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La présente invention est relative à un nouveau pro- cédé pour la déshydrogénation fermentative de stéroïdes, pour la scission oxydante de la chaîne latérale en 17 de stéroïdes ou pour les deux, et aux produits en résultant.
Le procédé de la présente invention consiste à sou- met tre un stéroid : à l'action d'un champignon du genre Septomyxa.
Une déshya énation est ainsi effectuée spécialementà la posi- tion 1-2 lorsque le stéroïde de départ est sature aux atomes de carbone des positions 1 et 2. Pour la déshydrogénation, des sté-
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roïdes de départ oxygénés en 3 ayant deux atones d'hydrogène chacun des atomes de carbone des positions 1 et 2 sont spéciale- ment intéressants. Une dégradation de la chaîne latérale en 17 peut également être effectuée pour donner ues stéroïdes 17-hydro- xyliques et 17-cétoniques, spécialement à partir d'un stéroïde de départ oxygéné en 20.
Alors qu'on a observé une dégradation de la chaîne latérale et une ouverture concomitante du neau avec une série d'organismes, une déshydrop;énation dans le noyau A et une dégra- dation sélective de la chaîne latérale sans ouverture du noyau ont été observées avec un petit nombre seulement d'organismes.
C'est ainsi que Fried et d'autres, Journal of American Chemical Society 75, 5764-5 (1953) montrent qu'une fermentation, par Cylindrocarpon radicola, de progestérone, de 17 [alpha] , 21-dihydroxy- 4-prégnène-3,20-dione, ou de testostérone produit de la #1 -dé- hydrotestololacétone avec ouverture du noyau D initial. Par con- tre, la présente fermentation de stéroïdes par Septomyxa permet au noyau D de rester intact dans une grande mesure.
Un but de la présente invention est de procurer un procédé de fermentation par Septomyxa pour la déshydrogénation de stéroïdes, spécialement de stéroïdes saturés à la position 1-2. Un autre but de l'invention est de prévoir un procédé pour la production de #1 1 -stéroïdes. Un autre but de l'invention est de prévoir un procédé pour la dégradation de la chaîne laté- rale en 17 de stéroïdes, spécialement de stéroïdes oxygénés en 20, par l'action d'un champignon du genre Septomyxa. Un autre but de l'invention est de prévoir un procédé pour la production de stéroïdes 17-hydroxyliques et de stéroïdes 17-cétoniques.
D'autres buts de la présente invention consistent à prévoir de nouveaux #1 -stéroïdes intéressants. D'autres buts et utilisa- tiorsde la présente invention apparaîtront d'ailleurs aux spé- cialistes en ce domaine.
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La production de .A-sturoifin.. ,<,t couine, -jais rus- qu'à présent elle a entraîne un tP'17.1;C:IG1'lt chimique tl.Ia:I.C::1..E:, tel qu'une dibroniation d'un 3terorde pour donner, en (':; 18 t'."ps que d'autres monomères, le composé .,*-ciibror7o, qui pouvait alors subir un enlèvement d'hydracide avec de la pyridine pour donner un Al,4¯stérol"de, Fieser et Fieser, raturai Products Related to Phenanthrene, Ed. J, J':'.r"G :G64, Keinhold Pull. Co. j,'.Y. 1949, et brevet lJ.S..d.. Dei ar¯.-f¯ :.5"l t."/' du .-1-51. Par le présent procédé, les. & -stéroïdes et les ], 1+ -stéroïdes peuvent être réalisés directement.
Le présent procédé est intéressant pour réintroduire la fonction # là où, par exemple, elle peut avoir été détrui- te par un traitement préalable, tel que par des incubations de #1 , #1 # -hydrogénase de levure, qui convertissent la # -andros--
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téne-;,17-cïione en androstane -3 ,17 %J -diol avec saturation de la position 1-, Butenandt, Ber. 73, SI 8 (1940).Jusqu'à pré- sent, des transformations directes dans ce groupe connu de #1 - stéroïdes n'ont 'cas été utilisables à cause de l'absence d'un
Al procédé convenable de préparation de * * -stéroïdes, Dorfman et
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Ungar, Metabolism of Steroid Hormones, papes 8o,93, Burgess Piibl, Co.
Hinneapolis, Uinnesota, 1953.
Le procédé de la présente invention est apte à four- nir une variété de produits qui sont des produits thérapeutiques intéressants en eux-mêmes aussi bien que comme intermédiaires dans la production d'autres produits thérapeutiques. Les 1-déhy- dro stéroïdes produits instantanément, par comparaison avec les stéroïdes saturés en 1 correspondants, ont généralement un plus bas point de fusion et une activité pharmacologique accrue. Ils sont de plus des intermédiaires de valeur là où on désire aroma- tiser le noyau A.
Les composés de départ de la prenante invention sont susceptibles d'une déshydrogénation, spécialement à la position
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1-2, ou d'une dégradation de la chaîne latérale n 17, ou de (,'eux transformations. La déshydrogénation est spécialement intéressante en liaison avec des stéroïdes saturés à la posi- tion 1-2. Elle peut être réalisée, de préférence, sur des sté-
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roides tels que ceux qui sont oxygènes en j, c'st-a-dire, conte- 3 ester nant le groupe 3-hydroxy, i-étlieij/ou j-céto, dans lesquels les atomes de carbone des positions 1 à 3 peuvent être représentés co aie suit : -CH ;- CH 2-Cü-; -CH-CH-CHOH-; -#..-UH(CH. )-CO-.
En liaison avec la dégradation de la chaîne latérale à la posi- tien 17, on a comme spécialement intéressants, des stéroïdes de
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départ oxygénés en 20, de préférence les stéroïdes 0-hrd.rcxy- liques et les stéroïdes 20-cétaniques. Le cyclopentano-polyhy- dro-phénanthrène de départ peut posséder d'autres substituants,
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par exenple, des groupes cétoniques ou des groupes hydroxyxliques en positior 3,6,7,,11,1,14,1? et 21, spécialement à la position 11, et peut avoir des doubles liaisons en diverses positions, spécialement aux positions 4-5 et 17-20. Le stéroïde de départ peut a voir divers substituants ailleurs sur la molécules sans nuire à la nature, de la réaction sur les positions actives dé- crites ici.
Lorsque le stéroïde de départ est saturé à la posi- tion 1-2, il peut être soit dégradé, dans la chaîne latérale en position 17, en stéroïde 17-hydroxylique ou stéroïde 17-céto- nique, ou déshydrogéné à la position 1-2 pour donner une double
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liaison à cet endroit, ou être à la fois dé';rané à le chaîne la- térale et aéshydrogéné . Les stéroïdes à noyau cl aromatique ré- sultent de 19-hydroxy; 19-aldéhyde-, ou l9-norméchyl-3-céto- A4- stéroïdes.
Conme représentations des rmti¯èra de départ, on a : les. 3 0(, - et 3 -hydrcxyn,.nane-U-onas, les.\3OC- et 3 p - hydroxy-5-présnene-20-ones, les et 3 f3 -hydro::ypré,nane- 11,20-diones, les 3 <.:(,11 c{ -, >0C ,11 f3 -, .) ft ,11 oC et ,11 -dih,üro;vpremnane-NU-ones, la ll-dclhydropro'-estérone, les c 0(.-fluoro-, 0,-chloro- ou ol-brorl1()- 1,)ro -,est ('-,i,oll(,s
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V: l'7 C(.. -méthy1déhYllrocorticos térone, la 17 0(. -méthy1-11-d ésoxy- corticostérone, la l7o(-niethylproestérone, le 12 0(,-hyâro:rypro- gestérone, la progescérone, la 11-cétopro.estérone, la 11 oC-hy- droxypro[';8s1iérone, la 11 0(, -acétoxypro!"estérone, la j.1 (! -hy- droxyprogestérone, la 14<?C.- hydroxyprocestérone, la l7$-"-hy¯ droxypro;estéron8, la 1.
CO ,1'i OC 1-t: ihyàrofcy-4.-pré ;nane.- 3,0-dione, la lL 0(, ,17 o(.-dihydroxy-21-acétoxy-4-prérnène-), ;w- dione, la 11oC,17 oC -clihydros,yproç;estérone, la 17 1 -hydroxy- 11-cétoproc;estérone, le ,17 , 0-allopré nanetriol , la 17 OC, 21-dihydroxy-4-prégnène-3,0-dione, la 1-hydroxy-4-prénène- 3,11,'0-trione, la cortjcostérone (11 , ,Z1-dihydrocy.-l-prëunnne- 3,20-dione), la 11-désoxyconticostérone ( 1-hydro>y-t,.-p.réMéne- , 3,20-dione), la cortisone ( l'i' ," l-dihydxoxy-l-.prégnëne-i,11 , 0- ;
trione), l'acétate de cortisone (17 cC-hydroxy-21-acéto:;cy¯4-pré- nÉne-3,11, U-trione ) , l'hydroxycorbisone (11 jj ,17 f,7r , 1-trihy- droxy-4-prëgnène-3,0-dione), les 9 CC -chloro-,bromo-,ou fluoro- 11 fj l'7 , l-trihydrol>y-x.-pra-,nêne-j, EU-cxiones , la 2-méthyl- 11 ,17 OC ,21--trihyôro-/,y-1.-préKncne-3,û-dione, la 11 OC ,17 0 , 21-trihydroxy-4-prégnene-3,20-dione, la 4-androstène-3, 17-dione, l'a.ndrénastérone (I-a,ndrost :ne-a,11,1'7-triane),l.a 11-cétotestos- tërone, les 1106- et 11 n -hydro;cy-17 oC-ri1-éthyl-testostérones, la 17 (,,-éthin3Tltestostérone, la prër¯nàne-,11 ,NC-trione, la 17 0 -hydroxyprw.'ùane-j,11,2:O-trione, la 17 d..- , ,21-dihydroxypré- ;nane-3,11,U-.trione, 1&. pr:
ïraue-,1,N0-trione, la préfrnane- 3,20-digne, la 1.? -hydroTp-rénane->,.C)-diona, l'ail opréAnane- 3,11,20-trione, l' alloprégnBYle-3, ,.;O-clione, la 3 c(. -hydroxy-5- prenène-20-one, la " j"J'1:1. .-cül:yctzaxy-.1.? anrét:nrne-U¯anes les 30C- et 3 -hydroxya(llaré.;nan-a0-ones, l'androstérone (an- drostan -j C -0l.-17-one ) , la 3 0( ,l, (')G ,1-trihydroxyprGpnan- 20-one, la testost ####,-, la 1J-iorméthyl-tes.;aste:rone, la 17 OC - ntéthyltestostérone, 11 fi 1-dihydrohy-.,1'l ( U )-pr é;nad.ëne- , 3-one, la 2-mëthyl-' ir p 21-di.hrdro:cy-., l'/ ( 0 ) -pré,na dicr.e-3-one,
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la 21-hydroxy-4,17(20)-prégnadiène-3,11-dione, la 11 ,21-di- h-droxy-t,17(0)-pr,:;nadiêne--ane, la -irorno-11 r.:l-c1ihydro- =cy-c,17 ( zU ) -pr ê;nacîiêne--one , la 17 OC ,21-dihydroxy-4,9(ll)- pré;nadiène-3,:
U-diorm, la 17, , 1-dihydroxy-I..nr,:rrrF,rre-:11- (3 -o:ydo-3, .U-d.one, l-méthrl-l7 OC , 21-dihydroxy-4 , CA 11 ) - prénadiène-3,20-dione, la z-méthyl-l'l pG ,21-dihpdrosy---prés,'nÈnr n:ll- -oxydo-3,U-dione, et les 2-méthyl-c C%,-crloro-,bromo.-, ou fluoro-ll j3 l! CJ , -trihydroxy-l-pré;néne-3 , 0-d iones .
L'un ou l'autre des stéroïdes hydroxyliques libres ou leur for-
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me d'ester peuvent être utilisas couve substrat de stéroïde de départ. Ia déshydrogénation en 1-2 résultante s'effectue en tss# tout cas pour produire la forme 1-déhydro correspondante de la
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nattière de départ avec récupération comme alcool libre.
