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PROCEDE DE PREPARATION DE SUBSTANCES ANTI-ENZYMATIQUES.
La présente invention concerne des substances douées de propriétés anti-enzymétiques, particulièrement à l'égard de l'hyaluronidase, ainsi qu'un procédé de préparation de ces substances.
Des recherches antérieures de la demanderesse ont montré qu'en soumettant,. dans des conditions convenables,à une phosphorylation, des di et poly-hydroxy flavones ou flavanones ou des di ou poly-hydroxy chalcones ou leurs dérivés di-hydrogénés., on obtenait des composés à poids mo- léculaire plus ou moins élevé résultant d'une condensation et d'une polymé- risation conjointes. La charge des composés ainsi formés est fortement né- gative et ces composés sont dans tous les cas solubles dans l'eau à la neu- tralité ou à 1'alcalinité. Ils se distinguent par leur effet anti-enzyma- tique à l'égard de certains enzymes, en particulier de l'hyaluronidase.
Certaines de ces matières premières., par exempts la phlorétine, exercent le même effet, même lorsqu'elles ne sont pas phosphorylées, mais cet effet est notablement augmenté pour les produits de polymérisation avec l'acide phosphorique par rapport à celui de la matière première correspondante.
J.M. Beiler et G.J. Martins (Journal of Biolo Chem. 174, 31 (1948) ont trouvé précédemment que, dans certains cas, l'introduction de groupes d'acide phosphorique et d'acide sulfurique pouvait augmenter l'effet des substances anti-enzymatiques. Dans l'hespéritine phosphorylée, par exemple, qui est un mélange du pentaphosphate et du tétraphosphate, on con- state une augmentation de l'action inhibitrice sur l'hyaluronidase, mais l'effet obtenu est moindre que celui que l'on peut obtenir avec des substan- ces connues, par exemple la sur amine
La demanderesse a maintenant trouvé qu'un effet fortement anti-enzymatique était inhérent à des substances formées par des composés polymères de l'acide phosphorique (y compris les composés de l'acide thio- phosphorique)
dans lesquel les groupes d'acide phosphorique sont reliés
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entre eux au moyen de groupes organiques qui sont des glucosidës de' composés di ou poly-hydroxylés de la série des flavones ou flavanonez tels que ' la phloridzine, la p-phloridzine, la naringine, llhespéritiné et là rutine et dans lesquels le composé polymère a un poids moléculaire qui n'est 'pas inférieur à 2ËOOO mais qui, par ailleurs, n'est pas élevé au point d'empêcher les ccmposés d'être encore solubles dans l'eau ou les alcalie.
- les substances fondamentales ou primaires qui présentent* de l'intérêt et à partir desquelles on peut former des composés polymères de l'acide phosphorique (y compris les composés de l'acide thio-phosphorique),selon l'invention, peuvent, en premier lieu, être considérées comme des glucosides de substances répondant aux formules 1 ou 2 du dessin annexé, dans lesquelles R représente l'hydrogène ou un ou plusieurs hydroxyles ou groupes alcooliques. Au moins l'un des hydroxyles appartient au glucoside
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et la plupart des glucogl4es en question contiennent au moins 2 hydroxyles liés au noyau.
On sait, d'une manière générale, que les flavanones peuvent être également obtenues par l'intermédiaire de chalcones que l'on transforme aisément en flavanones. Ceci s'applique également aux glucosides correspondants. En ce qui concerne la présente invention, il ne faut attacher aucune importance au fait que les substances soient présentes sous la'forme de flavanones ou de chalcones, ce que montre le fait, par exemple, que les glucosides des chalcones hydrogénées conviennent particulièrement à l'appli- cation de l'invention. Ainsi on peut transformer la naringine, par hydro- génation en solution alcaline, en un glucoside qui ne diffère de la phloridzine naturelle que par sa portion saccharide et sa position dans la molécule .
Les substances primaires que l'on peut utiliser selon l'invention comprennent aussi les glucosides des dérivés de chalcones que l'on peut transformer aisément en flavanones ou les dérivés di-hydrogénés de - ' ces dérivés de chalcones. Dans ce qui précède ainsi que dans ce qui suit, ces glucosides de composés di ou polyhydroxylés de flavones, flavariones et chalcones, ainsi que les-dérivés di-hydrogénés de cette dernière substance sont compris dans l'expression glucoside de composés di ou polyhydroxylés de la série des flavones ou flavanones.
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Afin d'illustrer les possibilités de composition strp.etu- relle de tels produits, on peut mentionne:),' le produit que l'on obtint en
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phosphorylant un composé de cette espèce dans le noyau aromatique duquel sont présents deux hydroxyles phosphorylables. Ce produit comporte, en premier lieu, des chaînes du type représenté par la formule 3 du dessin annexé, dans laquelle Z représente des glucosides qui peuvent être identiques ou différents et Y, qui représente des atomes qui peuvent également être identiques ou différents, désigne l'oxygène ou le soufre.
