement des troubles neuropathiques. La FFT est décrite avec l'ultracentrifugation et l'ultrafiltration comme méthodes de séparation des vésicules.

SSS SAT à GWO XI Stem Cell divulgue une composition pharmaceutique pour traiter la maladie d'Alzheimer. Les cellules souches dérivées de l'adipeuse sont d'abord cultivées en deux étapes. Ensuite, les vésicules extracellulaires sont séparées en recueillant d'abord la solution de culture. Les vésicules extracellulaires sont séparées de — la solution de culture par filtration tangentielle.

USSSSS ISSN à Vitti Labs divulgue une méthode pour isoler les exosomes de cellules souches mésenchymateuses à partir de cultures de cellules souches mésenchymateuses liquides et exemptes de cellules. Une première filtration à flux tangentiel (FPT) avec une taille de pore de 0,1 à 1 micron, de préférence 0,65, est décrite, suivie d'une seconde FPT avec une taille de pore de 30 kD à 600 kD. En option, une FFT intermédiaire peut être réalisée avec une taille de pores de 0,45 micron à 2 microns. Mais cette méthode nécessite un bioréacteur complexe, voir la figure 4A.

WOSOETIINDS7A] à Stem Cell Medicine divulgue des compositions cosmétiques anti- âge préparées à partir de cellules souches dérivées de l'adipeuse. La fraction protéique est obtenue en concentrant et en filtrant le milieu de culture des cellules souches à l'aide d'une filtration à flux tangentiel (TFF) avec un seuil de poids moléculaire de 1kDa ou 3kDa.

WO2020112694A9 pour Arytha Biosciences, divulgue des nanoparticules contenant une membrane cellulaire.

WOSGSSTISSSSAT de Novadip Biosciences divulgue des extraits cellulaires et/ou extracellulaires obtenus à partir d'une culture tridimensionnelle sans échafaudage de cellules matures et d'un matériau particulaire pour la prévention et/ou le traitement du cancer. Les cellules matures sécrètent la matrice extracellulaire néo-synthétisée. Les cellules matures et les particules sont intégrées dans la matrice extracellulaire néo- synthétisée. Aucun bioréacteur n'est nécessaire, les cellules étant cultivées dans des flacons. L'exosome est séparé par ultracentrifugation. Mais l'uitracentrifugation permet d'obtenir une plus grande pureté. Cela signifie que l'exosome isolé contient moins de composants extracellulaires.

BRÈVE DESCRIPTION DE L'INVENTION

Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que l'exosome isolé par filtration à flux tangentiel (TFF) est enrichi en composants extracellulaires tels que des facteurs et des micro-ARN par rapport à l'ultracentrifugation.

L'exosome est obtenu à partir d'un biomatériau sans échafaudage obtenu par l'ajout de particules à des cellules souches différenciées et la génération ultérieure d'une matrice extracellulaire néo-synthétisée par les cellules souches différenciées.

Les inventeurs ont également montré que l'exosome enrichi augmente l'apoptose dans les cellules cancéreuses.

En conséquence, un premier aspect de la présente invention est un procédé de production d'une composition comprenant des vésicules extracellulaires, comprenant les étapes suivantes : = Culture de cellules souches, de préférence de cellules souches adipeuses = Différencier les cellules souches, de préférence les différencier de manière ostéogénique ou chondrogénique ; = Ajout d'un matériau particulaire, de préférence des billes de gélatine, pour obtenir une culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage ;

= Collecte du liquide contenant les vésicules extracellulaires de la culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage ; = Soumettre le liquide contenant les vésicules extracellulaires à une filtration à flux tangentiel (TFF).

Selon un autre aspect, le dispositif TFF comprend une membrane de filtration dont la taille des pores est comprise entre 10 nm et 100 nm, de préférence entre 25 nm et 75 nm, de préférence encore entre 40 nm et 60 nm.

Dans un autre aspect, le nombre de vésicules extracellulaires dans la composition comprenant les vésicules extracellulaires ou pouvant être obtenues selon le procédé de la présente invention est de 1,107! à 1,1013 , de préférence de 5,10"! à 1,1013 et encore plus préférentiellement de 5,10!" à 5,10"? par ml de la composition tel que mesuré par l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA).

Selon un autre aspect, la concentration en protéines dans la composition de l'invention est comprise entre 1000 microgrammes/ml et 15000 microgrammes/ml, de préférence entre 2000 microgrammes/ml et 15000 microgrammes/ml, de préférence encore entre 2000 microgrammes/ml et 10000 microgrammes/ml.

Dans un autre aspect, la composition a un indice de pureté, mesuré par le nombre de vésicules extracellulaires par microgramme de protéine, de 1,107 à 1,109, de préférence de 5,107 à 1,10° , de préférence encore de 5,107 à 5,108.

Dans un autre aspect, la FFT est utilisée pour réduire la quantité ou le niveau de liquide de la composition comprenant les vésicules extracellulaires.

Dans un autre aspect, la FFT est utilisée pour éliminer de 50 % à 99,9999 %, de préférence de 70 % à 99,9999 %, de préférence encore de 90 % à 99,9999 % du liquide de la composition.

Dans un autre aspect, les cellules différenciées néo-synthétisent une matrice extracellulaire par l'ajout de la matière particulaire.

Dans un autre aspect, les cellules matures et les particules sont intégrées dans la matrice extracellulaire néo-synthétisée.

Dans un autre aspect, les cellules différenciées sont choisies dans le groupe constitué par les ostéoblastes, les ostéocytes, les chondroblastes, les chondrocytes, les kératinocytes, les myofibroblastes, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les adipocytes, les cellules neurales et leurs précurseurs, et sont de préférence des cellules des tissus mous, des chondroblastes ou des ostéoblastes.

Dans un autre aspect, la matière particulaire est choisie dans le groupe consistant en : = une matière organique, y compris la matrice osseuse déminéralisée (DBM), la gélatine, l'agar/agarose, les alginates, le chitosane, le sulfate de chondroïtine, le collagène, l'élastine ou les peptides de type élastine (ELP), le fibrinogène, la fibrine, la fibronectine, les protéoglycanes, les protéoglycanes de sulfate d'héparane, l'acide hyaluronique, les polysaccharides, les laminines et les dérivés de la cellulose, de préférence la gélatine ; = un composé calcique comprenant des particules de phosphate de calcium, et de préférence encore de l'hydroxyapatite (HA) et/ou du B- phosphate tricalcique (B-TCP) ; = un polymère, y compris les polyanhydrides, l'acide polylactique (PLA), le poly(acide lactique-coglycolique) (PLGA), l'oxyde de polyéthylène/polyéthylène glycol (PEO/PEG), le poly(alcool vinylique) (PVA), les polymères à base de fumarate tels que, par exemple le fumarate de polypropylène (PPF) ou le fumarate de polypropylène-co- éthylène glycol (P(PF-co-EG)), le fumarate d'oligopolyéthylène glycol (OPF), le poly(aldéhyde guluronate) (PAG), la polyp- vinyl pyrrolidone (PNVP), ou des combinaisons de ceux-ci ; = un gel, y compris un gel d'oligopeptides auto-assemblés, un microgel, un nanogel, un gel particulaire, un hydrogel, un gel thixotropique, un xérogel, un gel réactif, ou des combinaisons de ceux-ci ; = une creme ; et = toute combinaison de ces éléments.

