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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX TRAITEMENTS DE FERMENTATIONS POUR LESQUELS
ON UTILISE DES LEVURES.
L'invention est relative à des traitements de fermentations pour lesquels on utilise des levures et elle a pour but, en général, de supprimer les mauvais goûts et odeurs des matières traitées et d'augmenter la vitesse de fermentation.
Les bactéries, qui infectent ordinairement la levure de brasserie et les fermentations des bières de brasserie sont les bâtonnets gram négatifs Flavobacterium proteus, les cocci gram positifs Pediococcus damnosus et les bâtonnets gram positifs Lactobacillus pastorianus ou des espèces qui sont très apparentées à ces bactéries.
Parmi ces bactéries, celle qu'on trouve le plus couramment et qui est capable de croître le plus rapidement pendant une fermentation normale de la bière, est le bâtonnet gram négatif Flavobacterium proteus. Cet organisme est presque universellement présent dans les fermentations des bières de brasserie et quand il se trouve en quantité suffisamment élevée dans ces fermentations il procure une odeur étrange à la bière, cette odeur rappelant celle de panais cuits (I) (Shimwell, J.L. 1948 Wallerstein Lab.
Gomm. 11 , 135). Ceci est évidemment très désagréable.
La méthode usuelle pour essayer de contrôler ce genre d'infection est de traiter la levure infectée, c'est-à-dire la levure d'inoculation, avec une solution aqueuse, plutôt faible, d'un acide tel que l'acide phosphorique ou tartrique. Ceci a lieu quand la contamination bactérienne a atteint un niveau qui est considéré comme étant dangereux et cette lessive à l'acide diminue effectivement l'importance de la contamination bactérienne mais elle ne permet pas de supprimer complètement l'inaction. Ce traitement réduit le nombre des bactéries infectantes viables mais cette ré-
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duction n'est généralement que de l'ordre de 90 %. Les 10 % restants de l'infection bactérienne commencent à se multiplier à nouveau dès que la levure traitée est utilisée pour une fermentation subséquente.
Par ailleurs, ce traitement par lavage à l'acide est très aléatoire car la différence entre la valeur optimum du pH pour l'effet bactéricide et la valeur du pH à laquelle la levure est elle-même affectée par les bactéries en présence correspondent seulement à 0,3 d'une unité de pH.
Ainsi, ce traitement de lavage à l'acide de la levure permet d' obtenir, dans les meilleures conditions, une levure qui contient encore 10% de bactéries viables qui se trouvent dans un milieu acide favorable à leur multiplication de sorte que la purification obtenue est ainsi rendue inutile, plus particulièrement quand la levure traitée doit être conservée avant d'être utilisée à nouveau pour une fermentation qui se fait dans des conditions par lesquelles le pH est modifié et par lesquelles la croissance des bactéries est favorisée. Par ce traitement connu, le brasseur était obligé de conserver des unités de propagation de la levure, dans des conditions soigneusement contrôlées pour que la levure ne risque pas d'être infectée par des bactéries. Ceci était coûteux et ennuyeux.
Fréquemment, malgré la surveillance sérieuse et permanente que l'on exerçait, il se produisait une contamination bactérienne de la levure d'une manière inexplicable et le bain de fermentation devait être jeté.
La seule méthode, qui existait jusqu'ici pour éliminer complètement l'infection bactérienne de la levure de brasserie était de se débarrasser de la levure infectée et de la remplacer par une levure cultivée de manière telle qu'elle n'ait pu s'infecter par les bactéries. La plupart des brasseries ne sont pas équipées pour cultiver la levure de cette manière et l'achat répété d'une levure pure de ce genre est, évidemment, très coûteuse.
On sait que d'autres conditions sont nécessaires pour obtenir la fermentation de breuvages maltés, tels que la bière ordinaire, la bière claire (ale ) et les bières colorées (porter et stout) que pour la fermentation de l'alcool industriel, telle que réalisée dans les distilleries.
La fermentation de la bière dans une installation industrielle, à cause des dimensions des appareils et des quantités de matières utilisées, est extrêmement sensible à la fermentation bactérienne. Cette fermentation, dans les brasseries ou distilleries se fait généralement à une température relativement basse, de l'ordre de 10 à 15 , pour éviter les activités excessives de la levure d'autres espèces et, plus particulièrement, pour empêcher la croissance de levures et de bactéries indésirables.
Pour certains genres de fermentations de bières on adopte des températures allant jusqu'à 21 .
A cause de la basse température à laquelle la fermentation de la bière se fait généralement, de la valeur réduite du pH de la bière en fermentation, des conditions anaérobiques dans la cuve de fermentation et des principes antiseptiques des extraits de houblon dissous, seules quelques espèces de bactéries sont susceptibles de croître et de survivre pendant le processus de la fermentation et les contaminants bactériens, communément rencontrés, sont les bâtonnets gram négatifs Flavobacterium proteus ou les espèces gram négatives très apparentées à ceux-ci.
La levure, ordinairement utilisée dans la bière, est la S. carls- bergensis, alors que la levure de brasserie utilisée pour la bière claire est la S. cerevisiae. La première est une levure de dépôt alors que la dernière est une levure superficielle. D'autres levures, telles que la levure Saaz ou la S. monacensis, peuvent être utilisées comme levures de dépôt typiques pour une fermentation et on obtient des résultats tout aussi bons.
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Pour la fermentation des mélasses, des sirops de canne à sucre ou des moûts (doux ou aigres), pour la fabrication d'alcools de seigle, de froment , de malte ou de mais (Wiskys) on se sert de souches de Saecharomyces cerevisiae ou d'autres levures, telles que le Schizasaccharomyces, pour ino- culer le moût.
Le processus de la fermentation, pendant la fabrication de la bière ordinaire ou de la bière claire, peut être suivi aisément en obser- vant la réduction du pH de la bière, la réduction de la densité de la bière en degrés Plato et en déterminant la quantité de bactéries dans le milieu de fermentation dans des conditions de fermentations soigneusement réglées qui doivent être suivies scrupuleusement au cours d'un traitement de fermen- tation normale. En même temps, la concentration des cellules de levure dans le milieu de fermentation peut être observée au début, au cours de la fermen- tation et à la fin de celle-ci.
La température de fermentation est un facteur important, comme déjà spécifié plus haut. On préfère que la fermentation de la bière ait lieu à une température relativement basse, comprise entre 10 et 15 , la tem- pérature allant en augmentant, depuis la première valeur jusqu'à la dernière. pendant une période de fermentation de 4 à 5 jours. Pour la méthode de fer- mentation basse, les conditions dans le milieu de fermentation sont anaéro- biques et l'extrait de houblon contient un principe antiseptique qui éli- mine, en substance, toutes les bactéries- à l'exception du Flavobactérium proteus.
La bière claire fermente à une température un peu plus élevée, comprise entre 14 et 23 , et on permet à la température de monter de quel- ques degrés chaque jour, en substance'comme pour la fermentation de la bière. Bien que le fermentation des levures de dépôt se fasse généralement entre 6 et 12 pendant une période de 8 à 10 jours et que celle des le- vures superficielles ait lieu entre 14 et 23 pendant environ 5 à 7 jours, les zones de températures plus limitées indiquées plus haut sont préférées et la durée de la fermentation est moindre a cause de la pureté élevée des souches de la levure initialement utilisée.
Vers la fin de la fermentation de la levure, au cours de la fa- brication de la bière ordinaire ou de la bière claire un changement bien défini se fait dans le moût et la levure forme des flocons qui commencent à se déposer. Dans la bière ordinaire, la levure se dépose au fond et dans la bière claire il se produit un changement, connu sous le nom de "cassure", quand les écumes, qui recouvrent le milieu de fermentation, s'épaississent.
Pendant la fermentation de la bière ordinaire, la "cassure"'se fait géné- ralement entre le 3ème et le 4ème jour. Pendant la fermentation de la biè- re claire, la "cassure" se fait entre le 2 ème et le 3ème jour. Au cours de la fermentation d'un moût ou sirop doux ou aigre, la méthode de fermenta- tion douce se fait généralement en moins de temps que la méthode par fer- mentation aigre et une "cassure" analogue est observée à peu près au deu- xième jour. Un rendement plus élevé en alcool est obtenu par la méthode par fermentation aigre. Des températures de fermentations comprises entre 21 et 36 sont usuelles pour ces fermentations par lesquelles on obtient des alcools (wiskys).
