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La présente invention a pour objet le traite- ment préalable des milieux de fermentation, nutritifs, et aqueux, pour améliorer le rendement en tétracycline obtenu à partir de ces milieux, et elle constitue un perfectionnement au une modification de l'invention sui- vant le brevet principal.
Il est connu que la tétracycline s'obtient par la fermentation d'un milieu nutritif aqueux par des r- cro-organismes producteurs de tétracycline appartenant au groupe des Streptomyces, ainsi qu'il est expliqué dans le brevet principal, Il est également connu que l'on obtient de la chlorotétracycline, en même temps que la tétracycline, lorsqu'il y a des ions chlorure dans le milieu.
Un des buts de la présente invention est de fournir un milieu de fermentation à partir duquel on puisse obtenir une tétracycline pratiquement exempte.de chlorotétracycline, chose très souhaitable au point de vue médical.
Conformément à la présente invention, on four- nit un procédé pour le traitement préalable d'un milieu de fermentation, nutritif et aqueux, pour améliorer le rendement en tétracycline obtenu à partir de ce milieu lorsqu'on le fait fermenter par un microorganisme produc- teur de tétracycline du groupe des Streptomyces ; pro- cédé consiste à mettre ce milieu aqueux en contact avec un échangeur d'ions pour réduire la teneur en ions chlo- rures. On poursuit de préférence le traitement jusqu'à ce que la teneur en ions chlorures du milieu aqueux soit inférieure à 50 parties par million, et de préférence inférieure à 10 parties par million.
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Les microerganismes utilisés comprennent des souches, aes variantes ou des mutantes de S. aurefaciens, particulièrement celles qui donnent des rendements rela- tivement élevés en tétracycline dans la liqueur de fer- mentation, particulièrement celles qui donnent plus de 500 microgrammes par cm3. On peut citer- comme exemple un organisme nommé UV-8, qui est une mutante du microorga- nisme Texas. Cette mutante est une souche nouvelle qui produit de tels rendements dans le milieu de fermenta- tion, et c'est une souche non décrite jusqutà présent, La souche UV-8, lorsqu'on la cultive sur l'agar-agar Waksman (Journal of Bacteriology ; 339-341, 1922), présente une forte production de mycélium, d'abord 7: châtre, devenant jaune, et se couvrant graduellement d'un mycélium aérien blanc poudreux, qui sporule par blan-$la suite.
Les vieilles cultures sont d'un noir de jais, avec de petites taches de mycélium blanc. Cette végé- tation noire est constituée par une masse de corps à chaînes courtes qui se rompent facilement. Ces corps sont de grandeur et de forme variables, allant approxi- mativement de 0,5 à 4,5 microns, et leur forme peut va- rier de l'ovale à un globe sphérique légèrement angu- laire. La grandeur moyenne est un peu supérieure à celle trouvée chez le S. aureofaciens (NRRL-2209), et il y a une plus grande variété de grandeur et de forme.
On a observé de nombreuses souches différentes de streptomyces qui ont la faculté de produire à la fois de la chlorotétracycline et de la tétracycline, et l'on pense qu'elles peuvent toutes être raisonnablement clas- sées Comme Streptomyces aureofaciens, malgré des diffé- rences assez marquées dans leurs habitudes de croissance et leurs besoins nutritifs, comme le signalent Duggar et al.; dans "Annals of the New York Academy of Sciences",
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volume 60, pages 71 à 101, publié le 29.10.54; pourtant, certains pourraient'être portés, pour une raison ou pour une autre, à affirmer que leurs microerganismes produc teurs de tétracycline appartiennent à une espèce diffé- rente.
Etant donné ce conflit possible de terminologie, et étant donnée la nature générale de la présente inven- tion, la demanderesse désire inclure ici l'emploi de tous les microorganismes nui présentent les qualités de production de tétracycline indiquées ci-dessus.
La préparation de milieux de fermentation con- tenant moins de 10 parties par million d'ions chlorures est relativement facile, quand le milieu est un milieu synthétique"* c'est-à-aire un milieu dans lequel les besoins en carbone pour la fermentation sont satisfaits par des matières relativement pures, telles que le sac- charose, et dans lequel l'azote est fourni par du sulfa- te d'ammonium ou autres substances chimiques très puri- fiées. Malheureusement, ces milieux synthétiques sont très coûteux, et manquent de certains principes essen- tiels de métabolisme du processus de fermentation per- mettant d'obtenir des rendements élevés en tétracycline.
Pour cette raison et pour d'autres imparfaitement con- nues, il est préférable d'utiliser, dans la préparation des milieux de fermentation, des matières de provenance naturelle, par exemple, liqueur de macération de mais, liqueur de fermentation d'origine animale, caséine di- gérée, etc.. Non seulement ces matières sont moins coû- teuses que les matières synthétiques, mais elles.donnent des rendements bien plus élevés en antibiotique désiré.
Malheureusement, ces matières contiennent des quantités appréciables d'ions chlorures, et quand on prépare la tétracycline par fermentation, on obtient en marne temps des quantités excessives de chlorotétracycline.