Un autre aspect de la présente invention est l'utilisation de la composition comprenant des vésicules extracellulaires obtenue selon le procédé de la présente invention pour le traitement ou la prévention du cancer, en particulier pour induire l'apoptose dans les — cellules cancéreuses, en particulier l'ostéosarcome, dans laquelle la composition est obtenue selon un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.

/ | BE2024/5304

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Extrait extracellulaire

Par opposition aux extraits cellulaires, on entend par extrait extracellulaire tout composé ou élément sécrété ou autrement produit et transporté en dehors de la cellule. 5 _ Exosome et vésicules extracellulaires

Les termes vésicules extracellulaires (VE), exosome, vésicules de type exosome, vésicules extracellulaires ou nanoparticules sont utilisés indifféremment pour désigner les particules libérées par les cellules lors de la fusion d'un compartiment endocytaire intermédiaire, le corps multivésiculaire (CMV), avec la membrane plasmique. En d'autres termes, les exosomes, les vésicules de type exosome ou extracellulaires correspondent aux vésicules intraluminales qui sont libérées dans l'espace extracellulaire.

Dans un cas, la composition de la présente invention est substantiellement exempte de cellules différenciées, en particulier de cellules différenciées viables ou non viables. Dans un mode de réalisation, les exosomes comprennent moins de 0,1 %, de préférence moins de 0,01 %, et de préférence encore moins de 1 % de cellules différenciées viables ou non viables par rapport au poids total de la composition.

Dans un cas, la composition comprend des cellules différenciées viables ou non viables dans une proportion de 0,001 % à 1 %, de préférence de 0,001 % à 0,1 %, de préférence encore de 0,001 % à 0,01 % par rapport au poids total de la composition.

Taille des vésicules extracellulaires

La taille des vésicules extracellulaires est généralement déterminée par le NTA.

Extrait extracellulaire

Le terme "extrait extracellulaire" fait référence au matériel qui a été transporté activement et/ou passivement - par exemple par sécrétion, exocytose ou fuite - hors des cellules. Dans le présent document, un extrait extracellulaire peut comprendre, sans s'y limiter, des métabolites, des acides nucléiques, y compris des ARNm, des polypeptides, y compris des facteurs de transcription, des facteurs de croissance, des composants de la matrice extracellulaire et des lipides.

Exosome enrichi - Analyse du suivi des nanoparticules

La composition comprenant des vésicules extracellulaires obtenue par le procédé de la présente invention se différencie du procédé connu par le rendement, la concentration en protéines et l'indice protéique.

De préférence, la composition de l'invention est une composition liquide.

Dans un cas, la concentration de vésicules extracellulaires est mesurée par l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) en tant que nombre de particules par volume du produit final (liquide).

Dans un cas, la teneur en protéines de la composition de la présente invention est plus élevée que celle des exosomes dérivés de cultures 2D ou des exosomes isolés selon le protocole UC2.

Le rendement en particules est mesuré par le NTA.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le nombre de vésicules extracellulaires dans la composition _ comprenant les vésicules extracellulaires ou pouvant être obtenue selon le procédé de la présente invention est de 1,10"! à 1,1013, de préférence de 5,10"! à 1,1013 et encore plus préférentiellement de 5,10"! à 5,1012 par ml de la composition tel que mesuré par l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA).

Dans un mode de réalisation préféré, le nombre de vésicules extracellulaires dans le liquide contenant des vésicules extracellulaires avant l'étape TFF est de 1,108 à 1,10" , de préférence de 5,108 à 5,109 et encore plus préférablement de 7,108 à 3,109 par ml de la composition, tel que mesuré par l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA).

Concentration en protéines

Dans un cas, la pureté EV de la composition de la présente invention est diminuée par rapport à lultracentrifugation. L'indice de pureté de chaque échantillon est établi comme le rapport particules/protéines dans le volume final.

Dans un cas préféré, la concentration en protéines totales est mesurée par BCA. miR-27a-3p, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-125a-5p

Dans un cas, la composition de l'invention comprend des micro-ARN (miARN) ayant des propriétés de suppression des tumeurs, en particulier miR-27a-3p, miR-34b-5p, miR-34c- 5p,miR-125a-5p.

Dans un mode de réalisation, le niveau des miARN ayant des propriétés de suppression des tumeurs, en particulier miR-27a-3p, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-125a-5p, est augmenté d'au moins 100 %, de préférence d'au moins 125 %, de préférence encore d'au moins 150 %, de préférence encore d'au moins 200 % par rapport au nombre de molécules de miARN par ml de liquide obtenu après l'ultracentrifugation de la culture tridimensionnelle.

Dans un mode de réalisation, le niveau de miARN ayant des propriétés de suppression des tumeurs, en particulier miR-27a-3p, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-125a-5p, est augmenté de 100 % à 3 000 %, de préférence de 200 % à 3 000 %, de préférence encore de 300 % à 3 000 %, par rapport au nombre de molécules de miARN par mi de liquide obtenu après la culture cellulaire bidimensionnelle et la FFT.

La pureté

Dans un mode de réalisation, l'indice de pureté de la composition de la présente invention grâce à l'isolation TFF est diminué par rapport à l'indice de pureté après ultracentrifugation.

Dans un cas, la pureté est mesurée par l'indice de pureté, c'est-à-dire le nombre de particules ou de vésicules extracellulaires par microgramme de protéine.

Dans un mode de réalisation, l'indice de pureté de chaque échantillon est établi en tant que ratio particules ou vésicules extracellulaires/protéines dans la composition comprenant des vésicules extracellulaires de l'invention, c'est-à-dire après TFF.

Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que les EV "moins pures” dérivées de l'isolation de la TFF sont plus efficaces dans le traitement du cancer car elles déclenchent l'apoptose des cellules tumorales par rapport aux EV dérivées du même processus en amont mais isolées en utilisant l'uitracentrifugation.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention a un indice de pureté, mesuré parle nombre de vésicules extracellulaires par microgramme de protéine, de 1,107 à 1,109, de préférence de 5,107 à 1,109, de préférence encore de 5,107 à 5,108.

Cellules souches

Dans un cas, les cellules différenciées sont dérivées de cellules souches, telles que les cellules souches pluripotentes (CSP), par exemple les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSP!) ou les cellules souches adultes telles que les cellules souches hématopoiétiques (CSH), les cellules souches de la peau (CSP), les cellules souches neurales (CSN) et les cellules souches mésenchymateuses (CSM). Les CSM sont présentes dans de nombreux tissus, notamment la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang périphérique et le placenta.