L'évolution de ces fermentations pour obtenir des alcools est, en substance, terminée en deux jours environ quand une température de fer- mentation correspondant à la partie supérieure de la zone de température susdite, c'est-à-dire voisine de 36 , est adoptée. En pratique, toutefois, on préfère les durées de fermentation plus longues avec des températures appartenant à la partie médiane ou à la partie inférieure de la zone susdi- te. Une contamination bactérienne se produit inévitablement aux températures plus élevées, cette contamination étant très difficile à réglermalgré l'emploi courant de matières désinfectantes et l'observation méticuleuse d'une grande propreté pour le choix des matières adoptées et pour les appareils utilisés
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polir la fermentation.
Le réglage de l'acidité du moût pour un PH acide facilite le réglage de la contamination bactérienne et pour cette raison on préfère se servir de la méthode de fermentation aigre.
La contamination bactérienne se produit aussi bien pour la fermentation à moût doux que pour celle à moût aigre et elle donne lieu à la formation de goûts et d'odeurs désagréables et à l'introduction de sous-produits indésirables, résultant de la fermentation, dans le moût ferrenté, ces impuretés et ces goûts et odeurs se retrouvant dans le produit distillé. Les résidus de distillation sont fréquemment contaminés à un degré tel qu'ils n'ont pour ainsi dire plus aucune valeur pour la nourriture du bétail. L'effet de la fermentation est diminué par la formation de quantités substantielles de bactéries en suspension qui tendent à retenir l' hydrate de carbone non fermenté et qui, ensuite, convertissent les matières occluses en sous-produits indésirables.
Les méthodes de filtration sont compliquéps à cause de la présence de grandes quantités de bactéries en suspension. Il en résulte ultérieurement une sédimentation dans le distillat et un manque d'uniformité de la matière distillée malgré les soins attentifs apportés au réglage des conditions de la fermentation. Une surveillance qualifiée est fréquemment nécessaire car les matières contaminées par les bactéries flottent parfois à la surface ou parfois elles forment des dépôts et il arrive souvent quelles restent en suspension de sorte que leur précipitation doit être provoquée.
Conformément à l'invention, on écarte les difficultés indiquées plus haut en exécutant la fermentation en présence d'un antibiotique dénom- mé polymyxine. On améliore l'effet inhibiteur pour le Flavobacterium proteus et on stimule la fermentation quand un ou plusieurs autres antibiotiques sont présents dans le milieu de fermentation en même temps que la polymyxine.
Ces antibiotiques sont la pénicilline, la bacitracine, la Terramycine et la Streptomycine. Des résultats exceptionnels sont obtenus quand la pénicilline est en présence en même temps que la polymyxine, le cas échéant avec un ou plusieurs des antibiotiques : bacitracine, Terramycine et Streptomycine. La pénicilline, utilisée seule, ne procure pas un effet avantageux, comme expliqué plus loin.
La polymyxine est efficace quand une quantité correspondant à au morts 0,005 [gamma] par ml du milieu de fermentation est en présence, mais on utilise, de préférence, une quantité correspondant à au moins 0,05 [gamma]par ml.
Bien qu'il ait été dit par Stansly, P.G., R.G. Shepherd et H.J.
White, dans le bulletin of the Johns Hopkins Hospital 81x 43 (1947), que la polymyxine a une activité bactériostatique et bactéricide spécifiquement dirigée contre les bactéries gram négatives, il n'était pas du tout évident que cet antibiotique pourrait également être utilisé pour régler et empêcher la croissance des bactéries gram négatives infectant une 'fermentation de levure. Par ailleurs, comme des antibiotiques, tels que la Gliotoxine. le Lu- pulone, le Humulone, la Pyocyanine et a Streptothricine gênent ou empéchent la croissance des cellules de levure, on pouvait admettre que l'addition de l'antibiotique polymyxine à un moût contenant de la levure pourrait avoir un effet défavorable sur la levure.
Chacun des agents antibiotiques, cités plus haut, à des activités bactéricides et bactériostatiques nettement établies mais leur usage pour éliminer les flores et micro-organismes indésirables est contre-indiqué par suite de l'effet indésirable sur les cellules de la levure.
En outre, l'utilisation d'un antibiotique pour régler la croissance microbienne et la flore ne doit pas introduire un facteur dangereux dans un breuvage potable à tel point que celui-ci serait transformé en une drogue.
Les expériences faites au cours de l'étude des antibiotiques ont montré que des préparations contenant plus de 50 g d'un antibiotique par tonne doivent être considérées comme étant des drogues. A cause des doses
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élevées de certains des antibiotiques qui sont nécessaires pour empêcher la croissance des bactéries du genre de celles qui se trouvent dans le bouil- lon de fermentation, il est surprenant en effet qu'une quantité aussi rédui- te que 0,005 f par ml soit efficace pour supprimer les bâtonnets'et les coc- ci dans la bière en fermentation.
Cette concentration résiduelle de la poly- myxine dans la bière en fermentation, qui s'élève à 0,005 [gamma] par ml et cor- respond donc à 0,005 g de l'antibiotique par 1.000.000 g de bière en fermen- tation, peut être citée en contraste avec la limitation maximum indiquée plus haut qui correspond à 50 g de l'antibiotique pour 1.000.000 g du pro- duit. La teneur en polymyxine correspond donc à un dix-millième de la va- leur maximum citée plus haut.
Les conséquences économiques de cette découverte surprenante sont évidentes, Pour laver 1000 g de levain (levure liquide) on doit se ser- vir d'environ 2,6 g d'acide tartrique pour obtenir le pH nécessaire quand on adopte le procédé connu de lavage à l'acide, dont question plus haut. Par contre, on doit utiliser seulement 0,01 g de polymyxine par 1000 g de levain.
Le traitement à la polymyxine présente l'avantage par rapport à la méthode utilisant l'acide tartrique ou tout autre acide, qu'on ne doit pas prévoir une période d'attente ou d'arrêt. Il suffit simplement d'ajouter la polymyxine à la levure et l'effet bactéricide se poursuit dans la bière en fermentation.
Bien que, comme dit plus haut, une quantité aussi réduite que 0,005 par ml de l'antibiotique polymyxine soit suffisante pour éliminer les bâtonnets ou cocci dans la fermentation d'un liquide malté, des précau- tions sérieuses concernant l'hygiène et la propreté du matériel utilisé pour la fermentation doivent être observées et malgré cela il est souvent désirable d'adopter des concentrations plus élevées en polymyxine, c'est-à- dire des teneurs de l'ordre de 0,05 [gamma] par ml du milieu de fermentation pour pouvoir contrôler efficacement l'infection qui se produisait jusqu'ici au cours d'un brassage industriel ordinaire.
Ainsi, les exemples qui sont donnés ci-après illustrent la mise en oeuvre de l'invention pour laquelle on utilise une concentration plus élevée en polymyxine (0,05 [gamma] par ml) pour empêcher la contamination dans les conditions industrielles les plus usuelles pour lesquelles il se produit une contamination importante alors que les exemples, pour lesquels on adop te la concentration moindre en polymyxine (0,005 [gamma] ml) montrent l'effica- cité surprenante de ces quantités minimes dans un milieu de fermentation quand des précautions convenables sont prises concernant la propreté des ap- pareils et quand on utilise des ingrédients non contaminés pour la fermen- tation. Il est à noter que l'accélération de la fermentation est la même dans les deux cas.
La méthode préférée pour introduire la polymyxine dans le mi- lieu de fermentation est d'ajouter la polymyxine, sous la forme d'une solu- tion aqueuse, à la levure d'inoculation et de la mélanger soigneusement avec cette levure avant d'inoculer la cuve de fermentation. Les proportions entre la levure d'inoculation et le volume final de la bière en fermenta- tion, contenu dans la cuve, est d'environ 1 :200. Des concentrations de poly- myxine inférieures à 20 [gamma] par ml ne sont pas toxiques pour la levure de bras- serie ou de distillerie.
Si, par exemple, 10 [gamma] de polymyxine sont ajoutés à la levure d'inoculation par ml de levain quand celui-ci est dilué 200 fois dans la cuve de fermentatiôn, la teneur en polymyxine obtenue dans la bière en fermentation est de 0,05 r par ml ce qui est une concentration optimum pour des opérations de brasserie.
