BE530419A

BE530419A -

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Publication number: BE530419A
Authority: BE

Description


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   La présente invention concerne un nouvel antibiotique et son procédé de préparation. 



   Le nouvel antibiotique selon la   présente   invention, que l'on appelle dans ce qui suit spiramycine, peut etre obtenu à partir des cultu- res par fermentation d'un micro-organisme particulier décrit ci-après. Il n'a pu être obtenu jusqu'ici à l'état cristallisé. En tant que base il se présente sous forme d'une poudre amorphe, blanche; ses sels d'addition acides, par exemple le sulfate et le chlorhydrate, peuvent être isolés à l'état solide. La base est soluble dans le chloroforme, les solvants chlo- rés, les alcools, l'hexane, le benzène, les cétones et les acétates d'éthy- le et d'amyle. Le sulfate est soluble dans l'eau et les alcools aliphati- ques inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol, le butanol.

   L'analyse élé- mentaire de la base montre qu'elle contient seulement les éléments   C,H;O   et N; plusieurs analyses effectuées sur des échantillons de base ont donné les valeurs suivantes: 
Carbone : 60 à 61 % 
Hydrogène : 8,9 à 9,4% 
Oxygène 25,5 à 27 % 
Azote 3,3 à 3,6% 
Par distribution à contre-courant avec 60 tubes suivant   la métho-   de de Craig, en utilisant le cyclohexane et une solution aqueuse de spiramy- cine renfermant 1% de phosphate disodique, on a pu mettre en évidence la pré- sence de 3 constituants;

   cependant ces trois corps paraissent extrêmement voisine du point de vue composition, propriétés chimiques et activité anti-   bactérienne.   Les poids moléculaire de la base, calculé à partir de son équi- valent neutre ou par dosage des ions sulfate sur le sulfate, est compris en- tre   (400)n   et   (450)n .   La détermination du poids moléculaire par la méthode de Rast semble indiquer que n = 2. La teneur en azote donne également un chiffre compris dans ces limites, ce qui indique que tout l'azote est basi- que.

   La base donne des tests négatifs dans les réactions suivantes : réaction de Sakaguchi, réaction de Molish, réaction   à   la ninhydrine, réaction à la ninhydrine après hydrolyse acide, réaction à la liqueur de   Fehling,   réaction du biuret, réaction du maltol ferrique, réaction du maltol ferrique après hydrolyse alcaline. Avec les acides forts concentrés, elle donne une colora- tion   rose-violet.   La base est optiquement active et ses solutions dans le   chloroforme ou l'alcool éthylique sont lévogyres [[alpha]]D20 = - 72  (c = 2 %, éthanol) pour un produit spécialement purifié.

   Son spectre d'absorption (solution dans l'alcool éthylique) dans l'ultra-violet présente un seul maximum à 231 m  (E 1%11cm = 346 pour un échantillon spécialement purifié) ce qui la différencie de l'erythromycine (280 m ) et de la carbomycine (240 m  ),   dont elle se rapproche par son spectre antibactérien. Elle se différencie également de ces deux antibiotiques en ce sens que des germes rendus résis- tants à la spiramycine conservent une sensibilité partielle à l'érythromy- cine et à la carbomycine.

   La spiramycine est surtout active vis-àvis des germes Gram positifs, mais est peu active   vis-à-vis   des germes   Gratn   négatifs; elle possède également une certaine activité sur   les mycobactéries.   Elle est très active vis-à-vis des germes anaérobies et, en particulier, de Clostri- dium septicum et Clostridium   histolyticum.   Le tableau I résume le spectre antibactérien d'un échantillon spécialement purifié, l'activité étant déter- minée en milieu liquide. 

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 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Résistance <SEP> Incubation <SEP> Activité
<tb> Souches <SEP> éventuelle <SEP> Incubation <SEP> mcg/cm3
<tb> 
 
 EMI2.2 
 ###############..... --------- --....---------- ¯¯¯¯¯¯¯-.,... ####-## - ¯¯, ¯¯¯¯ 
 EMI2.3 
 
<tb> 
<tb> Staphy.aureus <SEP> 209 <SEP> p. <SEP> - <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 37 ' <SEP> 1,4
<tb> " <SEP> " <SEP> B3 <SEP> Pénicillinestreptomycine <SEP> " <SEP> 3,5
<tb> " <SEP> " <SEP> 2700 <SEP> R <SEP> 16 <SEP> Streptothricinestreptomycinenéomycine <SEP> . <SEP> " <SEP> 1,6
<tb> " <SEP> " <SEP> Hb <SEP> chlortétracyclineoxytétracycline. <SEP> " <SEP> 1,6
<tb> " <SEP> " <SEP> Beaujon <SEP> 3 <SEP> chlortétracyclineoxytétracycline <SEP> - <SEP> 
<tb> chloramphénicolpénicilline <SEP> - <SEP> 
<tb> streptomycine.