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Les matières naturelles, telles que la liqueur de macération de mais, peuvent être diluées avec de l'eau jusqu'à une concentration appropriée pour les fai- re passer à travers une couche d'échangeurs d'ions, et on peut éliminer l'ion chlorure dans la mesure jugée nécessaire. On peut alors ajouter, à la solution de ma- cération de mais désionisée, les quantités supplémentai- res d'azote, de carbone et d'éléments minéraux nécessai- res au milieu de fermentation, et celui-ci est alors prêt à servir dans le procédé. La liqueur de macération de mais contient des quantités appréciables d'ions chlo- rure, de l'ordre de 0,15 à 0,5 %'en poids, et il faut prendre plus de précautions dans le traitement d'une ma- tière de ce genre, que dans le cas d'autres substance naturelles utilisées dans la préparation du milieu de fermentation.
La caséine, qui est une matière très utile pour préparer des liqueurs de fermentation, est sucep- .tible de contenir de grandes quantités d'ions chloru- res, suivant les méthodes de préparation. On rencontre fréquemment des quantités d'ions chlorures allant jus- qu'à 0,30 %. Les produits de digestion enzymatique de la caséine, utiles aussi pour la préparation des milieux de fermentation, peuvent contenir des concentrations encore plus élevées en ions chlorures, et il faut trai- ter ces produits conformément aux renseignements de la présente invention, si on les.utilise dans la préparation des liqueurs de fermentation pour l'obtention de- la té- tracycline.
La liqueur de fermentation d'origine animale, la poudre de viande, et les poudres de poisson digé- rées, ainsi que diverses autres matières, particulière- ment d'origine animale, contiennent de grandes quantité
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d'ions chlorures, et les solutions préparées à partir de ces substances doivent être traitées conformément aux renseignements de la présente invention, pour rédui- re leur teneur en ions chlorures.
On comprendra, bien entendu, que les consti- tuants du milieu de fermentation qui sont sous forme insoluble ne peuvent traverser des couches d'échangeurs d'ions sans les obstruer rapidement par des dépôts inso- lubles. Le procédé de la présente invention envisage le traitement de constituants solubles des milieux men- tionnés ici. Les substances fortement visqueuses ont aussi de la difficulté à traverser les couches d'échan- geurs d'ions, et par suite il faut les diluer avec de l'eau jusqu'à une fluidité qui permette un écoulement suffisant à travers la couche.
Dans certains cas, où il faut ajouter des ma- tières insolubles au milieu de fermentation, on peut les laver avec de l'eau désionisée pour éliminer les ions chlorures avant d'ajouter ces matières au milieu de fermentation. Evidemment, la nature de la matière déterminera le traitement convenable. Pour l'amidon cru par exemple, qui contient souvent des quantités consi- dérables d'ions chlorures, on peut le laver l'eau dé- sionisée, l'ajouter au milieu de fermentation, et alors le faire cuire ou le traiter autrement pour le rendre assimilanle par le microorganisme de fermentation. Par silution convenable, on peut faire passer l'amidon so- luble à travers la couche d'échangeurs d'ions pour éli- miner,les ions chlorures.
,La farine de soja contient souvent des quanti- tés excessives d'ions chlorures pour la préparation de la tétracycline, et quand on utilise des matières de ce genre en quantités importantes, il faut aussi les traiter
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par la technique d'échange d'ions comme décrit ci-des- sus. Les mêmes observations s'appliquent à d'autres ma- tières-de provenance naturelle qui servent à préparer des liqueurs de fermentation, quand leur teneur en ions chlorures est trop élevée.
Les souches de Streptomyces aureofaciens pro- ductrices de tétracycline qui produisent plus de 500 mi- crogrammes d'antibiotique par cm3, sont préférables. En pareil cas, le milieu de fermentation peut contenir 10 parties par million d'ions chlorures, bien que des quan- tités inférieures soient préférables. D'autre part, les perfectionnements apportés à la sélection des souches de Streptomyces productrices de tétracycline ont amené des augmentations notables de rendement en tétracycline que l'on peut obtenir, de sorte qu'il est maintenant possible d'obtenir facilement 5000 microgrammes de tétras cycline par cm3, et même plus.
On obtient ce résultat, non seulement par sélection de souches particulièrement fortes productrices de tétracycline, mais aussi en sélec- tionnant soigneusement les matières qui constituent le milieu de fermentation, et en restreignant la teneur en ions chlorures. La présente invention envisage donc l'utilisation de souches de S. aureofaciens capables de produire des quantités de tétracycline supérieures à 500 microgrammes par cm3, dans des milieux de fermenta- tion contenant des matières naturelles du typé communé- ment utilisé maintenant dans d'autres processus de fer- mentation, mais qui ont été traités pour éliminer le plus possible d'ions chlorures.
De cette manière, il est possible d'obtenir des milieux de fermentation bruts dans lesquels une faible proportion seulement de l'anti- biotique total est présente sous forme de chlorotétra- cycline.
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Comme indiqué plus haut, il est admissible, bien que non désirable, que l'antibiotique total présent dans le milieu de fermentation soit sous forme de chloro- tétracycline jusqu'à concurrence de 8 à 10%. Donc, comme one le voit, un milieu de fermentation contenant 5000 microgrammes de tétracycline par cm3, pourrait contenir jusqu'à 500 microgrammes par cm3 de chlorotétracycline, ce qui pourrait se produire en présence de 40 à 50 par- ties par million d'ions chlorures dans les milieux de fermentation, quand le microorganisme est un utilisateur efficace. Si la souche particulière utilisée dans le processus n'utilise pas pleinement les ions chlorures, la liqueur de fermentation peut contenir des quantités plus grandes d'ions chlorures.