Comme la concentration bactéricide minimum de la polymyxine dans la bière en fermentation est de 0,005 y par ml et comme la concentration maximum, qui n'est pas susceptible d'avoir un effet préjudiciable sur la levure, est de 20 [gamma] par ml, toute teneur en polymyxine comprise entre 1 et 4000 0 par ml dans le levain d'inoculation procure une concentration bactéricide efficace de l'antibiotique contre le Flavobacté-
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rium proteus contenu dans la bière en fermentation sans que l'on ait à craindre une influence préjudiciable sur les activités de la levure de brasserie ou de distillerie.
La filtration usuelle, à la fin de la fabrication de la bière, sépare tout l'antibiotique polymyxine de la bière comme on l'a constaté par la méthode officielle utilisée pour analyser la polymyxine, cette méthode étant dénommée "Essai biologique modifié de Benedict et Stadola pour la détermination de la polymyxine".
L'antibiotique polymyxine est bactéricide dans les conditions auxquelles se fait la fermentation de la bière, pour les bactéries gram négatives Flavobacterium proteus, qui sont toujours présentés comme contaminants dans la levure des brasseurs utilisée pour la fermentation de la bière dans les brasseries. Toute concentration de cet antibiotique entre 0,005 [gamma] et 20 [gamma] par ml de bière en fermentation élimine complètement cette infection bactérienne pendant les 24 premières heures de la fermentation et n'agit pas sur le levure d'une manière préjudiciable.
La méthode préférée pour ajouter l'antibiotique est de mélanger soigneusement une solution aqueuse de ce produit à la levure d'inoculation juste avant que l'inoculation se fasse.
Une solution aqueuse de l'antibiotique peut, toutefois, être ajoutée également à la bière en fermentation pendant les 24 premières heures de la fermentation.
La polymyxine est efficace pour augmenter la croissance de la levure, pour réduire le pH pendant la fermentation, pour réduire la densité du milieu de fermentation et pour contrôler les micro-organismes, bâtonnets et cocci, qui se trouvent dans les fermentations pour lesquelles on se sert du Saccharomyces cerevisiae ou du Schizosaccharomyces pour les fermentations de bière claire ou de distillerie. Dans ces dernières, la quantité de polymyxine peut être augmentée, plus particulièrement dans le cas où l' infection par les micro-organismes est très importante et la récupération du produit distillé, par les méthodes de distillation usuelles, laisse l'antibiotique polymyxine dans le résidu recueilli dans l'appareil de distillation.
Pour la fermentation de la bière, pour laquelle on se sert d'un levure de dépôt pour la fermentation basse, le moût est réglé de manière telle que son pH initial soit de 5,1 et une densité initiale de 11,7 Plato à 12,3 Plato est préférée pour le moût. Les degrés Plato correspondant à la teneur en sucrose de la solution aqueuse et ils équivalent, également pour tous les usages pratiques, au pourcentage de l'extrait dans le moût ou la bière. La relation existant entre les degrés Plato et le poids spécifique est publiée, sous la forme d'un tableau, par la American Society of Brewing Chemists.
Le moût pour la fermentation de la bière ordinaire ou de la bière claire, après l'ébullition et avant l'inoculation , est refroidi rapidement depuis environ 87 à environ 9 . Il se produit ainsi une précipitation qu'une quantité importante de protéines dénommées généralement "lie".
Pour éviter la présence de la lie précipitée, qui donne une saveur amère à la bière dans les cuves pendant la fermentation, on laisse le moût refroidi au repos dans une cuve de sédimentation pendant environ 12 heures avant de le pomper dans la cuve de fermentation. Pendant cette période de douze heures, la plus grande partie de la lie se dépose et la couche de dép8t peut atteindre jusqu'à 25 cm sur le fond de la cuve.
Il est toutefois dangereux de laisser ce moût refroidi au repos pendant une période de temps aussi longue car il constitue un milieu de culture excellent pour des bactéries et une contamination bactérienne est susceptible de se produire. Pour cette raison, la levure est ajoutée au moût refroidi quand celui-ci est pompé dans la cuve de sédimentation de sorte que la fermentation commence presque immédiatement et on se base sur cette fermentation, en pratique, pour retarder la croissance bactérienne. Les
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organismes qui abiment le moût sont généralement désignés comme étant les bactéries "termo".
Ce sont ces bâtonnets courts gram négatifs appartenant ordinairement à la famille des Enterobactereaceae. Des explications concernant ces organismes peuvent être trouvées dans les Wallerstein Laboratories Communications II, 135 (1948).
La levure a toutefois une tendance à se déposer avec la lie et la bière ne peut donc pas être pompée dans la cuve de fermentation jusqu'à ce que la fermentation soit devenue suffisamment vigoureuse pour remettre la levure en suspension. Toutefois, le dégagement du CO2., qui remet la levure en suspension, provoque aussi une remise en suspension de la lie qui est ainsi transférée dans la cuve de fermentation et qui donne de l'amertume à la bière.
En ajoutant de l'antibiotique polymyxine au moût refroidi avec des concentrations d'au moins 0,05 par ml, la contamination bactérienne est contrôlée et le moût peut être laissé au repos dans la cuve de sédimentation sans qu'on ait à ajouter la levure. Comme aucune fermentation active ne se produit (du CO2 n'étant pas dégagé) la lie déposée n'est pas troublée.
Une quantité moindre de la lie est pompée dans la cuve de fermentation et se dépose en étant dans une meilleure condition physique.
Les indications, données dans le tableau ci-dessous, montrent l'effet de la polymyxine sur du moût maintenu à 9 qui est la température usuelle à laquelle se fait la sédimentation du moût. Les chiffres montrent que la croissance de cette infection, qui se produit naturellement, est complètement empêchée par 0,05 [gamma]/ml de polymyxine.
TABLEAU I
EMI7.1
P01ymine ¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯ ¯ ,¯¯¯ ---t ml odeur nombre de bactéries(termo)
EMI7.2
<tb>
<tb> -- <SEP> sur <SEP> la <SEP> plaque¯¯¯¯¯¯
<tb> 0 <SEP> termo <SEP> 22.500.000
<tb> 0,01 <SEP> " <SEP> 31.000.000
<tb> 0,02 <SEP> " <SEP> 5.300.000
<tb> 0,05 <SEP> normale <SEP> 1.500 <SEP> #
<tb> 0,10 <SEP> " <SEP> 2.800 <SEP> #
<tb>
# principalement des colonies de levure.
Pour la fabrication de bière claire (ale), le moût est inoculé avec environ 450 g de levure pour environ 190 litres de moût et la concentration dans le milieu de fermentation est d'environ 6.0-6,2 x 10 cellu-
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les de levure par ml. Pour une fermentati-6h contrôlée pour laquelle on n'a- joute pas d'antibiotique, la quantité de levure augmente jusqu'à environ @ 18-20 x 106 cellules par ml, 24 heures après l'inoculation, jusqu'à envi- ron 26-43 x 106 cellules par ml, 48 heures après l'inoculation, jusqu'à environ 39-46 x 106 cellules par ml, 72 heures après l'inoculation et jus- qu'à environ 15-24 x 106 cellules par ml, 96 heures après l'inoculation la "cassure Il se produisant entre 72 et 96 heures.
Des valeurs plus élevées pour la croissance de la levure sont observées avec des concentrations plus importantes en hydrate de carbone dans le moût initial (densités plus élevées en degrés Plato). L'addition de 0,05 [gamma] de polymyxine par ml au milieu de fermentation, comme indiqué plus haut, ne modifie pas la quantité de levure au cours de la fermentation et la "cas- sure" est observée, d'une manière similaire, entre le 3ème et le 4ème jour.
En augmentant la quantité de polymyxine jusqu'à 1,6 /ml on n'obtient, en substance, aucune amélioration par rapport à la quantité de 0,05 [gamma]/ml, en ce
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qui concerne la croissance et l'activité de la levure.
D'une manière remarquable, l'addition d'au moins 0,05 [gamma] de po- lymyxine à la bière en fermentation améliore la filtration subséquente, per- met la récupération des cellules de levure à l'état non-contaminé et aucune trace détectable de polymyxine ne peut être trouvée dans la bière filtrée ou dans la levure récupérée en se servant des méthodes d'essai normalisées¯ dont on dispose actuellement. On empêche ainsi l'introduction d'un réactif dangereux dans un breuvage potable ou dans de la levure comestible par lequel ces produits seraient convertis en drogues.
