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Procédé de préparation de substances vitaminiques.
L'invention est relative., de façon générale, à la produc- tion de substances de valeur au point de vue thérapeutique et alimentaire par fermentation, et en particulier à un procédé perfectionné de production microbiologique de substances vita- miniques ayant des propriétés favorisant la croissance du micro- organisme Lactobacillus lactis Dorner. Elle est également rela-
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tive à un procéda perfectionné de production microbiologique de vitamine B 12. La vitamine B 12 est un dérivé soluble dans l'eau., de couleur rouge, cristallin pouvant être extrait du foie et utile au traitement de certains genres d'anémie humaine, par exemple l'anémie pernicieuse. Il est également utile comme facteur alimentaire pour des animaux.
L'invention a pour but la production de substances vitamini- ques par fermentation d'un milieu d"alimentation contenant du cobalt ajouté, au moyen d'une culture produisant une activité LLD d'un micro-organisme appartenant aux Champignons sub-phylum.
Les substances vitaminiques telles que la vitamine B12 pro- duites par application du procédé perfectionné de l'invention, sont étudiées commodément en utilisant la réponse de croissance du micro-organisme Lactobacillus lactis Dorner dans les conditi- ons décrites par Shorb (J.Biol.Chem, 169.455-6). Les puissan- ces de ces substances vitaminiques et de bouillies fermentées et de concentrés enrichis en ces substances, sont exprimées en termes d'activité LLD en se basant sur un standard arbitraire de foie, ayant une puissance de 1,000 unités LLD par milligram- me. On a déterminé que la vitamine B12 cristalline pure a une activité LLD d'environ 11.000.000 unités LLD/mgr.
On produit des substances vitaminiques ayant une activité LLD par fermentation de milieux d'alimentation par des cultu- res sélectionnées de différentes variétés de Champignons sub- phylum. La puissance de bouillies résultant de la fermentation de milieux d'alimentation ordinaires par ces organismes, est cependant excessivement faible en comparaison de la puissance de la vitamine B12 pure. Ces produits ont une teneur variable en substances à activité LLD, qui dépend de la variété de cham- pignon utilisée, mais ordinairement ils possèdent une activité LLD équivalente à une teneur en vitamine B12 de l'ordre de 0,00003 mgrs/ml.
Il est extrêmement difficile de séparer la
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vitamine B12 pure ou des concentrés à activité LLD de grande activité, des grandes quantités d'impuretés présentes dans ces milieux. Il est par conséquent de grande importance de trouver un moyen d'augmenter la puissance LLD de la bouil fermentée et d'augmenter en même tempw la concentration de substances à activité LLD par rapport aux solides totaux de la bouillie.
On a maintenant découvert que ces buts peuvent être réalisés on cultivant des cultures de Champignons qui produisent des subs- tances ayant une activité LLD,, dans dès milieux d'alimentation aqueux contenant du cobalt ajouté. On a trouvé que lorsque ces champignons sont cultivés en présence de cobalt ajoutée des quan- tités fortement accrues de substances à activité LLD sont produi- tes par le micro-organisme. On obtient ainsi une bouillie finale d'activité LLD fortement accrue, et également une augmentation considérable de la concentration en vitamine B12 par rapport aux matières solides totales de la bouillie.
Cette production micro- biologique accrue de matière à activité LLD non seulement facili- te la séparation de vitamine B12 pure de la bouillie fermentée mais rend également possible l'utilisation des matières solides de la bouillie comme supplément d'alimentation pour des animaux.
Il est particulièrement surprenant que l'addition de cobalt puisse stimuler une production microbiologique accrue de subs- tances à activité LLD telles que la vitamine B12, car on sait que le cobalt est extrêmement toxique vis-à-vis de nombreux mi- cro-organismes. On a trouvé qu'à des concentrations plus élevées, le cobalt est en fait également toxique aux cultures de champi- gnons qui produisent des substances ayant une activité LLD. Par exemple, une quantité de cobalt (sous forme de nitrate de cobalt) de plus de 10 à 20 parties par million basées sur le milieu em- pêche en réalité la production de substances à activité LLD par le champignon Streptomyces grisous.
