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L'invention, concerne la préparation d'un remède de valeur thérapeutique qui est actif contre différentes maladies, en particulier contre les maladies du foie, de la bile et de l'intestin. Il s'agit d'un procédé dans lequel une sorte déterminée de bactérie est cultivée dans des solutions déterminées.. ces solutions de culture étant utilisées comme remède ou traitées pour la préparation d'un remède.
La substance thérapeutiquement agissante de ce remède est constituée lors de la culture et de la croissance d'un micro-organisme, à savoir le bacillus subtilis var. indolasus qui a été isolé d'herbes sur un pré à Murnau-Oberbayern en Allemagne. La description et l'identification du microorganisme selon la clé du "Manual of determinative bacteriology" (manuel de bactériologie déterminative) de Bergey, VI Edition., avec intervention de quelques tests qui n'y sont pas décrits., s'effectuent comme suit.
Le bacillus subtilis var. indolasus appartient à la famille XIII des bacilles de Fischer; genre bacille, espèce bacillus subtilis, variété indolasus.
Souvent, on remarque la présence de deux formes, une forme rugueuse et une forme lisse. Lors de l'isolement et de la culture d'une de ces formes, l'autre forme se reconstitue presque toujours. Les deux formes, séparément, comme aussi en mélange entre elles, peuvent être employées pour la production du remède.
Pour caractériser davantage le bacillus subtilis var. indolasus, on dispose du tableau suivant donné en annexe.
Comme autre caractéristique du bacillus subtilis var. indolasus, on indiquera an particulier l'observation selon l'invention, que par la culture sur un milieu nutritif exempt d'albumine, il ne produit pratiquement pas de corps à action toxique,tandis que toutes les autres variétés de bacillus subtilis soumises au contrôle produisent des corps toxiques même en milieu nutritif exempt d'albumine,
On a trouvé que, pour la production du remède, il faut cultiver le bacillus subtilis var. indolasus sur des milieux nutritifs synthétiques ou dans des liquides nutritifs synthétiques qui ne contiennent pas d'albumine, Ainsi on parvient directement à des produits qui sont pratiquement sans toxicité.
Comme source d'azote, on utilise en premier lieu des sels d'ammonium inorganiques, mais il est possible d'ajouter aussi de faibles quantités d'amino-acides, par exemple d'asparagine et d'alanine, mais pas plus de 0,1 % du milieu de culture, et cette addition est même favorable selon la composition des autres éléments nutritifs. Si le bacillus subtilis var. indolasus est au contraire cultivé sur une matière contenant de l'albumine ou dans des solutions contenant de l'albumine, il y a très souvent formation de corps toxiques qui rendent impossible son emploi comme remède. L'emploi de solutions exemptes d'albumine pour la culture du bacillus subtilis var. indolasus et pour la production du remède est donc une caractéristique particulière de l'invention.
Des solutions de culture ou des terrains de culture appropriés contiennent par exemple du glucose, du fructose, du maltose, du sucre de canne, du chlorure d'ammonium, du phosphate d'ammonium, du phosphate de potassium, du phosphore de sodium, du sulfate de magnésium, de l'alanine, de l'asparagine, du chlorure de calcium, de l'acide citrique, de la glycérine, de la dextrine, de la mannite, de la sorbite, des vitamines, des hormones, de la purines, etc..
L'utilisation, proposée par ailleurs, comme milieux de culture, d'infusions de foin qui naturellement peuvent contenir de l'albumine jusqu'à un certain degré donne par suite au point de vue thérapeutique des résultats très variables. Ces différences s'expliquent par les natures différentes des herbes employées et aussi par des circonstances locales et saisonnières. En particulier pour obtenir des préparations non toxiques,
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il était nécessaire de soumettre les produits à un procédé d'épuration compliqué.
La valeur de pH de la solution de culture - surtout des terrains de culture - doit avant l'ensemencement être de préférence faiblement alcaline, par exemple entre 7 et 8. Il y a particulièrement avantage à ce que les solutions contiennent des composés à action tampon. Malgré un tel effet tampon, la solution devient plus acide pendant la culture et peut présenter à la fin de pH de 6 à 7.
Les bactéries peuvent être cultivées sur des terrains nutritifs solidesen particulier sur des terrains qui contiennent de l'agar-agar mais elles sont cultivées de préférence dans des solutions nutritives li- quides. Une culture de bacillus subtilis var. indolasus dans des conditions anaérobies est bien possible, mais l'activité thérapeutique de telles cultures est plus faible que dans le cas de la culture dans des conditions aérobies,de sorte que cette dernière méthode està préférer, d'autant plus que le développement et la multiplication des bactéries agissent plus rapidement sur l'augmentation de l'efficacité thérapeutique des solutions de culture que dans des conditions anaérobies.