Dans la procédé de la présente invention, les conditions opératoires et le processus ainsi que les détails de réac- tion peuvent être ceux qui sont déjà connus dans la technique
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de la bio-conversion de stéroïdes, télé qu'illustrée par Hurray et d'autres dans le brevet U.S.A. 2.602.769 accordé le ci juillet 1952, utilisant du reste l'action d'une espèce de champignon du Eenre Septomyxa. Le genre Septomyxa appartient à la classe des
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Deuteromyces, Fungi inperfecti, de l'ordre des 1-lélanconiales de la famille des Helanconiacées. Parmi les espèces du genre Septo- Myxa que sont intéressantes dans la fermentation de stéroïdes, (Sherb. );lr.,..T.C.t.6737, Septomyxa sesculi, on a les oeatomyxa affinis,iseut s . ixa corni, Sentor3.xa salicina et Septomyxa tulasnei.
La culture des champignons, pour les buts et la mise en pratique de la présente invention, se fait dans ou sur un milieu favorable au développement des champignons. On peut utili: ser des milieux solides, mais les milieux préférés sont ceux qui permettent une croissance quantitative sous des conditions aéro- biques. On peut utiliser des milieux à particules solides humides tels que son, grains de céréales, gruaux, déchets de bois, co-
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peaux, sciure, balle de crains, matière fibreuse, et 1 que co- pra, châtaignes, et sentences de lupin.
Ces matières peuvent être extraites à l'alcool, à l'éther ou autres solvants organiques, pour enlever les souillures nuisibles et les inhibiteurs de croissance, avant fermentation. Cessupports peuvent facultative- ment contenir des additions de facteurs de croissance et d'agents nutritifs et peuvent être utilises en couches ou en plateaux avec ou sans aération auxiliaire, dans des tours comme dans le procédé pour le vinaigre ou sous des conditions d'agitation comme, par exemple, par agitation dans un tambour rotatif.
Des milieux liquides , par exemple un moût de brasserie, conviennent bien pour être utilisés sous des conditions à couches aérobiques ou plus spécialement de fermentation submergée aérobique. Les mi- lieux devraient, de préférence, conenir des sources de carbone, d'azote et de minéraux disponibles, bien qu'évidemment on puisse arriver à un croissance et un développement convenables sous des conditions inférieures aux conditions optima.
Le carbone disponible peut provenir de aarbohydrates, amidons, amidons gélatines, dextrine, sucres, mélasses telles que de canne, de betterave et de sorgho, glucose, fructose, man- nose, galactose, maltose, sucrose, lactose, pentoses, amino- acides, peptones ou protéines, les hexoses étant préférés. Des acides gras inférieurs, des acides gras supérieurs ou des grais- ses constituent des exemples d'autres Matières qui fournissent du carbone assimilable pour les exigences en énergie des chanpi- gnons. Des mélanges de diverses sources de carbone sont parfois avataeeux.
L'azote nous forme assimilable peut être fourni par des matières solubles ou insolubles : protéines végétales ou animales, farine de soja, lactalbumine, caséine, albumine des oeufs, peptones, polypeptides, amino-acides, amides d'acide, urée, sels d'ammonium, ammoniaque sur des résines échangeuses de
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base ou sur vos :Mo1.1tcs, chlorure ci',t.d,iOllil.1" i1i,tl":", [J';1',!';.1,rJ ClEy'S¯t.Llt.l, nitrate mf-'. pot':'I";UÍl1Hl ou IIIOY"j)t10l.l.rl. Lu j"c.,i1, 1; jt'., Ctc:S .:., lk'2't:S sol11<\]u:3 de dis lui lotion, liqueur (1(; t1': y..itYfs do céréales, ou extrait (1.' levure sont utiles.
Do:-me cons-.-;' t:ani;s minéraux, les ::1 lieu:¯ ou le dits- solvant peuvent COt1t,Cl}::, par nrësence nl,urvl J i uU p"Jl' addition, cas u0t,'ux disponible-:, tels tLltCtluttlinitll.i, c;.lc1.Ui., (:i1!'C:.;, cobalt cuivre, ^ü11it1II, iE'Y' It''1-(.,'ûlut.l, Molybdène, lJOt...à;?-ütt, sC2n(iur!, uraniun et vanadium . Le soufre peut êt-.re fourni par des sul- :'..'[.2.8 , al:cyl sulfonates, sulfoxylates, sulfamates, suifinates, sou,:1'9 libre hyposulfite, p0rsulÎè<te, tliiosull'ate, iaét1-lioniYle, cystéine persulfate, thiosulfate, méthionine, cystine, thiür.line ou biotine.
On peut avoir une présence de phosphore de préférence pentavalent, en une concentration r -,1 S. i- re de 0,001 à 0, 07 ou voisine, spécialement 0,015 à 0,02 ou @ viron, et ce sans forme d'ortho-, méta-, ou pyrophosphates, sels ou esters, phytine, acide phytique, phytatcs, clycérophosphate,
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nucléinate de sodium, et/ou liqueur de treipape de céréales, ca- séine, lécithine ou ovovitelline. Le bore, l'iode et le sélé-' nium peuvent être é: vanté,ceux en traces. Le bore, sous la forme d'acide borique ou de borate de sodium peut avantageusement être présent ou ajouté, spécialement après germination et première croissance du champignon.
D'autres facteurs accessoires de croissance vitami- nes, auxines et stimulants de croissance peuvent être prévus suivant les nécessité ou les désirs.
Bien qu'on puisse utiliser des milieux solides ou liquida on préfère un milieu liquide car il favorise la crois- sance du mycélium.
Pour la préservation contre l'infection, le milieu de fermentation peut contenir des agents additifs antiseptiques ou antibiotiques, tels que benzoates, sulfites, pénicilline ou tétracycline.-
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Pour faciliter la ferrientati' n, l'aération Fat,; la filtration, on peut ajouter des supports de suspension ou p./c'# liaux, tels que terres filtrantes, adjuvants fie f11tr,:: ,ion, cellulose finement subdivisée, déchets de bois, Lentonit0, car- bonate de calcium, carbonate de 1l!:',g'1.Gsiurr!, charbon de Lois, char- bon active, ou autre ''1L'.'f',,lÉ:rf- cciide pouvant tt^ aise en suspen- sion, méthylcellulose, carboxym6thylccllulose, o.l.F;7.llut;r's ou &1-
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cool polyvinylique.
L'espèce choisie de champignon se développe sur un
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milieu contenant : du carbone non st,é1'oï0¯al ;::,,;im11a;J.e, par exemple des carbohydrates, tels que du dextrose; de l'azote aussi- milable, par exemple des aino-acides, des peptones ou des pro-
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téines solubles ou insolubles; et des constituants .Minéraux, par exemple du phosphate de sodium ou d'ammonium et du sulfate de
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magnésium. Le nilieu peut avantageusement avoir, avant enser:18n- ce:lent, un pH compris entre environ 4 à environ 7, bien qu'on puisse utiliser un pli plus ou nains :;razid. On préfère un pI=1 compris entre environ 5 et environ o peur la croissance de Sep-
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tomyxa. L'ensemencement du milieu soutenant la croissance des
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champignons par l'espèce choisie de eptoMyxa peut être réalisé de toute manière convenable.
Le :âptoalù;.:r: se développe sur une r<^nli'rle de teapératures ut environ 20 à ,)0 (;, de préférence ci' envi- ron 0 à 35 F.
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La périme de développement requise de la croissance
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du champignon avant que le stéroïde a fermenter ne BrIÜ; exposé à l'action du champignon ne semole pi¯oS Stre critique; par #!lnl<:; le st1'0j:(lE' peut être ;, juut5 soit avant stc:rilÜ;[.ti'.Jl1 tl:: .ti,.zl . ou autre du milieu, au routent de l'ensemencement du ('11,.i .' (IVee une espèce de Septomyxa choisie, soit parfois, par exemple, -4 ou 1+6 heures plus tard.
Le stjro'i'dc a fornanter peut "t;,'¯ ajouté ., toute concentration convenable bion que, pour (1,.1] raisons 1'1'a- tiques, le substrat <>.<.# stéroïde à une concentration d'environ
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ou jusqu'à environ 0,5 gr. par litre ou même 0,8 gr par litre de milieu soit satisfaisant, et que 2 gr par litre soient pra- tiques ; cependant,une concentration plus élevée peut être utili- sée suivant le stéroïde particulier.
L'addition du substrat de stéroïde à mettre à fermenter peut être réalisée de toute maniè- re convenable mais spécialement en ayant en vue de promouvoir une grande surface de contact du substrat de stéroïde avec le champignon, par exemple, par dispersion du substrat de stéroïde, soit seul avec un agent dispersant, soit en solution dans un solvant organique, par mélange ou homogénéisation d'un substrat de stéroïde avec un milieu de champignon pour former une suspen- sion ou dispersion du stéroïde. Des processus à culture submer- gée ou superficielle peuvent être utilisés avec facilité, bien qu'on préfère une culture submergée.
Ou bien, des enzymes, pour la fermentation du stéroïde, d'une croissance du champignon peuvent être séparées du champignon ou milieu, mélangées avec le stéroïde ou une solution ou dispersion de celui-ci, et le mélan- ge soumis à des conditions aérobiques pour réaliser la fermenta- tion du stéroïde.
La température durant la période de fermentation du stéroïde peut être la même que celle qu'on trouve convenable pour la croissance du champignon. Il est uniquement nécessaire de maintenir cette température dans la gamme qui maintient la vie, la croissance active ou l'activité enzymique du champignon.
Bien que toute forme d'ensemencement aérobique soit satisfaisante pour la croissance du champignon choisi et la fer- mentation du substrat de stéroïde, l'efficacité- de la fermenta- tion du stéroïde est proportionnelle à l'aération et à l'agita- tion. Par conséquent, l'aération est habituellement réglée, par exemple par agitation et/ou insufflation d'air à travers le mi- lieu de fermentation. L'aération peut être effectuée par culture superficielle ou sous des conditions de fermentation submergée.
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Dos conditions a0I'oL:i ±1HCU CC)intJ1' "l;t:tlt non :;',111', h 'It 'J' 111, j 1 i,' - fcion d'air Pour i.ill:i'Utiltl.x't. de l'ozy,r"l!J1(;, 11r..i;; # #-.< !<.##,>#..t, n';ll11;rf;;; sources do Id..jlt't1f" 'S C(11lL-.I..¯IL;11t, v. l'oy'''''nu CIU17;: une j'or-.o l i1Jr( ou libh'able....:.11 uL.iLi:3tnt, de l'air CO IWt: 11i.li"1( l W t ¯' o.'.'t^ !. !¯W fl, un tau;-, avantageux d'aération est d'environ 4 al >-0 Milli''t0l: h spécialement (.ile'' lV:LrUt1 à 1 1.lilJ.imole:1 cJ' 0):r:,-'r1'; -(a<.:1- liuirt par ]itre, co,,rnc on yE31).. le (J:!terfJ1iller par la !](:;U,O(, de Coop-sr, Fernstrol.1 ot niller, 1'!'. En. c%üc;m..3, 504 (1944).
L'aération est convenablement Modifiée en utilisant des j>.I c= ".:1¯Gn:: supéri- eures ou inférieures à la pression atrJlOf3phc;riqJ.e, par 8:'-.e: lpJ.G, de 50 livres par pouce carré ou 10 livres par pouce carr de pression absolue. La fixation d'oxygène peut être facilitée par la présence de divers agents, tels que de l'acide ascorbique, de
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l'acide glutamique, de l'acide citrique, de l'acide lczCi.7¯C!ü8 de la tyrosine ou du tryptophane. Le pi peut être r05!;lé par addi- tion d'alcali ou d'acide phosphorique. On a trouvé avantageux d'ajouter un excès de carbonate de calcium pour conserver un résidu de carbonate de calcium solide.