L'infection normale, qui se produit dans une fermentation de malt, est de l'ordre de plusieurs centaines de milliers à quelques millions par ml de bâtonnets gram négatifs, tel que spécifiés plus haut et de nombres si- milaires de bâtonnets et de cocci gram positifs indiqués plus haut, ces bac- téries provenant des matières utilisées ou d'une infection secondaire au cours de la fermentation. Une dose effective de polymyxine , pour obtenir l'élimination sensiblement complète d'une infection gram négative, corres- po nd à environ 0,05 [gamma] /ml. Quand on double ou quand on augmente davantage la dose,, on n'obtient aucun avantage additionnel et il se produit l'incon- vénient que des petites quantités de polymyxine peuvent être transférées dans la bière ou dans la levure après la fermentation.
Afin que l'invention puisse être bien comprise, elle sera décri- te dans les exemples illustratifs suivants pour lesquels les exemples I à VIII concernent l'addition de polymyxine seulement, alors que les exemples IX à XI sont relatifs à l'addition de polymyxine et de pénicilline aux diver- ses fermentations.
EXEMPLE TEMOIN A - On utilise trois litres de bière en fermentation, nrove- nant d'un appareil de fermentation, qui a été inoculée pendantles troisheures précédents avec une levure (Saccharomyces carlsbergensis) infectée par en- viron 200.000 cellules de Flavobacterium proteus, du type à bâtonnets bac- tériens par millilitre. La densité initiale de cette bière était de Il,7 Plato, le pH initial était de 5, L et la quantité de levure initiale était de six millions de cellules par millilitre. La cuve de fermentation est sus- pendue dans un bain d'eau dont la température peut être réglée et cette tem- pérature est ajustée chaque jour pour qu'elle corresponde , d'aussi près que possible, aux températures qui règnent dans l'appareil de fermentation et qui correspondent à environ 10 à 15 .
La fermentation de la bière, c'est- à-dire de la décoction filtrée des amidons, des sucres et des houblons après le chauffage de l'orge maltée, commence à 10 et on permet à la température de monter d'environ 1,2 seulement par jour jusqu'à ce qu'on obtienne une température d'environ 15 , en refroidissant si cela est nécessaire. Le jour qui succède à celui auquel la cuve de fermentation a été remplie et chaque jour suivant pendant quatre jours, on prélève, à l'aide d'une pipette, des parties aliquotes pour l'analyse à une profondeur normalisée, adopta pour les cuves de fermentation.
Les résultats de ces analyses au deuxième, troisième, quatrième et qinquième jour, après que la fermentation a débuté sont respectivement les suivants : quantité de levure x 10- /ml = 18,8 ; 26,0 ; 39,2 et 15,2 ; le pH = 4,69 ; 4,45 ; 4,21 et 4,10 ; degrés Plato = 10,39 ; 8,00 ; 5,74 et 3,30.
EXEMPLE 1.- Pour l'exemple 1 on adopte un procédé et des conditions analq- ' gues à ceux de l'exemple témoin A à l'exception qu'une solution aqueuse de polymyxine est ajoutée par laquelle on obtient une concentration finale en polymyxine, dans la bière en fermentation, de 0,003 [gamma] /ml.
Les résultats de l'analyse aux deuxième, troisième quatrième et cinquième jours, après que la fermentation a débuté, sont respectivement : quantité de levure x 10-6 /ml = 18,0 ; 29,3 ; 37,3 ; et la,8 ; pH = 4,71; 4,29 ; 4,16 et 4,00 ; Plato = 10,35 ; 7,61; 5,09 et 3,05.
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EXEMPLE II.- Pour l'exemple II on adopte un procédé et des conditions analo- gues à ceux de l'exemple témoin A à l'exception qu'une solution aqueuse de polymyxine est ajoutée par laquelle on obtient une concentration finale dans la bière en fermentation de 0,024 [gamma]/ml.
Les résultats de l'analyse au deuxième, troisième, quatrième et cinquième jour, après que la fermentation a débuté, sont respectivement : quantité de levure x 10-6 /ml = 16,7 ; 30,8 ; 40,2 et 12,1 : pH = 4,68 ;
4,25 ; 4,09 et 4,00 ; degrés Plato = 10,25 ; 7,46 ; 4,97 et 3,05.
EXEMPLE III.- Pour l'exemple III on adopte un procédé et des conditions ana- logues à ceux de l'exemple témoin A à l'exception qu'une solution aqueuse de polymyxine est ajoutée par laquelle on obtient une concentration finale dans la bière en fermentation de 0,200 [gamma]/ml.
Les résultats de l'analyse au deuxième, troisième, quatrième et cinquième jour, après que la fermentation a débuté, sont respectivement : quantité de levure x 10-6 /ml = 20,2 ; 30,5 ; 44,9 et 12 ,2 ; pH = 4,62 ; 4,22 4,03 et 3,98 ; degrés Plato = 10,40 ; 7,65 ; 4,92 et 3,06.
EXEMPLE IV.- Pour l'exemple IV on adopte un procédé et des conditions ana- logues à ceux de l'exemple témoin A à l'exception qu'une solution aqueuse de polymyxine est ajoutée par laquelle on obtient une concentration finale, dans la bière en fermentation, de 1,600 [gamma]/ml.
Les résultats de l'analyse au deuxième, troisième, quatrième, et cinquième jour, après que la fermentation a débuté, sont respectivement : quantité de levure x 10-6 /ml = 14,8 ; 30,0 ; 46,0 et 18,0 ; pH = 4,67 ; 4,22 . 4,02 et 3,98 ; degrés Plato = 10,35 ; 7,65 ; 4,84 et 3,00,.
EXEMPLE V - Pour l'exemple V on adopte un procédé et des conditions analogues ceux de l'exemple témoin A à l'exception qu'une solution aqueuse de polymy- xine est ajoutée par laquelle on obtient une concentration finale, dans la bière en fermentation, de 13,0 [gamma]/ml.
Les résultats de l'analyse au deuxième, troisième, quatrième et cinquième jour, après que la fermentation a débuté, sont respectivement : quantité de levure x 10-6 /ml = 19,5 ; 29,7 ;39,3 et 16,2 ; pH = 4,65, 4,14, 4,02 et 3,98 ; degrés Plato = 10,22 ; 7,28 ; 4;74 et 3,00.
EXEMPLE VI.- Pour l'exemple VI on adopte un procédé et des conditions ana- logues a ceux de l'exemple témoin A à l'exception qu'une solution aqueuse de polymyxine est ajoutée par laquelle on obtient une concentration finale, dans la bière en fermentation, de 0,05 /ml dans l'appareil de fomenta- tion.
L'infection bactérienne est complètement éliminée. Une diminu- tion considérable du pH est notée à partir du deuxième jour et les degrés Plato diminuent d'une manière analogue ce qui indique une accélération de la fermentation sans une augmentation de la croissance de la levure.
L'infection bactérienne est complètement éliminée pour les exem- ples II, III, IV, V-et VI.
Les résultats d'une étde de l'influence de la polymyxine sur la fermentation de la bière sont indiqués dans le tableau II.
Les quantités de levure, obtenues dans les cuves de fermenta- tion contenant la bière-témoin et la bière avec la polymyxine, sont indi- quées dans la première colonne du tableau et montrent que la polymyxine n' influence pas la croissance de la levure pendant une fermentation normale.
Les valeurs du pH des bières en fermentation, pendant la période de quatre jours, sont indiquées dans la deuxième colonne du tableau. Au premier jour on ne remarquait pas des différences appréciables. Le troisième jour, tou- tefois, on notait une diminution considérable du pH dans les cuves contenant la polymyxine par rapport à celle obtenue pour le témoin. La diminution du pH dans les bières en fermentation est accompagnée d'un accroissement
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de la teneur en polymyxine.
Une référence à la réduction du pH pendant la fermentation normale de la bière et à sa relation avec l'accroissement de la production d' alcool neut être trouvée dans un article : "Experiments of Bottem Fermentation I. Methodologic publié par Erik Helm et Berger Trolls dans les Wallerstein Laboratories Communications 10 p. 87-98 (1947).
Un effet similaire paraît dans la troisième colonne du tableau II dans laquelle on indique les densités des bières en fermentation. Le point final absolu de fermentation, basé sur l'activité de la levure dans les cuves de fermentation est considéré comme étant de 3.000 Plato dans chaque cas. Les cuves, qui contiennent les concentrations les plus élevées en polymyxine, atteignent donc la fermentation finale à un certain moment entre le quatrième et le cinquième jour mais le témoin n'a pas atteint la fermentation finale le cinquième jour.