Dans ces chaînes, les troisièmes valences des atomes de
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phosphore sont occupées par des hydroxyles libres qui se trouvent dissâciés lorsque la substance est dissoute. Dans certains cal3 toutefois, ces troisièmes- valences peuvent être reliées à des groupes Z, les chah1e s pou- vant alors/être ramifiées. La constitution des produits peut être considérée comme définie d'une manière suffisante par ce qui précède.
Les glucosides peuvent contenir des constituants autres que les groupes d'acide phosphorique servant à la formation de la structure polymère. C'est ainsi qu'il est particulièrement important de signaler que les composés peuvent également contenir des groupes de phosphates ou sulfates acides,particulièrement dans la partie saccharide, ce qui augmente la solubilité dans l'eau et permet d'obtenir des produits solubles ayant un degré de polymérisation plus élevé que si ces groupes n'étaient pas présents.
Au lieu d'être reliés aux hydroxyles, ces substituants qui scht différents des groupes d'acide phosphorique servant à former la structure polymère peuvent être reliés aux atomes de carbone de l'ossature carbonée, par exem-
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ple dans les noyaux aromatiques. A titre d'exemple d'aglycone des substan-' ces primaires, on peut mentionner l'apiginine et la diosmétine qui sont tou:
= tes deux des poly-hydroxy flavones, le Kampferol, la fisetine, là quercétine et la myricétine qui sont tous des poly-hydroxy flavanones, ainsi que quel- que s éthers tels que la rhamnétine et la rhamnazine En outre, on peut ci- ter la naringénine et l'hespéritine comme exemples de .flavanoneso
La partie saccharide des glucosides peut être le glucose, le rutinose, l'arabinose, le galactose et le rhamnose, aussi bien que d'au- tres saccharides entrant dans la composition des glucosides et leurs dérivés, par exemple le désoxy hexose.
Ces glucosides sont très répandus dans le règne végétal et beaucoup d'entre eux sont des produits industriels. On peut également les obtenir par synthèse
De façon à obtenir des produits aussi stables que possible, on a jugé préférable d'éviter certains glucosides dérivés de di ou poly-hy- droxy flavanones, par exemple l'hespéridine qui donne des produits de moin- dre stabilité.
Afin d'obtenir un effet anti-enzymatique prononcé, il est important que le degré de polymérisation soit suffisamment élevé. Ainsi, des composés dialysables n'ont qu'un effet anti-enzymatiquetout à fait in- signifiant. La limite inférieure du poids moléculaire est donc d'environ 2.000. La limite supérieure est déterminée par le fait que les produits doivent etre solubles en milieu neutre ou alcalino L'invention concerne éga- lement un procédé de production de substances anti-enzymatiques du genre mentionné ci-dessus, procédé qui consiste à former un composé organique polymère de l'acide phosphorique à partir de groupes d'acidesphosphoriques y compris ceux de l'acide thio-phosphorique,
composé dans lequel chaque groupe d'acide phosphorique est relié au suivant par un glucoside ou un dérivé de glucoside du genre mentionné ci-dessus, ceci de façon à atteindre un poids moléculaire d'au moins 2.000.
On peut obtenir cette formation en faisant réagir un agent de phosphorylation tel que l'oxychlorure de phosphore, le chlorure de thiophosphoryle ou l'un de ces agents et le dichlorure de phénylphosphoryle (chlorure de phosphényle) avec un ou plusieurs glucosides ou dérivés de glucosides dans des conditions favorables à la condensation, de préférence avec l'aide d'une amine tertiaire servant gagent fixant les hydracides halogénés, puis en soumettant les produits de condensation obtenus à une hydrolyse Par cette hydrolyse, les substituants tels que les atomes de chlore qui sont liés à l'acide phosphorique dans l'agent de phosphorylation envisagé et qui n'ont pas déjà été remplacés par des liaisons avec les radicaux organiques durant la condensation,
sont éliminés et se trouvent remplacés par des hydroxyles de sorte que le produit de condensation contient des groupes d'acide phosphorique libres, c'est-à-dire des groupes dans lesque ls une ou deux des valences du phosphore sont reliées par de l'oxygène à un groupe organique,tandis que la ou les valences restantes sont reliées à des hydroxyles de sorte que les produits ont un caractère acide prononcé et peuvent former desels, les sels alcalins pouvant etre solubles dans l'eau.
