BE497813A - - Google Patents

Description

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  PROCEDE DE SEPARATION DES GLOBULINES BETA ET GAMMA DU PLASMA SANGUIN. 



   Il a été décrit dans le brevet anglais ? 6030 998 un procédé   permettant   la séparation du fibrinogène et de la prothrombine du sang des mammifères, et plus particulièrement du sang humaine Comme décrit dans ce brevet, le liquide surnageant après la précipitation de la prothrombine était enlevé et soumis à un traitement ultérieur (éventuellement après un traite- ment destiné à séparer d'autres globulines), afin de donner un fluide se   prê-   tant à une   transfusion 0 -   
La présente invention concerne la-séparation de ces autres   globu-   lines du liquide surnageant le précité, notamment des globulines gamma et bè- tâ, et elle vise la séparation de ces deux globulines.Ce résultat est obte= nu, suivant l'invention, en amenant le pH du liquide surnageant,

   sépare de la prothrombine,à une valeur comprise entre 5 et 6,50, en le diluant d'eau dis- tillée   stérile,   de façon à amener la concentration ionique   à   une valeur com- prise entre   0,12   et   0,012,   en ajoutant progressivement de   l'éther   pour amener la teneur en éther du mélange à un pourcentage de 16 à 18,5 en   volume,   en - abaissant en même temps la température à une valeur comprise entre -2 et 3,5  G.,en laissant reposeret en enlevant le précipité obtenu qui contient la plus grande partie des globulines bèta et   gamma.   



   La globuline   bèta   est séparée du précipité,obtenu en la dissol- vant dans une solution tampon appropriée, dont le pH est suffisamment bas pour   1?amener   en solution à un   pH   par exemple inférieur à 4,8 en ajoutant une solution tampon d9un   pH   élevé pour porter le   pH   de la solution à une valeur comprise entre 4,8 et 5,3 en ajoutant de   l'eau   distillée stérile pour réduire la concentration ionique à une valeur comprise entre   0,012   et   0,006,   en ajou- tant de l'éther de   fagon   à amener,la teneur en éther entre 8 et 12 % en volu= me, en-laissant reposer,

   et en enlevant le précipité obtenu contenant essen= tiellement de la   globuline     bêta.   



   La. globuline   gamma,   est séparée du liquide surnageant-, duquel la globuline   bèta   précipitée a été   séparée  en amenant le   pH   de ce liquide   à   une' 

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 valeur comprise entre 6 et 7,5, et en ajoutant de l'éther de façon à amener la teneur en éther à un pourcentage en volume compris entre 10 et 18,5 et en enlevant le précipité de globuline gamma obtenu. 



   Toutes ces opérations (y compris le traitement du plasma san- guin) sont effectuées à basse température, c'est-à-dire entre 0 C et -3,5 Co, sous des conditions aseptiques, et les agents sont maintenus à une tempéra- ture similaire ou légèrement supérieure, par exemple à + 2 C. D'autre part, dans toutes ces opérations ét dans la totalité de la présente description, il faut entendre par éther de l'éther   diéthyliqueo   
On donnera ci-après les détails des conditions préférées du trai- tement avec du sang humain, mais il est bien entendu que du sang d'autres mammifères, tel que du sang bovin ou du sang avien , peut être traité dans des conditions à peu près similaireso 
Le procédé peut être celui décrit dans le brevet anglais précité N    603.998   jusqu'à la précipitation de la prothrombine,

   effectuable de pré- férence à un pH de 5,35 et jusqu'à l'enlèvement de la solution   surnageante.   



   La globuline gamma est préparée à partir de la prothrombine sur- nageante, en trois phases.   lère phase -   Précipitation des globulines bèta et gamma à partir de la pro- thrombine surnageante.      



   Le liquide est une solution de   protéine.à   3-4 %, ayant la compo- sition suivante: albumine 70,8 %, globulines alpha et bèta, 14,5 %,   globuli   nes gamma 14,7 %. La solution contient 10 % en volume d'éther, et la concen- tration ionique est de 0,12, calculée à partir des concentrations de sel con- nues. 