Les degrés de Plato sont équivalents au pourcentage de sucrose en solution aqueuse et sont également, pour tous les usages pratiques, au pourcentage de l'extrait dans le moût ou la bière. La relation entre les degrés Plato et le poids spécifique est publiée, sous la forme d'un tableau, par la American Society of Brewing Chemist.
Les quantités de bactéries sont comptées le deuxième,: et le quatrième jour. Les bactéries sont complètement éliminées dans les bières en fermentation qui contenaient 0,024 [gamma] /ml ou qui ont des teneurs plus élevées en polymyxine.
Les exemples I à VI déterminent les concentrations de polymyxine nécessaires pour empêcher la croissance de la levure et des bactéries infectantes dans la bière en fermentation aux températures de fermentation norma- les. La croissance des bactéries est empêchée par une quantité aussi réduite que 0,005 [gamma] /ml et approximativement 20 t /ml sont nécessaires pour empêcher la croissance de la levure et la fermentation. La bière filtrée, obtenue à partir de ces fermentations, ne contient pas de polymyxine car ce produit n'est pas détecté par la méthode d'essai normalisée.
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T A B L E A U II Effet de l'antibiotiaue Polymyxine sur les fermentations de-bière*
EMI11.1
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> levure <SEP> x <SEP> 10-6 <SEP> pH <SEP> (2 <SEP> ) <SEP> Degrés <SEP> Plato
<tb> EXEMPLES <SEP> A <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V <SEP> A <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V <SEP> A <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V
<tb> @
<tb> ler <SEP> jour <SEP> 18. <SEP> 8 <SEP> 18. <SEP> 0 <SEP> 16. <SEP> 7 <SEP> 20.2 <SEP> 14.8 <SEP> 19.5 <SEP> 4.69 <SEP> 4.71 <SEP> 4. <SEP> 68 <SEP> 4.62 <SEP> 4. <SEP> 67 <SEP> 4. <SEP> 65 <SEP> 10.39 <SEP> 10.35 <SEP> 10.25 <SEP> 10. <SEP> 40 <SEP> 10.35 <SEP> 10. <SEP> 22
<tb> 2ème <SEP> " <SEP> 26.0 <SEP> 29. <SEP> 3 <SEP> 30. <SEP> 8 <SEP> 30,5 <SEP> 30. <SEP> 0 <SEP> 29. <SEP> 7 <SEP> 4.45 <SEP> 4.29 <SEP> 4.25 <SEP> 4.22 <SEP> 4. <SEP> 22 <SEP> 4.14 <SEP> 8.
<SEP> 00 <SEP> 7. <SEP> 61 <SEP> 7. <SEP> 46 <SEP> 7.65 <SEP> 7. <SEP> 65 <SEP> 7. <SEP> 28
<tb> 3ème <SEP> " <SEP> 39. <SEP> 2 <SEP> 37.3 <SEP> 40.2 <SEP> 44. <SEP> 9 <SEP> 46.0 <SEP> 39. <SEP> 3 <SEP> 4.21 <SEP> 4.16 <SEP> 4.09 <SEP> 4. <SEP> 03 <SEP> 4. <SEP> 02 <SEP> 4. <SEP> 02 <SEP> 5. <SEP> 74 <SEP> 5. <SEP> 09 <SEP> 4. <SEP> 97 <SEP> 4. <SEP> 92 <SEP> 4. <SEP> 84 <SEP> 4. <SEP> 74
<tb>
EMI11.2
4eue " 15.3 10.8 ,2 . I 12.2 18.0 16.2 4.10 4.00 4. 00 3.98 3.98 3.98 3.30 3.05 3.05 3.06 3.00 3.00 (2) la densité initiale dans toutes les cuves de fermentation était = 11,7
EMI11.3
fi32Mles Additions-de polmyxi ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯.
EMI11.4
<tb>
Témoin <SEP> A <SEP> nulle <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> (Flavobacterium <SEP> proteus)
<tb> Exemple <SEP> Exemple <SEP> Exemple <SEP> Exemple <SEP> Exemple <SEP> Exemple
<tb> 0,003 <SEP> [gamma]/ml <SEP> Jour <SEP> A <SEP> II <SEP> III <SEP> IV
<tb> II <SEP> 0,024 <SEP> 1er <SEP> 203000 <SEP> 197000 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> III <SEP> 0,200 <SEP> 2ème <SEP> 194000 <SEP> 85000 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
EMI11.5
IV 1,600 '###############################--#-######
EMI11.6
<tb> V <SEP> 13,0
<tb>
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Sur le tableau II les quantités de levure,
obtenues dans les cuves de fermentation contenant le témoin et la polymyxine sont indiquées' dans la première colonne du tableau et montrent que les concentrations de la'po- lymyxine n'affectent pas la croissance de la levure. Les valeurs du pH des bières en fermentation pour la période de quatre jours sont indiquées dans la deuxième colonne du tableau. Au premier jour il n'y avait pas de différences appréciables. Au deuxième jour, toutefois, on notait une diminution considérable du pH dans les cuves de fermentation contenant la polymyxine par rapport à celui obtenu pour le témoin.
L'importance de la diminution du pH, ainsi déterminé, varie directement avec les teneurs en polymyxine entre environ 0,02 et envron 0,2 /ml. la différence continue à se manifester pendant le troisième et le quatrième jour, mais à un degré moindre à mesure qu'on s'approche de la fin de la fermentation.
Un effet analogue est représenté dans la troisième colonne du Tableau II dans laquelle on indique des densités des bières en fermentation.
Les fermentations finales dans les sept cuves de fermentation sont déterminées et on constate qu'elles correspondent à 3. 000 degrés Plato dans chaque cas. Les cuves, qui contenaient les concentrations les plus élevées en polymyxine avaient donc atteint la fermentation finale à un certain moment entre le troisième et le quatrième jour (en réalité entre le quatrième et le cinquième jour après l'inoculation) mais le témoin n'avait pas atteint la fermentation finale à la fin du cinquième jour.
La détermination du nombre de bactéries a été faite le premier et le troisième jour. Les bactéries avaient complètement disparu dans les bières contenant 0,024 [gamma]/ml ou des concentrations plus élevées de polymyxine.
Les chiffres, indiqués dans le tableau II, montrent que l'antibiotique polymyxine ne stimule pas la croissance de la levure mais, par contre, stimule le processus de la fermentation. Cette stimulation n'est pas le résultat de l'élimination de la contamination bactérienne puisqu'un effet accru est obtenu quand la teneur en antibiotique augmente au-delà du minimum nécessaire pour éliminer complètement-la croissance bactérienne et comme visible sur le tableau II.
On a donc montré que la polymyxine supprime l'infection de la levure par le Flavobaçterium proteus et stimule la fermentation de la levure dans la bière en fermentation. Cette stimulation de la fermentation de la levure est plus grande, d'une manière inattendue, que celle due à la suppression de l'infection bactérienne et elle est obtenue sans aucune augmentation de la croissance des cellules de levure.
La filtration de la bière permet la séparation d'un résidu solide contenant l'antibiotique de la levure, ce résidu étant excellent pour la nourriture du bétail et de la volaille. Le résidu végétal contient un principe favorisant la croissance, qui se trouve dans la levure et dans la polymyxine, ainsi que des vitamines adjointes à la levure. Le résidu peut être utilisé comme supplément de nourriture avec toutes les protéines végétales comme celles dérivées de la farine de soja, d'arrachides et analogues.
EXEMPLE VII.- L'effet de l'antibiotique polymyxine sur une fermentation de bière claire est déterminé en mélangeant 3,7 g de polymyxine avec 158 kg d'une levure d'inoculation pour la bière claire. On utilise cette quantité de levure pour inoculer 600 cuves de moût (chaque cuve contenant 120 1. de moût ) et on permet sa fermentation. Une fermentation témoin, ne contenant pas de polymyxine, se fait simultanément.
Des analyses des deux bières en fermentation sont faites à des intervalles de temps et les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-dessous.