En pareil cas, beaucoup de matières naturelles n'ont pas besoin d'être préala- blement traitées conformément au procédé de l'invention, car leur teneur en ions chlorures est déjà suffisamment basse. Toutefois, les substrats les plus efficaces pour donnâmes rendements élevés d'antibiotique comprennent la liqueur de macération de mais, qui, comme indiqué plus haut, a une très forte teneur en chlorures, et les liqueurs de fermentation contenant des quantités appré- ciables de cette matière peuvent s'améliorer si on les traite.
Ainsi qu'il est commun à d'autres processus de fermentation pour la production d'antibiotiques, les liqueurs de fermentation contiennent des sources de car- bone, d'azote et de sels minéraux assimilables. Beau- coup de ces sources sont relativement exemptes d'ions chlorures, et on les utilise pour compléter les matières citées plus haut qui sont traitées par des échangeurs d'ions conformément à la présente invention. Elles com- prennent notamment le saccharose, le glucose, la dex-
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trine, les alcools/le sucres, l'acide citrique, l'amidon, la farine de grains de coton, de mais, de soja, d'arachi- de et d'autres substances carbonées et azotées qui sont utilisées en quantités variables, à raison de 0,5 à 5% en poids ou davantage par rapport au point total du mi- lieu de fermentation.
Pour accroître le rendement et l'économie, on utilise souvent des mélanges de ces matiè- res en même temps que les produits de provenance natu- relle mentionnés plus haut, qui ont été traités par des échangeurs d'ions pour éliminer les quantités excessives d'ions chlorures.
Des sels minéraux sont aussi ajoutés, commer- cialement, au milieu de fermentation, en quantités va- riables, pour favoriser la croissance du microorganisme et obtenir des rensements élevés en tétracycline. Parmi des sels, on peut mentionner le phosphate d'ammonium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le carbonate de calcium, et divers oligo-éléments comprenant le cobalt, le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer, le chrome, etc... L'usage de ces oligo-éléments pour favori- ser la fermentation est bien connu du spécialiste, et toute.description complémentaire apparaît inutile.
Comme on le verra, lorsqu'on traite les solu- tions aqueuses contenant des matières nutritives desti- nées au processus de fermentation, pour en éliminer les ions chlorures, l'absorption non sélective d'anions que possèdent certains échangeurs d'anions, tend parfois à éliminer une partie des anions désirables contenus dans la liqueur de fermentation. Par exemple, dans certaines conditions les ions phosphates peuvent être éliminés de la solution. De même, l'anion sulfate peut aussi être éliminé.
Pour éviter cette possibilité, et pour rédui- re la. charge imposée à la colonne d'échangeurs d'ions,
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il est préférable que la majeure partie des éléments mi- néraux, par exemple les phosphates et les sulfates, ainsi que les oligo-éléments, soient ajoutés après l'élimina- tion des chlorures par le traitement d'échange d'ions.
Le but principal du traitement d'échange d'ions est, bien entendu, d'éliminer les ions chlorures en excès des matières de provenance naturelle qui en contien- nent en quantités excessives. Dans certaines conditions, il peut être désirable aussi d'éliminer certains groupes cationiques avant la fermentation. En conséquence, on peut utiliser des couches mixtes qui éliminent à la fois des cations et des anions. L'usage et le contrôle de ces couches mixtes d'échange d'ions incombent à l'habili- té du technicien, et sur quoi il n'y a pas lieu de s'é- tendre davantage:
Les échangeurs d'ions envisagés suivant la présente invention comprennent, parmi les substances in- solubles dans l'eau, celles qui ont la propriété d'ad- sorber, ou d'éliminer autrement, les ions chlorures des solutions aqueuses.
Ce sont généralement des résines synthétiques contenant des groupements amino libres, par exemple des condensats phénol-formaldéhyde-polyamine,
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des résines mélamine-guanidine-formaldéhyde, et des rési- nes polyalkylène-polyamine. On ne connaît par parfaite- ment la nature chimique exacte de ses substances ni la ma- nière dont elles adsorbent les ions chlorures. Mais on peut les acheter chez différents fabricants, en spéci- fiant qu'elles sont destinées à éliminer des ions chloru- res dans des solutions aqueuses. Divers types sont dis- ponibles sur le marché.
On peut utiliser, aans la présente invention, des substances qui adsorbent simplement les ions chloru- res, mais cela ne serait pas industriellement applicable, parce qu'on ne pourrait les réutiliser. Le moféchange"
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est utilisé, à propos des échangeurs d'ions de la présen- te invention, pour désigner une matière que l'on peut réactiver, lorsqu'elle a adsorbé des ions chlorures d'une solution, afin d'éliminer les ions chlorures ainsi ad- sorbés et de réutiliser la résine pour préparer de nou- veaux milieux de fermentation.
Certaines couches d'échangeurs d'ions peuvent fonctionner de manière à éliminer seulement des anions de la solution. Dans d'autres, il peut y avoir rempla- cement. Par exemple, aans une résine échangeuse d'ions fonctionnant sur le cycle de sulfate, aes ions chlorures sont éliminés et des ions sulfates sont libérés pour les remplacer dans la solution. Bien que ce ne soit pas habituellement nécessaire, ces ions sulfates peuvent être adsorbés par une deuxième couche d'échangeurs d'ions fonctionnant simutanément avec la première. Il peut en être de même en ce qui concerne d'autres ions qui peu- vent être en cause. Pour ces raisons, il est important, , après le traitement d'échange d'ions, d'ajuster les be- soins anioniques des milieux nutritifs, spécialement en phosphate.