   Le pH de la solution est amené à 5,50 par addition de bicarbonate de soude ou d'une solution de soude caustique d'une teneur appropriée en mo- lécule-gramme, par exemple 0,5 M NaHCO3. La solution est diluée en ajoutant trois volumes d'eau distillée, afin d'obtenir une concentration ionique de   0,035.   La teneur en éther du mélange est progressivement élevée à 18,5 % en volume, et en même temps la température du,mélange est abaissée à   -3,5 Co,   en plaçant le récipient de réaction dans un bain d'alcool refroidi à -5 C. 



  Il se forme un précipité qu'on laisse reposer pendant la nuit à -3,5 Co On enlève par siphonage autant que possible du liquide surnageant, et le dépôt est séparé du résidu' par centrifugeage à-3,5 C. Le liquide surnageant peut être traité de la façon indiquée dans le brevet anglais N  603/998 pour don- ner un liquide se prêtant à une transfusion. 



   Le précipité préparé dans les conditions décrites ci-dessus con- tient   90 %   de globuline gamma, contenue dans la matière de départ, et donne l'analyse électrophorétique ci-après: albumine: 10   %,   globulines alpha et bèta: 46,5 %, globulines gam- ma :   43,5 %.   



   Les conditions opératoires ci-dessus indiquées sont préférées, mais. les globulines peuvent être précipitées de la prothrombine surnageante, dans les conditions ci-après: pH : 500 - 6,50, 1 : 0,12 - 0,012, éther : 16,0 - 18,5 % en volume, température : -2 C. à-3,5 C. 



   La composition électrophorétique du précipité varie suivant les conditions exactes de la précipitation. 

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  2ème phases- Séparation des globulines alpha et bèta de la globuline-Fa-mia. 



  Le précipité est dissous dans une solution tampon acétate-phos-   phate   appropriée   d'un   pH de 4,0 (H Ac 0,043M - Na HPO4   0,007     M) afin     dobte-   
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 nir une solution de pH égal à bzz6<, La solution est refroidie à OOC., et en ajoutant une solution tampon acétate - phosphate de pH égal à 690 (H Ac ont M - Na HP04 09027 M) le pH est amené à 4,97 i 0,02;

   de leau distillée stéri- le est ajoutée de façon à réduire la concentration ionique à   09010   et l'éther est amené à   9 %   en volume à 0  G.Le précipité qui se forme contient la plus grande partie des globulines alpha et bèta et est enlevé comme décrit ci- dessus après un équilibre réalisé pendant la nuit à 0  Co 
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 Les conditions pour la séparation des globulines bèta et gamma sont critiques, mais une séparation partielle e9e eotue dans les conditions pI3 4,8 - 5,3, 1 s 0 0..2 0 9 OOH o 6ther  8 - 12 % en volume, température s 0C 3eme phase = Préotpitation de la globuline gamma à partir de la 1 bu],! ine béta qui surnage. 



   La globuline gamma est précipitée à partir du liquide surnageant en amenant le pH à 6,50-   650 -   6,75 à l'aide d'une solution de bicarbonate 
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 de soude ou de soude caustique d?une teneur appropriée en moléoulegrea par exemple 09 5 M NaHC03, et en amenant l'éther à 18,5 % en volume à =395  C La concentration ionique est de 0,025.Cette opération précipite   90 %   de la globuline gamma en solution. 



   Les conditions ci-dessus sont préférées, mais les globulines gamma peuvent être précipitées dans une zone de pH de 6900 à 7,5 et de concentration en éther de 10 à 18,5 % en volume. 



   La globuline gamma obtenue de cette façon possède une pureté élec-   trophorétique   de 95 %.La pureté de la globuline bèta est difficile à   déteimi-   ner à cause de son comportement électrophorétique complexe  mais elle n'est 
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 pas polluée dealbumine ou de globuline gamma. 



   Les globulines gamma peuvent être purifiées davantage en dissol- vant le précipité dans une solution tampon de phosphate dun pH de 7,0, de con- 
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 centration ioniques 1,0, en amenant la concentration ionique à 0,05, en dilu- ant avec de   1?eau   distillée stérile,et en ajoutant de   l'éther   à 18 % en volume à une température de -3,5    0. La   globuline gamma précipitée est exempte d'albumine et de globuline bêta.