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Effet de la o. ine -sur le 1DII-de la bière en fermentation
EMI13.2
<tb>
<tb> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> bière <SEP> en <SEP> fermentation <SEP> Fin <SEP> de <SEP> la
<tb> après <SEP> : <SEP> fermentation
<tb>
EMI13.3
, ...---i-¯-..-.¯..- ... - ...- -. après 60 h. cuve contenant o h 6 h 12 h ?4 h À cuve contenant ## ## ### #'-# *#'#
EMI13.4
<tb>
<tb> la <SEP> polymyxine <SEP> 5,03 <SEP> 5,01 <SEP> 4,96 <SEP> 4,74 <SEP> 4,30 <SEP> 3,94
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> le <SEP> témoin <SEP> 4,93 <SEP> 4,92 <SEP> 4,86 <SEP> 4,66 <SEP> 4,18 <SEP> 3,94
<tb> Diminution <SEP> du <SEP> pH <SEP> après <SEP> :
<SEP> Fin <SEP> de <SEP> la
<tb> fermentation
<tb> 6. <SEP> h <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 36 <SEP> h <SEP> après <SEP> 60 <SEP> h
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> de <SEP> la <SEP> polymyxine <SEP> 0,02 <SEP> 0,07 <SEP> 0,27 <SEP> 0,73 <SEP> 1,07
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> le <SEP> témoin <SEP> 0,01 <SEP> 0,07 <SEP> 0,27 <SEP> 0,75 <SEP> 0,99
<tb> Densité <SEP> (en <SEP> degrés <SEP> Plato) <SEP> après <SEP> :
<SEP> Fin <SEP> de <SEP> la
<tb>
EMI13.5
0 h 6 h 1&...11 2 36ji i&l! {:IJ h fermentatiol1
EMI13.6
<tb>
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> la <SEP> polymyxine <SEP> 12,40 <SEP> 12,39 <SEP> 12,30 <SEP> 11,78 <SEP> 9,90 <SEP> 5,92 <SEP> 3,71 <SEP> 2,30
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> le <SEP> témoin <SEP> 12,30 <SEP> 12,30 <SEP> 12,17 <SEP> 11,31 <SEP> 9,40 <SEP> 5,10 <SEP> 3,52 <SEP> 2,20
<tb> Diminution <SEP> de <SEP> la <SEP> densité <SEP> (en <SEP> degrés <SEP> Plato) <SEP> après <SEP> :
<SEP> Diminution
<tb> 6 <SEP> h <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 36 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 60 <SEP> h <SEP> - <SEP> totale
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> la <SEP> polymyxine <SEP> 0,01 <SEP> 0,62 <SEP> 0,62 <SEP> 2,50 <SEP> 6,48 <SEP> 8,69 <SEP> 10,10
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> le <SEP> témoin <SEP> 0,00 <SEP> 0,13 <SEP> 0,99 <SEP> 2,90 <SEP> 7,20 <SEP> 8,78 <SEP> 10,10
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> par <SEP> ml <SEP> après <SEP> .
<SEP> Nombre <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> par <SEP> ml
<tb> 0 <SEP> h <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 60 <SEP> h <SEP> de <SEP> la <SEP> levure
<tb> cuve <SEP> contenant <SEP> récoltée
<tb> la <SEP> polymyxine <SEP> 250 <SEP> 2000 <SEP> 3000 <SEP> 3500 <SEP> 520 <SEP> 1200
<tb> cuve <SEP> contenant
<tb> le <SEP> témoin <SEP> 375 <SEP> 80000 <SEP> 280000 <SEP> 220000 <SEP> 100000 <SEP> 111000
<tb>
Les chiffres ci-dessus montrent que la polymyxine dans ce groupe de fermentations accélère seulement légèrement la fermentation quand celle-
EMI13.7
ci est mesurée par la diminution du rq e+ de la E\t1SitÁ des bières claires en fermentation. Cette diminution peut.avoir pour cauaeq# la fermentation de la bière claire est très rapide, comparativement à la fermentation de la bière obtenue avec le S carlsbergensis.
Elle se fait également à une température beaucoup plus élevée. La température initiale de la fermentation de la bière claire est 14,5 et on lui permet d'atteindre une valeur aussi élevée que 23,5 . Ceci peut être comparé à la température initiale de 9 pour la bière ordinaire avec un maximum de 15 pendant le fermentation.
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La polymyxine, toutefois, réduit effectivement le nombre de bac- téries dans la bière claire en fermentation ainsi que la récolte de la le- vure formée.
La polymyxine n'a pas un effet préjudiciable sur la croissance de la levure pendant la fermentation.
EXEMPLE VIII.- Une fermentation d'alcool industriel a lieu en se servant de la levure Saccharomyces cerevisiae ou de la levure Shizosaccharomyces.
De la cassonade, four ie par l'industrie sucrière et contenant environ 40 à 55 % de sucre fermentatif ou le moût usuel de seigle ou de froment, est uti- lisée pour préparer la bière de fermentation en réglant la teneur en sucre fermentatif à environ 12 à 14 % , en ajoutant les quantités usuelles de sul- fate d'ammonium, de phosphates solubles et analogues comme source nutritive pour la levure et en réglant le pH à environ 3,5 à environ 4,7. La compo- sition du moût de seigle ou de froment est celle indiquée à la page 231 du traité de Prescott & Dunn "Industrial Microbiology", Me Graw Hill, 1949.
La fermentation avec les levures, indiquées ci-dessus, se fait à une tém- pérature d'environ 21 jusqu'à environ 32 pendant six jours. La témpéra- ture monte, pendant la fermentation, comme à l'ordinaire et le nombre de bactéries par ml de levure récoltée, en partant d'environ 181 kg de levure pour environ 60.500 litres de bière, correspond à une valeur de 400.000 après 24 heures pour une fermentation surveillée alors que, dans les mêmes conditions, l'addition d'environ 4,5 g de polymyxine à 181 kg de levure Sac- charomyces cerevisiae réduit le nombre de bactéries à environ 3. 800 par ml de levure récoltée.
Le pH est réduit d'un pH initial d'environ 4,7 à un pH d'environ 4,0 après 24 heures et un pH final d'environ 3,8 est atteint après 36 heures aussi bien pour la fermentation témoin que pour la fermen- tation avec la polymyxine mais la diminution de la densité est légèrement plus grande pour la fermentation avec la polymyxine que pour la fermen- tation témoin, plus particulièrement après 24 heures ce qui montre qu'il se produit un effet synergétique perceptible de la polymyxine dans la stimu- lation de la croissance de la levure.
On a constaté que les désinfectants usuels, tels que le bifluo- rure d'ammonium, peuvent être supprimés si l'on se sert de la polymyxine.
Les inconvénients, qui résultent¯de l'usage de ces désinfedtants usuels, sont aussi évités. -
L'effet à retardement de la polymyxine, pour réduire le nombre de bactéries, est similaire à celui qui se produit pour la fermentation de bière ordinaire ou de bière claire. La disparition de bactéries qui sont re- tenues ou absorbées par la levure après la période d'induction qui dure de 2 à 3 jours, permet d'exercer un contrôle remarquablement efficace à la fin de la fermentation quand le contrôle est réellement nécessaire pour éli- miner les micro-organismes indésirables.
EXEMPLE TEMOIN B.- Pour l'exemple'témoin B on procède comme dans l'exemple témoin A et dans les mêmes conditions à l'exception qu'on ajoute une solution aqueuse de pénicilline qui donne des teneurs finales suivantes en pénicilli- ne à la bière en fermentation : 0, 5 /ml ; 10 [gamma]/ml ; 15 [gamma]/ml et 120 [gamma]/ml.
Les résultats de l'analyse le 2ème, le 3ème, le 4ème et le 5ème jours, agrès que la fermentation a débuté, montrent que la quantité de levure x 10 /ml, est, en substance, la même que la quantité de levure obtenue pour l'exemple témoin A. Les valeurs du pH sont, en substance, les mêmes que pour l'exemple A et aucune différence appréciable n'est observée pour les valeurs des densités en degrés Plato. L'infection bactérienne, au début, est d'environ 203.000/ml. Dans le témoin le nombre de bactéries (pour ainsi dire que des Flavobacterium proteus gram négatifs) diminuait jusqu'à environ 194.000/ml au 3ème jour et la valeur à la fin du 5ème jour variait entre environ 100.000 et environ 200. 000 par ml.