   <SEP> " <SEP> 1,6
<tb> Klebs.pneumoniae
<tb> ATCC <SEP> 9997- <SEP> Il <SEP> 33
<tb> Bac.cereus <SEP> ATCG <SEP> 6630 <SEP> - <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 28  <SEP> 2,7
<tb> 
 
 EMI2.4 
 hlicro,citreus - 16h à 37  5,1 Sarc ,lutea ATCC 9341 - 40h à 28  0,8 
 EMI2.5 
 
<tb> 
<tb> Strept. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 37  <SEP> 1
<tb> " <SEP> Il
<tb> ATCC <SEP> 9790 <SEP> - <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 37  <SEP> 1
<tb> 
 
 EMI2.6 
 Strept. hemo1yticus - I6h a o,6 Strept. viridans - n 3,1 Diplo .pneonias - 1 0,2 
 EMI2.7 
 
<tb> 
<tb> SOUCHES <SEP> Résistance <SEP> Incubation <SEP> Activité
<tb> éventuelle <SEP> Incubation <SEP> mcg/cm3
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> - <SEP> 40h <SEP> à <SEP> 37  <SEP> 10,3
<tb> Mycobact. <SEP> Sp.

   <SEP> ATCC <SEP> 607 <SEP> - <SEP> " <SEP> 85
<tb> 
 
 EMI2.8 
 '1 38 li NR Néomycine it 38 
 EMI2.9 
 
<tb> 
<tb> " <SEP> SR <SEP> Streptomy- <SEP> " <SEP> 38
<tb> cine
<tb> 
 
 EMI2.10 
 Corynebact.pseudodiphte- 
 EMI2.11 
 
<tb> 
<tb> ricum. <SEP> - <SEP> " <SEP> 3,5
<tb> Bac, <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633- <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 37  <SEP> 3,75
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica
<tb> CN-387 <SEP> - <SEP> " <SEP> 75
<tb> 
 
 EMI2.12 
 Bac. mycoides - 16h va 28*= 2,3 Mycobact, phlei - 40h va 3 70 33 " patasuegnatis - " 166 
 EMI2.13 
 
<tb> 
<tb> Gaff. <SEP> tetragena- <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 37  <SEP> 0,8
<tb> 
 

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In vivo chez la souris, la spiramycine est très active, par voie orale et sous-cutanée, sur les infections à streptocoque, pneumocoque et staphylocoque, pour de faibles fractions des doses maximum tolérées.

   Elle s'est révélée active comme   antimalarique   dans le traitement de l'infection à P. Bergnei de la souris. Elle possède également une activité curative et préventive sur les infections à rickettsies de la souris. Sa toxicité est très faible chez la souris, elle est bien tolérée par voie orale à la dose   de 5 g/kg. La dose léthale pour 50% des animaux (DL5) est de 1,5 à 2,5 g/kg par voie sous-cutanée et de 0,15 à 0,25 g/kg par voie intraveineuse.   



   L'organisme qui produit le nouvel antibiotique selon l'invention est une espèce, du genre Streptomyces et il sera appelé ci-après S.3486 ou "Streptomyces 3486" ( de même que ses mutants, sauf si le contexte ne le permet pas). 



   Ce microorganisme a été isolé d'un échantillon de terre provenant d'un champ aux environs de Péronne dans le département de la Somme (France);   la méthode d'isolement a été la suivante : unéchantillon de terre a été mis   en suspension dans de l'eau distillée stérile, la suspension a été diluée et une petite quantité de cette suspension étalée sur une   boîte   de Pétri renfer- mant de la gélose nutritive. Après incubation de 7 jours à 28  la colonie de 
Streptomyces   3486   a été prélevée au moyen d'un fil de platine et utilisée pour ensemencer des tubes de gélose nutritive inclinée pour obtenir de plus grandes quantités de cet organisme. 



   Cette souche de Streptomyces   3486   a été déposée au Northern Re- gional Research Laboratory   (NRRL)   à Peoria 5, Illinois, Etats-Unis, sous ré- férence NRRL 2420. 



   En utilisant la classification du Bergey's Manual of déterminative Bacteriology (6e édition   1949)   pour le genre   Streptomyces,   cet organisme peut être rapproché du Sreptomyces griseolus, primitivement décrit par Waks- man sous le nom   d'Actinomyces   96 [Soil Science 8, 121 (1919)]. Comme on le verra par la suite, il existe certaines différences entre l'organisme décrit par   Waksnan   et le S.   3486,   de sorte qu'on ne peut assimiler les deux Strep- tomyces à une même espèce. Quelques propriétés de S.3486, en particulier la production d'un pigment brun en milieu synthétique et sur   pomme   de terre, permettraient également de le classer près du   Streptomyces   fimicarius.