Lors de la culture dans une solution de culture en repos dans des conditions aérobies, le bacillus subtilis var. indolasus croît en un trouble diffus et avec une pellicule superficielle. Par suite, pour la culture en grande quantité, des bacs ou cuves analogues sont avantageux. Il est encore préférable, pour l'obtention de grandes quantités avec emploi de solutions de culture liquides, de cultiver le bacillus subtilis var. indolasus dans une culture submergée, pendant que de l'air stérile est insufflé dans la solution de culture en même temps que cette solution est soumise à un tourbillonnement. On a observé que l'insufflation d'air en une quantité de 0,1 à 1,5 vol. à la minute par volume de la solution de culture est particulièrement favorable.
Dans le cas de l'emploi du procédé par submersion, il est avantageux d'ajouter aux solutions de culture un produit anti-mousse, en particulier un silicone agissant pour empêcher la mousse. Comme température de culture la plus favorable, aussi bien pour une culture superficielle que pour une culture submergée, on peut employer une température entre 30 et 40 C, mais aussi des températures plus élevées et plus basses, quoique avec un résultat un peu moins favorable. Selon la composition de la solution de culture et selon la température employée pour la culture, la durée de croissance la plus favorable est de 3 à 10 jours; pour des cultures submergées, ce temps est en général un peu plus faible surtout en cas de circulation d'air active.
On a établi qu'il est particulièrement favorable de prolonger la durée de croissance jusqu'à ce que tous les produits nutritifs, en particulier les hydrates de carbone, soient consommés; cependant il est encore possible de retarder plus longtemps le traitement de la solution nutritive car on a observé que., par un long séjour, l'action ne perd pas son efficacité, comme c'est pourtant souvnet le cas pour la culture d'autres micro-organismes.
Les cultures solides ou liquides ainsi obtenues de bacillus subtilis var. indolasus peuvent être utilisée directement comme remède, en particulier après addition pour leur stabilité d'un agent de conservation, en particulier un mélange de différents esters de l'acide para-oxybenzoïque. Il est préférable cependant, notamment pour des raisons de stabilité, de débarrasser le produit de l'eau, par exemple de le concentrer par séchage par pulvérisation., sur un sécheur à tambour ou par évaporation, pendant qu'on peut encore ajouter à la solution, avant ou après le séchage, en vue de mieux la diviser, des corps indifférents solubles ou insolubles dans 1'eau, en particulier des hydrates de carbone. Il n'est pas ainsi nécessaire de tuer les bactéries dans le remède ou de les enlever.
Cependant il est parfaitement possible de tuer les bactéries par des moyens physiques ou chimiques sans qu'ait lieu un abaissement d'efficacité,par exemple
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par stérilisation par la chaleur. De plus, on peut séparer les bactéries présentes dans la solution de culture et on peut utiliser comme agent thérapeutique aussi bien ces bactéries séparées, éventuellement après les avoir tuées, que la solution de culture sous forme liquide ou débarrassée d'eau. Une épuration du reliquat sec de la solution de culture est en principe possible, mais ou n'obtient pas alors d'avantages particuliers.
Une telle épuration est par exemple possible par dialyse des bouillons de culture contenant les bactéries ou même débarrassés des bactéries, de sorte que des corps inactifs passent dans le dialysat tandis que les corps actifs restent dans le reliquat de dialysée car ils ne sont pas dialysables.
Le reliquat de dialyse peut être soit employé directement, éventuellement après addition d'agents de conservation ou on peut, comme décrit précédem- ment,, les débarrasser de l'eau. On n'a pu encore découvrir quel est le corps responsable de l'action thérapeutique dans les remèdes ainsi préparés. Si on en juge d'après les essais effectués jusqu'à présent les solutions ne contiennent pas d'antibiotique comme le montre le tableau 2 suivant. Les solutions de culture contiennent une série de ferments, en particulier des ferments tryptiques ; cependant, ce n'est même pas à eux apparemment qu'est due l'action car leur enlèvement ou leur destruction n'altère pas l'efficacité.
Il est remarquable que les corps actifs contenus dans la solution de culture et dans les bactéries ne sont pas rendus inactifs par un chauffage prolongé à de hautes températures.
