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Description


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   MEMOIRE DESCRIPTIF à l'appui d'une demande de B R E V E T   D'   INVENTION "Milieux employés pour la culture de moisissures et procédé de préparation de substances   anti-bactérielles."   La Société dite: 
 EMI1.1 
 "lbà société Anonyme, SE3-Tt± IrS'RE- H--, Bâle (Suisse) Faisant objet de deux premières demandes de brevets déposées en SUISSE, les 13 janvier 1944 et 3 Août 1944. Comme milieux employés pour cultiver les moisissures capables de former des substances anti-bactérielles, on a employé   jusqu'à   présent surtout des bouillons de viande ou des solutions nitritives préparées à partir de sels minéraux et d'hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose ou le maltose pur.

   Or les substances anti-bactérielles ne se forment que relativement lentement sur ces solutions nutritives artificielles. En ajoutant des substances tampons 

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 et des filtrats de cultures, le temps de développement peut être réduit à environ la moitié. On a également recommandé d'ajouter des: extraits de levure comme substances favorisent la croissance des moisissures; les auteurs qui ont   recommandé   cette addition   l'ont  suppriméepar la suite. Les cultures faites dans ces conditions ne donnent cependant qu'une faible concentration en substances   anti-bactérielles   dans les solutions nutritives.

   On a par conséquent proposé de remplacer le saccharose pur par du "sucre brun", ce qui doit permettre d'obtenir en un temps un peu plus court   de:;   filtrats de culture jusqu'à 10 fois plus actifs. 



   La demanderesse a trouvé   qu'on   peut employer avantageusement comme milieux pour le. culture de moisissures capables de former des substances anti-bactérielles, des substrats qui ont une teneur en lait eu minimum partiellement dégraissé et le ces échéant désalbuminé ou en produitslactés correspondants. Les laits ou produits lactés de ce genre sont par exemple: le lait maigre ou lait écrémé, le babeurre, le petit lait, le petit lait désalbuminé appelé aussi recuite, les eaux-mères du sucre de lait, la poudre de lait maigre ou de recuite, etc.

   Ces milieux ne contenant que peu de sels par rapport à leur teneur en lactose, on leur ajoute avantageusement des sels minéraux tels qu'on en emploie habituellement dars la culture de ces moisissures, par exemple des nitrates alcalins, des phosphates alcalins, des chlorures alcalins, du sulfate de magnésium ou de fer. 



   L'addition d'une autre source de carbone est en général superflue lorsque le lait au minimum partiellement dégraissé et le cas échéant désalbuminé ou ces produits sont employés dans des concentrations dont la teneur en lactose 

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 est supérieur à 2% dans le substrat prêt à la culture. On   einployera   donc par exemple des petits laits ou des recuites dilués à 50% ou moins, qui fournissent en même temps les substances de croissance et les hydrates de carbone nécessaires. D'autre part il suffit déjà d'ajouter des laits et produits lactés définis ci-dessus en faible quantité aux milieux de culture, par exemple 2 - 25% de petit lait, pour que ces milieux contiennent les substances de croissance encore nécessaires.

   Il est toutefois alors avantageux d'ajouter/des hydrates de carbone, par exemple du glucose, du saccharose, du lactose ou du maltose à ces milieux. 



   Pour diluer ou pour préparer les solutions nutri- tives, on emploiera avantageusement de l'eau de source douce ou adoucie, ou de l'eau distillée. 



   Le procédé de la présente invention pour préparer des substances anti-bactérielles au moyen de moisissures est caractérisé par l'emploi des nouveaux milieux définis ci-dessus pour cultiver ces moisissures. On prendra d'autre part les mesures déjà connues, par exemple on pourra ajouter d'autres substances de croissance, des substances tampon, on réglera la température à environ 20-25 , on remuera, etc. 



   Le procédé de la présente invention permet d'obtenir des milieux, par exemple des filtrats, dont la teneur en substances anti-bactérielles, après que la culture a été effectuée, est notablement plus élevée que la teneur des milieux employés jusqu'à présent. D'autre part le procédé de la présente invention permet de remplacer le sucre pur, rare et cher pendant les périodes d'économie déficiante, par des sous-produits bruts, bon marché et facilement accessibles. 

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   Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois la limiter. 



   Exemple 1
On prépare des solutions nutritives de composition suivante : a) petit lait désalbuminé ou recuite 99,5% ainsi qu'un mélange de sels analogue à celui de   Czapek-Dox,   c'est-à-dire 0,3% de nitrate de sodium, 0,1% de monophosphate de potassium,   0,05%   de chlorure de potassium, 0,05% de sulfate de magnésium,   0,001%   de sulfate ferreux; b) petit lait désalbuminé ou recuite 100%; c) petit lait désalbuminé ou recuite 75%, mélange de sels précité 0,5%, eau distillée   24,5%;   d) petit lait désalbuminé ou recuite 50%, mélange de sels précité 0,5%, eau distillée 49,5%; e) petit lait désalbuminé ou recuite 25%, mélange de sels précité 0,5% eau distillée 74,5%;

   f) petit lait désalbuminé ou recuite 10%, mélange de sels précité 0,5%, eau distillée   87,5%:   sucre de canne pur 2%, g) petit lait désalbuminé ou recuite 2%, mélange de sels précité 0,5%, eau distillée   95,5%,   sucre de canne pur 2%, h) mélange de sels précité 0,5%, eau distillée 97,%%, sucre de canne pur 2% (culture de comparaison). 