La temps requis pour la fermentation du stéroïde varie quelque peu avec le processus utilise. Lorsque le substrat
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de stéroïde est présent au uotieirc de l'ensenencenent du milieu, on peut utiliser des périodes de ±> à 7.- heures. ;G,e.luc4nt, lors- que le stéroïde est ajouté au Cha"rlr.j-..noil, après croissance aéro- bique importante de l'organisée de champignon, par exemple, après 16 à 24 heures à la température optimum, la conversion du
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substrat de stéroïde cor1J1ence immédiatement et on obtient des ren denents élevés en 1 à 72 heures, une durée de 24 heures étant
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généraleraent satisfaisante.
A la fin de la fermentation du stéroïde , le stéloï- de fermenté résultant est récupéré du milieu de réaction de fer-
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nmc.8.tiol1.. Une manière spécialenent avantageuse ne récupération ou stéroïde fermenté suppose l'extraction du !lél¯é111<P do réaction de fermentation, not;[<"1"wnt la liqueur de f2J''wlltatiol1 et lesmycé-
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lia, avec un solvant pour les st'roldes or':a:1Ïnlw , non miscible dans l'eau, par exemple, du chlorure de Méthylène, du chlorofor-
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17'9, du tétrachlorure de carbone, du chlorure d'éthylns, du tri- clllJéthylèneJ de l'éther, de 1 r ac.!tate d'amyle, du b0n:,:;ène, etc.
La liqueur de fermentation et le mycélium peuvent dre sépares et ensuite extraits séparément avec des solvants convenables, Le mycélium peut être extrait avec des solvants ni. cibles ou non miscibles dans l'eau, l'acétone étant efficace. La liqueur -le avec
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fermentation, libérée des :'1ycélia, peut être extraite/des sol- vants non miscibles dans l'eau.
Les extraits peuvent, être combi- nés, soit avant,soit après lavage avec une solution alcaline, par exemple, de bicarbonate de soude, puis convenablement séchés, par exemple sur du sulfate de sodium anhydre, et le stéroïde fer- menté purifié résultant peut être obtenu par recristallisation à partir de solvants organiques, par trituration ou par chroaa- tographie, afin d'isoler les stéroïdes ainsi obtenus , des autres -produits de fermentation.
Les exemples suivants illustrent le procédé de la présente invention mais ne sont pas limitatifs.
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îiù;?LL 1 - Progestérone. 12 livres d'un milieu comprenant l- de éérr310se dex- trose, 2% d'une liqueur de trempage de nais à 60% de solides,
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étaient réglées à un pi de 4,9 avec ce la soude caustique. 10 ml d'huile de lard contenant 0,1 à ;7 dtoctadécanol étaient ajoutés p.-ur empêcher la formation de mousse. le milieu ,té<it stérilisé la vapeur ?, 15 livres de pression pendant 30 minutes. Au re- froidissement, le milieu stérile était ensemencé avec une crois-
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sance de a-4 heures, provenant de spores, de ;:'Ito!.wxa affinis t. r. F . t,..77.
Le milieu osait s'u'!Ís L c ita , tion et traité avec de l'air stérile un taux d'un litre d'air par minute. Apres culture i lil tf3";T;rcttLtrE3 ambiante permant eY r1[Llr;'u, le pI-i était '-i'-' 7,..5. A cette culture de ho heures, on ajoutait b f:r de prorestérone disroute ans 1> ni. di:,cétone. La fermentation de la
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progestérone était entretenue pendant 24 heures, période après laquelle le pH était de 8,1. Le bouillon de fermentation était filtré à travers une gaze pour séparer le mycélium. Celui-ci était lavé une fois avec, un litre d'acétone et ensuite deux fois avec des portions d'un litre de chlorure de méthylène.
Les li- quides ae lavage d'acétone -et de chlorure de méthylène étaient combinés avec quatre libres supplémentaires de chlorure de mé- thylène; ces sept litres d'extrait et de solvant étaient ensuite utilisés pour extraire. la liqueur filtrée. Après séparation de l'extrait, de la liqueur, celle-ci était extraite encore deux fois .avec des volumes de trois litre de chlorure de méthylène. Les extraits d'acétone et de chlorure de méthylène étaient combinés et lavés avec 1200 ml. d'une solution de bicarbonate de soude à 2%, et ensuite avec 1200 ml. d'eau. L'extrait lavé était en- suite séché avec du sulfate de soude anhydre et évaporé sous le vide pour laisser 7 gr d'extrait.
L'extrait était dissous dans 230 ml. de benzène et fractionné sur une colonne de 300 gr d'alumine (lavée à l'acide, séchée à 120 C) en utilisant des portions de 230 ml. de solvant de développement comme montré au tableau I.
EMI13.1
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TABLEAU <SEP> I
<tb>
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<tb>
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<tb>
<tb> Fraction <SEP> Solvant <SEP> Solides <SEP> d'éluat, <SEP> mgr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Benzène <SEP> ---
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> id. <SEP> 390
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> benzène-5% <SEP> d'éther
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> id. <SEP> 162
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> benzène-10/0 <SEP> d'éther
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> id. <SEP> 63
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> benzène-30).) <SEP> d'éther <SEP> 81
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> id. <SEP> 490
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> benzène-50% <SEP> d'éther <SEP> 657
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> id. <SEP> 667
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
TAJ3Ll!;
A.l, (suite) Fraction Solvant Solides d'éluat, ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯## m'frr #
EMI14.2
<tb> 11 <SEP> éther <SEP> 49
<tb>
<tb> 12 <SEP> id. <SEP> 217
<tb>
<tb> 13 <SEP> id. <SEP> 121
<tb>
<tb> 14 <SEP> id. <SEP> 93
<tb>
<tb> 15 <SEP> éther-7,: <SEP> de <SEP> chloroforme <SEP> 118
<tb>
<tb> 16 <SEP> id. <SEP> 111
<tb>
EMI14.3
17 éther-15;a de chloroforme 101
EMI14.4
<tb> 18 <SEP> id. <SEP> 119
<tb>
<tb> 19 <SEP> id. <SEP> 102
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> id. <SEP> 88
<tb>
EMI14.5
21 éther-50',0 d' ."bloroforme 69
EMI14.6
<tb> 22 <SEP> id. <SEP> 60
<tb>
<tb> 23 <SEP> id. <SEP> 49
<tb>
<tb> 24 <SEP> id. <SEP> 47
<tb>
<tb> 25 <SEP> chloroforme <SEP> 63
<tb>
<tb> 26 <SEP> id. <SEP> 16
<tb>
<tb> 27 <SEP> chloroforme-20;
3 <SEP> d'acétone <SEP> 195
<tb>
EMI14.7
28 chloroforme-50',., d'acétone 771
EMI14.8
<tb> 29 <SEP> acétone <SEP> 52
<tb>
<tb> 30 <SEP> méthanol <SEP> 35
<tb>
Les fractions de solides d'éluat 8 à 13 inclusivement, étaient combinées pour donner 2,58 gr de résidu, qui étaient triturés avec de l'éther; l'éther était décanté jusqu'à ce que les liquides de lavage décantés soient incolores. Ceci laissait 1,4115 gr de l,4-androstadiène-3,17-dione, ayant un point de
EMI14.9
fusion de 143 à 144,5 C, oGJ23 de plus de 1150 (ceci 3), D ale.
/ alc. 239,5 mp (E = 1.500). Ce composé est connu comme max. étant intérassant dans la production d'estrone.
Les fractions de solides d'éluat 19 à 25 inclusive- ment étaient combinées et recristallisées deux fois à partir d'un
<Desc/Clms Page number 15>
ml. d'acétate d'éthyle pour produire 0,3948 gr de 17ss -hydro- xy-1,4-androstadiène-3-one (1-déhydrotestostérone), ayant un point de fusion de 172 à 173 C, [[alpha]]D23 de plus de 23 , alc.
# alc. 243 mu, (ni = 16000) Ce composé est connu comme max. étant intéressant dans la production d'oestradiol.
Les fractions de solides d'éluat 27 à 30 inclusive- ment étaient combinés. Les résidus combinés étaient dissous dans du chlorure de méthylène, transformés en boue avec 10 gr de terre à diatomées Ûélite, et le solvant était ensuite évaporé. Le ré- sidu-portant la-terre à diatomées était chargé au haut d'une colonne, ce qui était fait de la manière suivante : un mélange d'un volume de toluène, d'un volume d'heptanes normaux Skellysol- ve G bouillant à 186-212 F, de 1,4 volume de méthanol et de 0,6 volume d'eau était admis à se séparer. La phase aqueuse était ensuite enlevée.
Une portion de 150 ml. de la phase aqueuse était transformée en boue avec 100 gr de terre à diatomées Célite, et ensuite la phase non aqueuse était ajoutée et la boue de mélange était versée dans une colonne. La phase non aqueuse de surplus était éliminée de la colonne. Celle-ci, chargée du résidu de stéroïde-terre à diatomées, était ensuite.éluée avec 13 portions de 200 ml de la phase non aqueuse obtenue ci-avant, 200 ml de méthanol et 200 ml de chlorure de méthylène. Les fractions 4 à 11 étaient de la 1-déhydrotestostérone. Les fractions 14 et 15 étaient de la 1-déhydrotestololactone.
Le résidu combiné des fractions 14 et 15 était repris dans du méthanol, décoloré avec du charbon activé, évaporé et recristallisé à partir de 2 ml d'a- cétate d'éthylour donner de la 1-déhydrotestololactone pure ayant un point de fusion de 221 à 223 C, et des spectres aux ray- ons infra-rougeset une rotation optique caractéristiques.
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EXEMPLE 2 - Progestérone
Le processus de fermentation et d'extraction de l'exemple 1 était suivi sauf qu'au moment de l'addition de.pro- gestérone, on ajoutait 40 ml. de HPO pour acidifier la liqueur, d'un pH de 7,3 à un pH de 2,15.
L'extrait résultant total de 6 gr était dissous dans du benzène et passé à la chromatographie de façon précise comme à l'exemple 1.
Les fractions de solides d'éluat 8 à 16 inclusivement (3,34 gr) étaient combinées et triturées avec de l'éther pour donner 1,94 gr de résidu, à savoir de la l,4-androstadiène-3,17- dione, ayant un point de fusion de 143,5 à 144, 5 C.
EXEMPLE 3 - 17 [alpha],21-dihydroxy-4-prégnène-3,20-dione.
Le processus de fermentation et d'extraction de l'exemple 1 était suivi, sauf que la. progestérone substrat de stéroïde était remplacéepar 2 gr. de 17[alpha],21-dihydroxy-4-pré- gnène-3,20-dione, dissous dans 100 ml d'éthanol.
Les extractifs pesaient 3 gr. Ils étaient dissous dans 360 ml. de chlorure d'éthylène.et fractionnés sur une colon- ne de 240 gr.de silicate de magnésium Florisil avec des portions de 360 ml de solvant comme suit : chlorure d'éthylène, trois por tions; chlorure d'éthylène-acétone, deux portions 25/1, trois portions 15/1, trois portions 12/1, trois portions 10/1 (frac- tions 12 à 14), trois portions 8/1 (fractions 15 à 17), trois portions 5/1, trois portions 2/1; acétone, six portions ; et mé- thanol, trois portions.
Les fractions de solides d'éluat 12 à 17 inclusivement, pesant 0,8 gr, étaient combinées et recristalli.. sées trois fois à partir de méthanol-chloroforme (11) pour don- ner 400 mgr de 17 [alpha], 21-dihydroxy-1,4-prégnadiène-3,20-dione, ayant un point de fusion de 238 à 42 C, [[alpha]]D23 de plus de 70 alc.
(CHOU), #maxalc. 245 (E = 13.068).
' max
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EMI17.1
EXEMPLE 4 - 17 OC -hydro;ypro;<est0rone On a it comme à l'exemple 1 sauf qu'on utilise de la 17 0(, -hyd2:ox-y,pi,o--,c,,stéronc au lieu de progestérone, pour pro- duire de la 1-dëhydro-l'j. -hydroxyproestéron8 avec un rende- ment de 5OÏ, de 1-déhydrotestostérone.