L'addition de pénicilline, même en quantités allant jusqu'à 120 [gamma] /ml, pour cet exemple, ne modifiait pas le nombre de bactéries. La présence de pénicilline ne pouvait pas être dé-
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tectée dans la fermentation finale ou dans les cellules de la levure prélevée dans cette fermentation quand la pénicilline était ajoutée en quantités correspondant à 0,05 [gamma], à 0,10 ' et 0,15 (par ml. Par conséquent, on constate que la pénicilline est devenue inactive pour ces doses et qu'aucune amélioration n'est obtenue pour le réglage de la quantité des bâtonnets gram négatifs en se servant de l'antibiotique seul.
EXEMPLE TEMOIN C.- Pour cet exemple on procède comme dans l'exemple témoin B et on adopte les mêmes conditions à l'exception que les additions de 0,05 #, de 0,10 #, de 0,15 # et 120 sont faites à une fermentation de bière claire qui a débuté à une température de 14,5 et à laquelle on permet que la température, après 60 heures, atteigne une température de 23,5 en se servant de la levure Saccharomyces cerevisiae.
La fermentation témoin, aux conditions de température susdites, a lieu en se servant d'environ 158 kg de cette levure d'inoculation de bière claire pour environ 600 cuves de moût, chaque:cuve contenant 116 litres. Le pH initial du moût est d'environ 4,95. Le pH descend après environ 6 heures à environ 4,92, après environ 12 heures à environ 4,86, après environ 24 heures à environ 4,66, après environ 36 heures à environ 4,18 et après environ 60 heures à environ 3,94. La densité en degrés Plato pour l'exemple témoin, au début, est d'environ 12,30. Aucune diminution n'est observée après 6 heures. Après 12 heures, la densité pour l'exemple témoin est d'environ 12,17, après 24 heures d'environ 11,31, après 36 heures d'environ 9,40, après 48 heures d'environ 5,10 et après 60 heures d'environ 3,52.
L'addition de pénicilline en quantités correspondant à 0,03 [gamma] /ml, 0,10 [gamma]/ml et 0,1,5 [gamma]/ml ne modifie pas d'une manière appréciable les valeurs du pH et de la densité. Comme pour l'exemple 6 ces additions n' ont pu être détectées dans les essais après que la fermentation était terminée, ni dans la levure récupérée ou dans la bière claire obtenue.
L'infection bactérienne, au début de la fermentation dans le témoin est d'environ 400/ml de bâtonnets gras négatifs. Après 12 heures le nombre est d'environ 80.000, après 24 heures d'environ 280.000, après 48 heures d'environ 220.000 et après 60 heures d'environ 100.000. La réduction du nombre de bactéries entre 24 et 60 heures est due à l'entraînement des bactéries qui flottent à la surface. La levure déposée contient environ 111.000 bactéries par ml.
Quand on ajoute les quantités indiquées de pénicilline le nombre de bactéries ne varie pas d'une manière sensible quand on vérifie ce nombre à des intervalles de 12, de 24, de 48 et de 60 heures.Il n'est pas invraisemblable qu'une quantité réduite de la pénicilline, qui flotte à la surface, ait été entraînée quand on utilise la dose très importante de 120 [gamma]/ml.
On voit que l'usage de l'antibiotique pénicilline n'a pas un effet substantiel sur la fermentation de la bière claire en adoptant la méthode de fabrication usuelle.
EXEMPLE TEMOIN D.- Une fermentation d'alcool industriel, pour laquelle on remplace la polymyxine par la pénicilline, est effectuée comme pour l' exemple 8 avec des doses de pénicilline de 0,05 [gamma]/ml, 0,10 [gamma]/ml, 0,15 [gamma]/ml et 120 [gamma]/ml. Aucun effet substantiel n'est obtenu avec ces doses de pénicilline en ce qui concerne le nombre de bactéries (bâtonnets gram négatifs), la réduction du pH et la réduction de la densité comparativement au témoin, comme indiqué dans l'exemple 8. La pénicilline ne procure aucun avantage quand elle est utilisée seule.
EXEMPLE IX.- Une fermentation de bière ordinaire se fait dans les conditions indiquées dans l'exemple témoin A, excepté qu'on ajoute de la pénicilline et de la polymyxine (0,05 [gamma]/ml de polymyxine et 0,10/ml de pénicilline )cor - respondant à 0,15 [gamma]/ml de bière en fermentation. Le mélange est ajouté à la levure d'inoculation avant l'inoculation. Les résultats de l'analyse du
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contenue de la cuve de fermentation et de celui de la cuve de fermentation témoin sont indiqués dans le tableau III ci-dessous. Ce mélange supprime effectivement les bactéries, stimule la fermentation comme indiqué par la mesure de la réduction du pH et de celle de la densité de la bière en fermentation et il n'affecte pas la croissance de la levure.
Bien que les quantités des deux antiboitiques ajoutés correspondaient respectivement à 0,10 [gamma]/ml de pénicilline et 0,05 de polymyxine par ml ; essai de la bière ayant complètement fermenté montre qu'elle contient 0,05 [gamma] /ml de pénicilline (la limite de l'essai). On n'a également pas trouvé la polymyxine mais la quantité ajoutée est inférieure à la concentration que l'on peut déterminer par une analyse.
TABLEAU III
Comparaison entre la fermentation de la bière avec la poly- myxine (0,05[gamma]/ml) et de la pénicilline (0,10 [gamma]/ml) et celle du témoin pour l'exemple 9.
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<tb>
<tb>
Heures <SEP> Quantité <SEP> Nombre <SEP> de
<tb> après <SEP> de <SEP> levure <SEP> pH <SEP> Degrés <SEP> Plato <SEP> bactéries
<tb> inocul. <SEP> Mélange <SEP> Témoin <SEP> Mélange <SEP> Témoin <SEP> Mélange <SEP> Témoin <SEP> Mélange <SEP> Témoin
<tb> 0 <SEP> 6,2 <SEP> 6,4 <SEP> 5,10 <SEP> 5,10 <SEP> 12,3 <SEP> 12,3 <SEP> 132.000145.000
<tb> 24 <SEP> 24,7 <SEP> 19,5 <SEP> 4,61 <SEP> 4,74 <SEP> 11,5 <SEP> 11,6 <SEP> 1.200 <SEP> 460.
<SEP> 000
<tb> 48 <SEP> 42,2 <SEP> 43,4 <SEP> 4,31 <SEP> 4,50 <SEP> 9,5 <SEP> 10,4 <SEP> 0 <SEP> 790.000
<tb> 72 <SEP> 40,1 <SEP> 46,2 <SEP> 4,02 <SEP> 4,20 <SEP> 5,3 <SEP> 7,0 <SEP> 0 <SEP> 510.000
<tb> 96 <SEP> 24,9 <SEP> 23,6 <SEP> 4,00 <SEP> 4,15 <SEP> 3,7 <SEP> 3,9 <SEP> 0 <SEP> 140.000
<tb> 120 <SEP> 2,8 <SEP> 4,1 <SEP> 4,01 <SEP> 4,18 <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> 0 <SEP> 130.000
<tb>
EXEMPLE X.- Le traitement pour cet exemple est exactement le même que celui de l'exemple 7, excepté que 3,7 g de polymyxine sont remplacés par 2,4 g de pénicilline mélangés avec 1,2 g de polymyxine. Une fermentation témoin sans polymyxine a lieu simultanément.
Des analyses des deux bières claires de fermentation ont lieu à des intervalles déterminés et les résultats sont indiqués dans le tableau ci-après.
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb>
<tb>
Effet <SEP> de <SEP> la <SEP> pénicilline <SEP> et <SEP> de <SEP> la <SEP> polymyxine
<tb> sur <SEP> le <SEP> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> bière <SEP> claire <SEP> en <SEP> fermentation.
<tb> pH <SEP> de <SEP> la <SEP> bière <SEP> en <SEP> fermentation <SEP> Fin <SEP> de <SEP> la
<tb> après <SEP> : <SEP> fermentation
<tb> après <SEP> 60 <SEP> h.
<tb>
EMI17.2
0 h 6 h 72 h 2 .1, h ,6 h
EMI17.3
<tb>
<tb> polymyxine <SEP> + <SEP> pénicil- <SEP> 5,03 <SEP> 5,01 <SEP> 4,97 <SEP> 4,73 <SEP> 4,29 <SEP> 3,93
<tb> line
<tb> fermentation <SEP> témoin <SEP> 4,93 <SEP> 4,92 <SEP> 4,86 <SEP> 4,66 <SEP> 4,18 <SEP> 3,94
<tb> Diminution <SEP> du <SEP> pH <SEP> après <SEP> : <SEP> Fin <SEP> de <SEP> la
<tb> fermentation
<tb> 6 <SEP> h <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 36 <SEP> h <SEP> après <SEP> 60 <SEP> h.