Claims (1)

1. RESUME. EMI3.7 c=>===o:>!:=>....tZm<':lm=1;:ID 1 - Procédé pour la séparation des globulines bèta et gamma'du plasma sang caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes, effectuées toutes à basse température.- clarification du plasma par filtration précipitation du fibrinogène par un traitement à l'éther, abandon au repos., séparation du liquide surnageant du fibrinogène, précipitation de la prothrom- bine du liquide en réglant le pH du liquide, abandon au reposa séparation du liquide surnageant de la phothrombine, réglage du pH du liquide mentionné en EMI3.8 dernier lieu à une valeur comprise entre 5, 00 et 6,

   sos dilution avec de Peau distillée stérile de façon à amener la concentration ionique à une valeur com- EMI3.9 prise entre 09 T2 et Os012 addition de éther de façon à amener la teneur en éther du mélange à une valeur comprise entre 16 et 1S8 5 % en volume abaisse- ment de la température â =2 à - 35 Gas abandon au repos, et enlêvsnent du précipité nbt6na qui contient la plus grande partie des globulines bêta st gamma.

   2 - Procédé tel que spécifié en 1, caractérisé par les points suivants pris ensemble ou séparément a) - le pH du liquide-surnageant séparé de la prothrombine est <Desc/Clms Page number 4> amené à 5,50; b) - le pH est amené à la valeur indiquée par addition de 0,5 mo- lécule-gramme de bicarbonate de soude; c) - la dilution est poussée jusqu'à une concentration ionique de 0,035; d) - l'addition finale d'éther est telle que la teneur en éther soit amenée à 18,5 % en volume; e) - la température au moment de l'addition finale d'éther est a- baissée à -3,5 C.

   3 - Procédé de séparation de la globuline bèta du plasma sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend, outre les opérations indiquées ci-dessus en 1 ou en 2, les suivantes: dissolution du précipité final dans une solution tampon appropriée d'un pH suffisamment bas pour l'amener en solution à un pH inférieur à 4,8, addition d'une solution tampon d'un pH plus élevé de façon à amener le pH de la solution à une valeur comprise entre 4,8 et 5,3, addi- tion d'eau distillée stérile de façon à réduire la concentration ionique à une valeur comprise entre 0,012 et 0,006, addition d'éther pour amener la teneur en éther à une valeur comprise entre 8 et 12 % en volume, abandon au repos, et enlèvement du précipité obtenu comportant essentiellement de la globuline bêta.

   4 - Procédé tel que spécifié en 3, caractérisé par les points sui- vants pris ensemble ou séparément: a) - la dissolution est effectuée dans une solution tampon d'acé- tate - phosphate de pH 4,0 et en quantité suffisantepour obtenir une solu- tion d'un pH de 4,6, le pH étant alors réglé à 4,97 # 0,02 en ajoutant une so- lution tampon d'acétate-phosphate d'un pH de 6,0; b) - la dilution avec de l'eau distillée est poussée jusqu'à une concentration ionique de 0,010; . c) - l'addition d'éther est poussée jusqu'à 9 % en volume; d) - la dissolution et les opérations suivantes sont toutes ef- fectuées à 0 C.;

   5 - Procédé de séparation de la globuline gamma du plasma san- guin des mammifères, caractérisé en ce qu'il comprend, outre les opérations indiquées ci-dessus en 3 ou en 4, les suivantes: réglage du pH du liquide sé- . paré final à une valeur comprise entre 6,00 et 7,5, addition d'éther de fa- çon à amener la teneur en éther à une valeur comprise entre 10 et 18,5 % en volume, et enlèvement du précipité de globuline gamma obtenu.

   6 - Procédé tel que spécifié en 5, caractérisé par les points suivants pris ensemble ou séparément-. a) - le pH est amené à une valeur comprise entre 6,50 et 6,75; b) - le réglage est effectué avec 0,5 molécule-gramme de bicar- bonate de soude; c) - la teneur en éther est amenée à 4,8 % en volume; d) - les opérations sont effectuées à -3,5 C; e) - les globulines gamma sont purifiées davantage en les dissol- vant dans une solution tampon de phosphate d'un pH de 7 et d'une concentra- tion ionique de 1,0 en diluant avec de l'eau distillée, de façon à abaisser <Desc/Clms Page number 5> la concentration ionique à 0,05, en ajoutant de l'éther jusqu'à 18 % en vo- lume à une température de -3,5 C., et en enlevant le précipité de globulines gamma,