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SOCIETE : AMERICAN CYANAMID COMPANY, résidait à
NEW YORK (E.U.A.).
(Mandataire : VANDER. HAEGHEN).
PERFECTIONNEMENTS AUX ANTIBIOTIQUES.
(faisant l'objet du brevet principal, n 530.983 du 7 août 1954 - perfec- tionnement ayant fait l'objet d'une demande de brevet déposée aux E.U.A. le 7 mars 1955 au nom de S.A. Szumski - déclaration de la déposante).
Lettre rectificative jointe pour valoir comme de droit,, à la date du 18/7/56: A la page 9, exemple 6, lignes 6 et 7, il faut lire "anions" au lieu de "cations".
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La présente invention a pour objet un procédé perfectionné pour préparer la tétracycline par fermehta- tion de souches de S. aureofaciens productrices de tétra- cycline et de chlorotétracycline, et constitue un perfec- tionnement du brevet principal.
On sait maintenant que la chlorotétracycline et la tétracycline peuvent toutes deux être produites par le même organisme S.aureofaciens, suivant les conditions de fermentation. En particulier, on obtient la chlorotétracycline comme antibiotique prédominant lorsque le milieu nutritif contient une abondance d'ions chlorure disponibles. D'autre part, on obtient la tétracycline comme antibiotique prédominant, suivant le procédé du brevet principal quand on utilise un milieu qui présente une teneur limitée et restreinte en ions chlorure.
On a trouvé que ce procédé d'obtention de la tétracycline est extrêmement efficace et applicable commercialement, malgré les frais de production accrus dus à la sélection soignée et au traitement préalable des constituants du milieu de fermentation, afin d'en élimi-
EMI2.1
ner les ions ch... ure.
Le but principal de la présente invention est de fournir un 'procédé perfectionné pour augmenter la production de tétracycline en diminuant la production de chlorotétracycline, sans engager des frais élevés pour éliminer les chlorures des milieux de fermentation.
Suivant l'invention, ce procédé perfectionné consiste à cultiver des souches de S. auroofaciens productrices de tétracycline et de chlorotétracycline, dans des milieux de fermentation contenant plus de 50 parties par milieu d'ions chlorure, et de 10 à 500 parties par million,de préférence 10 à 350 parties par million,
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d'ions bromure, ce qui augmente le rapport tétracycline : chlorotétracycline dans le produit.
On peut ajouter l'ion bromure au milieu de fermentation de toute manière désirée, mais on l'ajoute de préférence en utilisant un bromure d'un métal alcalin ou d'un métal alcalino-terreux, ou d'ammonium, par exemple le bromure de potassium, le bromure de sodium, le bromure de calcium, le bromure de magnésium, le bromure d'ammonium etc.
La quantité de bromure ajoutée dépend, dans une certaine mesure : 1) de la nature et des caractéris- tiques de la souche ou mutante particulière de Strepto- myces aureofaciens que l'on utilise, 2) de la concentration des sions chlorure présents dans les milieux de fermentation, et 3) de la nature, des propriétés et des caractéristiques des autres constituants des milieux de fermentation.
L'effet de direction désiré a été observé avec toutes les souches et mutantes de btreptomyces aureofaciens étudiées, et apparemment il n'est limité à aucune souche ou mutante particulière, mais varie en degré et en étendue avec la souche ou mutante particu'- lière utilisée.
Toutefois, l'ampleur de ces effets semble rentrer dans deux catégories quantitatives générales, suivant que l'on utilise une souche ou mutante "ramasseuse ae chlorures", ou "non ramaaseuse de chlo- rures". Pour définir ces expressions, on peut dire que le type "ramasseur de chlorures" est capable d'un rendement élevé et d'une utilisation élevée des ions chlorure disponibles, même lorsque les ions chlorure sont présents à faible concentration, tandis que le type "non ramasseur de chlorures" n'en est pas capable.
On a trouvé que l'effet de direction est plus renforce
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dans le type non ramasseur de chlorures, mais que cepen- dant il est encore marqué dans le type ramasseur de chlo- rures.