   Ce- pendant la production de pigment par S.3486 est dans ces deux cas, extrême- ment faible et il diffère de S.   Fimicarius par   un certain nombre d'autres caractères. Enfin la souche   S.3486   a montré des propriétés variables au cours des essais d'identification et la description donnée ci-dessous correspond aux caractères les plus fréquemment observés. 



  Morphologie microscopique - 
Cultivée sur gélose de Czapek au glucose, cette souche produit des filaments ramifiés. Dans des conditions favorables d'ensemencement, on peut observer rapidement la formation de chaînes de spores qui se rattachent aux filaments principaux soit isolément, soit rassemblées en arborescences. 



  La forme des filaments sporulés peut être simplement recourbée, ou en vrille, ou irrégulièrement contournée. A l'aisselle des filaments sporulés on rencon- tre fréquemment des éléments non segmentés en forme de vrille   à   plusieurs spires serrées. Les spores ont en général une forme variable, d'ovale courte, à sphérique. 



  Forme des colonies - 
Des cultures monospores sur gélose à l'asparagine présentent des colonies rondes dont la taille peut varier selon ledegré de développement, 
Dans le cas d'ensemencement dense, les colonies restent petites, rondes, hémisphériques et peuvent présenter dans certains cas une dépression centrale plus ou moins accusée. La sporulation est rapide et s'étend en gé- néral sur la colonie entière ou sur le pourtour avec tendance à former des 

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 arborescences autour de la colonie. La couleur du mycélium aérien d'abord blanche, vire au gris au moment de la sporulation. 



   Dans le cas où les colonies sont peu nombreuses, leur forme peut être variable, mais l'aspect le plus fréquement observé est celui d'une colonie ronde pouvant atteindre 10 mm de diamètre. Le mycélium végétatif jaunâtre, à bords lobés, forme des plis profonds suivant les rayons et plusieurs bourrelets concentriques laissant en général une dépression au centre de la colonie.Des craquelures se produisent le long dès plis, en particulier au centre de la colonie,montrant l'envers du mycélium végétatif. Le mycélium aérien d'abord blanc ( très légèrement teinté de jaune-rosé pâle) prend rapidement une teinte grise au moment de la sporulation qui peut se produire plus intensément sur la partie externe de la   colonie.   



  Caractères culturaux - Propriétés biochimiques 
Les caractères culturaux et les réactions biochimiques sont donnés dans le tableau ci-dessous. Les milieux de culture utilisés ont été préparés pour la plupart d'après des formules publiées par S.A.   Waksman   dans "The Actinomycates" ( 1950. Ghronica Botanica Company.   Waltham..   Mass. U.S. 



  A. p .193 à   197)'.   



   Les numéros donnés aux différents milieux dans "The Actinomyce-   teslt   ont été conservés ici. 

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  1 )Caractères culturaux. 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Milieux <SEP> Mycélium <SEP> Mycélium <SEP> Sporulation <SEP> Exopigment
<tb> végétatif <SEP> aérien
<tb> Gélose <SEP> Jaunâtre <SEP> à <SEP> gri- <SEP> Blanc <SEP> vi- <SEP> Rapide <SEP> Très <SEP> faible,
<tb> synthéti- <SEP> sâtre <SEP> se <SEP> déve- <SEP> rant <SEP> au <SEP> brun <SEP> jaunâ-
<tb> ,que <SEP> (milieu <SEP> loppant <SEP> presque <SEP> gris <SEP> au <SEP> mo- <SEP> tre
<tb> de <SEP> Czapek) <SEP> uniquement <SEP> sous <SEP> ment <SEP> de <SEP> la
<tb> (n .l) <SEP> la <SEP> surface, <SEP> La <SEP> sporulation
<tb> pousse <SEP> au-dessus <SEP> de <SEP> la <SEP> surface <SEP> est <SEP> limitée <SEP> presque <SEP> entièrement <SEP> au <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> Gélose <SEP> Jaunâtre <SEP> à <SEP> Blanc <SEP> Plus <SEP> tardive <SEP> Très <SEP> faible,

  
<tb> synthéti- <SEP> orangé <SEP> jaunâtre <SEP> grisâtre <SEP> brun <SEP> rougeque <SEP> au <SEP> glu- <SEP> âtre
<tb> cose.
<tb> 