Dans un cas, les cellules différenciées sont choisies dans le groupe comprenant ou consistant en ostéoblastes, ostéocytes, chondroblastes, chondrocytes, kératinocytes, myofibroblastes, cellules épithéliales, cellules endothéliales, adipocytes, cellules neurales et leurs précurseurs, et sont de préférence des cellules de tissus mous, des chondroblastes ou des ostéoblastes.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules différenciées sont dérivées de cellules souches adipeuses (ASC).

Les cellules différenciées sont intégrées dans la matrice extracellulaire néo-synthétisée tridimensionnelle.

Dans un cas, les cellules différenciées sont des cellules ostéo-différenciées, des cellules différenciées de la peau ou des cellules chondro-différenciées. Cela signifie que les cellules différenciées peuvent favoriser la formation d'os, de peau et/ou de cartilage, et/ou maintenir les os, la peau et/ou le cartilage existants dans un état physiologique sain.

Dans un cas, les cellules différenciées sont des cellules myofibroblastiques .

Dans un autre cas, les cellules différenciées sont des cellules endothéliales différenciées.

Dans un autre cas, les cellules différenciées sont des cellules épithéliales différenciées.

Dans un autre cas, les cellules différenciées sont des cellules adipogènes différenciées.

Dans un autre cas, les cellules différenciées sont des IPCS différenciées sur le plan neuronal.

Rapport entre la taille des exosomes et celle des cellules différenciées

Dans un cas, le rapport entre la taille des exosomes et celle des cellules différenciées est compris entre et ___, de préférence entre et , et encore plus de préférence entre et.

Matrice extracellulaire (ECM) néo-synthétisée en 3 dimensions (3D)

La matrice extracellulaire néo-synthétisée tridimensionnelle est une matrice extracellulaire que les cellules différenciées sécrètent de manière surprenante lorsque le matériau particulaire est ajouté.

La matrice extracellulaire néo-synthétisée tridimensionnelle sert d'échafaudage. Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'ajouter un échafaudage externe.

Les cellules différenciées et les particules sont intégrées dans une matrice extracellulaire néo-synthétisée.

Après l'induction multidimensionnelle par l'ajout de la matière particulaire aux cellules différenciées, les cellules différenciées et la matière particulaire sont intégrées dans la matrice extracellulaire néo-synthétisée.

Culture

Dans un cas, la culture est réalisée dans des flacons.

Dans un mode de réalisation préféré, aucun bioréacteur ou échafaudage externe n'est nécessaire.

Différenciation

La différenciation des cellules souches peut, par exemple, être effectuée par la méthode décrite dans l'exemple 1.

Ajout d'une matière particulaire

La matière particulaire est généralement ajoutée par saupoudrage sur les cellules différenciées.

Il est important de noter que le matériau particulaire ne sert pas d'échafaudage externe mais induit l'expansion multidimensionnelle des cellules différenciées par la biosynthèse de la matrice extracellulaire par les cellules différenciées (matrice extracellulaire néo- synthétisée).

Filtration à flux tangentiel (TFF) :

Par filtration à flux tangentiel, on entend une méthode d'isolement utilisant un dispositif de filtration à flux tangentiel, tel que le HansaBioMed. Le pore est choisi pour séparer les EV du sumageant de la culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage.

Dans un cas, la taille des pores est comprise entre 10 nm et 100 nm, de préférence entre nmet nm, de préférence encore entre nmet nm.

Sans échafaudage

Par conséquent, la composition de la présente invention est exempte d'échafaudages extemes, c'est-à-dire qu'elle ne contient pas d'échafaudages. La matière particulaire est saupoudrée sur les cellules différenciées pour induire la croissance multidimensionnelle de la culture cellulaire.

Cela signifie qu'aucun échafaudage tridimensionnel exteme n'est utilisé pour fixer les cellules.

Matière, taille et concentration des particules

Le terme "matière particulaire", tel qu'il est utilisé ici, désigne une matière solide sous forme de particules.

Dans le cadre de l'invention, les particules comprennent les matières organiques, telles que la matrice osseuse déminéralisée (DBM) et la gélatine, les matériaux céramiques, les polymères, tels que les polyanhydrides, les gels, tels que les hydrogels, et toute combinaison de ceux-ci.

La matière particulaire est de préférence choisie dans le groupe constitué par : = une matière organique, y compris la matrice osseuse déminéralisée (DBM), la gélatine, l'agar/agarose, les alginates, le chitosane, le sulfate de chondroitine, le collagène, l'élastine ou les peptides de type élastine (ELP), le fibrinogène, la fibrine, la fibronectine, les protéoglycanes, les protéoglycanes à base de sulfate d'héparane, l'acide hyaluronique, les polysaccharides, les laminines et les dérivés de la cellulose ; = composé de calcium ;

= un polymère, y compris les polyanhydrides, l'acide polylactique (PLA), le poly(acide lactique-coglycolique) (PLGA), l'oxyde de polyéthylène/polyéthylène glycol (PEO/PEG), le poly(alcool vinylique) (PVA), les polymères à base de fumarate tels que, par exemple le fumarate de polypropylène (PPF) ou le fumarate de polypropylène-co-éthylène glycol (P(PF-co-EG)), le fumarate d'oligopolyéthylène glycol (OPF), le poly(aldéhyde guluronate) (PAG), la polyp- vinyl pyrrolidone (PNVP), ou des combinaisons de ceux-ci ; = un gel, y compris un gel d'oligopeptides auto-assemblés, un microgel, un nanogel, un gel particulaire, un hydrogel, un gel thixotrope, un xérogel, un gel réactif, ou des combinaisons de ceux-ci ; ou = -une crème ; et = toute combinaison de ces éléments.

La matière particulaire est de préférence de la gélatine, et plus encore des billes de gélatine.

Dansuncas, la gélatine de l'invention est une gélatine animale, de préférence une gélatine de mammifère, plus particulièrement une gélatine porcine.

Dans le présent document, le terme gélatine porcine peut être remplacé par gélatine de porc ou gélatine de porc. Un exemple disponible dans le commerce est Cultispher.

Dans un cas, la gélatine est de la gélatine de peau de porc.

Dans certains cas, la matière particulaire, en particulier la gélatine, se présente sous forme de particules.

Dans un cas, les particules, en particulier les particules ou les billes de gélatine, ont un diamètre volumétrique moyen compris entre environ 50 micromètres et environ 1 000 micromètres, mesuré par granulométrie à diffraction laser, de préférence avec un

Mastersizer de Malvem.

Dans le cadre de l'invention, l'expression "d'environ 50 micromètres à environ 1 000 micromètres” englobe 50 micromètres, 60 micromètres, 70 micromètres, 80 micromètres, 90 micromètres, 100 micromètres, 150 micromètres, 200 micromètres, 250 micromètres, 300 micromètres, 350 micromètres, 400 micromètres, 450 micromètres, 500 micromètres, 550 micromètres, 600 micromètres, 650 micromètres, 700 micromètres, 750 micromètres, 300 micromètres, 350 micromètres, 400 micromètres, 450 micromètres, 500 micromètres, 550 micromètres, 600 micromètres, 650 micromètres, 700 micromètres, 750 micromètres,

800 micromètres, 850 micromètres, 900 micromètres, 950 micromètres et 1 000 micromètres.