1:IAL:. AAL 5 - Allopréfnane-j,1l,20-.trione On procède comme à l'exemple 1, sauf qu'on utilise de l'alloprégnane-,''1,.G-trione, au lieu de pro[8st6rone, pour produire de la l-déhyclroadrénostérone et de la 17 -hydroxy- 1,4.-androstadiêne-.3,11-dione d'activité anabolique aL18licrée.
EXEMPLE 6 - 11-désoxycorticostérone
On procède cornue à l'exemple 1, mais on utilise de la 11-désoxycorticostérone au lieu de progestérone; on produit
EMI17.2
ainsi de la 1-déhydro-ll-désoxycorticostérone, de la 1-déhydro- testostérone, de la l,4-androstène-3,17-dione, et de la 1-déhy- drotestololactone.
EMI17.3
EïEi.'iPLE 7 - androstenedione En procèdent comme à 1 ' exenple l, mais en utilisant de la .-androstène-,1-dione, au lieu de progestérone, on pro- duit de la 1-déhydrotestostérone, de la 1,1,.-androstêne.-j,lÎ- dione, et de la 1-déhydrotestololactone.
EXEMPLE $ - testostérone
En procédant comme à l'exemple 1 mais en utilisant de la testostérone, au lieu de progestérone, on produit princi- palement de la 1-déhydrotestostérone, et également de la 1,4- androstadiène-3,17-dione.
EMI17.4
EXEl'iPLE 9 - Progetérone
Du Septomyxa affinis était cultivé'pendant 18 heures dans un milieu nutritif préparé comme décrit à l'exemple 1. Le mycélium était centrifugé à partir du milieu et lavé 6 fois par centrifugation avec de l'eau distillée. Le mycélium lavé était mis en suspension dans 600 ml. d'eau distillée et divisé en 6
<Desc/Clms Page number 18>
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portions dans des flacons d'Lrlonmeyer de 50 r.rl. On faisait des additions corme indiqué au tableau' II, et on ajoutait 40 mgr de progestérone dissoute dans 1 ml d'acétone, à chaque flacon.
EMI18.2
Les fll-consptaient soumis à culture avec agitation, L la tempé- rature ambiante pendant 24 heures. Chacune des liqueurs était soumise à extraction quatre fois avec des portions de 5 ml de chlorure de méthylène.
Chaque extrait était ensuite lavé avec une solution de bicarbonate de soude à 2% et de l'eau distillée, et séché sur du sulfate de soude anhydre; puis le solvant était évaporé. Les résidus étaient analysés par chromatographie sur papier avec les résultats donnés au tableau II. La 1-déhydropro-
EMI18.3
gestérone montre une activité prorestationnelle améliorée.
De la même manière, le remplacement du substrat de progestérone par de la 19-norméthyltestostérone avec des cellu- les lavées à fond, tamponnées à un pH de 7, produisait de la l-déhydro-19-norméthyltestostérone qui peut être transposée dans de l'acide en oestradiol.
EMI18.4
<tb> pH <SEP> TABLEAU <SEP> II <SEP> [alpha]isoléa <SEP> par <SEP> 200 <SEP> [alpha]d'extrait
<tb> Initial <SEP> Final <SEP> Additifs <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D
<tb>
<tb> 3,9 <SEP> 6,9 <SEP> - <SEP> - <SEP> 60 <SEP> 20 <SEP> 12
<tb>
EMI18.5
7,6 bio KH ,-CO3 60 6 10
EMI18.6
<tb> 2,0 <SEP> 2,1 <SEP> H3PO4 <SEP> 75 <SEP> 2 <SEP> 6-
<tb> 3,9 <SEP> 3,9 <SEP> dextrose <SEP> +
<tb> cérélose <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 2
<tb>
EMI18.7
6,2 6,.
C9C03+
EMI18.8
<tb> glucose <SEP> 3 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 2
<tb>
<tb> 5,8 <SEP> 7,0 <SEP> tampon <SEP> phosphate <SEP> 2 <SEP> 60 <SEP> 30 <SEP> 15
<tb>
A : 1-déhydroprogestérone
EMI18.9
B : l-déhydro-4-androstène-3 ,17-diQne C : 1-déhydro-testostérone D : 1-déhydro-testololactone.
EMI18.10
B,¯n fLL 10 - 11 , l-dihydrâxy-t 17 ( 0 ) -préF;nad ime-3-one .
Du Septomyxa affinis était conservé sur des cultures
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en tube couché d'agar-agar et de malt, composées de 50 gr d'ex- trait sec de malt, 5 gr d'une digestion enzymatique, à base d'Edamine, de lactalbumine, et 20 gr d'agar-agar dilués à 1 li- tres avec de l'eau de robinet et réglés à un pH compris entre
6,5 et 7. L'ensemencement provenant de la culture d'agar-agar en tube couché était transvasé dans des flacons d'Erlenmeyer d'un litre, contenant 100 ml d'agar-a ar extrait de malt, et mis en incubation à la température ambiante pendant 4 à 7 jours pour produire des spores.
Ceux-ci étaient mis en suspension dans 100 ml d'une solution stérile saline à 2%, Cinq ml. de cet en- semencement de spores étaient introduits dans chacun des cinq flacons de 250 ml, contenant chacun 100 ml d'un milieu tel qu'à l'exemple 1, qui était réglé à un pH de 4,8 à 5. On soumettait à incubation pendant 48 à 72 heures avec agitation, à la tempéra- ture ambiante, et on ajoutait ensuite à 6 litres du milieu tel qu'à l'exemple 1. Cette culture était maintenue pendant 24 heures à la température ambiante avec aération à un taux d'un litre par minute.
Ces six litres de culture-étaient alors ajoutés à 100 litres du milieu tel qu'à l'exemple 1 et mis à croître à la tem- pérature ambiante pendant 24 heures avec agitation et aération à un taux de deux litres par minute. A cette culture, on ajou- tait 25 gr de 11 ss -21-dihydroxy-4,17(20)-prégnadiène-3-one, dissous, dans 500 ml d'acétone. On poursuivait pendant 24 heures l'agitation et l'aération au taux d'un litre par minute.
Le bouillon était filtré pour donner le mycélium et la liqueur filtrée. Le mycélium était lavé avec 20 litres d'eau, et l'eau de lavage était ajoutée à la liqueur filtrée. Le mycé- lium lavé était mis. en suspension et transformé en boue deux fois, avec 12 litres d'acétone chaque fois, et ensuite mis en suspension et transformé en boue deux fois avec 12 litres de chlorure de méthylène chaque fois. Les extraits de Mycélium à l'acétone et au chlorure de méthylène, ainsi obtenus, étaient
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accumulés et ajoutés à l'extrait obtenu de quatre extractions de la liqueur filtrée et de l'eau de lavage, chaque extraction se faisant avec 24 litres de chlorure de méthylène.
Les extraits provenant de la liqueur filtrée et de l'eau de lavage et ceux provenant du mycélium étaient combinés et lavés deux fois, avec 12 litres, chaque fois, d'une solution de bicarbonate de soude à 2%, et ensuite deux fois avec 12 litres d'eau chaque fois.
L'extrait lavé était concentré pour donner trois litres de con- centré qui était ensuite évaporé jusqu'à siccité au bain de va- peur, à l'air, pour donner 54,3 gr de résidu cristallin brut. Ce résidu était trituré six fois avec 5 ml d'éther diéthylique chaque fois. Les cristaux restants pesant 20,9 gr étaient dis- sous dans250 ml de méthanol chaud, filtrés, et refroidis à la température ambiante pour donner 11,7 gr de cristaux fondant à
EMI20.1
lbl,5 - 1b3,5 C. Une portion de jC35 mgr de ces cristaux était dissoute dans 6 ni de chlorure d'éthylène bouillant .La solu- tion chaude était filtrée et cristallisée à la température am- biante avec ensuite un refroidissement à environ 5 C pour termi- ner la cristallisation.
On obtenait ainsi 238 mgr de cristaux
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fondant à 15à-lbl C. Une recristallisation, par la mené techni- que, produisant -cl5 5 "h'r e 11 ft, ,l-âiaydroxtT-1,.,17(:0)-prsgna- triène-j-are ayant un point de fusion de 1149 à 153 0. Une acé- tylation du groupe 21-hydroxylique avec de l'anhydride acèt e dans de la pyridine produisait de la 11 ss -hydroxy-21-acétoxy-
EMI20.3
l,4,17(20)-pré±natriène-3-cne qui était convertie, avec deux équivalents molaires d'eau oxygénée dens de l'alcool butylique tertiaire sec contenant de préférence un équivalent molaire de pyridine et en présence d'une quantité catalytique de peroxyde
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d'osmium, en 11 %.J , 17 oc -dihydroxy-21-a c étaxy-1, l.-prénadi ènej,0-dione
Les 11,7 gr de cristaux obtenus à p&rtir de mébhanol,
ayant un point de fusion de 11,5 à 183,5 C, étaient de la 1-mé-
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thoxy-11 /3 1-dihydrox.y-I,1'l ( 0 ) -prênadiène-3-one .
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EMI21.1
EXEMPLE 11 - l7e?C ,l-dihydroxy-4-pre'n(''ne-3,110-trionc.
En procédant comme aux exanpies 3 et 10, l'util ina- di '-,ion de 1706,l-hydroxy-.'!--pr6'';ncnu"3,ll,0-trirjne conne subo- trat de stéroïde produisait de la 7.r10.,c.)-dihydroy-l,f--yré-na- diène-3,11,0.-trione ayant des propriétés ranti-:i.nr:l:;r:rGctoires et anti-arthritiques. Le produit libre au les <.:l-R.;trs, vue par exemple le :l-acaate ou le 1-prop.ionate, sont. intéressants
EMI21.2
du point de vue thérapeutique.
EMI21.3
lï.¯FT,' 1 - 11 17o(,l-trihydroxy-4-pre;nene-3,20-dione.
En procédant suivant les exemples 3 et 10, mais en remplaçant le substrat de stéroïde de départ par de la 11 lo , "n 17 t, , 1-tr ihydxox--u-prét;ène-3, .0-dione, on produisait de la 11 /j 17 0(, ,21-trih3rdroxy-1,4--pr énadiène.-,NO-dione qui, dans
EMI21.4
sa forme libre ou comme 21-esters tels que le 21-acétate, ou le
EMI21.5
21-propionate, montrait des propriétés anti-inflanmatoires et
EMI21.6
anti-arthritiques qualitativement similaires à celles de l'hyctro- cortisone .
EMI21.7
L¯J¯:
zYLtJ 13 - 11-cétoprogestérone
EMI21.8
En procédant comme 1'exemple 1, mais en utilisant
EMI21.9
de la 11-cétoprogestérone comme substrat de stéroïde de départ, on produisait les composés anaboliquement actUë 1-déhydroadré- nostérone, 1-déhydro-ll-cétotestostërone et 1-déhycira-11-céto-
EMI21.10
progestérone, ayant une activité glucocorticoïdale..
EMI21.11
i:rîswi'LL 14 - 11 p -hydrox;,pro,-estérone En procéuant comme l'exeriple 1, nais en utilisant de la 11 oC -hydroxyprorestérone comme substrat de ca-part, on produisait les composes anaboliquement actifs 1-dehyaro-ll oC - hydrozytestostérone, 11 oi -hydroxy -l,4-androstadièneo,17- dione et 7.-dét:;rclx'o-11 (,, -hyd.roxyprok es tèrone . iiLt.PLE 1$ - 1 A -hjruroxyproj1;
'. bterone Ln procédant cc,..!rae a l'exemple mais en utilisant db la 11 -hydroXyproEestérone comoe substrat de départ, on produisait les composes anaboliquHment actifs 1-hydro-ll/-hy- droxytestosthrone, 11 /3-hydroxy-l,4-androstadim-3,17-diono et
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
dé
EMI22.2
I-hydro-ll f3 -hydro:h."Yrroi-:estérone, ayant une activité :-lucocor- ticoïdale. iL:.'LL 16 - 19-norméthy}/testostêronc En procédant cc.[ ,,'le à 1' ,xc. pie 1, mais en utilisant de la 19-norméthyltestostérone CO'1r1C stéroïdo dn déport, on pro-
EMI22.3
duisait de l'oestrone et le l'oestradiol.