  Gélose <SEP> à <SEP> Jaunâtre, <SEP> lobé <SEP> Blanc <SEP> Gris,à <SEP> légè- <SEP> Faible
<tb> l'aspara- <SEP> re <SEP> tendance <SEP> jaune-brun.
<tb> gine <SEP> (n 3) <SEP> jaune-verdâtre. <SEP> Peut
<tb> former <SEP> des
<tb> arbôrescences <SEP> sur <SEP> les
<tb> bords <SEP> de <SEP> la
<tb> colonie.
<tb> 
 Gélose au   mala-développement   rapide semblable à celui sur milieu syn- 
 EMI5.2 
 
<tb> 
<tb> te <SEP> (n .1) <SEP> Pas <SEP> d'éxopigcium <SEP> ment.
<tb> 



  Gélose <SEP> à <SEP> la <SEP> développement <SEP> à <SEP> peu <SEP> près <SEP> nul <SEP> Pas <SEP> d'exopigTyrosine <SEP> ment.
<tb> 



  (no.4)
<tb> Bouillon <SEP> Pousse <SEP> moyenne <SEP> Très <SEP> peu <SEP> Jaune <SEP> ambré
<tb> glucosé <SEP> jaunâtre <SEP> développé <SEP> faible <SEP> ou <SEP> pas
<tb> (n  <SEP> 16) <SEP> de <SEP> pigment.
<tb> 



  Bouillon <SEP> Jaune <SEP> ambré <SEP> Blanc <SEP> sur <SEP> Jaune <SEP> brun
<tb> peptoné <SEP> gé- <SEP> les <SEP> bords <SEP> faible <SEP> ou <SEP> pas
<tb> losé <SEP> (n .5) <SEP> de <SEP> la <SEP> cul- <SEP> de <SEP> pigment.
<tb> ture
<tb> Gélose <SEP> Jaunâtre <SEP> Peu <SEP> déve- <SEP> Présence <SEP> ou <SEP> faible, <SEP> brun
<tb> peptonée <SEP> lopé <SEP> blan- <SEP> absence <SEP> sui- <SEP> jaunâtre <SEP> ou
<tb> glucosée <SEP> chatre <SEP> vant <SEP> les <SEP> cul- <SEP> pas <SEP> de <SEP> pigtures;gris <SEP> ment.
<tb> jaunâtre <SEP> si
<tb> présence.
<tb> 



  Milieu <SEP> Jaune <SEP> orangé <SEP> à <SEP> Blanc <SEP> plus <SEP> Présence <SEP> ou <SEP> faible, <SEP> brun
<tb> d'Emerson <SEP> jaune <SEP> brun <SEP> développé <SEP> absence <SEP> sui- <SEP> jaunâtre <SEP> ou
<tb> sur <SEP> les <SEP> vant <SEP> les <SEP> cul- <SEP> pas <SEP> de <SEP> pigbords <SEP> de <SEP> la <SEP> tures, <SEP> gris <SEP> ment,
<tb> culture <SEP> @ <SEP> jaunâtre <SEP> si
<tb> présence.
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Pomme <SEP> de <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> à <SEP> Surface <SEP> pou- <SEP> Présence <SEP> ou <SEP> Variable,brun
<tb> terre. <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> sui- <SEP> dreuse <SEP> à <SEP> re- <SEP> absence <SEP> sui- <SEP> faible <SEP> à <SEP> brun
<tb> vant <SEP> les <SEP> cultu- <SEP> flet <SEP> grisâ- <SEP> vant <SEP> les <SEP> cul- <SEP> rougeâtre <SEP> poures. <SEP> tre. <SEP> tures,grisâ- <SEP> vant <SEP> colorer
<tb> tre. <SEP> le <SEP> fragment <SEP> de
<tb> pomme <SEP> de <SEP> terre
<tb> et <SEP> l'eau <SEP> du
<tb> fond <SEP> du <SEP> tube.
<tb> 
 



  2 ) Propriétés.biochimiques.- Lait - A 26 : culture formant voile. Peptonisation partielle en un mois sans coagulation apparente. La zone peptonisée prend une teinte orangé brun ou rougeâtre. Sur lait au bromocrésol pourpre : pH inchangé ou évolu- ant vers l'alcalinité suivant les cultures. 



   A 37 : développement moins bon. Floculation occasionnelle, peptonisation partielle. 



  Gélatine - (Formules Nos.7 et 8 de   Waksman).   



  Liquéfaction moyenne. Voile jaunâtre et flocons jaunâtres dans la partie liquéfiée. Pigment: variable, brun orangé faible dans la partie liquéfiée, plus accusé sur le milieu   glucosé.   