Dans un cas, la matière particulaire, de préférence la gélatine, est ajoutée à une concentration allant d'environ 0,1 cm3 à environ 5 cm3 pour un récipient de 150 cm? , de préférence d'environ 0,5 cm3 à environ 4 cm3 , plus préférentiellement d'environ 0,75 cm? à environ 3 cm? .

Dans un cas, la gélatine est ajoutée à une concentration allant d'environ 1 cm3 à environ 2 cm3 pour un récipient de 150 cm . 2

Dans un cas, la gélatine est ajoutée à une concentration d'environ 1 cm3 , 1,5 cm? ou 2 cm? pour un récipient de 150 cm . 2

Dans le cadre de l'invention, l'expression "0,1 cm3 à environ 5 cm3" englobe 0,1 cm® , 0,2 cm? , 0,3 cm? , 0.4 cm? , 0,5 cm3, 0,6 cm? , 0,7 cm? , 0,8 cm? , 0,9 cm3, 1,0 cm3, 1,5 cm3 , 2,0 cm°, 2,5 cm® , 3,0 cm? , 3,5 cm? , 4,0 cm? , 4,5 cm? et 5,0 cm? .

Dans un cas, la matière particulaire est intégrée dans la matrice extracellulaire néo- synthétisée sécrétée.

Dans un cas, les particules ont une taille supérieure à 50 um environ, de préférence supérieure à 100 um environ, mesurée par granulométrie à diffraction laser, de préférence avec un Mastersizer de Malvern.

Processus de fabrication

Les compositions peuvent être fabriquées dans le cadre d'un processus sans échafaudage, comme le montre la figure 1 : = Fourniture de cellules souches ; = Prolifération des cellules souches ; = Différenciation, en particulier différenciation ostéogénique ou chondrogénique ; = l'aspersion de particules ; et = Formation de structures en 3D.

Usage médical

Dans un cas, la composition de l'invention est utilisée pour le traitement ou la prévention du cancer.

Dans un cas, la composition de l'invention est utilisée pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses.

Protéines sécrétées à activité anticancéreuse

Voici quelques exemples de protéines à activité anticancéreuse sécrétées par les cellules différenciées présentes dans la matrice extracellulaire néo-synthétisée et impliquées dans la régulation positive des voies de mort cellulaire dans le traitement de l'ostéosarcome (OS), telles que l'apoptose, l'autophagie et la nécroptose :

Cancer

Les compositions des présentes inventions sont utiles dans le traitement ou la prévention du cancer.

Dans un cas, les compositions de la presente invention sont utiles dans un ou plusieurs des traitements suivants : = [inhibition de la viabilité des cellules cancéreuses, = [inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses ; = [inhibition de la migration des cellules cancéreuses ; = [inhibition de la formation de colonies de cellules cancéreuses ; ou = toute combinaison de ces éléments.

Dans un mode de réalisation, le cancer est un cancer solide choisi dans le groupe consistant en ou comprenant un cancer des os, un cancer du cerveau, un cancer de la peau, un cancer du sein, un cancer du système nerveux central, un cancer du col de l'utérus, un cancer du tractus aérodigestif supérieur, un cancer colorectal, un cancer de l'endomètre, un cancer des cellules germinales, un cancer de la vessie, un cancer du rein, un cancer du larynx, un cancer du foie, un cancer du pancréas, un cancer de la plèvre, un cancer de la prostate, un cancer de l'estomac, un cancer de l'intestin, un cancer du larynx, un cancer du foie, un cancer du poumon, un neuroblastome, un cancer de l'œsophage, un cancer de l'ovaire, un cancer du pancréas, un cancer de la plèvre, un cancer de la prostate, un rétinoblastome, un cancer de l'intestin grêle, un sarcome des tissus mous, un cancer de l'estomac, un cancer du testicule et un cancer de la thyroïde, et de préférence un cancer des os ou de leurs métastases ou un cancer de la peau. — MiARN sécrétés à activité anticancéreuse

Voici des exemples de miARN à activité anticancéreuse sécrétés par les cellules différenciées et présents dans la matrice extracellulaire néo-synthétisée : hsa-miR-210-3p,

hsa-miR-409-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-30e-3p, hsa-let-7b-5p, hsa- miR-3184-3p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-24-3p, hsa-let-7d-5p, hsa-miR- 193b-5p, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa- miR-151a-3p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-154-5p, hsa-et-7f-5p, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-664b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-3607-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-320b, hsa-miR-1291, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-3651, hsa-miR- 103b, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-664b-5p, hsa-miR-34a-3p, hsa-miR- 125a-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-664a-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR- 28-3p, hsa-miR-98-5p, hsa-miR-3609, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-374c-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-4449, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-191-5p, hsa- miR-3074-5p, hsa-miR-6516-3p, hsa-miR-4668-5p, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-miR-24-2-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-29b-1-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-328-3p, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-4461, hsa-miR-196a-5p, hsa-let-7d-3p, hsa- miR-374b-5p, hsa-miR-127-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-miR-423-3p, hsa-miR-196b-5p, hsa- miR-221-3p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-619-5p, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3653-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-376c-3p, hsa-miR-99b-3p, hsa-miR-663b, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-454-3p, et une combinaison de ceux-ci.

En conséquence, selon un autre aspect, la composition de la présente invention comprend un ou plusieurs des miARN susmentionnés.

De préférence, la composition de la présente invention comprend un ou plusieurs — miARN(s) choisi(s) dans un groupe constitué de : miARN choisi dans le groupe constitué de MiR-140, miR-199a, miR-34a, miR-335 et miR-505.

Les critères et les conventions pour l'identification et la nomenclature des miARN ont été décrits dans Ambros et al. (A uniform system for microRNA annotation. RNA 2003 9(3):277-279). Les séquences de miARN peuvent être extraites de la base de données miRbase (http://www.mirbase.org’) ou de la base de données miRDB (http://www.mirdb.org/).

En pratique, le profil des ARN peut être évalué par toute méthode appropriée connue dans l'art ou toute méthode adaptée.

À titre d'exemple, l'ARN peut être extrait, par exemple au moyen d'un kit commercial (tel que le kit miRNeasy de Qiagen®), puis séquencé, par exemple au moyen d'un système de séquençage à haut débit (tel que le système NextSeq 500 d'Ilumina®).

Par exemple, on peut utiliser le réactif de lyse Qiazol (Qiagen®, Hilden, Allemagne) et un homogénéisateur Precellys (Bertin® instruments, Montigny-le-Bretonneux, France). Les

ARN peuvent être purifiés à l'aide du kit Rneasy mini (Qiagen®, Hilden, Allemagne) avec une digestion supplémentaire à la DNase sur colonne selon les instructions du fabricant.