On peut varier la quantité de cobalt présente pendant la
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fermentation suivant le Milieu utilisée mais on préfère d'habi- tude employer une quantité de cobalt comprise entre 0,1 et 20 parties par million de parties de milieu. Dans certains cas, il peut être désirable d'utiliser des quantités de cobalt plus élevées ou plus faibles suivant la toxicité du cobalt pour le champignon particulier employé. Dans le cas de Streptomyces griseus . on a préparé des bouillies de fermentation de grande activité LLD et assuré des productions excellentes de vitamine B12 cristallins en cultivant les micro-organismes dans des mi- lieux contenant environ deux parties de cobalt par million (sous forme de nitrate de cobalt).
On peut ajouter le cobalt sous forme métallique, mais on l'ajoute ordinairement saus forme d'un composé de cobalt, de préférence un sel de cobalt tel que le nitrate de cobalt; ou sous la forme d'un sel ou complexe de cobalt existant dans la nature tel qu'il peut exister dans des aliments microbiens ri- ches en cobalt. Par suite de la difficulté d'assurer la quanti- té désirée de cobalt par addition de ces matières nutritives existant dans la nature, on préfère ajouter le cobalt sous for- me d'un sel de cobalt.
Pour l'application de l'invention, on peut utiliser un mi- lieu d'alimentation utilisé ordinairement à la propagation de champignons. La production d'activité LLD par un champignon don- né peut, il est vrai, varier suivant le milieu d'alimentation employé., mais on a trouvé que pour un type quelconque donné de milieu trop pauvre en cobalt, l'addition d'une petite quanti- té de cobalt produit invariablement une grande augmentation de la production de substances à activité LLD.
Les aliments usuels comprennent une source de carbone as- similable, une source d'azote assimilable, des sels inorganiques et des facteurs de puissance lorsque c'est nécessaire. On peut introduire le carbone sous forme d'un hydrate de carbone tel que la dextrose, maltose., xylose.. sucre interverti, sirgpde/
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grains, etc.. On peut introduire l'azote sous forme d'un sel d'ammonium acides aminés ou protéines, telles que fèves de soya, avoine, levure, extraits de levure, produit de digestion tryptique de caséine, extrait de viande, poudre de sang, vian- de protéinique et déchets d'os, farine de saumon , farines de poissons, produits de poissons solubles, produits solubles de distilleries, etc.
Si on le désire, les champignons peuvent être cultivés en utilisant des protéines (ou aminoacides) sans qu'au- cun hydrate de carbone ne soit présent dans le milieu, et dans ce cas les protéines (ou aminoacides) servent à la fois de sour- ce de carbone et d'azote exigés par le micro-organisme.
Les micro-organismes, dont des cultures sélectionnées sont considérées comme appropriées à la fermentation, en utilisant des milieux d'alimentation aqueux contenant du cobalt ajouté, sont des éléments de Champignons, tels que définis aux pages 1 et 2 de l'ouvrage intitulé : "An Introduction to Industrial Mycology" par Smith & Raistrick (Londres, Edward Arnold and C , troisième édition, i946), c' est :ci dire des Myxomycètes, Schizomycetes et Eumycetes. Les Schisomycetes conviennent par- ticulièrement bien, et particulièrement certaines cultures du genre Streptomyces griseus qui peuvent être également utilisées à la production des antibiotiques streptomycine et griséine.
D'autres variétés de Streptomyces, telles que Streptomyces albidoflavus, Streptomyces colombiensis nov. sp. Streptomyces rosechromogenus et Streptomyces antibioticus comprennent des cultures produisant de grandes quantités de substances à activi- té LLD. D'autres Schizomycetes appropriés sont des éléments du genre Clostridium, et on a trouvé que des cultures sélectionnées des variétés suivantes produisent des substances à activité LLD dans les conditions de fermentation du procédé de l'invention; clostridium tetanoporphum, Clostridium cochlearium, Clostridium
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flabelliferum et Clostridium butyricum.