EMI22.4
1=..'i. 17 - 17 OC -nidthy3.testost'.jrone n procédait. co :: ie à 1 j ï ,y7¯:. 1 , mais on utilisant de la 17 o(--:J:1étl1ylt(stostérone cor'ne stéroïde de départ, on pro- duisait u'j'ia 1-dc:hc.ro-l'7 (, -r.uahyitestostc:rone d'activité ana-
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bolique améliorée.
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.?L le - Espèces de Septomyxa 2n suivant les processus ô.¯h exemples 1 à 17,. mais en utilisant les J±-rT.:C'PlSryFi S3 E:s CL1 1, Septomyxa corni, 3Por.:1.rX-9. salicina ou '..iel1toJ.±Qa t¯'1¯'cg ii , on obtenait les ,"ê':8S résultats
EMI22.7
que ceux atteints a: rcC C ..j ::;:'0. l"t1")U::'- ffinis.
Il doit être -J,-;','-"1"!1l '##:&. l'invention n'est paS lir.1i- tée aux détails exacts 5 (,1 T i?c), t.lon ,"11 un: C')él:)0SS e,,",cts décrits car f. variantes et éq'.Tlval'3t!I:'S évidents apparaîtront aux spé- cialistes.
RK7 :IC..Vli;:;s 1. Un procédé C' ¯tI C^:1:!' ¯:E1G e- croissr-ncj d'un chi? spi- gnon du Genre bepto(1yxa sn1.lS des conditions aérohiques en pré- sence d'un milieu nutritif et d'un S'1',.t?r'tJl:i? ot 1¯, séparation du 5'Géroiae ¯ -r! ?rité résultant.
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::. Un procejoé qui coupranci. la c.-oiss.'.nce d'un. charmi- Sion au 'rcnr,:; Sr,;ptor'1:rxa sens ries conàitinns éhr0h."'1l\, en oré- sence, d'un milieu nutritif contenant (AU carboné non st.'ro.pj assimilable et un sterolde cil 20, et. lé, s,'paréltion du
EMI22.9
stéroïde fermente résultant.
EMI22.10
3. Un proco qui le cisnance d'un cha:.'pi- -.non du genre beptomyxa sous ces conuitions acrohiuuoH en présence d'un milieu nutritif contint m non steroldal
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assimilable et un stéroïde O-cétoniql1e) et la séparât;! <,n au été- roïde fermente résultant.
;.. Un procédé qui comprend la crci::aucf, d'un champi- gnon du "entre Septomyxa sous des conditions aérobiquor- en pré- sence d'un milieu nutritif contenant eu crr10n; non s1c5Y'oïd21 et un stéroïde .4.,. 4- -.;O-cÓtonique, et Ici séparation du t6rolde fermenté résultant.
5. Un procédé pour la déshydroénation à la position 1-2 d'un stéroïde, comprenant la mise en contact d'un champignon viable du genre Septomyxa sous des conditions de fermentation
EMI23.2
aérobiques avec un suéroïcie l,r-trihydro-3-oxygéné, et la sépa- ration du 6l-st éroide résultant.
6. Un procédé pour la désrryÜro3énation e. la position 1-2 d'un stéroïde, comprenant la mise en contact d'un champignon viable du genre beptonyxa sous des conditions de fermentation
EMI23.3
aérobiques avec un stéroïde l,-tétrahydro-3-oxy;éné, et la sépa- ration du # -stéroïde résultant.
7. Un procédé pour la déshydrogénation à la position 1-2 d'un stéroïde, comprenant la coissance d'un champignon du genre Septomyxa sous des conditions de fermentation aérobiques en présence d'un stéroïde 1,2-tétrahydro-3-cétonique, et la sépa.
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ration du stéroïde Li l¯j-cétonique résultant.
8. Un procédé pour la déshydrogénation à la position 1-2 d'un stéroïde, comprenant la croissance d'un champignon du genre Septomyxa sous des conditions de fermentation agitées aérobiques submergées en présence d'un stéroïde 1,2-tétrahydro-
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3-oxygéné, et la séparation du stéroïde /.\ -3-oxyëné résultant.
9. Un procédé pour la déshydrogénation la position 1-2 d'un stéroïde, comprenant la croissance de Septomyxa affinis sous des conditions de fermentation agitées aérobiques submer- gées dans un milieu nutritif contenant un stéroïde 1,2-tétrahydro.
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3-oxygéné, et la séparation du stéroïde ,d,l--oLyF;éné résultant.
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10. Le procédé de la revendication 9 dans lequel le milieu nutritif contient du carbone non stéroïdal assimilable.
11. Un procédé pour la déshydrogénation à la posi- tion 1-2 d'un stéroïde, comprenant la croissance d'un champignon du genre Septomyxa sous des conditions de fermentation aérobiques agitées submergées en présence d'un stéroïde 1,2-tétrahydro-3- cétoniaue, et la separation du stéroïde # 1-3-cétonique résul- tant. s
12.
Un procédé pour la déhydrogénation à la position 1-2 d'un stéroïde, comprenant la croissance d'un champignon du gente Septomyxa sous des conditions agitées aérobiques submergées dans un milieu contenant un stéroïde 1,2-tétrahydro-3-hydroxyli- que, et la séparation du stéroïde # 1-3-oxygéné résultant. comprenant la croissance d'un champignon 13. Un procédé/du genre Septomyxa sous des condi- tions aérobiques dans un milieu contenant de la progestrone, et la séparation du stéroïde fermenté résultant.
14. Un procédé comprenant la croissance de Septomyxa affinis sous des conditions agitées aérobiques submergées dans un milieu contenant du carbohydrate et de la progestérone, et la séparation du stéroïde fermenté résultant.
15. Un procédé comprenant la croissance d'un champi-. gnon su genre Septomyxa sous des conditions aérobiques dans un milieu contenant de la 11 ss, 17 [alpha],21-trihydroxy-4-prégnène-3, 20-dione, et la séparation du stéroïde fermenté résultant.
16. Un procédé comprenant la croissance de Septomyxa affinis sous des conditions agitées aérobiques submergées dans un milieu contenant du carbohydrate et de la 11 ss ,17 ci. ,21- trihydroxy-4-prégnène-3,20-dione, et la séparation du stéroïde fermenté résultant.
17. Un procédé comprenant la croissance d'un champi- gnon du genre Septomyxa sous des conditions aérobiques dans un milieu contenant de la 11ss,21-dihydroxy- #4,17(20)-prégna- diene-3-one ou un 21-acylate de celle-ci, et la séparation du stéroïde fermenté résultant.
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18, Un procédé comprenant la croissance de Septomyxa sous des conditions agitées aérobiques submergées dans un milieu contenant du carbohydrate et de la Il (3 , 21-dihydroxy- #4,17(20)-prégnadiène-3-one, et la séparation du stéroide fermenté résultant.
19. Un procédé comprenant la croissance d'un champi- gnon du genre Septomyxa sous des conditions aérobiques dans 'un milieu contenant de la 17[alpha] -méthyltestostérone, et la sépara- tion du produit fermenté résultant.
20. Un procédé comprenant la croissance de Septomyxa affinas sous des conditions agitées aérobiques submergées dans un milieu contenant du carbohydrate et de la 17 OC -màthyltestos- térone, et la séparation du produit fermenté résultant.
21. Un procédé comprenant la croissance de Septomyxa sous des conditions agitées aérobiques, avec un alloprénane, et la séparation du #1,4 -stéroïde résultant.
22. Un procédé comprenant la croissance d'un champi- gnon du genre Septomyxa sous des conditions aérobiques dans un milieu contenant une alloprégnane-3-one, et la séparation du stéroïde résultant.
23. Un procédé comprenant la .croissance d'un champi- gnon du genre Septomyxa sous des conditions aérobiques dans un milieu contenant de la 11 [alpha] -hydroxyalloprégnane-3,0-dione, et la séparation du stéroïde fermenté résultant.
24. Un procédé comprenant la croissance de Septomyxa afi'inis sous des conditions agitées aérobiques submergées dans un milieu contenant du carbohydrate et de la 11 [alpha] -hydroxyallopré- gnane-3,20-dione, et la séparation du stéroïde fermenté résultait ;5. Produits obtenus grâce aux procécés suivant l'une quelconque des revendications précédentes.
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The present invention relates to a new process for the fermentative dehydrogenation of steroids, for the oxidative cleavage of the 17 side chain of steroids or both, and to the products resulting therefrom.
The method of the present invention consists in subjecting a steroid to the action of a fungus of the genus Septomyxa.
Dehydrogenation is thus carried out especially at the 1-2 position when the starting steroid is saturated at the carbon atoms of the 1 and 2 positions. For dehydrogenation, steroids.
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Of particular interest are oxygenated starting roids at 3 having two hydrogen atoms each of the carbon atoms in positions 1 and 2. Degradation of the 17 side chain can also be effected to give 17-hydroxyl and 17-ketone steroids, especially from a 20-oxygenated starting steroid.
While degradation of the side chain and concomitant opening of the nucleus with a series of organisms was observed, dehydropenation in nucleus A and selective degradation of the side chain without opening of the nucleus were observed. with only a small number of organisms.
Thus, Fried and others, Journal of American Chemical Society 75, 5764-5 (1953) show that a fermentation, by Cylindrocarpon radicola, of progesterone, of 17 [alpha], 21-dihydroxy-4-pregnene -3,20-dione, or testosterone produces # 1 -dehydrotestololacetone with opening of the initial D ring. On the other hand, the present fermentation of steroids by Septomyxa allows the D nucleus to remain intact to a great extent.
An object of the present invention is to provide a process of fermentation with Septomyxa for the dehydrogenation of steroids, especially steroids saturated at position 1-2. Another object of the invention is to provide a process for the production of # 1 1 -steroids. Another object of the invention is to provide a process for the degradation of the 17 side chain of steroids, especially 20 oxygenated steroids, by the action of a fungus of the genus Septomyxa. Another object of the invention is to provide a process for the production of 17-hydroxy steroids and 17-ketone steroids.
Further objects of the present invention are to provide interesting new # 1 -steroids. Other objects and uses of the present invention will moreover be apparent to specialists in this field.
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The production of .A-sturoifin .., <, t squeaks, -jais rus- that now it has resulted in a tP'17.1; C: IG1'lt chemical tl.Ia: IC :: 1..E :, such as dibroniation of a 3terorde to give, in (':; 18 t'. "ps than other monomers, the compound., * - ciibror7o, which could then undergo hydracid removal with pyridine to give Al, 4¯sterol "of, Fieser and Fieser, raturai Products Related to Phenanthrene, Ed. J, J ':'. r" G: G64, Keinhold Pull. Co. j, '. Y. 1949, and lJ.S..d .. Dei ar¯.-f¯: .5 "l t." / 'du.-1-51. By the present process,. & -steroids and], 1+ - steroids can be made directly.
The present method is useful for reintroducing the # function where, for example, it may have been destroyed by pre-treatment, such as by incubations of yeast # 1, # 1 # -hydrogenase, which convert # - andros--
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tene - ;, 17-cionion in androstane -3.17% J -diol with saturation of the 1- position, Butenandt, Ber. 73, SI 8 (1940). Hitherto direct transformations in this known group of # 1 - steroids have not been usable due to the lack of a
Al suitable method of preparing * * -steroids, Dorfman et al.
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Ungar, Metabolism of Steroid Hormones, Popes 8o, 93, Burgess Piibl, Co.
Hinneapolis, Uinnesota, 1953.