Après avoir traité par des résines échangeuses d'ions certains des constituants des.milieux de fermen- tation, on peut ajouter alors au liquide traité les au- tres matières nécessaires qui sont utilisées dans le processus de fermentation, stériliser le tout, et ense- mencer avec des microorganismes producteurs de tétracy- cline. On conduit alors la fermentation suivant-la ma- nière usuelle.
Pendant la fermentation, il est désirable de cultiver l'organisme dans des conditions d'immersion, avec aération et agitation appropriées, par exemple dans un flacon placé sur une machine à secousse, ou
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dans un. appareil à fermentation sous agitation équipé d'un gicleur pour produire en continu un courant d'air.
La température ne semble pas critique, dans 1. gamme de
25 à 35 C, bien que l'intervalle de 30-33 C soit préfé- rable. Le pH initial du milieu doit être voisin de la neutralité, bien que l'on obtienne un peut d'antibioti- que avec des pH initiaux descendant jusqu'à 5,0 ou s'éle- vant jusqu'à 8,5.
Des tampons tels que le carbonate de calcium et des sels d'acides organiques tels que les citrates, acé- tates et lactateus, sont utiles pour maintenir le pH dans l'intervalle convenable. En'outre, les acides organi- ques peuvent servir de sources de carbone dans le méta- bolisme des microorganismes. L'usage d'un agent anti- mousse est désirable dans les appareils à fermenta Lion en grande échelle, mais dans cette fermentation la mousse ne pose pas un problème particulièrement difficile, et on l'empêche facilement en utilisant des agents antimous- ses ordinaires, tels que l'octaaécanol dans l'huile de saindoux, ou un autre antimousse commercial approprié.
La semence destinée à la fermentation peut être préparée avec une culture obtenue sur des gelées ense- mencées avec le S. aureofaciens. Un milieu approprié pour les gelées est l'agar-agar Wacksman, ayant la com- position suivante :
Glucose 10 g/1
Peptonse 5
PO4H2K 1 S04Mg.7H20 0,5 agar-agar 20
La culture sur gelée peut être transférée dans des flacons agitateurs qui peuvent être utilisés comme appareils à fermentation de laboratoire on petite écchel-
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le, ou-pour produire une semence destinée à inoculer des fermentations plus étendues.
Pour la fermentation en cuve en grande échelle, on utilise la culture sur gelée pour ensemencer un milieu liquide approprié, dans un flacon agitateur que l'on agite sur une machine à secousse alternative à des tem- pératures variant de 26 à 35 C. On utilise généralement un deuxième étage de flacons'agitateurs, conjointement avec des fermentations immergées en cuve, afin d'augmen- ter le volume de semence agité jusqu'à égaler 1,5 - 2,5% ' du volume de liquide dans la cuve. La réaction du mi- lieu de flacons agitateurs est comprise initialement entre pH 6,5 et 7,5 et, à mesure que la croissance se produit, on observe une baisse continue du pH, pouvant descendre jusqu'à 3,8. Toutefois, un âge physiologique comme celui indiqué par un pH d'environ 5,0 est apparem- ment le moment le plus favorable pour transférer la se- mence.
Celle-ci, occupant 1,5 - 2,5 % du volume de liquide de la cuve, est transférée aseptiquement dans l'appareil à fermentation, et on le cultive pendant 2 à
3 jours sous agitation et aération continues. On peut utiliser des proportions de 0,5 - 1,5 volume d'air libre par volume de liquide, suivant la grandeur de l'appareil.
On peut lutter contre la formation de mousse du moût en y ajoutant, dans des conditions aseptiques, un agent an- timousse tel qu'une huile de 'saindoux contenant 2% d'oc- tadécanol.
Pour récupérer la tétracycline dans le moût de fermentation, il est possible d'utiliser des méthodes ordinaires mises au point à propos d'autres antibioti- ques, par exemple extractions par solvants connus, avec ou sans supports, ou adsorptions. Parmi les solvants connus, tels que le butanol, l'acétate d'éthyle et le
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chloroforme, dont l'utilisation comporte des étapes de purification ultérieure, le butanol est le meilleur pour' l'extraction de la tétracycline. Ces méthodes connues sont applicables avec assez de succès dans le cas de moûts de fermentation dans lesquels il se forme peu de substance antibiotique autre que la tétracycline, le but étant alors simplement de réaliser la séparation en- tre l'antibiotique et les matières inactives ordinaire- ment classées comme impuretés.
Dans le cas où il y a formation appréciable d'une substance antibiotique autre que la tétracycline, par exemple quand la quantité d'ions chlorures n'est pas maintenue à un minimum et qu'il y a formation appréciable de chlorotétracycline, ces méthodes connues sont moins efficaces si l'on désire récupérer la tétracycline fortement concentrée dans le produit final, en supprimant les autres substances antibiotiques, (Les antibiotiques sont ici envisagés en tant que sub- stances antagonistes du E. coli).