D'autres micro-organis- mes parmi les champignons, qui ont été trouvés de môme produire une activité LLD sont les Torula, Eremothecium ashbyii et Escherichia coli. Il faut cependant appuyer sur le fait que pour un genre quelconque donné de champignon, il est nécessai- re de choisir des cultures produisant des substances à activité LLD. L'invention n'est ni limitée à un champignon quelconque en particulier et ne comprend non plus n'importe qielle culture d'un champignon donné quelconque. D'autre part., tout micro-orga- nisme essayé jusqu'à présent, produisant des substances à acti- vité LLD, produira ces substances à, activité LLD avec un ren- dement notablement accru si on la cultive dans un milieu ali- mentaire aqueux contenant une concentration optimum en cobalt.
Le milieu est stérilisé et le milieu stérilisé contenant la quantité désirée de cobalt est inoculé dans une culture du champignon choisi, et le mélange est soumis à l'incubation jusqu'à ce qu'on atteigne l'activité LLD optimum. On conduit habituellement la fermentation pendant une période d'environ deux à sept jours, bien que des durées plus courtes ou plus longues puissent être employées si on le désire. L'incubation s'effectue d'habitude dans des conditions submergées et à une température appropriée au champignon spécifique utilisé.
La vitamine B12 peut être séparée du mélange de fermenta- tion sous forme cristalline, si on le désire, par filtration de la bouillie de fermentation et traitement de la bouillie filtrée par du charbon de bois activé, pour adsorber la vita- mine B12. On élutrie le charbon activé par une solution aqueuse de pyridine ou d'alpha-picoline et on évapore l'élutriat à sic- cité. On extrait le concentré solide par un alcool aliphatique inférieur, tel que l'alcool méthylique, et on fait passer l'ex- trait alcoolique à travers une colonne chargée d'alumine acti-
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vée pour adsorber la vitamine B12 sur l'alumine.
On fait en- suite passer dais la colonne un solvant d'alcool aliphatique inférieur frais et on réunit les fractions de l'élutriat qui présentent une activité de vitamine B12 (telle que déterminée par l'essai microbiologique), et on concentre les élutriats réunis. On mélange alors la solution alcoolique concentrée à un liquide miscible à la solution et dans lequel la substance active est insoluble, comme l'acétone. On purifie le précipité qui se forme par reprécipitation à partir d'alcool par addi- tion d'acétone et on purifie le produit davantage par cristalli - sation à partir d'eau par addition d'acétone pour produire la vitamine B12 cristalline.
Les exemples qui suivent illustrent des procédés d'applica- tion de la présente invention., mais il est bien entendu que ces exemples sont donnés à titre d'illustration et non de li- mitation.
EXEMPLE 1
On prépare des milieux contenant 2 % de levure séchée en suspension dans l'eau distillée et différentes quantités de co- balt (sous forme de nitrate de cobalt), comme on l'indique sur le tableau suivant, et on les subdivise dans des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml. contenant 40 ml. par flacon. Après stérilisation des flacons et de leurs contenus à 1200 C pen- dant une demi -heure, on inocule les flacons au moyen d'envi- ron 2,5 % en volume d'une culture végétative de 48 heures de Streptomyces griseus 25G (culture produisant la griséine) cul- tivée dans un milieu d'extrait de viande-produit de digestion tryptique de caséine. Après inoculation, on maintient les bouillies inoculées à 280 C pendant 4 jours pendant lesquels on les remue continuellement sur une machine à remuer rotative.