The process of the present invention is capable of providing a variety of products which are valuable therapeutic products in themselves as well as as intermediates in the production of other therapeutic products. The instantaneously produced 1-dehyr steroids, compared to the corresponding 1-saturated steroids, generally have a lower melting point and increased pharmacological activity. They are also valuable intermediaries where it is desired to flavor the nucleus A.
The starting compounds of the present invention are susceptible to dehydrogenation, especially at the position
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1-2, or degradation of the # 17 side chain, or (, 'them transformations. Dehydrogenation is especially useful in connection with steroids saturated at position 1-2. It can be carried out, from preferably on steroids
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acids such as those which are oxygen in the j, i.e., containing the 3-ester containing the 3-hydroxy, i-etlieij / or j-keto group, in which the carbon atoms in positions 1 to 3 may be represented as follows: -CH; - CH 2-Cü-; -CH-CH-CHOH-; - # ..- UH (CH.) -CO-.
In connection with the degradation of the side chain at the 17-positive, there are particularly interesting steroids.
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starting oxygenated at 20, preferably the 0-hrd.rcxylic steroids and the 20-ketanic steroids. The starting cyclopentano-polyhy-dro-phenanthrene can have other substituents,
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for example, ketone groups or hydroxyl groups in the positive 3,6,7,, 11,1,14,1? and 21, especially at position 11, and may have double bonds at various positions, especially at positions 4-5 and 17-20. The starting steroid can see various substituents elsewhere on the molecules without detrimental to the nature of the reaction at the active positions described herein.
When the starting steroid is saturated at position 1-2, it can either be degraded, in the side chain at position 17, to 17-hydroxy steroid or 17-keto steroid, or dehydrogenated at position 1- 2 to give a double
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bond there, or be both side-chain de-removed and dehydrogenated. Aromatic cl-ring steroids result from 19-hydroxy; 19-aldehyde-, or 19-normechyl-3-keto-A4-steroids.
As representations of the starting rmtīera, we have: the. 30 (, - and 3 -hydrcxyn, .nane-U-onas,. \ 3OC- and 3 p - hydroxy-5-presnene-20-ones, and 3f3 -hydro :: ypré, nane-11, 20-diones, the 3 <. :(, 11 c {-,> 0C, 11 f3 -,.) Ft, 11 oC and, 11 -dih, üro; vpremnane-NU-ones, the ll-dclhydropro'-esterone , the c 0 (.- fluoro-, 0, -chloro- or ol-brorl1 () - 1,) ro -, is ('-, i, oll (, s
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V: 7 C (.. -méthy1deéhYllrocorticos terone, 17 0 (. -Méthy1-11-deoxycorticosterone, 17o (-niethylproesterone, 12 0 (, - hyâro: rypro-gestone, progescerone, 11-ketopro.esterone, 11 oC-hy- droxypro ['; 8s1ierone, 11 0 (, -acetoxypro! ”Esterone, j.1 (! -Hy- droxyprogesterone, 14 <? C.- hydroxyprocesterone, $ 17 - "- hy¯ droxypro; esteron8, the 1.
CO, 1'i OC 1-t: ihyarofcy-4.-pre; nane-3,0-dione, lL 0 (,, 17 o (.-Dihydroxy-21-acetoxy-4-prernene-),; w- dione, 11oC, 17oC -clihydros, yproç; esterone, 17 1 -hydroxy-11-ketoproc; esterone, 17, 0-allopré nanetriol, 17 OC, 21-dihydroxy-4-pregnene-3 , 0-dione, 1-hydroxy-4-prenene-3,11, '0-trione, corticosterone (11,, Z1-dihydrocy.-1-prëunnne-3,20-dione), 11-deoxyconticosterone ( 1-hydro> yt, .- p.remene-, 3,20-dione), cortisone (i ', "1-dihydxoxy-1-.pregnene-i, 11, 0-;
trione), cortisone acetate (17 cC-hydroxy-21-aceto:; cy¯4-prene-3,11, U-trione), hydroxycorbisone (11 dd, 17 f, 7r, 1- trihy-droxy-4-prenene-3,0-dione), the 9 CC -chloro-, bromo-, or fluoro- 11 fj the 7, l-trihydrol> yx.-pra-, nene-j, EU- cxiones, 2-methyl- 11, 17 OC, 21 - trihyôro - /, y-1.-préKncne-3, û-dione, la 11 OC, 17 0, 21-trihydroxy-4-prégnene-3,20 -dione, 4-androstene-3, 17-dione, a.ndrenasterone (Ia, ndrost: ne-a, 11,1'7-triane), 11-ketotestos- terone, 1106- and 11 n -hydro; cy-17 oC-ri1-ethyl-testosterones, 17 (,, - ethin3Tltestosterone, prër¯nane-, 11, NC-trione, 17 0 -hydroxyprw.'ùane-j, 11.2: O -trione, 17 d ..-,, 21-dihydroxypr-; nane-3,11, U-.trione, 1 &. pr:
ïraue-, 1, N0-trione, the prefrnane- 3,20-worthy, the 1.? -hydroTp-renan -> ,. C) -diona, garlic opreAnane- 3,11,20-trione, allopregnBYl-3,,.; O-clione, 3 c (. -hydroxy-5- prenene -20-one, the "j" J'1: 1. -Cül: yctzaxy-.1.? Anret: nrne-U¯anes the 30C- and 3 -hydroxya (llaré.; Nan-a0-ones, l 'androsterone (an- drostan -j C -0l.-17-one), 3 0 (, l, (') G, 1-trihydroxyprGpnan- 20-one, testost ####, -, 1J- iormethyl-tes.; aste: rone, 17 OC - ntethyltestosterone, 11 fi 1-dihydrohy -., 1'l (U) -pré; nad.ëne-, 3-one, 2-methyl- 'ir p 21-di.hrdro: cy-., L '/ (0) -pré, na dicr.e-3-one,
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21-hydroxy-4,17 (20) -pregnadiene-3,11-dione, 11, 21-di- h-droxy-t, 17 (0) -pr,:; nadiene - ane, la -irorno -11 r.:l-c1ihydro- = cy-c, 17 (zU) -prê; nacîene - one, 17 OC, 21-dihydroxy-4,9 (II) - pre; nadiene-3 ,:
U-diorm, la 17,, 1-dihydroxy-I..nr,: rrrF, rre-: 11- (3 -o: ydo-3, .Ud.one, l-methrl-17 OC, 21-dihydroxy- 4, CA 11) - prenadiene-3,20-dione, z-methyl-l'l pG, 21-dihpdrosy --- pres, 'nENr n: ll- -oxydo-3, U-dione, and the 2 -methyl-c C%, -crloro-, bromo.-, or fluoro-ll j3 l! CJ, -trihydroxy-1-pre; nene-3, 0-d ions.
Either free hydroxylic steroids or their form
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ester can be used as a starting steroid substrate. The resulting 1-2 dehydrogenation proceeds in tss # anyway to produce the corresponding 1-dehydro form of
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starting matter with recovery as free alcohol.
In the process of the present invention, the operating conditions and process as well as the reaction details may be those already known in the art.
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of the bio-conversion of steroids, as illustrated by Hurray and others in U.S. Patent 2,602,769 granted on July 1952, using moreover the action of a species of fungus of Eenre Septomyxa. The genus Septomyxa belongs to the class of
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Deuteromyces, Fungi inperfecti, of the order of 1-lélanconiales of the family of Helanconiaceae. Among the species of the genus Septo-Myxa which are of interest in the fermentation of steroids, (Sherb.); Lr., .. T.C.t.6737, Septomyxa sesculi, we have the oeatomyxa affinis, iseut s. ixa corni, Sentor3.xa salicina and Septomyxa tulasnei.
The cultivation of fungi, for the purposes and practice of the present invention, takes place in or on a medium favorable to the growth of the fungi. Solid media can be used, but the preferred media are those which allow quantitative growth under aerobic conditions. It is possible to use media with damp solid particles such as bran, cereal grains, groats, wood waste, co-
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skins, sawdust, husk, fibrous matter, and 1 that co- pra, chestnuts, and lupine sentences.
These materials can be extracted with alcohol, ether or other organic solvents, to remove harmful soils and growth inhibitors, before fermentation. These carriers may optionally contain additions of growth factors and nutrients and may be used in layers or trays with or without auxiliary aeration, in towers as in the vinegar process or under agitation conditions such as. , for example, by stirring in a rotating drum.
Liquid media, for example brewer's wort, are well suited for use under aerobic layered conditions or more especially aerobic submerged fermentation. The media should preferably contain available sources of carbon, nitrogen and minerals, although of course proper growth and development can be achieved under less than optimum conditions.
The available carbon can come from aarbohydrates, starches, gelatin starches, dextrin, sugars, molasses such as cane, beet and sorghum, glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, pentoses, amino acids , peptones or proteins, hexoses being preferred. Lower fatty acids, higher fatty acids, or fats are examples of other Materials which provide assimilable carbon for the energy requirements of the chanpins. Mixtures of various carbon sources are sometimes harmful.
Nitrogen forms us assimilable can be supplied by soluble or insoluble matters: vegetable or animal proteins, soybean flour, lactalbumin, casein, egg albumin, peptones, polypeptides, amino acids, acid amides, urea, salts of 'ammonium, ammonia on exchange resins of
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base or on your: Mo1.1tcs, chloride ci ', td, iOllil.1 "i1i, tl": ", [J'; 1 ',!' ;. 1, rJ ClEy'S¯t.Llt.l, nitrate mf - '. pot': 'I "; UÍl1Hl or IIIOY" j) t10l.l.rl. Lu j "c., i1, 1; jt '., Ctc: S.:., lk'2't: S sol11 <\] u: 3 de tell him lotion, liquor (1 (; t1': y..itYfs do cereals, or extract (1. yeast are useful.
Do: -me cons -.-; ' t: ani; s minerals, the :: 1 place: ¯ or the said solvent can COt1t, Cl} ::, by nrësence nl, urvl J i uU p "Jl 'addition, case u0t,' ux available- :, such tLltCtluttlinitll.i, c; .lc1.Ui., (: i1! 'C:.;, cobalt copper, ^ ü11it1II, iE'Y' It''1 - (., 'ûlut.l, Molybdenum, lJOt. ..à;? - ütt, sC2n (iur !, uranium and vanadium. Sulfur can be supplied by sul-: '..' [. 2.8, al: cyl sulfonates, sulfoxylates, sulfamates, sulfinates, sulfur ,: 1'9 free hyposulfite, porsulite, tliiosullate, iaet1-lionyl, cysteine persulfate, thiosulfate, methionine, cystine, thiür.line or biotin.
One can have a presence of phosphorus, preferably pentavalent, in a concentration r -, 1 S. i- re 0.001 to 0.07 or close, especially 0.015 to 0.02 or approximately, and this without form of ortho-. , meta-, or pyrophosphates, salts or esters, phytin, phytic acid, phytatcs, cycerophosphate,
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sodium nucleinate, and / or cereal treipape liquor, ca- sein, lecithin or ovovitellin. Boron, iodine and selenium can be praised, those in traces. Boron, in the form of boric acid or sodium borate can advantageously be present or added, especially after germination and first growth of the fungus.
Other accessory growth factors such as vitamins, auxins and growth stimulants can be provided as needed or desired.
Although solid or liquid media can be used, a liquid medium is preferred because it promotes the growth of the mycelium.
For preservation against infection, the fermentation medium may contain additive antiseptic or antibiotic agents, such as benzoates, sulfites, penicillin or tetracycline.
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To facilitate fermentation, aeration Fat ,; during filtration, suspension or p./c'# supports can be added, such as filter earths, additives fie f11tr, ::, ion, finely subdivided cellulose, wood waste, Lentonite, calcium carbonate, carbonate de 1l!: ', g'1.Gsiurr !, charcoal of Lois, activated charcoal, or other' '1L'. 'f' ,, lÉ: rf- cciide which can be easily suspended, methylcellulose, carboxymethylcellulose, olF; 7.llut; r's or & 1-
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cool polyvinyl.