Durant la phosphorylation, la substance primaire peut, avantageusement, être dissoute dans un solvant sur lequel n'agit pas l'agent de phosphorylation, ce solvant, si on le désire, pouvant être constitué totalement ou en partie par l'agent de condensation lui-même, selon les procédés que l'on utilise usuellement pour la phosphorylation de substances organiqueso Un mode de réalisation avantageux du procédé objet de l'invention et par lequel on obtient, d'une manière particulièrement sûre, des produits possédant d'excellentes propriétés anti-enzymatiques, consiste à maintenir des conditions convenable de condensation dans le milieu anhydre, par exemple en refroidissant, durant la phosphorylation, en ajoutant lentement l'agent de phosphorylation ou de condensation, en ajoutant périodiquement
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ces agents,
en laissant entre temps reposer le mélange de réaction ou en 'employant des moyens similaires jusqu'à ce qu'enfin l'on atteigne le degré de condensation voulu; ensuite, on arrête la condensation et, si elle a été poussée trop loin, on hydrolyse le produit obtenu, par exempta 'par l'action d'eau,d'un acide ou d'un alcali et, le cas échéant, par chauffage jusqu'à ce que la degré de condensation ait été ramené à la valeur désirée.
De façon à obtenir une condensation suffisante, il est avantageux de ne pas utiliser un trop grand excès d'agent de phosphorylation.
De préférence, le rapport entre le glucoside et l'agent de phosphorylation est compris entre 1/2 et n molécules d'agent de phosphorylation par molécule de glucoside, n étant le nombre d'hydroxyles présent dans l'aglycone.
En conséquence, il est préférable d'ajouter l'agent de phosphorylation à une solution de substances primaires et non de faire l'inverse, car, dans ce dernier cas, l'agent de phosphorylation serait présent en un excès disproportionné et la phosphorylation pourrait être terminée avant qu'une condensation suffisante avec les molécules de substances primaires puissent avoir eu lieu. Toutefois, une certaine proportion d'agent de phosphorylation correspondant à la quantité de phosphore contenue dans un composé résultant ayant la constitution ci-dessus peut être également présente lors de la mise en route du procédé, en mélange avec une substance primaire et .un solvant éventuel, auquel cas on amorce avec précaution la phosphorylation en ajoutant graduellement l'agent de condensation.
Finalement, la phosphorylation peut être exécutée sans aucun agent de condensation, mais alors elle s'effectue très lentemento Gomme agent de condensation, d'une manière connue, une substance susceptible de fixer le composant formé par condensation dans le milieu anhydre, par exemple l'acide chlorhydrique, lorsque l'agent de phosphorylation est l'oxyde chlorure de phosphore, le chlorure de thio-phosphorylt -!ou le bichlorure de phényl phosphoryle.
En faisant varier les conditions de réaction, par exemple le milieu de réaction,la manière dont se fait l'addition, la vitesse d'addition, la quantité d'agent de phosphorylation et d'autres variables possib les, on peut obtenir des produits de propriétés différentes.
Comme on l' a déjà dit, le solvant peut être de nature indif- férente. Parmi les solvants qui conviennent, on peut citer l'éther, le dioxane, l'acétone et d'autres solvants cétoniques.
Toutefois, le solvant peut également être l'agent de condensation utilisé dans le procédé, par exemple des aminés tertiaires parmi lesquelles on peut citer la pyridine, la picoline, la lutidine, la quinoléine et la diméthylaniline. Dans certains cas, il peut également être avantageux d'utiliser de tels agents de condensation mélangés à des solvants indifférents.
Etant donné que la phosphorylation est accompagnée d'un dégagement de chaleur, il est en général indiqué de refroidir assez énergiquement, de façon à pouvoir maîtriser la réaction et à s'assurer ainsi que de bonnes conditions de condensation sont maintenues, même durant la première partie de la phosphorylation lorsqu'il existe encore un large excès de molécules de substances primaires, dont tous les groupes actifs sont libres, c'est-à-dire ne sont pas liés à du phosphore. A cet effet, on peut mettre le mélange de réaction en contact avec des parois refroidies et utiliser tout agent convenable pour refroidir lesdites parois, par exemple une saumure refroidie.
Dans bien des cas, toutefois, il est également indiqué de refroidir énergiquement, par exemple à une température de -10 à -20 , dès avant la réaction, la solution dans laquelle l'agent de phosphorylation doit réagir avec la substance primaire. Durant la réaction, on maintient une basse température qui, pratiquement dans tous les cas, peut être la température du local ou une température inférieure, et ce n'est que si la phosphorylation s'effectua trop lentement dans ces conditions que l'on élève la température à une valeur supérieure convenable.
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On peut faire varier le temps que requiert la phosphorylà- tion primaire comme on l'a déjà décrit, notamment en modifiant la vitesse d'addition de l'agent de phosphorylation ou de l'agent de condensation.