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Après la fin de cette période de fermentation., les activités des bouillies, déterminées par des essais sur le Lactobaoillus lactis Dorner sont les suivantes :
Cobalt : parties par Unités LLD par ml. de million bouillie fermentée
EMI8.1
<tb> 0 <SEP> 300
<tb>
<tb> 1 <SEP> 2760
<tb>
<tb> 2 <SEP> 3000
<tb>
<tb> 10 <SEP> 4600
<tb>
<tb> 20 <SEP> 3000
<tb>
E X E M P L E 2
EMI8.2
..¯¯¯..s..,sm rmvm On prépare un milieu contenant les éléments suivants : Viande protéinique et déchets d'os . 8 % Chlorure de sodium ........ 05 %
EMI8.3
Fes04.HaO ........... 15 parties par mail- lion
Eau distillée pour parfaire le total de 100 %.
On prépare ce milieu, on le stérilise, on l'inocule et on le soumet à l'incubation comme il est décrit dans l'exemple 1. La deuxième partie du même mélange additionnée de 2 parties par million de cobalt (qu'on ajoute sous forme de nitrate de cobalt) est stérilisée, inoculée et soumise à l'incubation de la même manière. A la fin de la période de fermentation, les bouillies donnent les analyses suivantes :
EMI8.4
Sans cobalt Cobalt 2 parties dan million 160 unités LLD/ml 590 unités LLD/ml.
EXEMPLE 3 On prépare des milieux de fermentation contenant les
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constituants suivants :
Produit de digestion tryptique de caséine 1 %
Extrait de viande ............. 0,3 %
Chlorure de sodium ............ 0,5 %
FeSO4.H2O ................ 50 parties par million.
Huile de fèves de soya ......... 0,15 % (comme antimousse)
Eau de conduite pour parfaire un total de 100 %.
On prépare le milieu ci-dessus dans un appareil de fermen- tation de 3000 gallons et on le stérilise. On inocule le milieu par 275 gallons d'inoculum végétatif d'une culture produisant la griséine de Streptomyces griseus, désignée comme 25G, et on soumet le milieu à l'incubation à 28 C pendant 48 heures dans des conditions agitées., submergées et aérées.
On soumet la bouillie fermenté à un essai en utilisant la Lactobacillus lactis Dorner comme organisme d'essai et on traite ensuite la bouillie pour obtenir la vitamine B12 cris- 12 talline. On effectue cette obtention par filtration de la bouil- lie et adsorption de la matière active qu'elle renferme au moyen de charbon de bois activé. On élutrie l'adsorbat du charbon par une solution aqueuse de pyridine et on évapore l'é- lutriat résultant à siccité sous pression réduite.
On extrait le concentré solide ainsi obtenu par l'alcool méthylique et on adsorbe l'extrait alcoolique dans une colonne en utilisant de l'alumine activés, et on élutrie la matière active, au moyen d'alcool méthylique frais. On concentre ensemble les fractions présentant l'activité microbiologique la plus prononcée et on mélange ensuite la solution concentrée avec de l'acétone, pour précipiter la vitamine B12 brute, qu'on sépare. On purifie ce produit par réprécipitation de sa solution dans l'éthanol par @
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addition d'acétone. On purifie davantage ce produit par cris- tallisation en partant d'eau-acétone pour produire de la vita- mine B12 cristalline.
Les résultats suivants ont été obtenus sur des essais en duplicata montrant l'effet du cobalt, qu'on a ajouté sous for- me de nitrate de cobalt : Essais n Cobalt, parties Puissance des bouillies Vitamine % par million Unités LLD/ml. cristalline
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¯¯¯¯ ¯...¯¯¯ ni ¯ .=-âÉB&r4e¯
EMI10.2
<tb> 1 <SEP> Aucun <SEP> 173 <SEP> 18,4 <SEP> mgrs.
<tb>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> parties <SEP> 3250 <SEP> (en <SEP> moyenne) <SEP> 106.7 <SEP> mgrs.