Lagqualité etla quantité de l'ARN peuvent être déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre (Spectramax® 190, Molecular Devices®, Califomia, USA). L'ADNc peut être synthétisé à partir de 0,5ug d'ARN total en utilisant le kit RT? RNA first strand (Qiagen®, Hilden,

Allemagne) pour les profils d'expression des gènes à l'aide de matrices PCR personnalisées (Customized Human Osteogenic and angiogenic RT? Profiler Assay -

Qiagen®, Hilden, Allemagne). Le système ABI Quantstudio 5 (Applied Biosystems®) et le

SYBR Green ROX Mastermix (Qiagen®, Hilden, Allemagne) peuvent être utilisés pour la détection du produit d'amplification. La quantification peut être obtenue selon la méthode

AACT. Le résultat final de chaque échantillon peut être normalisé par rapport aux moyennes des niveaux d'expression des gènes de ménage (par exemple ACTB, B2M et

GAPDH).

Injection de liquide

Dans un autre mode de réalisation préféré, la composition est administrée par injection ou sous la forme d'un liquide injectable ou d'une suspension injectable.

En conséquence, un autre aspect de l'invention est un liquide injectable comprenant la composition de la présente invention.

Méthode de traitement

Un autre aspect de la présente invention est une méthode de traitement ou de prévention du cancer comprenant l'administration de la composition de la présente invention.

Support pharmaceutiquement acceptable

Dans un autre aspect, la composition de la présente invention comprend des véhicules ou des supports pharmaceutiquement acceptables.

Dans le présent document, on entend par support pharmaceutiquement acceptable tout solvant, milieu de dispersion, enrobage, agent antibactérien et/ou antifongique, agent isotonique et retardateur d'absorption, etc.

Le support pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un ou plusieurs ingrédients choisis dans un groupe d'additifs, de polypeptides, d'acides aminés, de lipides et d'hydrates de carbone.

Parmi les hydrates de carbone, on peut citer les sucres, y compris les monosaccharides, les di-, tri-, tétra- et oligosaccharides, les sucres dérivés tels que les alditols, les acides aldoliques, les sucres estérifiés.

Des exemples de véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent inclure des polypeptides tels que, par exemple, la gélatine, la caséine et autres.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

La figure 1 présente un schéma des méthodes de culture des cellules souches mésenchymateuses et des méthodes de collecte des exosomes de la présente invention.

Les cellules souches sont d'abord cultivées et proliférées, puis différenciées, de préférence de manière ostéogénique. Ensuite, un matériau particulaire, de préférence des billes de gélatine, est saupoudré sur les cellules différenciées afin d'obtenir une culture cellulaire tridimensionnelle. Le sumageant est ensuite recueilli et soumis à la filtration à flux tangentiel (TFF) pour obtenir la composition de la présente invention comprenant des vésicules extracellulaires.

La figure 2 présente un schéma des deux protocoles différents pour l'isolement des exosomes. Les sumageants des structures 3D ont été pré-clarifiés par centrifugation d'abord à 400g pendant 5 minutes à température ambiante, puis à 2000g pendant 20 minutes à 4°C. Pour une partie du sumageant pré-clarifié, les exosomes ont été isolés par un protocole d'ultracentrifugation standard (UC2) tandis que pour la seconde partie, un protocole de filtration à flux tangentiel (TFF) a été appliqué. Dans le cas du protocole UC2, deux étapes d'ultracentrifugation à 110 000g pendant 120 min ont été appliquées alors que dans le cas du protocole TFF, le sumageant clarifié a été soumis à une ultrafiltration dans un système TFF avec l'utilisation d'un filtre TFF-Evs (HansaBioMed, taille des pores 50nm) suivi d'une étape de concentration en utilisant un concentrateur centrifuge (Amicon).

La figure 3 montre les compositions comprenant des EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération (MP) par rapport aux EVs/exosomes dérivés des structures 3D (EXO2) produites comme décrit dans l'exemple 1, après isolement par ultracentrifugation (UC2) ou protocoles TFF selon les méthodes décrites dans la figure 2.

Les significations statistiques ont été testées par le test de Kruskal-Walli. *, p<0,05 et ns, non significatif. Points noirs : valeurs des lots individuels (réplicats biologiques). Chaque graphique représente la valeur moyenne des données de tous les lots testés. MP :

EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ; EXO2 :

EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur — l'ultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure 3A montre le rendement des particules isolées à la fin du processus de fabrication. Toutes les valeurs représentent le nombre de vésicules isolées normalisé par rapport au sumageant initial collecté à partir des cultures respectives. Un enrichissement significatif du rendement en exosomes a été observé pour les exosomes dérivés de cultures 3D (EXO2), par rapport aux exosomes dérivés de cultures 2D (MP), quelle que soit la méthode d'isolement. Un meilleur rendement a été observé dans le cas du protocole

TFF.

Figure 3B La figure 3B montre la concentration en protéines dans les compositions respectives. Toutes les valeurs représentent les mg de protéines totales par ml du volume final dans chaque composition. Un enrichissement significatif de la teneur en protéines a été observé pour les exosomes dérivés de la 3D (EXO2) isolés avec le protocole TFF, par rapport aux exosomes dérivés de cultures 2D (MP), ou aux exosomes isolés avec le protocole UC2.

La figure 3C montre l'indice de pureté pour chaque composition. Toutes les valeurs représentent le nombre de particules par mg de protéine totale. Un enrichissement significatif de la pureté des EVs a été observé pour les exosomes dérivés de la 3D (EXO2) isolés avec le protocole UC2, comparé aux exosomes dérivés des cultures 2D (MP), ou aux exosomes isolés avec le protocole TFF.

La figure 4 montre la taille des particules en nm. La taille moyenne des particules de tous les échantillons se situe dans la fourchette de la taille attendue pour les exosomes, quelle que soit la méthode d'isolement. Une cohérence significative des lots a été observée.

Les significations statistiques ont été testées par ANOVA-. *, pS 0,05 et ns, non significatif.

Points noirs : valeurs des lots individuels (réplicats biologiques). Chaque graphique représente la valeur moyenne des données de tous les lots testés. MP : EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ; EXO2 : EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur l'ultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure 5 montre le profil d'expression du marqueur tétraspanine dans chaque composition. Un net enrichissement des niveaux de tétraspanines a été observé pour les exosomes dérivés en 3D (EXO2), par rapport aux exosomes dérivés de cultures en 2D (MP). Des niveaux significativement plus élevés de tétraspanines CD63 ont été observés dans EXO2 lorsque la méthode d'isolation UC2 a été appliquée par rapport à TFF.

Les significations statistiques ont été testées par ANOVA-I lorsque les valeurs ont passé les tests de normalité (a =0,05) ou par le test de Kruskal-Walli lorsque les valeurs n'ont pas passé les tests de normalité (a=0,05). *, p<0,05 ; ** ; p<0,01, *** ; p<0,001 *** pS 0,0001 ; ns, non significatif. Points noirs : valeurs des lots individuels (réplicats biologiques).

Chaque graphique représente la valeur moyenne des données de tous les lots testés. MP : EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ; EXO2 : EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur l'ultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure SA montre les niveaux de CD63 détectés par ELISA dans chaque composition. _ Lafigure 5B montre les niveaux de CD81 détectés par ELISA dans chaque composition.