Dans la plupart des cas, il est avantageux que ce temps ne soit pas infé- rieur à 30 secondes, mais dans bien des cas, il peut etre expédient de l'augmenter notablement comme le montrent les exemples suivants. C'est ain- si que certains temps d'addition peuvent aller jusqu'à une heure, mais dans la plupart des cas, il est possible sans inconvénient d'effectuer l'addi- tion en une demi-minute à 25 minutes. Dans certains cas, il peut être ex- pédient d'effectuer l'addition par à-coups avec des périodes intermédiaires de repos, pendant lesquelles on peut augmenter la température, si on le dé- ,sire, par exemple jusqu'à la valeur de la température ambiante, ou jusqu'à une valeur comprise entre cette température et 50 , si ceci est nécessaire à l'obtention d'une condensation suffisante dans un temps raisonnable.
Lors- que l'on fait ainsi l'addition, il faut prendre soin ,de refroidir de façon que la température n'augmente pas dans une mesure telle que la réaction devienne incontrolable,
Lorsque l'addition est terminée, même si une condensation sensible s'est produite durant l'addition, il est généralement nécessaire ou commode de laisser le produit de réaction reposer pendant un temps plus ou moins long de façon que la condensation puisse atteindre au moins le degré que l'on désire pour le produit final, c'est-à-dire que le poids moléculaire soit de 2.000 ou plus et que le produit ne soit pas dialysable. Dans bien des cas, il est avantageux de laisser reposer le produit de réaction à environ 15 ou 20 et, comme il ressort des exemples suivants,
la durée du condensation convenable est alors généralement d'une demi-heure à 24 heures. Il est évident que le temps durant lequel le produit doit reposer peut être raccourci si l'on augmente la température et généralement il n'y a pas d'inconvénient à augmenter la température jusqu'à environ 50 . Toutefois, l'invention envisage également l'utilisation de températures encore plus hauteslorsque de telles températures n'empêchent pas d'obtenir des produits convenables selon l'invention.
Si, par phosphorylation ou condensation ultérieure, on obtient directement des produits qui, après hydrolyse, sont solubles en milieu aqueux alcalin, on constate que ces produits ont un bon effet anti-en- zymatique.
On arrete alors la réaction en diluant la produit avec de l'eau glacée, ce qui détruit également l'agent de phosphorylation qui n'a pas réagi. Le composé polymère produit est alors présent en solution aqueuse avec un chlorhydrate de l'amine tertiaire qui a été utilisée. Selon leurs propriétés, les substances ainsi produites peuvent être purifiées par diverses méthodes. La propriété la plus importante qui décide du genre de traitement à utiliser est la stabilité du produit en solution aqueuse, Si le compose a une bonne stabilité, on peut le purifier par dialyse suivie d'évaporation à siccité si cela est désiré.
Si.cependant, les substances ont une stabilité plus faible en solution aqueuse, on peut les isoler en évaporant à siccité avec précaution la solution aqueuse obtenue après la réaction, sans qu'il soit besoin d'une dialyse. On obtient ainsi généralement une poudre incolore ou une masse semi-solide, que l'on peut purifier par exemple par dissolution dans un alcali et précipitation avec un acide saturé de sel ordinaire et, le cas échéant, avec de l'éthanolo
Comme mesure de l'inhibition de l'effet enzymatique que l'on obtient avec les nouvelles substances, les exemples suivants donnent une "inhibition pour 100" calculée selon la formule :
inhibition % = H2- Hl 100
H2
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dans laquelle H1 désigne le temps de réaction qui est nécessaire pour que la viscosité d'une solution donnée d'acide hyaluronique qui. constitue un substratum convenable,soit réduite à la moitié de sa valeur d'origine par addition d'une solution donnée d'hyalyronidase tandis que H2 est le temps de réaction nécessaire pour 'diminuer de moitié la viscosité par action d'hyaluronidase sur un mélange de la morne solution d'acide hyaluronique et
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une substance ayant un effet anti-hyaluronidase le dessin annexé com.poriw te un diagramme dans lequel les abscisses représentent le temps d'action de l'hyaluronidase ou du mélange d'hyaluronidase et de la substance à essayer sur une solution standard d'acide hyaluronique tandis que les ordonnées re-
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présentent le temps de passage dans un viscosimètre d'0stwalà ,
La courbe 1 représente la relation entre le temps de réaction et la viscosité dans le cas de l'utilisation d'hyaluronidase bovine=
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On utilise 0,1 cm3 d'une solution d'enzyme contenant 2 URV (Unité de Réduc- tion de Viscosité définie parla quantité d'enzyme qui réduit la viscosité du substratum en question à une moitié de la valeur initiale, en 10 minutes) Comme substratum, on utilise de l'acide hyaluronique préparé au moyen de cordons ombilicaux selon le procédé Jeanloz et Forchielli (J. Biol.