<tb> polymyxine <SEP> + <SEP> pénicilline <SEP> 0,02 <SEP> 0,06 <SEP> 0,30 <SEP> 0,74 <SEP> 1,09
<tb> fermentation <SEP> témoin <SEP> 0,01 <SEP> 0,07 <SEP> 0,27 <SEP> 0,75 <SEP> 0,99
<tb> Densité <SEP> en <SEP> degrés <SEP> Plato <SEP> après <SEP> :
<SEP> Fin <SEP> de <SEP> la
<tb>
EMI17.4
0 h 6 h f2 h ô,h 4S h 60 h fermentation
EMI17.5
<tb>
<tb> polymyxyne <SEP> + <SEP> pénicilline <SEP> 12,40 <SEP> 12,38 <SEP> 12,29 <SEP> Il,77 <SEP> 9,88 <SEP> 5,90 <SEP> 3,70 <SEP> 2,30
<tb> fermentation <SEP> témoin <SEP> 12,30 <SEP> 12,30 <SEP> 12,17 <SEP> 11,319,40 <SEP> 5,10 <SEP> 3,52 <SEP> 2,20
<tb> Diminution <SEP> de <SEP> la <SEP> densite <SEP> en
<tb> degrés <SEP> Plato <SEP> après <SEP> : <SEP>
<tb> Diminution
<tb>
EMI17.6
6 h 12 h 24 h 6 h 48 h 60 h totale
EMI17.7
<tb>
<tb> polymyxyne <SEP> + <SEP> pénicilline <SEP> 0,02 <SEP> 0,11 <SEP> 0,63 <SEP> 2,51 <SEP> 6,50 <SEP> 8,70 <SEP> 10,11
<tb> fermentation <SEP> témoin <SEP> 0,00 <SEP> 0,13 <SEP> 0,88 <SEP> 2,90 <SEP> 7,20 <SEP> 8,78 <SEP> 10,10
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> par <SEP> ml <SEP> après <SEP> :
<SEP> Nombre <SEP> de
<tb> bactéries
<tb> par <SEP> ml <SEP> dans
<tb> la <SEP> levure <SEP>
<tb>
EMI17.8
0 h .12 h 24 h 48 b.- h 60 h récoltée
EMI17.9
<tb>
<tb> polymyxyne <SEP> + <SEP> pénicilline <SEP> 410 <SEP> 1800 <SEP> 3000 <SEP> 3400 <SEP> 580 <SEP> 1100
<tb> fermentation <SEP> témoin <SEP> 410 <SEP> 90000 <SEP> 285000 <SEP> 230000 <SEP> 101000 <SEP> 111000
<tb>
Les chiffres ci-dessus montrent une amélioration réduite mais significative obtenue par l'effet de la polymyxine et de la pénicilline, comparativement à ce qu'on obtient avec une mme dose de la polymyxine dans le cas de la fermentation de bière claire. L'amélioration par rapport au témoin est au moins aussi bonne qu'avec la polymyxine utilisée seule.
Alors que la pénicilline, utilisée seule, est inefficace, en doses variables, l' efficacité du mélange de pénicilline et de polymyxine est plutôt surprenante même dans les conditions d'une durée plus courte et de températures plus élevées qu'on adopte pour la fermentation de la bière claire et dans les conditions acides qui ont une tendance à empêcher la formation des bactéries dans la fermentation du malt.
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On évite la nécessité de se débarrasser, par entraînement, par un courant, des bactéries qui flottent à la surface de la bière claire pendant la fermentation. En outre, en ajoutant le mélange de pénicilline et de polymyxine au moût on obtient, après refroidissement, une meilleure séparation de la liez EXEMPLE XI.- Pour cet exemple on procède exactement comme indiqué dans l'exemple 8 excepté que les 4,5 g de polymyxine ajoutés aux 181 kg de levure sont remplacés par 3,0 g de pénicilline et par 1,5 g de polymyxine pour une même quantité de levure.
La fermentation du moût de seigle ou de froment a lieu entre une température comprise entre environ 21 et 32 et on permet à la température de monter. La durée de fermentation est de 6 jours. Le nombre de bactéries correspond à 500/ml au début et à environ 400.000 /ml après 24 heures pour le témoin comme dans l'exemple 8. L'addition de 3,0 g de pénicilline et de 1,5 g de polymyxine à 181 kg de levure (60. 000 litres de moût) diminue le nombre de bactéries à environ 2500/ml après 24 heures.
Une réduction légèrement supérieure du pH est obtenue après 24 heures et après 36 heures par rapport au traitement témoin qui se fait en l'absence de tout antibiotique- La réduction du pH est un peu meilleure qu ' avec la polymyxine utilisée comme dans l'exemple 8.
Ia diminution de la densité après 24 heures et après 36 heures est au moins aussi bonne que la diminution de la densité que l'on obtient quand on utilise la polymyxine dans le moût.
Le nombre de bactéries reste inférieur à 2. 000 pendant les quatre derniers jours de la fermentation. La suppression des odeurs et goûts indésirables, obtenue avec la polymyxine, a lieu également avec un mélange de polymyxine et de pénicilline. L'effet sinergétique perceptible dans la stimulation de la croissance de la levure est constaté quand on se sert du mélange, mais une meilleure amélioration est obtenue en ce sens que la con- tamination bactérienne, à la fin de la fermentation du moût, est rendue inférieure, de sorte qu'on réalise une amélioration qui est plus grande que lorsqu'on utilise la polymyxine seule.
Pour chacun des exemples I à XI donnés ci-dessus, pour la mise en oeuvre de l'invention, les antibiotiques sont ajoutés, à l'état pur, tels qu'on les trouve dans le commerce. Il est préférable que les antibiotiques soient aussi purs qu'il est possible de les obtenir car le contrôle du processus de fermentation nécessite que l'activité fermentative de la levure soit troublée au minimum quand la levure réagit avec le milieu fermentable. Par ailleurs, on désire éviter toutes opérations additionnelles, telles qu'une filtration ou une clarification dans l'installation, car on a constaté que celles-ci peuvent être évitées en veillant, très soigneusement à ce que les matières soient pures et à ce que le traitement se fasse dans des conditions de propreté excellentes.
En tenant compte de ces nécessités, l'invention peut être réalisée également en se servant d'antibiotiques incoporés dans un support ou véhicule qui peut être une matière solide stérile ou un liquide aqueux stérile. Pour constituer ces supports solides on peut se servir de terres diatomées, de charbon activé, de talc ou analogue. Par exemple, une composition comprenant un liquide stérile ou un support solide stérile ne contient, de préférence, pas plus qu'environ 1,5 g de polymyxine et environ 3,0 g de pénicilline pour servir à une fermentation qui nécessite environ 181 kg de levure. Si l'on se base sur 45 kg de levure, la composition contient environ 0,4 g de polymyxine et environ 0,75 g de pénicilline.
La quantité de levure nécessaire pour la fermentation des breuvages maltés et des moûts d'alcool (wisky) est bien connue et expliquée. En exprimant les doses unitaires des antibiotiques, polymyxine et pénicilline en fonction de ces quantités de levure nécessaires pour trois fermentations, on dispose d'un moyen simple et aisé pour régler l'activité de la levure dans ces
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fermentations, même si les antiblotiques peuvent être ajoutés au moût ou à la. décoction avant son inoculation avec la levure ou après l'inoculation ou même à la levure elle-même.
La filtration de la bière ordinaire, de la bière claire ou du moût permet la séparation d'un résidu solide contenant la levure et les an- tibiotiques et ce résidu a des qualités excellents comme nourriture pour le bétail et la volaille. Le résidu végétal contient un principe, favori- sant la croissance, qui est contenu dans la levure et la polymyxine, ainsi que les vitamines qui font partie de la levure. Le résidu peut être utili- secomme supplément de nourriture avec toutes les protéines végétales comme celles dérivées de la farine de soja ou d'arachides et analogues.
Une référence à la réduction du pH pendant une fermentation normale de la bière et sa relation avec l'augmentation dans la production d'alcool peut être trouvée dans un article intitulé : Experiments on Bottom Fermentation 1. Methodology par Erik Helm et Birger Trolle dans les Waller- stein Labcratories Communications 10 p. 87-98 (1947).