La figure 5C montre les niveaux de CD9 détectés par ELISA dans chaque composition.

La figure 6 montre les résultats du regroupement non supervisé des miARN détectés dans les différentes compositions à l'aide du séquençage de nouvelle génération (NGS).

Les données d'expression génique normalisées par RPM (Reads per million mapped reads) ont été utilisées pour effectuer un clustering hiérarchique. Les miARNSs qui ont été trouvés avec moins de 5 RPM dans 50% des échantillons sont préfiltrés et retirés de l'ensemble de données. MP : EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ; EXO2 : EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur l'ultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure 6A montre la carte thermique obtenue à partir du profilage transcriptomique non biaisé des miARN. Le dendrogramme des échantillons sur les données miRNA montre une séparation claire entre les échantillons d'exosomes 2D (MP) et 3D (EXO2).

MP, EXO2 et les méthodes d'isolation, TFF et UC2, sont codées en couleur. L'arbre de regroupement des miARN est représenté à gauche, et l'arbre de regroupement des échantillons est représenté en haut. L'échelle de couleurs en haut à droite illustre le niveau d'expression relatif des miARN, le rouge indiquant un niveau d'expression plus élevé et le bleu un niveau d'expression plus faible.

La figure 6B montre une analyse en composantes principales (ACP) sur les données transcriptomigues des miARN montrant une séparation claire entre les échantillons d'exosomes 2D (MP) et 3D (EXO2).

MP et Exo-2 sont codés en couleur, et la méthode d'isolement est indiquée par le symbole.

La figure 7 montre le profilage protéomique obtenu à partir des différentes compositions testées, HRM TM spectrométrie de masse pour la quantification non biaisée de tous les peptides et protéines détectables dans chaque échantillon. La matrice extracellulaire (ECM) tridimensionnelle, sans échafaudage, semble différencier et stabiliser la cargaison protéique des exosomes, ce qui garantit une plus grande cohérence d'un lot à l'autre. MP : EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ; EXO2 : EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur l'ultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure 7A montre la carte thermique dérivée du regroupement non supervisé des données protéomiques obtenues à partir des compositions testées. Le dendrogramme des échantillons sur les données protéomiques montre une séparation claire entre les échantillons d'exosomes 2D (MP) et 3D (EXO2).

MP, EXO2 et les méthodes d'isolement, TFF et UC2, sont codées en couleur .

La figure 7B montre le nombre total de protéines identifiées dans chaque composition testée, montrant une plus faible variabilité dans le nombre de protéines totales No identifiées dans les exosomes dérivés de cultures 3D (EXO2) par rapport aux exosomes dérivés de cultures 2D (MP) .

La figure 8 montre l'évaluation de l'activité anti-tumorale des exosomes dérivés de la culture 3D (EXO2) en comparaison avec les exosomes provenant de la culture 2D (MP) dans les cellules d'ostéosarcome 143B. Une diminution significative de la viabilité/prolifération des cellules 143B a été mise en évidence lorsque les cellules ont été traitées avec la dose la plus élevée d'échantillons EXO2 isolés par ultracentrifugation (UC2) (avec 74,60 + [33,57] % d'inhibition de la viabilité) ou par filtration tangentielle (TFF) (avec 76,75 + [35,08] % d'inhibition de la viabilité), tandis qu'un effet dose-réponse a été observé. En outre, la matrice extracellulaire néosynthétisée tridimensionnelle et sans échafaudage semble améliorer l'activité antitumorale des exosomes sécrétés (MP vs

EXO2).

Les graphiques représentent le pourcentage de viabilité cellulaire normalisé par rapport aux cellules non traitées. La doxorubicine 0,1 uM (Doxo 0,1 mM) a été utilisée comme contrôle positif. La ligne rouge représente 100 % de la viabilité. Les significations statistiques ont été testées par ANOVA- lorsque les valeurs ont passé les tests de normalité (a =0,05) ou par le test de Kruskal-Walli lorsque les valeurs n'ont pas passé les tests de nomalité (a=0,05). *, p<0,05 ; ***, p<0,001 ****, p<0,0001 ; ns, non significatif.

La figure 8A montre la viabilité des cellules 143B après 144h de traitement avec deux doses (1E+08 et 1E+09 No particule/mL) d'exosomes dérivés en 3D (EXO2) ou en 2D (MP) qui ont été isolés avec le protocole UC2.

La figure 8B montre la viabilité des cellules 143B après 144h de traitement avec deux doses (1E+08 et 1E+09 No particule/mL) d'exosomes dérivés de la 3D (EXO2) ou de la 2D (MP) qui ont été isolés avec le protocole TFF.

La figure 9 montre l'impact sur la viabilité des cellules du sarcome d'Ewing A673 lorsque les cellules ont été traitées pendant 144h avec deux doses (1E+08 et 1E+09 No particule/mL) d'exosomes dérivés de 3D (EXO2) qui ont été isolés par la méthode de filtration à flux tangentiel (TFF). Une diminution significative de la viabilité/prolifération des cellules A673 a été mise en évidence lorsque les cellules ont été traitées avec la dose la plus élevée de l'échantillon EXO2 isolé par TFF (avec 90,75+ [19,50] % d'inhibition de la — viabilité), tandis qu'un effet dose-réponse a été observé.

Les graphiques représentent le pourcentage de viabilité cellulaire nomalisé par rapport aux cellules non traitées. La doxorubicine 0,1 uM (Doxo 0,1mM) a été utilisée comme contrôle positif. La ligne rouge représente 100 % de la viabilité. Les significations statistiques ont été testées par ANOVA. **, p& 0,01 ; ns, non significatif. Points noirs : valeurs des lots individuels (réplicats biologiques). Chaque graphique représente la valeur moyenne des données de tous les lots testés. TFF : protocole d'isolement basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure 10 montre l'impact sur la viabilité des cellules souches mésenchymateuses non tumorales de la moelle osseuse humaine (hBM-MSC) lorsque les cellules ont été traitées pendant 144h avec deux doses (1E+08 et 1E+09 No particule/mL) d'exosomes dérivés de 3D (EXO2) qui ont été isolés avec différentes méthodes d'isolation : ultracentrifugation (UC2) ou filtration à flux tangentiel (TFF). Les EXO2 isolés par UC2 ont eu un impact significatif sur la viabilité des hBM-MSC (76.20+[32.68]% d'inhibition de la viabilité pour 1E+08 partcules/mL et 71.40+[39.20]% d'inhibiton de la viabilité pour 1E+09 particules/mL), alors que les EXO2 isolés par TFF n'ont pas montré d'effet cytotoxique significatif sur ces cellules non tumorales.

Les graphiques représentent le pourcentage de viabilité cellulaire normalisé par rapport aux cellules non traitées. La doxorubicine 0,1 uM (Doxo 0,1uM) a été utilisée comme contrôle positif. La ligne rouge représente 100 % de la viabilité. Les significations statistiques ont été testées par ANOVA-I. **, p< 0.01 ; ***, p<S 0.001 ; ns, non significatif.