Chem. 186, 495 (1950)). La solution contient 0,3 'Il de cet acide hyaluro-
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nique dans un mélange tampon de Mac Illvaines de pH 7. La solution d'en*y+ mes est mélangée à 3 cm3 de substratum et 0,9 cm3de tampon. La courbe 2 donne la relation entre le temps de réaction et la viscosité pour un mélan-
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ge similaire qui contient également la substance dont l'effet an5i-hyaluronidase doit étre mesuré.
Les proportions du mélange sont 0,1 cm d'enJ91le, 0,7 cm3 de tampon et 0,2 cm3 de solution aqueuse neutre de la substance dont on doit essayer l'effet anti-enzymatique ainsi que 3 cm3 de substratum. On détermine les quantités Hl et H2 au moyen des points d'intersection de la ligne horizontale dont l'ordonnée est la moitié de la somme des temps d'é- coulement de la solution tampon et de substratum dilué avec le mélange tam-
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pon dans le rapport 3 > la les exemples suivants illustrent les "inhibi- t ions %Il mesurées par le procédé ci-dessus et que l'on a pu obtenir pour certaines des substances produites selon l'invention. A titre de comparaison,il est à signaler que d'après la même méthode , l'inhibition % de la
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suramine qui, d'après J.M. Beiler et G.J.
Martins a un effet inhibiteur plus grand que les produits sulfonés et jhosphorylés obtenus par eux, est de 0 lorsqu'on utilise 40 y par 4 cm et de .3 si l'on utilise 160t' par 4 cm3. Exemple 1:
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On dissout 4,4 g de phloridzine aqueuse dans 25 cm3 de pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10a, puis on ajoute, en refroidissant et en agitant, une solution de 1,0 cm3 d'oxychlorure de phos- phore dans 10 cm3 de pyridine anhydre. La durée d'addition est de 3 minutes.
On laisse reposer le mélange dans un bain réfrigérant pendant 3 heures, puis pendant 15 'heures à la température du local, ce qui provoque la formation d'un précipité visqueux. On effectue alors une hydrolyse avec de la glace finement pilée et le précipité se dissout lentement. On évapore la solution résultante dans le vide, puis on fait réagir le résidu avec de l'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire. On obtient ainsi une masse semisolide que l'on dissout dans une solution saturée de bicarbonate de soude.
On filtre la solution et on la verse dans un volume égal d'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire. On obtient encore une masse semi-solide que l'on sèche sur de l'anhydride phosphorique et de l'hydroxyde de potassium. On peut alors pulvériser le produit. On recueille 4,7 g. Inhibi-
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tion (20 /4 cm3) ¯ 95 3L
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Exemple 2:
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On dissout 4,, g de phloridzine anhydre dans 25 cm3 de pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10 , puis on ajoute, en re- froidissant et en agitant, une solution de 1,5 cm3 d'oxychlorure de phospho- re dans 10 cm3 de pyridine anhydre. Durée d'addition: 3 minutes. On laisse reposer le mélange dans un bain réfrigérant.
Au bout de 40 minutes, la solution commence à devenir trouble Après une heure encore de refroidisse- ment au bain, on procède à l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, ce
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qui provoque une dissolution complète On traite la solution CanIne dans l'exemple 1 et avec le mê'me Órésultat On recueille 5,15 go Inhibition (20 /4 cm3) : 95.
Exemple 3: On dissout 4,/ g de phloridzine anhydre dans 25 cm3 de pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10 puis on y ajoute, en refroidissant et en agitant, une solution de 2 cin3 à'oxychlorure de phosphore dans l.0 cm3 de pyridine anhydreo Durée d'addutïon: 4 minutes. Après 15 minutes au bain réfrigérant, la solution s'épaissit et commence à se troubler. Après 5 minutes encore, on l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, ce qui en-
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tralne une dissolution pratiquement totale. On traite la solution comme dans l'exemple l, et avec le même résultat. On recueille 5,35 go Inhibition (20 b"'/4 cm3): 90 Exemple 4:
On dissout 2,2 g de phloridzine anhydre dans 20 cm3 de pyri-
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dine anhydre.
A -10c, on ajoute goutte à goutte, en agitant et en refrodissant, une solution de 1,5 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3-de pyridine anhydre. Durée d'addition: 10 minutes. Après 8 minùtés encoré" au bain réfrigérant, la solution se tro1.1bte 7 minutes après, on l'hydro":' s javec de la glace finement pilée, ce qui entra!ne une dissolution'prâ= tiquement totale . On tràite la solution ccmme dans l'exemple 1 et avec le m4me résultat. On recueille 2,5 g. Inhibition (20 "/! cm3): 56$o Examp 5 :
On dissout 2,2 g de phloridzine anhydre dans 20 cm3 de pyridine anhydre A -la , on ajoute, en refroidissant et en agitant, une solu-
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tion de 2,.5 cm3 d' oxßehlorure de phosphore dans 10 cm3 de pyridine anhydre.