Compte tenu de la dose thérapeutique nécessaires la toxicité du remède préparé comme indiqué est extraordinairement faible. Un reliquat sec stérilisé obtenu par évaporation d'une solution de culture de 10 jours possédait une dose mortelle 50 selon Kgrber par injection intraveineuse aux souris de 175-200 mg/kg (100 mg contenaient 13,3 milliards de germes).
Des doses subtoxiques peuvent être administrées pendant longtemps sans altération du bon état des animaux et sans modifications significatives du foie, de la rate, des reins et du sang. Par absorption buccale, par exemple à l'aide d'une sonde oesophagique,, on peut encore donner aux animaux d'essais des doses bien plus élevées que des effets toxiques quelconques se manifestent. La dose nécessaire pour soigner les maladies de foie, de bile et d'intestin., avec la même préparation par voie buccale, est par jour d'environ 25 mg pour un adulte d'environ 60 kg.
Il est particulièrement intéressant et remarquable que les remèdes préparés à partir du bacillus subtilis var. indolasus sont bien actifs par absorption buccale; il est cependant possible de les absorber par voie intraveineuse ou par voie rectale, mais cela ne présente pas d'avantages. Pour l'absorption intraveineuse, on préfère généralement l'utilisation d'un filtrat de culture. L'utilisation la plus avantageuse est donc par voie buccale.
La valeur thérapeutique du remède à base de bacillus subtilis var. indolasus se manifeste par le fait qu'on a obtenu jusqu'à présent de très bons résultats pour chalongite chronique., cholécystite chronique, suites d'hépatite épidémique aiguësuites de cholécystectomie, hépatites chroniques, précirrhoses et cirrloses avec ou sans ascites, gastro-entérite chronique, colite ulcérée grave. La proportion de succès est plus élevée que par les procédés et préparations usuels jusqu'à présent et le succès a même été souvent obtenu pour des malades traités auparavent sans aucun succès par les procédés connus jusqu'à présent; en particulier., en cas de colites ulcérées, le remède à base de bacillus subtilis var ; indolasus peut avoir la valeur d'un agent de choix.
Les résultats sont contrô- lables cliniquement et au laboratoire, par exemple par les tests connus du foie tels que la chromatographie sur papier du sérum, le test au thymol; le test de Takate Ara, le test de floculation de la céfaline, etc.
L'amélioration contrôlable au laboratoire suit généralement l'amélioration clinique après un temps plus ou moins long.
Pour un résultat thérapeutiques un diagnostic absolument assuré
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est nécessaire et il semble recommandable, sinon même absolument nécessaire, de prévoir un assainissement préalable du foyer, un repos au lit et l'observation d'une diète déterminée en particulier une abstention complète d'albumine et de graisseà l'exception de lait et de quantités limitées de beurre.
Selon les observations faites jusqu'à présent dans différen- tes cliniques, il serait avantageux de faire suivre des cures à l'aide du nouveau remède en faisant absorber par voie buccale pendant 5 à 6 jours une quantité d'environ 150 mg de reliquat sec d'une culture (correspondant à 20 milliards de germes) ou d'un filtrat de culture, ou encore 40 à 50 milliards de germes séparés, avantageusement sous forme-ci-lune solution aqueuse ou d'une suspension aqueuse.. Selon la gravité du cas, d'après les résultats obtenus jusqu'à présent, de telles cures doivent être répétées deux fois ou davantage jusqu'à complète guérison, les intervalles entre les cures devant être d'autant plus longs que la maladie est plus chronique.
Selon les observations faites jusqu'à présent, il semble qu'il est caractéristique pour le remède., qu'en plus d'un drainage de liquide d'ascite pour les maladies de foie et une amélioration progressive des tests du foie et autres pendant les différentes cures, on peut observer généralement, le plus souvent au quatrième ou cinquième jour, des réactions de courte durée., telles que des poussées d'anciens foyers de maladies éven- tuellement non reconnus jusque là.
EXEMPLES.
Exemple 1.
Une solution stérilisée de 5 g de phosphate de potassium primaire, de 0,6 g de sel de cuisine., de 0,1 mg de sulfate de zinc, de 0,8 g de chlorure d'ammonium et de 3,2 g de glucose dans 1 litre d'eau, qui a été amenée par addition de solution d'hydroxyde de sodium à un pH de 7,2, a été ensemencée de bacillus subtilis var. indolasus. La solution a été mise à l'étuve 7 jours à une température de 35 . Par agitation à l'aide d'un agitateur rapide bien actifs on a réparti finement dans la solution la pellicule superficielle formée (une telle répartition est aussi possible dans un appareil secoueur avec addition de billes de verre ou à l'aide ct'ultra-sons).