Points noirs : valeurs des lots individuels (réplicats biologiques). Chaque graphique représente la valeur moyenne des données de tous les lots testés. UC2 : protocole d'isolement basé sur lultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolement basé sur la filtration à flux tangentiel.

La figure 11 montre l'induction de l'apoptose dans la lignée cellulaire de l'ostéosarcome 143B après traitement avec les compositions suivantes : exosomes provenant de cultures 2D (MP), exosomes dérivés des structures 3D sans échafaudage (EXO-2). Une induction claire de l'apoptose précoce a été observée après le traitement avec EXO-2 dans les cellules 143B, qui semble être significativement plus élevée que celle observée dans le cas d'EXO2 dérivé de la culture 2D.

Graphiques représentant l'induction par pli dans les échantillons traités normalisés par rapport aux cellules non traitées. 1,0 et 5,0 uM de doxorubicine ont été utilisés comme contrôle positif. MP : EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ; EXO2 : EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur lultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

Lafigure 11A montre les résultats pour les exosomes isolés avec UC2.

La figure 11B montre les résultats pour les exosomes isolés avec la TFF.

EXEMPLES

Exemple 1 : Fabrication de la composition de l'invention

Le NVDM2 est un produit allogène/off-the shelf, actuellement développé par Novadip

Biosciences : il est dérivé du produit autologue NVD002. Le NVD-002 est produit à partir de cellules souches humaines dérivées de l'adipeuse (hASC) différenciées en cellules ostéogéniques combinées à des particules de gélatine dérivées de la peau de porc (Cultispher) pour produire des greffons 3D "sans échafaudage". 1.1 Processus en amont :

Le processus de fabrication de la substance active commence après l'obtention du tissu, comme le montre la figure 1 : = Collecte de cellules souches ; = Prolifération des cellules souches ; = Différenciation ostéogénique ; = [aspersion de particules ; et = Formation de structures en 3D

Le processus en amont comprend les trois phases suivantes : 1.1.1 Processus en amont - phase 1 :

Isolement des cellules de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux et expansion ultérieure des cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux (hASC) jusqu'au passage p3/p4 dans un milieu prolifératif (MP). Le stock de cellules est cryopréservé. 1.1.2 Processus en amont - phase 2 : fabrication d'un produit cellulaire tridimensionnel comprenant les étapes suivantes :

Décongélation des ASC : La première étape du processus de fabrication des produits cellulaires NVDM2 est la décongélation des cellules à P4 à partir du stock de cellules. Les cellules sont décongelées et inoculées dans des flacons de 150 cm? dans un milieu de prolifération et rincées le jour suivant.

Phase de prolifération : Ensuite, les cellules prolifèrent jusqu'à atteindre une confluence 270% et <100%, avant d'effectuer le passage P4/P5.

Passage P4/P5 et phase d'induction ostéogénique : Au passage P4/P5, les cellules prélevées dans tous les flacons sont regroupées et ensemencées dans des flacons T150cm? à couvercle refermable (flacon "TPP") dans un milieu de différenciation ostéogénique (MD) à une densité d'ensemencement comprise entre 0,5x 104 cellules/cm? et 0,8x104 cellules/cm?.

Lorsque les cellules atteignent un niveau de confluence et qu'au moins un nodule ostéoïde (partie organique non minéralisée de la matrice osseuse qui se forme avant la maturation du tissu osseux) est observé dans chaque flacon, l'ajout de billes de gélatine peut être lancé.

Ajout de particules de cultisphère : Après avoir été exposés au milieu de différenciation ostéogénique (MD), les récipients de culture contenant la monocouche confluente de cellules ostéogéniques adhérentes sont saupoudrés de billes de gélatine. 1.1.3 Phase d'induction tridimensionnelle :

Quelques jours après l'ajout des billes de gélatine, les cellules différenciées et les particules dispersées s'intègrent progressivement dans la minéralisation de la matrice extracellulaire néo-synthétisée. À ce stade, les cellules différenciées et les particules de gélatine commencent à former une grande plaque tridimensionnelle (ou quelques plaques plus petites) de mastic moulable brun-jaune partiellement minéralisé qui se détache de chaque récipient de culture.

La formation du produit cellulaire tridimensionnel final est obtenue à la fin d'une période de maturation. Ce produit cellulaire (CP) est congelé avant d'être traité en aval.

Processus en aval : Séparation des exosomes par la FFT

Le sumageant obtenu à partir de la culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage est soumis à la FFT.

La taille des pores de la FFT est choisie pour permettre une séparation efficace des vésicules extracellulaires du sumageant de la culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage. Les figures 1 à 3 illustrent un exemple du présent procédé.

La FFT peut être combinée à d'autres étapes de séparation ou de concentration, telles que la centrifugation.

Exemple 2 : Bioessais de puissance pour évaluer l'activité antitumorale du produit sur des lignées cellulaires d'ostéosarcome.

L'activité antitumorale du matrisome a été testée sur trois lignées cellulaires stables d'ostéosarcome : 143B, U2OS et SaOS-2. Des cellules mésenchymateuses de moelle osseuse humaine (hBM-MSC) ont également été utilisées dans l'étude afin de déterminer si l'effet anti-prolifératif potentiel du matrisome est uniquement ciblé sur les cellules OS.

Culture cellulaire

Les cellules 143B ont été maintenues dans un milieu MEM contenant 10 % de sérum bovin foœtal (FBS), avec de la pénicilline, de la streptomycine et de l'amphotéricine B. Les cellules U20S, SaOS-2 et hBM-MSC ont été maintenues dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), avec de la pénicilline, de la streptomycine et de l'amphotéricine B.

Essais biologiques de viabilité

La viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide du test CCK-8 _ Pource test, le kit de comptage cellulaire 8 a été utilisé (Sigma-Aldrich). Ce test de viabilité est basé sur la réduction du sel de tétrazolium (WST-8) par les déshydrogénases à l'intérieur des cellules, ce qui donne un produit orange soluble dans le milieu de culture cellulaire. Ce produit coloré (formazan) est mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre. Le formazan est directement proportionnel au nombre de cellules vivantes présentes dans la culture cellulaire.

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et on les a laissées s'attacher pendant 24 heures.

Après une incubation O/N, le milieu a été retiré et les cellules ont été incubées pendant 144 heures en présence des différentes doses de l'élément testé. Un traitement à la — doxorubicine a également été appliqué à chaque lignée cellulaire comme composé de référence pour démontrer que le système est capable de détecter l'inhibition de la viabilité.

Les traitements ont été effectués en trois exemplaires. Après 144h d'incubation, la plaque à 96 puits a été retirée de l'incubateur, lavée avec du PBS 2X et 200pl de milieu contenant 20ul de réactif CCK8 ont été ajoutés dans chaque puits. La plaque a été incubée à 37°C pendant 2 heures et l'absorbance à 450 nm a été mesurée.

Analyse transcriptomique

Les exosomes obtenus par les cultures 3D sans échafaudage sont fortement enrichis en miARN, en particulier en miR-27a-3p, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-125a-5p ayant une activité suppressive de tumeur.