L'effet désirable consistant à accroître les rapports de production tétracycline chlorotétracycline a été observé dans des milieux de fermentation contenant une concentration d'ions bromure de 10 parties par million environ seulement, et jusqu'à 500 parties par million environ, et la gamme commerciale préférentielle se situe entre 10 et 350 parties par million environ. Ces concentrations sont exprimées en poids, ainsi que toutes les autres concentrations mentionnées ci-après, sauf indication contraire.
De même, on a observé l'effet de direction désiré dans des milieux de fermentation contenant au moins 50 parties par million environ d'ions chlorure, et jusqu'à 1500 parties par million environ, ou même davantage. Au cas où le milieu est pratiquement exempt de chlorure, ou bien contient seulement une très faible concentration de chlorure, par exemple moins de 50 parties par million, l'effet d'inhibition sur la produc- tion de chlorotétracycline est, ou bien absent, ou bien peu important, ou bien ne peut être facilement détecté, et on peut observer d'autres phénomènes, par exemple un accroissement de la production de bromotétracycline.
Le milieu nutritif particulier utilisé exerce une certaine influence sur le degré de sélectivité productire désirée, mais ne change pas le caractère fondamental ni la nature essentielle de l'effet. Un milieu de fermentation préférentiel qui attire particulièrement l'attention est celui qui comprend 1 - 3% de liqueur de macération de mais, qualité pénicilline, à 50% de soldes; 2 - 5% de saccharose ;
0,1 - 0.6 % de sulfate d'ammonium, et 0,2 - 0,7 % de carbonate de calcium, à quoi
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on peut ajouter des quantités suffisante de sels de man- genèse, cuivre et zinc pour assurer la présence de ces oligo-éléments. Ces sels peuvent être des chlorures, sulfates, nitrates, etc.. et on peut choisir n'importe quel sel particulier pour modifier ou ajuster la teneur en chlorures du milieu de fermentation. De la même manière, on peut choisir n'importe quelle qualité particulière de liqueur de macération de mais, carbonate de calcium, etc.. suivant sa teneur en chlorures.
Il est évident, bien entendu, que l'on peut faire des substitutions dans ce milieu, et que l'on peut utiliser, au lieu des constituants mentionnés ci-dessus, des matières équivalentes comme celles décrites dans le brevet américain n 2.482.055 du 13 septembre 1949. Ce . milieu sera appelé ci-après -milieu N", et on y ajoute le bromure eh quantités indiquées, suivant le débir ou les besoins.
On décrira mieux l'invention au.moyen des exemples précis qui suivent, mais il y a lieu de souligner que ces exemples sont donnés ici principalement pour illustrer la forme de réalisation préférentielle, et ne doivent pas être interprêtés comme limitant l'invention. Dans ces exemples, l'expression "milieux riches en chlorures", désigne un milieu contenant plus que suffisamment d'ions chlorure pour assurer la production complète de chlorotétracycline de la souche particulière utilisée, tandis que l'expression "milieux à teneur limitée en chlorures", désigne les milieux contenant une quantité d'ions chlorure insuffisante pour le potentiel total de production ae chlorotétracycline de la souche particulière utilisée.
Pour illustrer plus clairement ces définitions il faut noter que 1 partie par million d'ions chlorure
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donne un potentiel correspondant à environ 14 microgram- mes de chlorotétracycline par cm3, donc, si une souche particulière a une capacité potentielle de production de 2800 microgrammes de chlorotétracycline par cm3, on considérera comme "rche en chlorures" un milieu à plus de 200 parties par million d'ions chlorure, et comme milieu "à teneur limitée en chlorures", un milieu contenant moins de 200 parties par million jusqu'à un minimum de 50 parties par million.
EXEMPLE 1
Voici l'effet exercé par le bromure de potassium sur la production de chlorotétracycline et de tétra cycline par le Streptomyces aureofaciens, souche A-377? NNRL-2209, dans un milieu "N" comprenant 2 % de liqueur de macération de mais,'qualité pénicilline à 50 % de solides; 3% de saccharose; 0,7 % de carbonate de calcium, et 0,2 % de sulfate d'ammonium, modifié et ajusté par la sélection des sels des oligo-éléments ci-dessus mentionnés, de manière à contenir environ 100 parties par million de chlorures :
KBr et Br- sont exprimes en parties par million, dans toute la description de l'invention, et les rendements en chlorotétracycline et en tétracycline sont
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exprimés en microgrammes par cm3.