Durée d'addition: 5 minutes. Après 5 autres minutes au bain réfrigérant, la solution se trouble. 7 minutes plus tard, on l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, la dissolution étant pratiquement totale On traite la solution comme dans l'exemple 1 et avec le même résultat. On recueille 2,1 g.
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Inhibition (20 r /4 cm'): ,22a Si l'on double la quantité de 1-lovchlorure de phosphore, on obtient un produit ne présentant aucune inhibition à la concentration de 20 '"/! cm 3 Exemple 6: On refroidît à -10 15 cm3 de pyridine anhydre au bain ré- frigéranto On ajoute avec précaution., en agitant et en refroidissant, 2,7 cm d'acide chlorosulfoniqueo On ajoute ensuite, à -100, une solution de 8,7 g de phloridzine anhydre dans 50 cm3 de pyridine anhydre. On chauffe lentement le mélange au bain-marie à 9ia, puis on lé laisse reposer à la température du local pendant 15 heures. On refroidit alors le mélange à 3-100 et l'on ajoute, en refroidissant et en agitant, une solution de 2 cm diloxychlorure de phosphore dans 10 cm3 de pyridine anhydre.
On laisse reposer le mélange
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à la température du local pendant 2 jours, puis on 1-'hydrolyse- avec de la glace finement pilée,ce qui permet d'obtenir une'solution limpide. On ajoute une solution de carbonate de sodium à pH 9, puis on procède, pendant 2 jours, à une dialyse avec de l'eau distillée. Ensuite, on évapore la solu- tion dans le vide et l'on obtient une poudre incolore que l'on sèche dans-
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le vide sur de l'anhydride phosphorique. On re cueille 13,,4 g. Inhibition (20 gµ/4 cm3) : 85%. Une analyse du produit donne 4,4% P et z S. Ceci signifie que le produit contient environ 2 molécules de soufre par molécule de phosphore. Nature llement, les groupes d'acide sulfurique sont dans la partie glucoside.
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Exempla 7: On dissout 2,2 g de p-phloridzine anhydre dans 25 cm3 de
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pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10, puis on ajoute une solution de z?,5 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre en refroidissant et en agitant. Durée d'addition: 2,5 minutes. Apres environ 5 heures au bain réfrigérant, la solution est devenue visqueuse. On l'hydrolyse alors avec de la glace finement pilée, ce qui entraîne une dissolution pratiquement totale. On traite la solution comme dans l'exemple 1
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et avec le même résultat On recueille 2,6 g. Inhibition (20 "'/4 cm.3): 22%.
Exemple 8: 'On dissout 2,2 g de p-phloridzine anhydre dans 25 cm3 de'
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pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10 , puis on ajoute, en refroidissant et en agitant, une solution de 1 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre. Durée d$addition r 3 minutes. Après 25 mi- nutes au bain réfrigérant, le mélange est devenu visqueux et trouble . On l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, ce qui donne une solution limpide.
On évapore celle-ci dans le vide, puis on traite le résidu avec de l'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire. On obtient une masse semi-solide que l'on dissout dans une solution saturée de bicarbonate de sodium. On filtre la solution et on la verse dans un volume égal d'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire. On obtient ainsi un précipité incolore que l'on filtre et que l'on sèche sur de l'anhydride phosphorique et 3 de l'hydro-
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xyde de potassium. On recueille 3,fil g. Inhibition (20 r/4cm ): 95%" Exemple 9 :
On dissout 2,2 g de p-phloridzine anhydre dans 25 cm3 de
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pyridine anhydre. ton refroidit la solution à -lOC' puis on ajoute une solution de 1,5 cm 3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm 3 de pyridine anhydre, en refroidissant et en agitant. Durée d'addition : 3 minutes.
Après 15 minutes au bain réfrigérant, la mélange est devenu visqueux et trouble. On procède alors à l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, ce qui donne une solution limpide. On évapore celle-ci dans le vide, puis on traite le résidu avec de l'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire. On obtient ainsi une masse semi-solide que l'on dissout dans une solution saturée de bicarbonate de sodium. On filtre la solution et on la verse dans un volume égal d'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire. Il en résulte un précipité incolore que l'on filtre et que l'on sèche sur de l'anhydride phosphorique et de l'hydroxyde de potassium. On recueille 2,2 g.
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Inhibition (20 b'''/ cm3): 900 Exemple 10:
On dissout 2,2 g de p-phloridzine anhydre dans 25 cm3 de pyridine anhydre.