The chosen species of fungus grows on a
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medium containing: non-st, e1'oï0¯al carbon; :: ,,; im11a; J.e, for example carbohydrates, such as dextrose; nitrogen, such as amino acids, peptones or pro
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soluble or insoluble teins; and constituents. Minerals, for example sodium or ammonium phosphate and sodium sulfate.
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magnesium. The nilieu can advantageously have, before enser: 18n- ce: slow, a pH of between about 4 to about 7, although one can use a plus or dwarf fold:; razid. A pI = 1 of between about 5 and about 0 is preferred for the growth of Sep-
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tomyxa. The seeding of the medium supporting the growth of
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fungi by the selected species of eptoMyxa can be carried out in any suitable manner.
The: âptoalù;.: R: grows over a range of temperatures of about 20 to,) 0 (;, preferably around 0 to 35 F.
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The development period required for growth
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fungus before the fermenting steroid burns; exposed to the action of the fungus ne semole pīoS Stre critical; by #! lnl <:; the st1'0j: (lE 'can be;, juut5 either before stc: rilÜ; [. ti'.Jl1 tl :: .ti, .zl. or other in the middle, at the seeding route of ('11, .i. '(IVee a selected species of Septomyxa, either sometimes, for example, -4 or 1 + 6 hours later.
The stjro'i'dc to be fornanter can "t;, '¯ added., Any suitable concentration except that, for (1, .1] alkal reasons, the substrate <>. <. # Steroid to a concentration of about
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or up to about 0.5 gr. per liter or even 0.8 g per liter of medium is satisfactory, and that 2 g per liter is practical; however, a higher concentration may be used depending on the particular steroid.
The addition of the steroid substrate to be fermented can be carried out in any suitable manner, but especially with a view to promoting a large contact area of the steroid substrate with the fungus, for example, by dispersing the steroid substrate. , either alone with a dispersing agent, or in solution in an organic solvent, by mixing or homogenizing a steroid substrate with a mushroom medium to form a suspension or dispersion of the steroid. Submerged or surface culture processes can be used with ease, although submerged culture is preferred.
Or, enzymes, for steroid fermentation, of a growth of the fungus can be separated from the fungus or medium, mixed with the steroid or a solution or dispersion thereof, and the mixture subjected to aerobic conditions. to ferment the steroid.
The temperature during the steroid fermentation period may be the same as that found suitable for the growth of the fungus. It is only necessary to maintain this temperature in the range which maintains the life, active growth or enzymic activity of the fungus.
Although any form of aerobic seeding is satisfactory for the growth of the fungus of choice and the fermentation of the steroid substrate, the efficiency of the steroid fermentation is proportional to the aeration and agitation. . Therefore, aeration is usually controlled, for example by agitation and / or blowing air through the fermentation medium. Aeration can be done by surface culture or under submerged fermentation conditions.
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Dos conditions a0I'oL: i ± 1HCU CC) intJ1 '"l; t: tlt no:;', 111 ', h' It 'J' 111, j 1 i, '- air fcion For i.ill: i'Utiltl.x't. de l'Ozy, r "l! J1 (;, 11r..i ;; # # -. <! <. ##,> # .. t, n '; ll11; rf ;;; sources do Id..jlt't1f "'SC (11lL-.I..¯IL; 11t, v. l'oy' '' '' nu CIU17 ;: une j'or-.ol i1Jr (or libh'able ....:. 11 uL.iLi: 3tnt, air CO IWt: 11i.li "1 (l W t ¯ 'o.'. 't ^!.! ¯W fl, a tau ; -, advantageous aeration is about 4 al> -0 Milli''t0l: h especially (.ile '' lV: LrUt1 to 1 1.lilJ.imole: 1 cJ '0): r:, -' r1 '; - (a <.: 1- liuirt by] iter, co ,, rnc on yE31) .. le (J:! terfJ1iller par la!] (:; U, O (, from Coop-sr, Fernstrol. 1 ot niller, 1 '!'. In. C% üc; m..3, 504 (1944).
The aeration is suitably modified using j> .I c = ".: 1¯Gn :: greater or less than the pressure atrJlOf3phc; riqJ.e, by 8: '-. E: lpJ.G, of 50 pounds per square inch or 10 pounds per square inch of absolute pressure Oxygen uptake may be facilitated by the presence of various agents, such as ascorbic acid,
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glutamic acid, citric acid, lczCi.7¯C! ü8 acid, tyrosine or tryptophan. The p1 can be r05l by addition of alkali or phosphoric acid. It has been found advantageous to add an excess of calcium carbonate to retain a solid calcium carbonate residue.
The time required for the steroid to ferment varies somewhat with the process used. When the substrate
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of steroid is present at the end of the medium flow, periods of ±> to 7 hours can be used. ; G, e.luc4nt, when the steroid is added to Cha "rlr.j - .. noil, after significant aerobic growth of the fungus organism, for example, after 16 to 24 hours at the optimum temperature , the conversion of
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steroid substrate begins immediately and high yields are obtained within 1 to 72 hours, with 24 hours being
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generally satisfactory.
At the end of the fermentation of the steroid, the resulting fermented steloid is recovered from the iron reaction medium.
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nmc.8.tiol1 .. A specially advantageous way of recovering or fermented steroid involves the extraction of the! lél¯é111 <P do fermentation reaction, not; [<"1" wnt the liquor of f2J''wlltatiol1 and the myc-
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IIa, with a solvent for the gold standards: a: 1Ïnlw, immiscible in water, for example, methylene chloride, chlorofor-
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17'9, carbon tetrachloride, ethylene chloride, tri-clllJethylene, ether, amyl acetate, b0n:,:; ene, etc.
The fermentation liquor and the mycelium can be separated and then extracted separately with suitable solvents. The mycelium can be extracted with neither solvents. targets or immiscible in water, acetone being effective. The liquor with
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fermentation, freed from: 'Iycelia, can be extracted from water-immiscible solvents.
The extracts can be combined, either before or after washing with an alkaline solution, for example, of sodium bicarbonate, then suitably dried, for example over anhydrous sodium sulfate, and the resulting purified fermented steroid can. be obtained by recrystallization from organic solvents, by trituration or by chromatography, in order to isolate the steroids thus obtained, from other fermentation products.
The following examples illustrate the process of the present invention but are not limiting.
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LL 1 - Progesterone. 12 pounds of a medium comprising 1 of err310se dextrose, 2% of a 60% solids walnut steep liquor,
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were set to a μl of 4.9 with this caustic soda. 10 ml of bacon oil containing 0.1 to 7 dtoctadecanol was added to prevent foaming. the medium, steam sterilized ?, 15 pounds of pressure for 30 minutes. On cooling, the sterile medium was inoculated with a growth
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a-4 hour session, from spores, from;: 'Ito! .wxa affinis t. r. F. t, .. 77.
The medium dared to be used and treated with sterile air at a rate of one liter of air per minute. After culture i lil tf3 "; T; rcttLtrE3 permant ambient eY r1 [Llr; 'u, the pI-i was' -i'-' 7, .. 5. To this culture of ho hours, we added bf: r of proresterone disroute years 1> ni. di :, ketone. Fermentation of the
<Desc / Clms Page number 13>
progesterone was maintained for 24 hours, after which time the pH was 8.1. The fermentation broth was filtered through gauze to separate the mycelium. This was washed once with one liter of acetone and then twice with one liter portions of methylene chloride.
The acetone and methylene chloride wash liquids were combined with four additional methylene chloride free liquids; these seven liters of extract and solvent were then used to extract. the filtered liquor. After separating the extract from the liquor, this was extracted two more times with three liter volumes of methylene chloride. The acetone and methylene chloride extracts were combined and washed with 1200 ml. with a 2% baking soda solution, and then with 1200 ml. of water. The washed extract was then dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated in vacuo to leave 7 g of extract.
The extract was dissolved in 230 ml. of benzene and fractionated on a column of 300 g of alumina (washed with acid, dried at 120 ° C.) using portions of 230 ml. of developing solvent as shown in Table I.
EMI13.1
<tb>
TABLE <SEP> I
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fraction <SEP> Solvent <SEP> Solids <SEP> eluate, <SEP> mgr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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Benzene <SEP> ---
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> id. <SEP> 390
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> benzene-5% <SEP> ether
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> id. <SEP> 162
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> benzene-10/0 <SEP> ether
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> id. <SEP> 63
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> benzene-30).) <SEP> ether <SEP> 81
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> id. <SEP> 490
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> benzene-50% <SEP> ether <SEP> 657
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> id. <SEP> 667
<tb>
<Desc / Clms Page number 14>
EMI14.1
TAJ3Ll !;
A.l, (continued) Fraction Solvent Eluate solids, ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ## m'frr #
EMI14.2
<tb> 11 <SEP> ether <SEP> 49
<tb>
<tb> 12 <SEP> id. <SEP> 217
<tb>
<tb> 13 <SEP> id. <SEP> 121
<tb>
<tb> 14 <SEP> id. <SEP> 93
<tb>
<tb> 15 <SEP> ether-7 ,: <SEP> of <SEP> chloroform <SEP> 118
<tb>
<tb> 16 <SEP> id. <SEP> 111
<tb>
EMI14.3
17 ether-15; chloroform a 101
EMI14.4
<tb> 18 <SEP> id. <SEP> 119
<tb>
<tb> 19 <SEP> id. <SEP> 102
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> id. <SEP> 88
<tb>
EMI14.5
21 ether-50 ', 0 d'. "Bloroform 69
EMI14.6
<tb> 22 <SEP> id. <SEP> 60
<tb>
<tb> 23 <SEP> id. <SEP> 49
<tb>
<tb> 24 <SEP> id. <SEP> 47
<tb>
<tb> 25 <SEP> chloroform <SEP> 63
<tb>
<tb> 26 <SEP> id. <SEP> 16
<tb>
<tb> 27 <SEP> chloroform-20;
3 Acetone <SEP> <SEP> 195
<tb>
EMI14.7
28 chloroform-50 ',., Acetone 771
EMI14.8
<tb> 29 <SEP> acetone <SEP> 52
<tb>
<tb> 30 <SEP> methanol <SEP> 35
<tb>
The eluate solids fractions, 8 to 13 inclusive, were combined to give 2.58 g of residue, which was triturated with ether; the ether was decanted until the decanted washings were colorless. This left 1,4115 g of 1,4-androstadiene-3,17-dione, having a
EMI14.9
melting 143-144.5 C, oGJ23 over 1150 (this 3), D ale.
/ alc. 239.5 mp (E = 1,500). This compound is known as max. being interesting in the production of estrone.
The eluate solids fractions 19 to 25 inclusive were combined and recrystallized twice from a.
<Desc / Clms Page number 15>
ml. of ethyl acetate to produce 0.3948 gr of 17ss -hydro-xy-1,4-androstadien-3-one (1-dehydrotestosterone), having a melting point of 172 to 173 C, [[alpha]] D23 over 23, alc.
# alc. 243 mu, (ni = 16000) This compound is known as max. being of interest in the production of estradiol.
The eluate solids fractions 27 to 30 inclusive were combined. The combined residues were dissolved in methylene chloride, slurried with 10 g of elite diatomaceous earth, and the solvent was then evaporated. The diatomaceous earth-bearing residue was loaded at the top of a column, which was done as follows: a mixture of one part toluene, one part normal heptanes Skellysol- ve G boiling at 186-212 F, 1.4 volumes of methanol and 0.6 volumes of water were allowed to separate. The aqueous phase was then removed.
A portion of 150 ml. of the aqueous phase was slurried with 100 g of Celite diatomaceous earth, and then the non-aqueous phase was added and the mixture slurry was poured into a column. The excess nonaqueous phase was removed from the column. This, loaded with the residue of steroid-diatomaceous earth, was then eluted with 13 portions of 200 ml of the non-aqueous phase obtained above, 200 ml of methanol and 200 ml of methylene chloride. Fractions 4 to 11 were 1-dehydrotestosterone. Fractions 14 and 15 were 1-dehydrotestololactone.