EXEMPLE 2
Voici l'effet exercé par le bromure de potas- sium sur la production de chlorotétracycline et de tétracycline par le Streptomyces aureofaciens, souche S-580, type non ramasseur de chlorures, Gans un milieu riche en chlorures comprenant 25 g/1 de liqueur de macération de mais, 50 g/1 d'amidon de maïs, 7 g/1 de carbonate de calcium, 1,5 g/1 de chlorure d'ammonium, 50 mg/1 de sulfate de manganèse, 5 g/1 de sulfate dtammo- nium, et contenant environ 1000 parties par million de chlorure :
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<tb>
<tb> Titrage <SEP> chimique
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 2230 <SEP> 900 <SEP> 3130
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 440 <SEP> 3050 <SEP> 3490
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 410 <SEP> 3110 <SEP> 3520
<tb>
CTC déterminé par titrage fluorimétrique.
EMI7.2
<tb>
<tb>
Titrage <SEP> biologique <SEP> (E.coli)
<tb> KBr <SEP> Br" <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 2430 <SEP> 910 <SEP> 3140
<tb> 200 <SEP> @ <SEP> 133 <SEP> 440 <SEP> 2940 <SEP> 3380
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 410 <SEP> 2210 <SEP> 2620
<tb>
EXEMPLE 3
Voici l'effet exercé par le bromure de potassium sur la production de chlorotétracycline et de tétracycline par le Streptomyces aureofaciens, souche S-580, dans un milieu à teneur limitée en chlorures de 90 parties par million (milieu N sans addition volontaire de chlorures, et liqueur de macération de mais non traitée) :
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EMI8.1
Titrage cY:.:¯'ae
EMI8.2
<tb>
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> O <SEP> 645 <SEP> 3620 <SEP> 4270
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 160 <SEP> 3810 <SEP> 3970
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 180 <SEP> 3840 <SEP> 4020
<tb>
CTC déterminé par titrage flucrimétrique avec photomultiplicateur.
EMI8.3
<tb>
<tb>
Titrage <SEP> biologique <SEP> (E. <SEP> Coli)
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 570 <SEP> 3180 <SEP> 3650
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 210 <SEP> 3320 <SEP> 3530
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 160 <SEP> 3260 <SEP> 3420
<tb>
EXEMPLE 4 Voici l'effet exercé par le bromure de potas-
EMI8.4
sium sur la production de chlorot6tr,,,(,I,-cli.np- et de l >.é..... tracycline par le Streptomyces aureofac'imsj souche S-77e type ramasseur de chlorures, dans un ..il.:î (':¯1 .1 >' riche en chlorures, à 1000 parties par million :
EMI8.5
<tb>
<tb> Titrage <SEP> chimique
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 5180 <SEP> 500 <SEP> 5680
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 4700 <SEP> 850 <SEP> 5550
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 4800 <SEP> 860 <SEP> 5600
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 4450 <SEP> 1000 <SEP> 5450
<tb>
CTC déterminé par titrage fluorimétrique
EMI8.6
Titrage biologioue (E.