   On stérilise des couches minces de ces solutions nutritives et les inocule avec une moisissure appartenant au groupe chrysogenum du genre Pénicillium, qui ne se distingue du Penicillium notatum   Westling   que par la grandeur des spores. A cet effet on emploie une suspension de spores dans un filtrat de cette moisissure obtenu précédemment.   Apres   une culture d'environ 9 jours, on élimine le mycelium formé 

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 d'essai en filtrant et examine l'effet de prises/des filtrats de ces cultures sur le Staphylococcus aureus.

   Les différents filtrats contiennent alors : 
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<tb> a) <SEP> 52 <SEP> unités <SEP> d'Oxford <SEP> par <SEP> com.
<tb> b <SEP> ) <SEP> 12 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> c) <SEP> 52 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> d) <SEP> 40 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> e) <SEP> 10 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> f) <SEP> 26 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> g) <SEP> 12 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> h) <SEP> 3 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> "
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Les cultures obtenues avec addition de petit lait désalbuminé ou recuite sont donc bien su.périeures à celles obtenues sans petit lait désalbuminé. 



   A la place d'eau distillée on peut aussi employer de l'eau de source douce ou adoucie pour préparer les solutions nutritives et à la place du sucre de canne, par exemple du glucose, du lactose ou du maltose, ainsi que du sucre brut, par exemple du sucre interverti, du sucre candi, du jus de betterave, de la mélasse ou de la vinasse. 



   On peut extraire la substance anti-bactérielle ainsi formée des filtrats de culture acidulés au moyen d'éther acétique ou d'éther. Cette substance se comporte aussi à d'autres points de vue de manière analogue à la Pénicilline; on peut l'enrichir et la purifier de manière connue. 



   Exemple 2
On prépare des solutions nutritives a - h comme on l'a indiqué à l'exemple 1 en employant du petit lait à la place du petit lait désalbuminé ou recuite. Pendant la stérilisation de ces solutions il se sépare des protéines. 

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  Les milieux de culture contenant les précipités sont inoculés et donnent, après forte croissance de la moisissure, des filtrats qu'on examine sur le Staphylococcus aureus. On constate alors les mêmes effets   antj-bactériels   qu'à l'exemple 1. Les protéines précipitées n'influencent donc pas défavorablement la formation des substances autibactérielles. 



   Exemple 3
On emploie les mêmes solutions nutritives contenant du petit lait   qu'à   l'exemple 2. On les chauffe à 90  et les maintient 2 heures à cette température. Puis on filtre les protéines précipitées à l'état floconneux, stérilise le filtrat et l'inocule comme on l'a indiqué à l'exemple 1. Au lieu de procéder au chauffage comme on l'a décrit ci-dessus, on peut aussi stériliser les solutions nutritives prêtes dans un autoclave, puis filtrer et stériliser une seconde fois. 



   Lorsqu'on emploie des solutions nutritives préparées de cette manière, on obtient la même quantité de substances anti-bactérielles qu'à l'exemple 1. 



   Exemple 4
On prépare une solution nutritive de composition suivante: 5,5% de poudre sèche de lait maigre, 0,3% de nitrate de sodium,   0,05%   de phosphate monosodique,   0,07%   de phosphate dipotassique,   0,05%   de chlorure de potassium, 0,05% de sulfate de magnésium,   0,001%   de sulfate ferreux, 94% d'eau adoucie. 



   On acidule cette solution avec de l'acide lactique à un pH de 4,5, la chauffe lentement à 90  et la laisse refroidir lentement à la température ordinaire. Puis on filtre le précipité, stérilise la solution et l'inocule avec du Penicillium notatum Fleming. Lorsqu'il s'est formé un mycelium épais, on filtre et examine le filtrat de culture sur le 

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 Staphylococcus aureus. Il contient 48 unités d'Oxford par ccm. 



   A partir d'une culture de comparaison qui, à la place de poudre sèche de lait maigre, contient la quantité correspondante de lactose pur, on obtient un filtrat de culture ne contenant que 4 unités d'Oxford par ccm. 



   R é s u m é. 



   La présente invention a pour objet : 1.) Les milieux employés pour la culture de moisissures capables de former des substances anti-bactérielles, caractérisés par une teneur en lait au minimum partiellement dégraissé ou désalbuminé ou en produits lactés correspondants. 



  2. ) Ce procédé peut être en outre caractérisé par les points suivants pris ensemble ou séparément : a) On ajoute aux milieux employés des sels minéraux tels qu'on en emploie habituellement dans la culture de moisissures. b) Les milieux employés ont une teneur en lait ou en produits lactés définis ci-dessus comme seule source de carbone pour les moisissures. c) Les milieux employés ont une teneur relativement faible en lait ou en produits lactés définis ci-dessus et sont additionnés d'hydrates de carbone comme autre source de carbone. 



  3) Un procédé de préparation de substances antibactérielles au moyen de moisissures, consistant à employer les milieux définis sous 1 - 2, a - c, pour la culture des moisissures. 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

Les substances anti-bactérielles préparées au moyen de moisissures en employant les milieux définis sous 1 - 2 a - c ou ces mêmes substances préparées par tout autre procédé, pour leurs applications autres que la thérapeutique. **ATTENTION** fin du champ CLMS peut contenir debut de DESC **.