De préférence, on procède à la récupération en utilisant un groupe particulier de sels d'ammonium qua- ternaire qui précipitent sélectivement la tétracycline du moût, à un pH alcalin' (pH 8 à 11), sous forme de sel d'ammonium quaternaire de la tétracycline. Après avoir filtré ce sel, on le délaie alors avec une faible quan- tité d'eau et une quantité relativement grande de chloro,, forme, ce qui a pour effet de dissoudre le sel d'ammo- nium quaternaire de la tétracycline dans la phase chlo- roforme de la bouillie. On sépare alors de préférence les phases aqueuse et chloroformique, afin d'éliminer toutes les impuretés' dissoutes dans l'eau.
On extrait alors la tétracycline par une solution acide aqueuse à un pH d'environ 1 à 2,5, avec formation du sel d'acide de la tétracycline; qui passe en solution dans la phase
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aqueuse,' d'où il précipite sous forme de produit cris- tallin quand on porte le pH dans la gamme de 3 à 7, la précipitation commençant au pH le plus bas de ces deux chiffres.
Les sels d'ammonium quaternaire particuliè- rement utiles dans ce procédé de récupération sont les chlorures d'alkyltBiméthylammonium et les chlorures de, dialkyldiméthylammonium dans lesquels le groupement al- kyle contient de 8 à 18 atomes de carbone, inclusivement.
EXEMPLE I
On prépare un milieu à base de liqueur de macération de mais, de la façon suivante; On prend une liqueur de macération de mais ayant une teneur en soli- des d'environ 50 % (en poids), on la dilue avec de l'eau distillée pour donner une concentration finale de 2%.
On fait passer la matière diluée résultante à travers une colonne garnie de 30 litres d'un mélange constitué par 2 volumes d'Amberlite IR-45 comme résine échangeuse /anionique, et 1 volume d'Amberlite IRC-50, résine échangeuse /cationique. On commence seulement à recueillir le liqui- de d'écoulement quana la résistivité s'est .élevée jus- qu'à 5000 ohms par centimètre, et on continue jusqu'à ce que la résistivité soit abaissée en dessous de 3000 ohms par centimètre.
A 1000 cm3 de la solution désio- nisée de liqueur de macération de mais, on ajoute les constituants suivants pour préparer un milieu convenant à la préparation de la semence et à la production de la tétracycline, pour obtenir un'milieu contenant environ
17 parties par million de-chlorure, bien qu'une teneur plus faible en chlorures soit préférable :
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saccharose 30,0 g P04HK2 15,0
PO4H(NH4)2 5,0
SO4Mg.7H2O 2,0
CO3Ca 1,0
KBr 0,5 S04Zn.7H20 0,05 S04Cu.5H20 0,003
SO4Mn.4H2O 0,0025
Pour la préparation d'une semence, on distri- bue des volumes de/50 cm3 du milieu ci-dessus dans des Erlenmeyers de 250 cm3, et des volumes de 400 cm3 dans des flacons de 2 litres.
On utilise une cuillerée sè- che de spores provenant de la végétation superficielle de l'organisme à tétracycline, cultivée sur un milieu semi-solide incliné, pour ensemencer les volumes de 50 cm3 que l'on secoue à 30 C pendant 72 heures sur une machine à secousse alternative -(82 cycles par mi- nute avec un déplacement de 73 mm). A la fin de ce temps, on utilise 1,0 cm3 de la suspension de mycélium obtenue pour inoculer 400 cm3 de milieu que l'on agite pendant 28 heures. On réunit, dans des conditions asep- tiques, quatre volumes de 400 cm3 et on les utilise pour ensemencer l'appareil à fermentation.
On prépare le milieu de fermentation dans des appareils de 10 litres, comme suit :on dissout les constituants, à des concentrations indiquées ci-des- sus, dans 43 litres de la solution désionisée de-li- queur de macération de mais, pour obtenir un volume total final de 57 litres. On stérilise le milieu à 121 C en injectent de la vapeur à 1,05 kg/cm2, directe- ment dans la fournée, pendant 30 minutes. Le volume fourni par le condensat de vapeur donne la différence
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voulue entre les 43 litres initiaux de solution compre- nant liqueur de macération de mais désionisée, sucre et sels, et les 57 litres désirés finalement.
Après avoir refroidi à 30 C, on ensemence le mélange avec les qua tre volumes de 400 cm3 de semence réunis, mentionnés plus haut, on agite et on aère à raison de 1,6 volume .d'air par volume de milieu, pendant 38 heures. A ce mo- ment, par réaction du moût, le pH qui était primitive- ment à 5,9, s'est abaissé à 4,1. Le moût titre 20 mi- crogrammes d'antibiotique par cm3 si l'on utilise l'oxy- tétracycline comme étalon, et contient une quantité appréciable de tétracycline.
On désionise les solutions de liqueur de macé- ration de mais à des concentrations de 1,5 et 2,0 %, avec des mélanges de résines contenant 3 volumes de résine anionique Amberlite IR-45 et 1 volume de résine cationi- que Amberlite IRC-50 (environ 10 opérations). On fait une opération avec une résine mixte Rohm &t Haas MB-1 (2 volumes de résine anionique IRA-400 plus 1 volume de résine cationique IR-120). On trouve que la propor- tion de 1 :3 entre volume de résine et volume de liqui- de d'écoulement est satisfaisante. ; Un débit de 0,01 cm3 de solution par cm3 de résine et par minute donne une meilleure résionisation que 0,016 cm3 solution/cm3 rési- ne/minute. L'usagede deux colonnes'de résine en série réalise une bonne désionisation.