  Nitrites - La réduction des nitrates en nitrites se produit en milieu synthétique (en présence de saccharose). En milieu organique, les réactions de recherche des nitrites sont négatives. 



  Utilisation de différentes sources de carbone - 
Ces essais ont été effectués en utilisant la méthode de Pridham et Gottlieb [J. Bact. 56. 107 - 114 (   1948)    J.   



  Eléments bien utilisés: glycérine, arabinose, glucose, galactose, lévulose, mannose, lactose, rhamnose, amidon, mannitol. 



  Eléments utilisés plus lentement ( cultures bien développées mais plus tardives) ou de façon irrégulière: xylose, saccharose, maltose,   inositol.   



  Eléments non utilisés! raffinose, érythritol, dulcitol, sorbitol. 



  Comparaison entre le S.   Griseolus   et le S.3486 - 
Le tableau ci-dessous réunit quelques uns des caractères qui permettent de rapprocher ou de différencier la souche   de 8.   Griseolus décrite par   Waksman   et la souche productrice de spiramycine. 

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 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Streptomyces <SEP> griseolus <SEP> Souche <SEP> 3486
<tb> Morphologie <SEP> Spirales <SEP> non <SEP> observées. <SEP> Présence <SEP> de <SEP> spirales
<tb> microscopique <SEP> Spores <SEP> ovales <SEP> à <SEP> sphéri- <SEP> Spores <SEP> ovales <SEP> à <SEP> sphéques. <SEP> riques.
<tb> 



  Agar <SEP> synthétique <SEP> Prédominance <SEP> du <SEP> mycélium <SEP> Prédominance <SEP> du <SEP> mycéaérien <SEP> gris. <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pig- <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> gris. <SEP> Pigment <SEP> soluble. <SEP> ment <SEP> soluble <SEP> très <SEP> faible, <SEP> jaune <SEP> brun.
<tb> 



  Bouillon <SEP> glucosé <SEP> Pigment <SEP> brun <SEP> faible <SEP> ou <SEP> nul. <SEP> Pigment <SEP> jaune <SEP> ambré <SEP> ou
<tb> nul.
<tb> 



  Gélatine <SEP> Liquéfiée. <SEP> Pellicule <SEP> Liquéfiée; <SEP> Pigment
<tb> jaunâtre, <SEP> jaune <SEP> brun <SEP> faible.
<tb> 



  Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Crème <SEP> à <SEP> noir. <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé.
<tb> 



  Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> devenant <SEP> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> colorée
<tb> brune, <SEP> en <SEP> brun.
<tb> 



  Lait <SEP> Coagulé, <SEP> peptonisé. <SEP> à <SEP> 26 : <SEP> Peptonisé <SEP> sans
<tb> coagulation <SEP> apparente.
<tb> 



  Nitrates <SEP> Réduits <SEP> en <SEP> nitrites. <SEP> Réduits <SEP> en <SEP> nitrites.
<tb> 



  Pigment <SEP> Formation <SEP> d'un <SEP> pigment <SEP> Formation <SEP> d'un <SEP> pigment
<tb> brun <SEP> faible, <SEP> jaunâtre <SEP> à <SEP> brunâtre
<tb> faible.
<tb> 
 



   Selon un mode de réalisation de l'invention, un procédé pour la préparation de la spiramycine comporte l'ensemencement d'un milieu nutritif aqueux avec une culture de la souche S.3486, la fermentation aérobie, et la séparation à partir du milieu de culture, de la spiramycine ainsi formée. 



  Le milieu de culture contient également un antibiotique déjà décrit dans la littérature [COSAR, NINET, PINNERT, PREUD HOMME, C.R. 234 ,  1498   ( 1952)] et auquel a été donné le nom de congocidine [DESPOIS et   NINET,   6ème congrès international de microbiologie, Rassunti delle communicazioni, vol. I, p. 



  162 (1953)], qui ne possède pas les mêmes propriétés intéressantes que la spiramycine et qui peut être isolé sous forme cristalline. La séparation des deux antibiotiques est faite facilement   comme   décrit en détail ci-après. 



   La culture par fermentation du S. 3486 peut être faite en sur- face, mais on préfère généralement faire la fermentation en culture   submer-   gée. 



   La fermentation peut en particulier être conduite suivant le sché- ma : 
Culture sur agar   #   
Culture en erlenmeyers agités   #   
Inoculum en fermenteurs   Culture productrice fermenteurs Culture productrice en fermenteurs   
Le milieu nutritif contient, en commun avec les milieux dans les- quels sont cultivés d'autres champignons pour la préparation de substances antibiotiques, une source de carbone assimilable, une source d'azote organi-   que ou minéral assimilable,. certains sels minéraux tels que des phosphates, et des traces de différents métaux qui se trouvent normalement à l'état   

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 d'impuretés dans les autres constituants du milieu. 