Coli) KEr Br" CTO TC Total
EMI8.7
<tb>
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 5400 <SEP> 490 <SEP> 5890
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 5100 <SEP> 680 <SEP> 5780
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 5200 <SEP> 840 <SEP> 6040
<tb>
EMI8.8
EE;,::PI.3 5 Voici l'effet exercé psr ces concentrations variables de bromure ce potassium, sur la pr(;cl1.:cj Cl] do chlorotétracycline et ce tétracycline du ui;i'cl'"',
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ces aureofaciens, souche S-77, dans un milieu "N" riche en chlorures similaire à celui de l'exemple 2 et contenant approximativement 10C parties par million de chlorures :
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<tb>
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 5100 <SEP> 470 <SEP> 5570
<tb> 50 <SEP> 33 <SEP> 5100 <SEP> 525 <SEP> 5630
<tb> 100 <SEP> 67 <SEP> 4800 <SEP> 545 <SEP> 5350
<tb> 150 <SEP> 100 <SEP> 4650 <SEP> 580 <SEP> 5230
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 4750 <SEP> 650 <SEP> 5400
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 4350 <SEP> 610 <SEP> 4960
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 4400 <SEP> 625 <SEP> 5130
<tb> 350 <SEP> 233 <SEP> 4450 <SEP> 680 <SEP> 5130
<tb> 400 <SEP> 267 <SEP> 4100 <SEP> 680 <SEP> 4780
<tb> 500 <SEP> 333 <SEP> 4350 <SEP> 820 <SEP> 5170
<tb>
CTC déterminé par titrage fluorimétrique avec photomultiplicateur.
EXEMPLE 6
Voici l'effet exercé par des concentrations variables de bromure de potassium sur la production de chlorotétracycline et de tétracycline du Streptomyces aureofaciens, souche S-77, dans un milieu à teneur limitée en chlorures, que l'on a obtenu en remplaçant, dans un milieu "N", les chlorures utilisés par d'a-res cations (notamment sulfates), et en utilisant une liqueur de macération de maïs sélectionnée,
les chlorures présents étant d'environ 90 parties par million
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<tb>
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 645 <SEP> 3620 <SEP> 4270
<tb> 50 <SEP> 33 <SEP> 245 <SEP> 3890 <SEP> 4140
<tb> 100 <SEP> 67 <SEP> 210 <SEP> 3950 <SEP> 4160
<tb> 150 <SEP> 100 <SEP> 210 <SEP> 3920 <SEP> 4130
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 160 <SEP> 3810 <SEP> 3970
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 180 <SEP> 3840 <SEP> 4020
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 160 <SEP> 3630 <SEP> 3790
<tb> 350 <SEP> 233 <SEP> 90 <SEP> 3670 <SEP> 3760
<tb> 400 <SEP> 267 <SEP> 130 <SEP> 3810 <SEP> 3940
<tb> 500 <SEP> 333 <SEP> 165 <SEP> 3770 <SEP> 3940
<tb>
CTC déterminé par titrage fluorimétrique avec photomultiplicateur.
EXEMPLE 7
On conduit les processus indiqués à l'exemple 1, à peu près tels quels, en utilisant une couche A-377 NNRL-2209, le seul changement apporté consistant à utiliser du bromure d'ammonium à la place du bromure de potassium. On obtient des résultats comparables à ceux indiqués à l'exemple 1.
EXEMPLE 8
On conduit les processus indiqués à l'exemple 1, à peu près tels quels, en utilisant une souche A-377 NNRL-2209, le seul changement apporté consistant à utiliser du bromurè de calcium à la place du bromure de potassium. On obtient,des résultats comparables à ceux indiqués à l'exemple 1.
EXEMPLE 9
Dans une fermentation en cuve profonde, en utilisant un milieu "N" comprenant 20 parties de liqueur de macération de mais, 30 parties de saccharose, 7 parties de carbonate de calcium et 2 parties de sulfate d'ammonium dans 1000 parties de milieu de fermen-
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tction, ajusté à 1000 parties par million datons chlorure, on obtient les résultats de production suivants, en utilisant une souche de Streptomyces aureofaciens S-77, ramasseuse de chlorures :
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<tb>
<tb> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Total
<tb> 0 <SEP> 6450 <SEP> 300 <SEP> 6750
<tb> 500 <SEP> 4650 <SEP> 1230 <SEP> 6880
<tb>
REVENDICATIONS 1. Procéda perfectionné de préparation de la tétracycline par fermentation de souches de creptomy- ces aureofaciens productrices de tétracycline et de chlorotétracycline, caractérisé en ce qu'on utilise pour la croissance desdites souches des milieux de fermentation contenant plus de 50 parties par million d'ions chlorure, et de 10 à 500 parties par million d'ions bromure, de préférence 10 à 350 parties par million, ce qui augmente le rapport tétracycline : chlorotétracycline dans le produit.