Quand on titre les ions chlorures dans la solution désionisée de cette ma- nière, on constate la présence de 3,5 à 29 parties par million.
EXEMPLE II
On prend une liqueur de macération de mais ayant une teneur en solide d'environ 50% (en poids), et on la dilue avec de l'eau distillée pour donner une
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concentration finale do 1,5%. On fait passer cotte ma- tière diluée à travers une colonne garnie d'un mélange comprenant 3 volumes d'Amberlite IR-45, résine échan- geuse anionique, et 1 volume d'Amberlite IRC-50, résine échangeuse cationique. On commence seulement à recueil- lir le liquide d'écoulement quand la résistivité s'est élevée à 5000 ohms par centimètre, et on continue jus- qu'à ce que la résistivité se soit abaissée en dessous de 3000 ohms par centimètre.
On ajoute les matières suivantes à la solution désionisée de liqueur de macé- ration de mais, pour préparer un milieu convenant à la propagation de la semence et à la production de tétra- cycline : saccharose 2,0 % P04H2K 1,5 %
PO4H(NH4)2 0,5 S04Mg.7H20 0,2 CO3Ca 0,1 S04Zn.7H20 50,0 parties par million S04Cu.5H20 ' 3,0 parties par million S04Mn.4H20 2,5 parties par million
KBr 0,05 %
Pour l'utiliser dans la préparation de la se- mence aussi bien que des flacons à fermentation, on distribue ce milieu en portions de 100 cm3 dans des Erlenmeyers de 500 cm3, et on stérilise 4 l'autoclave pendant 20 minutes à 121 C sous 1,05 kg/cm2.
La te- neur en chlorures du milieu après stérilisation est de 17,7 parties par million.
On prépare une semence en ensemençant des flacons avec un mélange lyophilisé de spores et de mycélium de Streptomyces aureofaciens (souche 201-15)
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et en faisant incuber'les flacons à 26 C pendant 48 heures sur une machine à secqusse alternative. On uti- .lise des volumes de 5% de semence de 40 .heures pour en- semencer les flacons à fermentation, que l'on fait alors incuber dans les mêmes conditions pendant 48 heures.
' On démontre l'activité d'antibiotique en saturant de moût filtré un disque en papier de 13 mm, en plaçant le disque sur un plateau d'agar-agar ensemencé avec de l'Escherichia coli, et en faisant incuber à 30 C pen- dant 18 heures.
On traite 400 cm3 de ce mélange avec 2,4 g d'acide oxalique et 1,6 g dtoxalate atammonium. Après avoir agité 10 minutes, on filtre le mélange. On agite alors le filtrat avec 80 cm3 d'acétate d'éthyle et on ajuste le pH à 8,5. La phase solvant qui contient la ,'majeure partie du produit actif, est agitée avec 5 cm3 d'eau et ajustée à pH 2. Quand on dilue à 1/500 avec la phase inférieure du système butanol-eau contenant
2,5% d'acide acétique, on obtient des maxima d'absorp- tion dans l'ultra-violet à 270.. et à 360 millimicrons.
L'analyse par', distribution à contre-courant (48 transferts, butanol-acide acétique à 2,5%) de ce concentré, montre qu'il contient de la tétracycline.
On y parvient, à la fin de la distribution, en diluant chacune des phases inférieures avec du méthanol et en mesurant la densité optique à 370 millimicrons. On trouve la majeure partie du produit au tube 19. Les numéros de tubes de pointe pour la chlorotétracycline et l'oxytétracycline sont respectivement 26 et 16.
EXEMPLE III On conduit une fermentation en flacon agita- teur, identique 4 tout égard à celle décrite plus haut, sauf que les résines anionique et cationique utilisées
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sont respectivement de l'Amberlite IRA 400 (2 volumes) et de l'Amberlite IR 120 (1 volume). Le milieu contient
13,3 parties par million ae chlorure après stérilisation.
On démontre l'activité d'antibiotique du mélange par la méthode du disque en papier et du plateau à E. coli.
Quand on traite ce mélange pour concentrer l'activité antibiotique comme décrit dans l'exemple II ci-dessus, on voit que les données d'absorption dans l'ultra-violet et de distribution à contre-courant sont pratiquement les mêmes que pour le milieu préparé avec des résines Amberlite IRC 50 et IR 45.
EXEMPLE IV
Pour préparer une semence destinée à servir dans des appareils à fermentation de 10 litres, on dis- tribue des volumes de 50 cm3 du milieu décrit à l'exem- ple II dans des Erlenmeyers de 250 cm3. et des volumes de'400 cm3 dans des flacons de 2 litres. On utilise une cuillerée sèche de spores provenant de la végéta- tion superficielle du S. aureofaciens (souche T-5), cultivée sur milieu semi-solide incliné, pour ensemen- cer les volumes de 50 cm3, que l'on agite à 30 C pen- dant 72 heures sur une machine à secousse alternative.
Au bout de ce temps, on utilise 1,0 cm3 de la suspen- sion de mycélium obtenue pour inoculer 400 cm3 de mi- lieu, que l'on agite pendant 28 heures. On réunit dans des conditions aseptiques quatre volumes de 400 cm3, et on les utilise pour ensemencer l'appareil à fermenta- tion.