   Gomme source de carbone assimilable on peut utiliser des lipides ( huiles végétales ou animales), différents polyols (glycérol) et de préférence, des hydrates de carbone assimilables, tel qu'amidon ordinaire,   amidon   soluble, des sucres tels que sucrose, glucose, maltose de textrose et d'autres hydrates de carbone solubles ou partiellement solubles dans l'eau tels que les sucres-alcool. Comme source convenable d'azote assimilable, on peut utiliser une grande variété de substances telles que aminoa- cides, caséine hydrolysée ou non, farine de poisson, farine de soja, extraits de viande, liver cake, distillers soubles, extraits de levures ou autolysats et différentes autres substances azotées d'origine végétale ou animale.

   Comme source d'azote on peut également ajouter au milieu nutritif des substances chimiques comme l'urée, des.nitrates et des sels d'ammonium. 



    On   a trouvé que le corn steep, à cause de la grande variété des substances tant organiques que minérales qu'il contient, est un adjuvant intéressant du milieu de fermentation. Il est préférable également d'ajouter au milieu des sels minéraux essentiels, tels que sels de sodium ( par exemple chlorure), de calcium ( carbonate), etc.. 



   Le pH du milieu avant stérilisation est amené sensiblement à neu- tralité et de préférence entre 6 et 7. La fermentation est conduite à une température de 24 à 28  et de préférence à 26 . L'évolution de la culture productrice n'est pas très rapide; on peut, cependant, la sonsidérer comme terminée après 3   à 4   jours. Les principales caractéristiques sont: d'abord une baisse de pH jusque vers 6,   4,   puis, après 30 heures environ, une remontée du pH jusque vers 7,5 et parfois au-delà. Il semble que cette remontée coïncide avec la fin de la consommation du glucose. L'activité antibiotique due à la spiramycine est régulièrement croissante dès le début de la fermentation.

   Bien que l'aération ne soit pas un facteur critique et puisse varier dans d'assez larges limites, il est préférable d'opérer avec une aération de 0,5 à 2 litres d'air par litre de bouillon et par minute. 



   La spiramycine peut être isolée des jus de fermentation par différentes méthodes. La méthode qui s'est révélée jusqu'ici préférable est l'extraction par un solvant. On peut utiliser un solvant qui laisse dans le moût résiduaire les substances formées simultanément au cours de la fermentation telles que, par exemple, la congocidine. On peut également utiliser un solvant qui extrait une partie de ces impuretés que l'on élimine au cours des traitements suivants. Cette extraction est effectuée après filtration du moût de fermentation en présence d'agents de filtration à pH compris entre 7 et 9.

   On fait l'extraction à un pH compris entre 8 et 11 et de préférence à pH 9 au moyen d'un solvant non miscible à l'eau appartenant aux groupes des alcools (et en particulier le butanol), des cétones aliphatiques   (méthyléthylcétone,   méthylisobutylcétone..), des carbures aliphatiques halo- 
 EMI8.1 
 génés (chloroforme), des carbures aromatiques benzène)etçèesters comme l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'amyle. La solution ainsi obtenue est ensuite extraite par de l'eau à pH acide (inférieur à 4 et de préférence entre 2 et 3). L'extrait aqueux est ensuite concentré, extrait à pH 9 par du chlo-   roforme   ou du benzène. La solution organique est ensuite concentrée,   deshy-   dratée, amenée à pH 5 avec de l'acide sulfurique et le sulfate de l'antibiotique est précipité par l'éther. 



     On   peut également concentrer directement l'extrait organique primaire, extraire à l'eau à pH 2 et traiter ensuite cette solution aqueuse comme précédemment. Le sulfate brut ainsi obtenu peut être ensuite purifié par extractions successives avec des solvants organiques ou avec de l'eau ou par chromatographie. 



   Les exemples suivants, à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en oeuvre. L'unité arbitraire choisie est la plus petite quantité d'un certain produit purifié, qui, dissoute dans 1 cm3 d'un milieu de   culture   approprié, inhibe le développement du staphylocoque doré 
 EMI8.2 
 ...,rè.x.t r--t I . 

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 ( souche F.D.A. 209 P); pour le produit considéré, cette quantité est égale à 1 micro gramme. 



    EXEMPLE   1.-
40 litres du milieu suivant : 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> - <SEP> Corn-steep <SEP> (extrait <SEP> sec <SEP> 50%............ <SEP> 4 <SEP> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> 2 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium................... <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium..................... <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> ................... <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> "
<tb> 
 sont chargés dans un fermenteur de 75 litres. Le pH est ajusté à 7,0 et le mélange stérilisé à 120  pendant   45   minutes.