Analyse transcriptomique

Les exosomes obtenus par les cultures 3D sans échafaudage sont fortement enrichis en miARN ayant une activité suppressive de tumeur, en particulier miR-27a-3p, MIR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-125a-5p.

MP : EVs/exosomes dérivés de cultures cellulaires 2D dans un milieu de prolifération ;

EXO2 : EVs/exosomes dérivés des structures 3D ; UC2 : protocole d'isolation basé sur l'ultracentrifugation ; TFF : protocole d'isolation basé sur la filtration à flux tangentiel.

Le tableau 1 présente la liste des miARN qui ont été au moins deux fois plus enrichis dans les exosomes dérivés des structures 3D (EXO2) que dans les exosomes provenant des cultures 2D (MP), lorsque le protocole d'isolation par filtration sur flux tangentiel (TFF) a été utilisé.

Le tableau 2 montre la liste des miARNSs qui étaient au moins 2 fois plus enrichis dans les exosomes dérivés des structures 3D (EXO2) que dans les exosomes provenant des cultures 2D (MP), lorsque le protocole d'isolation par ultracentrifugation (UC2) a été utilisé.

hsa-miR-497-5p 8,3) [hse-miR-125a-3p | 2,5)

Tableau 1 se hsa-miR-30a-5p 191

Tableau 2

Traduction des expressions anglaises dans les dessins : «Stem cell prolferation — Proifération des celulessouches ee Wee T7 ME 3D structures supematant collection Collecte du sumageant de la structure 3D -

RIT Taille des pores BO nm

TT Ultracentrfugation 7 Uiracentifigation 07

Ker Facheurks 9 Beckman Coulter 8 Beckman Coulter

Redenen

Patrie dede ies CS ii TT

9 Anglais | Français : 9 Level | Niveau ;

Isolation | Isolement :

Sample type | Type d'échantillon : : Clusters from sample groups | Clusters de groupes d'échantillons : 9 Variance | Variance : 9 Group | Groupe : 9 Isolation method : Méthode d'isolement : ; No of identified proteins Nombre de protéines identifiées : 9 Viability à Viabilité :

Normalized to untreated \ Normalisé par rapport aux échantillons 9 | non traités : : Foldinduction nomalizedtothe © Induction multipliée normalisée par untreated samples _ rapportaux échantilons non traités

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de production d'une composition comprenant des vésicules extracellulaires, comprenant les étapes suivantes : = Culture de cellules souches, de préférence de cellules souches adipeuses ; = Différencier les cellules souches, de préférence les différencier de manière ostéogénique ou chondrogénique ; = Ajout d'un matériau particulaire, de préférence des billes de gélatine, pour obtenir une culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage ; = Collecte du liquide contenant les vésicules extracellulaires de la culture cellulaire multidimensionnelle sans échafaudage ; = Soumettre le liquide contenant les vésicules extracellulaires à une filtration à flux tangentiel (TFF).

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le dispositif TFF comprend une membrane de filtration dont la taille des pores est comprise entre 10 nm et 100 nm, de préférence entre 25 nm et 75 nm, de préférence encore entre 40 nm et 60 nm.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le nombre de vésicules extracellulaires dans la composition comprenant les vésicules extracellulaires ou pouvant être obtenue selon Ie procédé de la présente invention est de 1,101 à 1,1013 , de préférence de 5,101 à 1,1013 et encore plus préférentiellement de 5,101" à 5,1012 par ml de la composition tel que mesuré par l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA).

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le nombre de vésicules extracellulaires dans le liquide contenant des vésicules extracellulaires avant l'étape TFF est compris entre 1,108 et 1,10"° , de préférence entre 5,108 et 5,109 et encore plus préférentiellement entre 7,108 et 3,109 par ml de la composition, tel que mesuré par l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA).

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la concentration en protéines dans la composition de l'invention est comprise entre

1000 microgrammes/ml et 15000 microgrammes/ml, de préférence entre 2000 microgrammes/ml et 15000 microgrammes/ml, de préférence encore entre 2000 microgrammes/ml et 10000 microgrammes/ml.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la composition présente un indice de pureté, mesuré par le nombre de vésicules extracellulaires par microgramme de protéine, de 1,107 à 1,109, de préférence de 5,107 à 1,109, de préférence encore de 5,107 à 5,108 .

7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la FFT est utilisée pour réduire la quantité ou le niveau de liquide de la composition comprenant les vésicules extracellulaires.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la FFT est utilisée pour éliminer de 50 % à 99,9999 %, de préférence de 70 % à 99,9999 %, de préférence encore de 90 % à 99,9999 % du liquide de la composition.

9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les cellules différenciées néo-synthétisent une matrice extracellulaire par l'ajout de la matière particulaire.

10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les cellules matures et le matériau particulaire sont intégrés dans la matrice extracellulaire néo-synthétisée.

11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les cellules différenciées sont choisies dans le groupe constitué par les ostéoblastes, les ostéocytes, les chondroblastes, les chondrocytes, les kératinocytes, les myofibroblastes, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les adipocytes, les cellules neurales et leurs précurseurs, et sont de préférence des cellules de tissus mous, des chondroblastes ou des ostéoblastes.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la matière particulaire est choisie dans le groupe constitué par : = une matière organique, y compris la matrice osseuse déminéralisée (DBM), la gélatine, l'agar/agarose, les alginates, le chitosane, le sulfate de chondroitine, le collagène, l'élastine ou les peptides de type élastine (ELP),

le fibrnogène, la fibrine, la fibronectine, les protéoglycanes, les protéoglycanes de sulfate d'héparane, l'acide hyaluronique, les polysaccharides, les laminines et les dérivés de la cellulose ; de préférence, la gélatine ; = Un composé calcique comprenant des particules de phosphate de calcium, et de préférence encore de l'hydroxyapatite (HA) et/ou du B- phosphate tricalcique (B-TCP) ; = un polymère, y compris les polyanhydrides, l'acide polylactique (PLA), le poly(acide lactique-coglycolique) (PLGA), l'oxyde de polyéthylène/polyéthylène glycol (PEO/PEG), le poly(alcool vinylique) (PVA), les polymères à base de fumarate tels que, par exemple le fumarate de polypropylène (PPF) ou le fumarate de polypropylène-co- éthylène glycol (P(PF-co-EG)), le fumarate d'oligopolyéthylène glycol (OPF), le poly(aldéhyde guluronate) (PAG), la polyp- vinyl pyrrolidone (PNVP), ou des combinaisons de ceux-ci ; = un gel, y compris un gel d'oligopeptides auto-assemblés, un microgel, un nanogel, un gel particulaire, un hydrogel, un gel thixotropique, un xérogel, un gel réactif, ou des combinaisons de ceux-ci ; = une crème; et = toute combinaison de ces éléments.

13. Utilisation d'une composition comprenant des vésicules extracellulaires pour le traitement ou la prévention du cancer, en particulier pour induire l'apoptose dans les cellules cancéreuses, en particulier l'ostéosarcome, dans laquelle la composition est obtenue selon un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.