On refroidit la solution à -10 puis on ajoute une solution de 2,5 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 car 3 de pyridine anhydre, en refroidissant et en agitant. Durée d'addition: 2 minutes. Après 4 minu-
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tes au bain réfrigérant, la solution commence à se troubler. Au bout de
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6 autres minutes, on l'hydrojyee avec de la glace finement pilée , le "précipité se dissolvant lanternent. On tl1a;tte la solution obtenue comme dana lee mmple 1 avec e mfme résultat. On recueille 1,7 g. Inhibitiop (20 r/4 cm ):25%.
Essmple Us On dissout 1,1 g de naringine dans 25 cm3 de pyridine anhy 3 dre, on refroidit la solution à -la , puis on ajoute une solution de 0,5 cm d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre en refroidissant et en agitant. Durée d'addition : 5 minutes. Après 3 heures au bain réfrigérant, il s'est formé un précipité. On laisse reposer le mélange à la température du local pendant 15 heures, puis on l'hydrolyse avec de la glace finement pilée. Au bout de 24 heures à la température ambiante, on obtient une solution limpide. On l'évapore dans le vide et l'on traite le résidu avec de l'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire, ce qui permet d'obtenir une poudre jaune que l'on filtre et que l'on dissout dans une solu--' tion saturée de bicarbonate de soude.
On filtre la solution et on la verse
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dans un vaùzme égal d'acide chlorhydrique 2n saturé de se 1 ordinaire. On obtient un précipité jaune On le filtre et on le sèche dans le vide sur de l'anhydride phosphorique et de l'hydroxyde de potassium. On recueille
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l,5 go Inhibition (20 r/4 cm3): .0. Si l'on utilise 0,75 em3 d'oxychiorure de phosphore au lieu de 0,5 cm.3' on obtient un produit ayant la même inhibition, tandis qu'une quantité d'oxychlorure de phosphore de 1,25 cm donne un produit qui ne présente aucune inhibition à la concentration de 20 # /4 cm3.
Exemple 12:
On dissout 1,2 g d'hespéridine dans 30 cm3 de pyridine anhydre. On refroidit la solution à-10 , puis on ajoute, en refroidissant et en agitant, une solution de 0,25 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre. Durée d'addition: 1,5 minute. On laisse le mélange au bain réfrigérant pendant 2 heures, puis on le fait reposer à la
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température du local pendant 15 heures. On l'hydrolyge ensuite avec de la glace finement pilée, ce qui entratne une dissolution pratiquement tota- le. On traite alors la solution comme dans l'exemple 11 et avec le môme
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résultat. On recueille l g. Inhibition (20 j' /4 cm3 ) : 30..
Exsmple 13: 7n dissout 1,2 g d'he spéridine dans 30 cm3 de pyridine an- hydre. On refroidit la solution à -10 , puis on ajoute une solution de 0,75 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 10 cm3 de pyridine anhydre, en refroidissant et en agitant. Durée d'addition: 3,5 minutes. On laisse le mélange au bain réfrigérant pendant 2 heures, puis on l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, ce qui entraîne une dissolution pratiquement tota- le. On traite la solution comme dans l'exemple 11 avec le même résultat.
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On recueille 0,9 g. Inhibition (20 r/4 .3) : 6. Si l'on utilise 2,5 CM3 d'oxychlorure de phosphore, on obtient un produit ne présentant aucune inhibition à la concentration de 20 # /4 cm3.
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EEmp le J4 :
On dissout 1,2 g de rutine anhydre dans 25 cm3 de pyridine anhydre. On: refroidit la solution à -lE , puis on ajoute une solution de 0,2 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre, en refroidissant et en agitant. Durée d'addition: 5 minutes. Après une heure un quart au bain réfrigérant, la solution commence à devenir trouble. On
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l'hydrolyse alors avec de la glace finement pilée, ce qui entraine une dis- solution pratiquement totale.
On évapore la solution dans le vide et l'on traite le résidu, très soluble dans l'acide chlorhydrique 2n saturé de sel ordinaire,avec de l'éthanol anhydre, ce qui donne une poudre jaune. On filtre,on lave avec de l'éthanol anhydre et l'on sèche dans le vide sur de l'anhydride phosphorique. On recueille 0,8 g. Inhibition (20 1-IL cm3): 40%.
Exemple 15;
On dissout 1,2 g de rutine anhydre dans 25 cm3 de,pyridine anhydre. On refroidit la solution à-10 , puis on ajoute une solution de 0,4 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de :pyridine anhydre , en re- froidissant et en agitant, Durée d'addition: 3 minutes. Après 4 minutes au bain réfrigérant, la solution commence à se troubler et après 6 autres minutes, on l'hydrolyse avec de la glace finement pilée, ce qui entrane une dissolution pratiquement totale, On traite la solution comme dans l'exemple 11 et avec le même résultat. On recueille 1,1 g. Inhibition (20 #/4 cm3):57%.