Pour préparer le milieu de fermentation, on complète la solution de liqueur de macération de mais jusqu'à une concentration de 2% et on la désionise avec le mélange 3 : 1 de résines Amberlite IRC 50 et IR 45.
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On ajoute les autres constituants du milieu décrit à l t exemple II dans cette solution désioinisée, en quantités telles qu'après 30 minutes de stérilisation à 121 C par injection directe de vapeur à 1,05 Kg/cm2 dans la four- née, le volume fourni par le condensat de vapeur donne un volume total de 57 litres de milieu par appareil à fermentation de 10 litres.
Après refroidissement à 30 C, on ensemence les fermentateurs avec des volumes de semences de 1600 cm3, on agite mécaniquement à 155 - 165 tours par minute, et on aère à raison de 1,6 volume dtair par vo- lume de milieu pendant 38 heures. Les moûts provenant de deux de ces fermentations contiennent respectivement 81 et 116 microgrammes d'antibiotique par cm3, quand on les titre avec du S. lutea en utilisant l'oxytétracy- cline comme étalon.
On prend 96 litres de mélange obtenus par réu- nion des fournées décrites ci-dessus, on les traite par 920 g d'acide oxalique et on ajuste le pH à 3,5. On ajoute de l'Hyflo, on filtre le mélange et on lave le tourteau avec 4 litres d'eau. On réunit le filtrat et le liquide de lavage, on extrait à-pH 8,5 par 20 litres d'acétate d'éthyle contenant 1 litre d'Emulsept
EMI20.1
(N-/"'lauroylcolaminoformalméthyl¯7-pyridine). On agi- te -alors l'extrait au solvant à pH 2, avec quatre por- tions successives de 140 cm3 d'eau. On réunit ces con- centrés aqueux et on les ajuste à pH 7,8. On filtre les solides qui se séparent, on les lave à l'eau, puis on sèche dans un dessicateur sous vide. On obtient 4,19 g, titrant 904 microgrammes par mg. Cola représen- te un rendement en activité de 41%.
On détermine l'ab- sorption dans l'ultra-violet de cette matière dans l'a- cide sulfurique 0,1 M. On trouve des maxima à 266 et
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360 millimicrons, des minima à 232 et 301 millimicrons.
On distribue cinq milligrammes entre du chloroforme et un tampon phosphate à pH 7. On trouve pratiquement tou- te l'activité dans la phase inférieure. Dans ces condi- tions, l'oxytétracycline se concentre dans la phase supérieure.
On dissout 50 g du produit dans un minimum d'acide chlorhydrique 1 N, et on ensemence la solution avec quelques cristaux de chlorotétracycline, et on laisse reposer le mélange à la température ambiante. La cristallisation commence au bout de 15 minutes. On pla- ce le mélange dans une glacière pendant une nuit. Le lendemain, on sépare les solides cristallins et on les sèche sur plateau de porcelaine poreuse. Le spectre d'absorption dans l'ultra-violet de ces cristaux en so- lution dans l'acide sulfurique 0,1 N présente des maxima à 267 et 360 millimicrons, et des minima à 234 et 301 millimicrons. Une solution de cristaux dans l'acide sulfurique concentré contenant de l'acide borique donne une coloration lilas-rose.
L'oxytétracycline et la chlorotétracycline dans des conditions analogues donnent des colorations respectivement rouge-cerise et violette,
EXEMPLE V
On prend 17,8 Kg d'Amberlite IR-4B, résine échangeuse faiblement anionique du type phénol-formal- déhyde-polyamine vendue par Rohm et Haas, on neutralise par l'acide sulfurique 1 N, on tasse dans une colonne de 15 cm jusqu'à une hauteur de 1,90 m, et on lave à l'eau jusqu'à ce que le pH du liquide d'écoulement soit de 2,0. On dilue 15,0 Kg de liqueur de macération de mais avec 45 litres d'eau, et on filtre à 50 C. On lave le tourteau avec 15 litres d'eau. On fait passer
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la solution de macération de mais à travers la colonne à raison de 40 litres par heure.
On obtient un test de chlorure positif dans le liquide d'élution après avoir traité l'équivalent de 13,5 Kg de liqueur. On ajuste la liqueur traitée, exempte de chlorures, à pH 4,0, avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré, et elle est alors - prête à l'usage.
On prépare un milieu de fermentation avec les constituants suivants : Liqueur de macération de mais traitée par résine : 20 g/1 (solides) amidon de mais, "fluidité" dégradée par l'acide sulfurique 55 g/1 carbonate de calcium 8,0 g/1 farine de graine de coton 3,5 g/1 sulfate d'ammonium, spécial à faible teneur en chlorures 6,0 acide phosphorique (85 %) 0,24 huile de saindoux 1,0 % (en volume) oligo-éléments SO4Fe.2H2O 41 mg/l S04Zn.7H20 100 mg/1
SO4Mn.4H2O 50 mg/1 eau du robinet, q. s. pour 1000 cm3
On stérilise le milieu pendant 15 minutes à
1250 C et on dilue alors avec 3 volumes d'eau du robi- net. Ce milieu contient approximativement 24 parties par million d'ions chlorures..
On l'inocule alors avec
2% de son volume de souche S. aureofaciens S-77 contenant (calculés en poids sous forme solide) 1% de liqueur de macération de maïs, 3% de dextrine, 0,625 % de car- bonate de calcium et 0,2 % de sulfate d'ammonium. On conduit la fermentation à 26 - 27 C pendant 112 heu- res sous agitation mécanique et aération, à raison d'en-. viron 0,5 volume d'air par volume de milieu et par mi-
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nute.