Ensuite on a dissous dans la solution à chaud, 2 g d' un mélange de quantités égales d'ester méthylique et d'ester propylique de l'acide para-oxybenzoïque. La solution obtenue peut être employée directement comme remède. Elle contient dans la quantité de liquide totale à peu près 1 billion de germes.
Au lieu de traiter la solution par les esters de l'acide ben- zolque., on peut aussi la stériliser par chauffage. De plus, on peut évaporer à sec par séchage par pulvérisation ou sur tambour, ou par évaporation à la pression orctinaire ou sous vide. Le reliquat obtenu peut être réglé à un poids déterminé par trituration avec du lactose, du glucose, du sucre de canne ou des produits similaires.
Exemple 2.
Une solution, stérilisée et réglée à un pH de 6,6 par addition d'une solution de soude, de 0,8 g de sulfate d'ammonium, de 0,6 g cte sel de cuisine, de 0,8 g de citrate de sodium, de 0,55 g d'acide citrique, de 0,5 g de phosphate de sodium primaire, et de 4 g de fructose dans 1 litre d'eau est ensemencée de bacillus subtilis var. indolasus et mise à. l'étuve 6 1/2 jours à une température de 36-37 . La culture obtenue peut être traitée ensuite selon l'exemple 1.
Exemple 3.
Une solution, stérilisée et réglée à un pH de 7,0, de 1,35 g de phosphate de potassium primaire, de 5,65 g de phosphate de sodium se-
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condaire, de 0,66 g de chlorure de magnésium, de 0,0005 g d'hydrate de chlorure de calcium, de 0,45 g de sel de cuisine, de 0,9 g d'alanine et de 4 g de saccharose dans 1 litre d'eau est ensemencée de bacillus subtilis var. indolasus. Après une durée de croissance de 5 jours, homogéisation de la pellicule superficielle formée et stérilisation par chauffage à 120 , la solution de culture obtenue est évaporée à sec sous vide et le'reliquat sec est'trituré avec 22,5 g -de lactose La trituration,obtenue peut être employée directement. exemple 4.
Une solution stérilisée et réglée à un pH da 7,5, de 0,001 g d'acide p-aminobenzoïque, de 0,05 g d'adénine$ de 0,05 g de cytidine, de 0,05 g de sulfate de manganèse de 0,85 g d'asparagine, de 0,5 g de chlorure de potassium.\) de 1,35 g de phosphate de potassium primaire, de 5,65 g de phosphate de sodium secondaire et de 4 g de maltose est ensemencée de bacillus subtilis var. indolasus et mise à l'étuve pendant 4 1/2 jours à une température de 37,5-38 . La solution de culture obtenue est filtrée dans un filtre à bactéries, le filtrat est évaporé à sec et trituré avec du lactose.
Les bactéries séparées sont également séchées et triturées avec du lactose. Les deux triturations au lactose peuvent être employées en thérapeutique.
Exemple 5.
Dans une solution nutritive préparée selon l'exemple 3, on dissout 30 g d'agar-agar. Le terrain de culture stérilisé est ensemencé de bacillus subtilis var. indolasus et mis à l'étuve dans des bacs pendant 7 1/2 jours à une température de 38 . La pellicule superficielle formée est enlevée des plaques d'agar-agar séchée, les bactéries sont tuées par chauffage et triturées ensuite avec du sucre de canne.
Exemple 6.
Dans 100 litres d'eau distillée, on dissout 85 g d'asparagine, 0,5 g d'aneurine 0,5 g de lactoflavine, 0,5 g de propionate de diéthyl- dioxystilbène.. 5 g de sulfate ferreux, 0,1 g de sulfate de cuivre,5 g de sel de cuisine, 55 g d'acide citriques 430 g de phosphate de sodium secondaire et 400 g de fructose. Après addition de 5 g a'un agent anti-mousse (agent anti-mousse E 100 conc. Bayer), on stérilise la solution par chauffage et, après refroidissement, on ensemence de bacillus subtilis var. indolasus. La solution est ensuite maintenue à une température de 36-37 et mise à l'étuve pendant 4 jours avec insufflation d'air stérilisé dans la partie inférieure du récipient.
La solution obtenue est alors stérilisée par chauffage et, après addition d'un mélange de quantités égales de sel de cuisine et de lactose, elle est séchée sur un sécheur à tambour.