<tb>
EXEMPLE 4
On prépare un milieu de fermentation contenant les consti- tuants suivants :
Farine de fèves de soya (Staley 4-s) 3 %
Dextrose .............. 2%
EMI10.3
Nazi .............. z 25 z%
Produits de distilleries solubles 0,75 %
Eau pour parfaire un total de 100 %
On prépare ce milieu et le subdivise dans des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml. contenant 40 ml. par flacon. On ajoute différentes quantités de cobalt (sous forme de nitrate de co- balt) comme on l'indique sur le tableau ci-dessous et on stéri- lise les flacons et leur contenu par chauffage à 1200 C. pen- dant une demi-heure. On inocule les flacons avec environ 2,5 % en volume d'une culture végétative de 48 heures d'une culture de Streptomyces griseus produisant de la streptomycine.
Après
EMI10.4
inoculation,, on Maintient les bouillies inoculées à 27 C. pen- dant 3 jours et, pendant ce temps, on les remue continuellement dans uns machine à remuer rotative. A la fin de cette période de fermentation, las activités de streptomycine et LLD des
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bouillies sont les suivantes :
Cobaltparties par million Streptomycine Unités LLD/ml.
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¯¯#, ¯ ¯¯¯¯¯ #¯. nr! .e. ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI11.2
<tb> 0,0 <SEP> 850 <SEP> 300
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> 825 <SEP> 3000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 845 <SEP> 3100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 650 <SEP> 4200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> , <SEP> 0 <SEP> 235 <SEP> 5000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,0 <SEP> moins <SEP> de <SEP> 150 <SEP> 2400
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,0 <SEP> idem <SEP> 2000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12, <SEP> 0 <SEP> idem <SEP> 220
<tb>
EXEMPLE 5 On prépare un milieu contenant les constituants suivants:
EMI11.3
<tb> Infusion <SEP> cervelle-coeur <SEP> ...... <SEP> 18,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Agar <SEP> ................ <SEP> 1,85 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Eau <SEP> 495 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> $7,0-7,2
<tb>
On prépare ce milieu et le subdivise dans des flacons Erlenmeyer contenant 100 ml. de milieu par flacon. On stérili- se les flacons et leurs contenus par chauffage pendant 25 mi- nutes à 120 C. On refroidit les milieux à 370C. et les inocule par 1 ml. par flacon d'une suspension de Clostridium tetanomor- phum cultivée anaérobiquement sur un milieu cervelle-foie-coeur Bacto. Après inoculation, on maintient les bouillies inoculées au repos à 37 C pendant une période indiquée sur le tableau ci-dessous.
On stérilise, inocule et soumet à l'incubation de façon semblable un second groupe de flacons contenant la même milieu
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additionné de 10 microgrammes d'haaa,hrdrats de nitrate de co- balt par ml. (environ 3 parties de cobalt par million de par- ties par milieu). A la fin de la période de fermentation les
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bouillies donnent les résultats d'essais suivants (les valeurs données ont été obtenues en prenant la moyenne des valeurs obtenues sur quatre fermentations différentes effectuées cha- cune dans les conditions indiquées).
Période pas de Activité LLD par ml. de fermentation cobalt Cobalt: 3 parties -par million.
EMI12.1
<tb>
Jours
<tb>
<tb> 4 <SEP> 600 <SEP> 4600
<tb>
<tb> 7 <SEP> 760 <SEP> 6300
<tb>
On peut apporter différents changements et modifications au mode d'application de la présente invention sans s'écarter de son esprit ni de son domaine, par exemple en utilisant des milieux d'alimentation solides tels que du son de grain au lieu des milieux d'alimentation spécifiés. Pour autant que ces chan- gements et modifications rentrent dans le domaine des revendica- tions jointes, ils doivent être considérés comme faisant partie de l'invention.
REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de substances vitaminiques, caracté- risé en ce qu'il comprend la fermentation d'un milieu d'a- limentation contenant du cobalt ajouté, au moyen d'une culture de micro-organisme produisant une activité LLD, et appartenant aux champignons sub -phylum .