   Après refroidissement à 26 , le milieu est ensemencé avec 250 cm3 d'une culture en erlenmeyer agité de S.   3486.   La culture en fermenteur est aérée et agitée pendant 25 heures et sert à ensemencer la culture productrice. 



   Celle-ci est effectuée en fermenteur de 350 litres chargé avec 200 litres du milieu suivant : 
 EMI9.2 
 
<tb> 
<tb> - <SEP> Glucose................................. <SEP> 2 <SEP> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> .......................... <SEP> 4 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Distilleras <SEP> solubles.................... <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium....................... <SEP> 2 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium.................... <SEP> 1 <SEP> % <SEP> "
<tb> 
 
Le pH avant stérilisation est à 6,8. L'évolution de la culture productrice n'est pas très rapide, on peut cependant la considérer comme terminée après 3 à 4 jours à 26  avec une aération de 12 m3/heure et une agitation de 400 tours/minute.

   On note d'abord une baisse du pH jusqu'à 6,   4   puis, à partir de 30 heures environ, une remontée du pH jusque vers 7,5. 



  Au bout de 4 jours, l'activité obtenue est de 92   unités/çm3.   



  EXEMPLE 2.- 
Dans un fermenteur de 350 litres, on charge 200 litres du milieu suivant: 
 EMI9.3 
 
<tb> 
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> ................................ <SEP> 1 <SEP> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Corn-steep <SEP> (50% <SEP> extrait <SEP> sec)........... <SEP> 3 <SEP> % <SEP> Il
<tb> - <SEP> Phosphate <SEP> monopotassique............... <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium................... <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> ..................... <SEP> 2 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium................... <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> "
<tb> 
 
Le pH est ajusté à   7,0   avec de la soude et le milieu est stérilisé   45   minutes à 120 . Le milieu est ensuite amené à 26 , puis ensemencé comme dans l'exemple 1.

   La fermentation est alors aérée et agitée. L'activité maximum est obtenue en 60 heures et est de 129   u/cm3.   



  EXEMPLE 3.- 
Une fermentation est conduite comme dans l'exemple 2, mais le glucose est remplacé par   2%   de saccharose et la quantité de corn-steep ramenée à 2% ( en poids). 



   Dans ces conditions, l'activité maximum est de 90 u/cm3 en   40   heures. 



  EXEMPLE   4.-   
Dansun fermenteur de 30 litres, on charge 15 litres du milieu suivant : 
 EMI9.4 
 
<tb> 
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> ............................... <SEP> 3 <SEP> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Autolysat <SEP> de <SEP> levure.................... <SEP> 1 <SEP> % <SEP> "
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium..................... <SEP> 2 <SEP> % <SEP> "
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 
 EMI10.1 
 
<tb> 
<tb> - <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium................... <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> 
 
 EMI10.2 
 - Phosphate monopoassiqu'3................ 05l % Il 
 EMI10.3 
 
<tb> 
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium....................

   <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> "
<tb> 
 
Le pH est ajusté à 7,0 avec de la   sauae   et après stérilisation et refroidissement à 26 ,le milieu est ensemencé avec 1 litre d'une culture inoculum en fermenteur sur le milieu au corn-steap précéaemment décrit. On obtient 144 u/cm3   en 4   jours de culture. 



  EXEMPLE   5 . -  
210 litres de moût de culture à pH 8 sont additionnés de 10 kg d'adjuvant de filtration (Supercel Hyflo) et filtrés sur filtre-presse. Le gâteau de filtration est lavé par 50 litres d'eau. Le filtrat, représentant 230 litres, contenant 15, 8 millions   d'unités,   est alcalinisé à pH 9 au moyen de solution de soude à 10% et extrait par 46 litres de méthyl-isobutylcétone. Le solvant est séparé et la phase aqueuse   réextraite   par 23 litres de méthylisobutylcétone. Après   décantation   les deux extraits sont mélangés et lavés par 6 litres d'eau alcalinisée à pH 9.

   L'antibiotique contenu par le solvant est extrait par de l'eau à la température de 5 , le pH étant abaissé à 3 par de l'acide phosphorique en solution à 5%; en réalisant cette extraction par 8 litres et 3 fois   4   litres d'eau, la totalité   ae   l'antibiotique est retrouvée dans la phase aqueuse. La solution aqueuse ajustée à pH 6,5 par de la soude diluée est concentrée sous vide à une température ne dépassant pas 35 . On obtient alors 1750 cm3 de solution renfermant 14,6 millions d'unités. L'antibiotique est extrait de la solution aqueuse alcalinisée à pH 9 successivement par 1 litre et deux fois 0,5 litre de benzène. 