A la récolte, on trouve que le moût fermenté contient plus de 5000 micro grammes de tétracycline par cm3, avec une quantité de chlorotétracycline inférieure à 5% de cette quantité.
Pour régénérer la colonne, on fait passer à travers celle-ci de l'acide sulfurique 1 N, à raison de
100 1/h, jusqu'à ce que le liquide d'écoulement ne con- tienne plus d'ions chlorures (il faut 200 1. d'acide).
On fait passer de l'eau à raison de 100 1/h jusqu'à ce que le pH s'élève au-dessus de 2,0. Il faut 450 litres d'eau. La colonne.est alors prête à resservir. On peut réutiliser cette colonne quinze fois sans diminution de sa capacité d'élimination de chlorures, ni diminution du caractère nutritif de la liqueras macération de mais obtenue.
EXEMPLE VI
On prépare une colonne similaire à celle de l'exemple V en utilisant de l'IRA-400, résine échangau- se d'ions fortement anionique du type phénol-formaldéhy- de-polyamine, fabriquée par Rohm et Haas. On fait passer de la liqueur de macération de mais à travers la colonne comme dans l'exemple V, et on prépare un milieu de fer- mentation, on le stérilise et on l'inocule avec la même souche de S. aureofaciens producteur de tétracycline que précédemment, et on conduit la fermentation de façon similaire. Ce milieu de fermentation particulier con- tient environ 18 parties par million d'ions chlorure.
Quand on fait la récolte du moût, on trouve . qu'il contient 3510 g/cm3 de tétracycline, et 255 micro- grammes de chlorotétracycline par cm3.
EXEMPLE VII
On prépare une couche mixte de résine échangea-
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se cationique-anionique, avec des parties égales d'IRA-
400 et d'IR-120, cette dernière étant une résine éhhan- geuse fortement cationique du type acide sulfonique ven- due par Rohm et Haas, et on traite par le sulfate d'am- monium 1 N de façon similaire à celle indiquée pour la préparation de la colonne dns l'exemple V.
On traite la liqueur de macération de mais comme indiqué plus haut, pour éliminer les ions chlorures par cette colonne, et on prépare un milieu de fermenta- tion de la même manière qu'à l'exemple V. On inocule alors le milieu dilué et stérilisé, avec du S. aureofa- ciens souche S-77, et on conduit la fermentation dans les conditions décrites à l'exemple V. Le milieu de fermen- tation, au début de la fermentation, contient environ
28 parties par million d'ions chlorures. On trouve que le moût fermenté contient 4670 microgrammes de tétracy- cline par cm3 et 390 microgrammes de chlorotétracycline par cm3.
EXEMPLE VIII
On dilue de la liqueur de macération de mais avec de l'eau, et on la traite par le nitrate d'argent pour éliminer les ions chlorures sous forme de chlorure d'argent. On incorpore la liqueur de macération exempte de chlorures dans un milieu de fermentation similaire à celui de l'exemple VII, et on inocule avec du S. aureo- faciens, et on conduit la fermentation comme précédem- ment. A l'analyse, on trouve que le moût fermenté con- tient 3600 microgrammes de tétracycline par cm3 et 270 microgrammes de chlorotétracycline par cm3.
EXEMPLE IX
Dans des expériences un flacons agitateurs, en utilisant les milieux de fermentation de l'exemple V dans lesquels le milieu est enrichi par 200 mg/1 d'acide
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phosphorique, on obtient 2830 microgrammes par cm3 de tétracycline et 210 microgrsmmes par cm3 de chlorotétra- cycline.
Quand on conduit la fermentation comme dans le paragraphe précédent, en utilisant de la liqueur de macération de mais non traitée à raison de 1 % de soli- des totaux, on trouve que le moût fermenté contient en- viron 1600 microgrammes de tétracycline par cm3 et 1600 microgrammes de chlorotétracycline par cm3, ce qui montre que l'utilisation de l'ion chlorure disponible dans la liqueur de macération de mais produit des proportions plus élevées de chlorotétracycline.
EXEMPLE X
La résine échangeuse anionique peut fonction- ner sous diverses formes, telles que sulfate, nitrate, hydroxyle etc... Quand on répète le processus décrit à l'exemple V avec la résine échangeuse d'ions sur le cy- cle nitrate, préparée par traitement avec de l'acide nitrique 1 N au lieu d'acide sulfurique, deux opérations différentes donnent 3590 microgrammes de tétracycline par cm3 et 210 microgrammes de chlorotétracycline par cm3 dans une première opération, et 4460 microgrammes de tétracycline par cm3 et 230 microgrammes de chloro- tétracycline par cm3 dans une deuxième opération.
Dans les opérations qui précèdent, la liqueur de fermentation contient de 15 à 30 parties environ par million d'ions chlorures et elle est pleinement utilisée par le microorganisme S. aureofaciens pour produire toute la chlorotétracycline qui est possible compte tenu de la teneur du milieu en chlorures. Mais étant donné les rendements élevés d'antibiotique obtenus, on observe que la proportion de chlorotétracycline dans ces opéra- tions, dans lesquelles on utilise des résines échangeuses
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d'ions pour traiter la liqueur de macération de mais, est inférieure à 8 % dans tous les cas.