Exemple 16:
On dissout 1,2 g de rutine anhydre dans 25 cm3 de pyridine anhydre On refroidit la solution à -la , puis on ajoute une solution de 0,6 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre, en re- froidissant et en agitant. Durée d'addition : 2 minutes. Après une minute au bain réfrigérant, la solution commence à se troubler et au bout de 4 autres minutes, il se forme un précipité abondant. On l'hydrolyse alors avec de la glace finement pilée. Au bout de 24 heures à la température du local, la dissolution est pratiquement totale. On traite la solution com- me dans l'exemple 11 et avec le même résultat. On recueille 1,6 g. Inhi- bition (20 #/4 cm3): 90%.
Exemple 17:
On dissout 1,2 g de rutine anhydre dans 25 cm3 de pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10 , puis on ajoute une solution de 1,0 cm3 d'oxychlorure de phosphore dans 5 cm3 de pyridine anhydre, en re- froidissant et en agitant. Durée d'addition: 2 minutes. Après 1 minute au bain réfrigérant, la solution est devenue très trouble. On l'hydrolyse alors avec de la glace finement pilée, ce qui entraîne une dissolution pratiquement totale. On traite alors la solution comme dans l'exemple 11 et avec le même résultat. On recueille 0,9 g. Inhibition (20 #/4 cm ): 27%.
Exemple 18:
On dissout 1,1 g de phloridzine anhydre dans 15 cm3 de py- ridine anhydre. On refroidit la solution à -10 , puis on ajoute une solu- tion de 0,6 cm3 de chlorure de thio-phosphoryle dans 10 cm3 de pyridine anhydre, en refroidissant et en agitant. Durée d'addition: 1,5 minute.
On laisse le mélange au bain réfrigérant pendant 4 heures puis à la tempéra- ture du local pendant 15 heures, ce qui entraîne la formation d'un léger précipité. On l'hydrolyse alors avec de la glace finement pilée et le pré- cipité se dissout lentement. On traite la solution comme dans l'exemple 1, avec le même résultat. On recueille 1,25 go Inhibition (20 #/4 cm ) : 100%.
Exemple 19:
On dissout 1,1 g de phloridzine anhydre dans 15 cm3 de pyridine anhydre. On refroidit la solution à -10 , puis on ajoute une so- lotion de 0,9 cm3 de chlorure de thio-phosphoryle dans 8 cm3 de pyridine anhydre en refroidissant et en agitant. On laisse le mélange au bain réfri- gérant pendant 3 heures, puis à la température du local pendant 15 heures,
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ce qui entraîne la formation d'un léger précipité,, On l'hydrolyse ensuite avec de la glace finement pilée et le précipité se dissout lentement. On' traite la solution comme dans l'exemple 1 et avec le même résultat. On re- cueille 1,3 go Inhibition (20 #/4 cm3): 100%.
Exemple 20 :
On dissout 4,36 g de phloriqzne dans 25 cm3 de dioxane.
On ajoute alors 2,8 cm3 de chlorure de phosphoryle et l'on chauffe la solu- tion avec reflux, au bain-marie bouillant. Au bout de 50 minutes, le déga- gement d'acide chlorhydrique est terminé et il s'est formé un précipité brun-rouge. On refroidit le mélange de réaction et on l'hydrolyse avec de la glace. On ajoute une solution bi-normale d'hydroxyde de sodium pour ren- dre la solution- alcaline, ce qui provoque la dissolution de la majeure 'par- tie du précipité formé lors de la phosphorylation. On filtre la partie'non dissoute qui est formée par un produit à poids moléculaire très élevé, et, après neutralisation avec de l'acide chlorhydrique, on évapore le filtrat à siccité dans le vide.
On dissout le résidu dans l'eau et on le précipite avec de l'acide chlorhydrique, ce qui entraîne la formation d'un précipité' brun-rouge On filtre ce dernier, on le lave avec de l'acide chlorhydrique normal et on le sèche dans le vide sur de l'anhydride phosphorique et de l'hydroxyde de sodium. On recueille 3,7 g d'une poudre brun-rouge dont l'inhibition (50 #/4 cm ) est de 50%.
Exemple 21 : On met en suspension 5, 82 g de rutine dans 25 cm3 de dioxans puis on ajoute 4,4 cm3 d'oxychlorure de phosphore On chauffe le mélange au reflux au bain-marie bouillant. Au bout de 30 minutes, le dégagement d'acide chlorhydrique est terminé et il .'Etat précipité une masse visqueuse et sombre On traite cette masse comme dans l'exemple précédent pour ob- tenir une poudre brun-foncé dont l'inhibition (50 #/4 cm ) est de 60%.