  L'extrait benzénique est concentré sous vida à température ne dépassant pas 30  jusqu'à ]De cm3, on ajoute 10C cm3 d'alcool butylique normal et ajuste le pH à 5 par addition de solution demi-normale d'acide sulfurique dans le butanol. La solution est concentrée à nouveau à 10C cm3 et le sulfate de   l'antibiotique   précipité par 2 litres d'éther. Le   sulfate précuite   sous forme de poudre blanche est essorée lavé à l'éther et séché. 



   On obtient 9,6 g de sulfate titrant   1320   u/mg, ce qui correspona à un rendement de   80%.   



  EXEMPLE   6. -   
185 litres de moût de culture sont filtrés, comme dans l'exemple 5. Le filtrat,représentant 155 litres, contenant 12,4 millions d'uni- 
 EMI10.4 
 tés9 est alcalinisé"à pH 9 par addition ae lessive de soude à 2c,% et extrait, successivement par   40   litres et   20   litres de butanol normal. Les extraits butyliques réunis sont concentrés sous   viae   à 10 litres, la température ne dépassant pas 30 . La solution butylique est extraite successivement par 8 litres et   aeux   fois 3 litres d'eau, le pH étant abaissé à 2 par de 11 acide sulfurique. La solution aqueuse ajustée à pH 6,5 par une solution de. soude est concentrée sous vide à 150C cm3 à une température ne dépassant pas 30 ; la solution aqueuse renferme alors 8 millions d'unités. 



   La solution aqueuse alcalinisée à pH 9 est extraite par le chloroforme (3 fois   700   cm3). Les extraits chloroformiques sont concentrés sous vide et traités comme dans l'exemple 1. 



   On obtient 7, 4 g d'antibiotique sous forme de sulfate titrant 746 u/mg, soit un rendement dé   44%.   



    EXEMPLE   7.- 
30 g de sulfate d'antibiotique brut sont dissous aans   70C   cm3 d'eau, le pH est amené à 9 par addition de soude et l'extraction effectuée 
 EMI10.5 
 avec trois òis.3ÇC;ez3-àe'begzµDB. Les extraits benzét,2n,gcnt ' , aves.-pa:r: 'cm.3 d' aü pH9 dt-'4" 0.!J. ôvapp¯qév,it à&i*%éÔé'.Éli$%7iç' ratura. 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 



     On   obtient 24,2 g de spiramycine base titrant 2150 u/mg.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S, 1 - La spiramycine et ses sels d'addition acides.

2 - Une substance antibiotique au groupe consistant en une base azotée et sés els formés avec les acides, la base ayant les propriétés sui- vantes : un poids moléculaire entre (4CO)n et (450)n, n'étant vraisembla- blement égal à 2, un pouvoir rotatoire lévogyre en solution alcoolique [[alpha] 20= - 70 à - 75 (c = 2%, éthanol)], la composition approximative sui- vante:

C = 60 à 61 H = 8,9 à 9,4 % 0 = 25,5 à 27 % N = 3,3 à 3,6 % un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 231 m en solution alcoolique (E 11 % étant voisin ae 350 ). cm 3 - Le sulfate de la base azotée définie dans la revendication 2, 4 - Le procédé pour la production de la spiramycine qui compor- te la culture aérobie d'une souche de Strepomyces 3486 productrice de spi- ramycine dans un milieu contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux jusqu'à ce qu'une activité antibiotique substan- tielle soit produite par ledit organisme dans ledit milieu de culture et la récupération de la spiramycine à partir dudit milieu de culture.

5 - 'Un procédé selon la revendication 4. dans lequel le milieu de culture'contient des sources assimilables- de carbone, d'azote et des sels minéraux et dans lequel l'organisme producteur de spiramycine est cultivé en culture submergée aérobie. , ' ' 60 - Un procédé selon la revendication 5 dans lequel le milieu de culture est maintenu à une température d'environ 24-28 .

7 - Un procédé selon la revendication 5 dans lequel l'organisme est cultivé pendant une période de 3 à 4 jours.

8 - Un procédé selon la revendication 5 qui comporte l'opéra- tion d'extraction au bouillon de culture à pH d'environ 8-11 au moyen d'un solvant non miscible à l'eau.

9 - Un procédé selon les revendications 4 à 8 dans lequel on fait réagir la spiramycine avec un acide pour former le sel correspondant à l'acide.

10 - Les substances antibiotiques produites par le procédé dé- crit dans les exemples 5 à 7.

11 - Une méthode pour la production ae-spiramycine et de ses sels d'addition acides tel que décrit aans les exemples 1 à 7.