The combined residue of fractions 14 and 15 was taken up in methanol, decolorized with activated charcoal, evaporated and recrystallized from 2 ml of ethyl acetate to give pure 1-dehydrotestololactone having a melting point of 221. at 223 C, and characteristic infrared ray spectra and optical rotation.
<Desc / Clms Page number 16>
EXAMPLE 2 - Progesterone
The fermentation and extraction process of Example 1 was followed except that at the time of the addition of progesterone, 40 ml was added. of HPO to acidify the liquor, from a pH of 7.3 to a pH of 2.15.
The resulting extract, totaling 6 g, was dissolved in benzene and chromatographed precisely as in Example 1.
The eluate solids fractions 8 to 16 inclusive (3.34 g) were combined and triturated with ether to give 1.94 g of residue, i.e. 1,4-androstadiene-3,17-dione. , having a melting point of 143.5 to 144.5 C.
EXAMPLE 3 - 17 [alpha], 21-dihydroxy-4-pregnene-3,20-dione.
The fermentation and extraction process of Example 1 was followed, except that the. progesterone steroid substrate was replaced by 2 gr. of 17 [alpha], 21-dihydroxy-4-pregnene-3,20-dione, dissolved in 100 ml of ethanol.
The extractives weighed 3 gr. They were dissolved in 360 ml. of ethylene chloride. and fractionated on a 240 gr column of Florisil magnesium silicate with 360 ml portions of solvent as follows: ethylene chloride, three portions; Ethylene Chloride Acetone, two 25/1 servings, three 15/1 servings, three 12/1 servings, three 10/1 servings (fractions 12 to 14), three servings 8/1 (fractions 15 to 17) , three 5/1 servings, three 2/1 servings; acetone, six servings; and methanol, three servings.
The eluate solids fractions 12 to 17 inclusive, weighing 0.8 g, were combined and recrystallized three times from methanol-chloroform (11) to give 400 mgr of 17 [alpha], 21-. dihydroxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione, having a melting point of 238 to 42 C, [[alpha]] D23 of more than 70 alk.
(CABBAGE), #maxalc. 245 (E = 13.068).
'max
<Desc / Clms Page number 17>
EMI17.1
EXAMPLE 4 - 17 OC -hydro; ypro; <estorone It was as in example 1 except that 17 0 (, -hyd2: ox-y, pi, o -, c ,, steronc au Instead of progesterone, to produce 1-dehydro-1'-hydroxyproesteron8 in a yield of 50% of 1-dehydrotestosterone.
1: IAL :. AAL 5 - Allopréfnane-j, 11, 20-.trione The procedure is as in Example 1, except that allopregnan -, '' 1, .G-trione is used, instead of pro [8st6rone, for to produce 1-dehyclroadrenosterone and 17 -hydroxy-1,4.-androstadien-.3,11-dione with anabolic activity aL18licrea.
EXAMPLE 6 - 11-Deoxycorticosterone
The retort is carried out in Example 1, but 11-deoxycorticosterone is used instead of progesterone; we produce
EMI17.2
so are 1-dehydro-11-deoxycorticosterone, 1-dehydro-testosterone, 1,4-androstene-3,17-dione, and 1-dehydro-testosterone.
EMI17.3
IPLE 7 - androstenedione Proceed as in Example 1, but using.-Androstene-, 1-dione, instead of progesterone, 1-dehydrotestosterone, 1,1 is produced. , .- androstene.-j, lÎ-dione, and 1-dehydrotestololactone.
EXAMPLE $ - testosterone
Proceeding as in Example 1 but using testosterone, instead of progesterone, mainly 1-dehydrotestosterone is produced, and also 1,4-androstadiene-3,17-dione.
EMI17.4
EXEl'iPLE 9 - Progeterone
Septomyxa affinis was grown for 18 hours in a nutrient medium prepared as described in Example 1. The mycelium was centrifuged from the medium and washed 6 times by centrifugation with distilled water. The washed mycelium was suspended in 600 ml. of distilled water and divided into 6
<Desc / Clms Page number 18>
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portions in 50 r.rl.Lrlonmeyer flasks. Additions were made as shown in Table II, and 40 mg of progesterone dissolved in 1 ml of acetone were added to each vial.
EMI18.2
The fll-conspt were cultured with shaking at room temperature for 24 hours. Each of the liquors was extracted four times with 5 ml portions of methylene chloride.
Each extract was then washed with 2% sodium bicarbonate solution and distilled water, and dried over anhydrous sodium sulfate; then the solvent was evaporated. The residues were analyzed by chromatography on paper with the results given in Table II. 1-dehydropro-
EMI18.3
gestone shows improved prorestational activity.
Likewise, replacement of the progesterone substrate with 19-normethyltestosterone with thoroughly washed cells, buffered to pH 7, produced 1-dehydro-19-normethyltestosterone which can be transposed into l-dehydro-19-normethyltestosterone. acid to estradiol.
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<tb> pH <SEP> TABLE <SEP> II <SEP> [alpha] isolateda <SEP> by <SEP> 200 <SEP> [alpha] of extract
<tb> Initial <SEP> Final <SEP> Additives <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D
<tb>
<tb> 3.9 <SEP> 6.9 <SEP> - <SEP> - <SEP> 60 <SEP> 20 <SEP> 12
<tb>
EMI18.5
7.6 bio KH, -CO3 60 6 10
EMI18.6
<tb> 2,0 <SEP> 2,1 <SEP> H3PO4 <SEP> 75 <SEP> 2 <SEP> 6-
<tb> 3.9 <SEP> 3.9 <SEP> dextrose <SEP> +
<tb> cerelose <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 2
<tb>
EMI18.7
6.2 6 ,.
C9C03 +
EMI18.8
<tb> glucose <SEP> 3 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 2
<tb>
<tb> 5.8 <SEP> 7.0 <SEP> buffer <SEP> phosphate <SEP> 2 <SEP> 60 <SEP> 30 <SEP> 15
<tb>
A: 1-dehydroprogesterone
EMI18.9
B: 1-dehydro-4-androstene-3, 17-diQne C: 1-dehydro-testosterone D: 1-dehydro-testololactone.
EMI18.10
B, ¯n fLL 10 - 11, 1-dihydrâxy-t 17 (0) -preF; nad ime-3-one.
Septomyxa affinis was preserved in cultures
<Desc / Clms Page number 19>
in a coated tube of agar-agar and malt, composed of 50 gr of dry malt extract, 5 gr of an enzymatic digestion, based on Edamine, lactalbumin, and 20 gr of agar-agar diluted to 1 liter with tap water and adjusted to a pH between
6,5 and 7. The inoculation from the agar-agar culture in a coated tube was transferred to 1 liter Erlenmeyer flasks, containing 100 ml of malt-extracted a-agar, and placed in incubation at room temperature for 4-7 days to produce spores.
These were suspended in 100 ml of a sterile 2% saline solution, five ml. of this spore seed were added to each of the five 250 ml flasks, each containing 100 ml of a medium as in Example 1, which was adjusted to a pH of 4.8-5. incubation for 48-72 hours with agitation at room temperature and then added to 6 liters of the medium as in Example 1. This culture was maintained for 24 hours at room temperature with aeration at a rate of one liter per minute.
These six liters of culture were then added to 100 liters of the medium as in Example 1 and grown at room temperature for 24 hours with stirring and aeration at a rate of two liters per minute. To this culture was added 25 g of 11 ss -21-dihydroxy-4,17 (20) -pregnadiene-3-one, dissolved in 500 ml of acetone. Stirring and aeration were continued for 24 hours at the rate of one liter per minute.
The broth was filtered to give the mycelium and the filtered liquor. The mycelium was washed with 20 liters of water, and the wash water was added to the filtered liquor. The washed mycelium was put. suspended and slurried twice, with 12 liters of acetone each time, and then suspended and slurried twice with 12 liters of methylene chloride each time. The extracts of Mycelium with acetone and methylene chloride, thus obtained, were
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accumulated and added to the extract obtained from four extractions of the filtered liquor and the washing water, each extraction being carried out with 24 liters of methylene chloride.
The extracts from the filtered liquor and the washing water and those from the mycelium were combined and washed twice, with 12 liters, each time, of a 2% sodium bicarbonate solution, and then twice with 12 liters of water each time.
The washed extract was concentrated to give three liters of concentrate which was then evaporated to dryness in a steam bath, in air, to give 54.3 g of crude crystalline residue. This residue was triturated six times with 5 ml of diethyl ether each time. The remaining crystals weighing 20.9 g were dissolved in 250 ml of hot methanol, filtered, and cooled to room temperature to give 11.7 g of crystals melting at.
EMI20.1
1bl, 5 - 1b3.5 C. A portion of 35 mgr of these crystals was dissolved in 6 µl of boiling ethylene chloride. The hot solution was filtered and crystallized at room temperature followed by cooling to about 5 C to complete crystallization.
We thus obtained 238 mgr of crystals
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melting at 15-1bl C. Recrystallization, by the technique, yielding -cl5 5 "h'r e 11 ft,, l-aydroxtT-1,., 17 (: 0) -prsgna-triene-j- are having a melting point of 1149-1530. Acetylation of the 21-hydroxyl group with acetic anhydride in pyridine produced 11 ss -hydroxy-21-acetoxy-
EMI20.3
1,4,17 (20) -pre ± natriene-3-cne which was converted with two molar equivalents of hydrogen peroxide dens of dry tertiary butyl alcohol preferably containing one molar equivalent of pyridine and in the presence of a catalytic amount of peroxide
EMI20.4
osmium, 11% .J, 17 oc -dihydroxy-21-a c etaxy-1, l.-prenadienj, 0-dione
The 11.7 g of crystals obtained from mebhanol,
having a melting point of 11.5 to 183.5 C, were 1-me-
EMI20.5
thoxy-11/3 1-dihydrox.y-I, 1'1 (O) -prenadien-3-one.
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EXAMPLE 11 - 17e C, 1-dihydroxy-4-pre'n ('' ne-3,110-trionc.
Proceeding as in examinations 3 and 10, the ina- di 'ion of 1706, 1-hydroxy -.'! - pr6 ''; ncnu "3, ll, 0-trirjne conne subotrate of steroid produced 7.r10., c.) - dihydroy-l, f - yré-na- diene-3,11,0.-trione having ranti-: i.nr: l:; r: rGctoires and anti-arthritics. The free product at the <.: lR.; very, seen for example: l-acaate or 1-prop.ionate, are.
EMI21.2
from a therapeutic point of view.
EMI21.3
lï.¯FT, '1 - 11 17o (, 1-trihydroxy-4-pre; nene-3,20-dione.
Proceeding according to Examples 3 and 10, but replacing the starting steroid substrate with 11 lo, "n 17 t,, 1-tr ihydxox - u-pret; en-3, .0-dione, one can produced 11 / d 17 0 (,, 21-trih3rdroxy-1,4 - prenadiene .-, NO-dione which, in
EMI21.4
its free form or as 21-esters such as 21-acetate, or
EMI21.5
21-propionate, showed anti-inflammatory properties and
EMI21.6
anti-arthritics qualitatively similar to those of hyctrocortisone.
EMI21.7
L¯J¯:
zYLtJ 13 - 11-ketoprogesterone
EMI21.8
Proceeding as in Example 1, but using
EMI21.9
of 11-ketoprogesterone as the starting steroid substrate, the anabolically active compounds 1-dehydroadrenosterone, 1-dehydro-11-ketotestosterone and 1-dehycira-11-keto were produced.
EMI21.10
progesterone, having glucocorticoid activity.
EMI21.11
i: rîswi'LL 14 - 11 p -hydrox;, pro, -esterone Proceeding as exercise 1, but using 11 oC -hydroxyproresterone as a substrate, the anabolically active compounds 1-dehyaro were produced. -11 oC - hydrozytestosterone, 11 oi -hydroxy -l, 4-androstadieneo, 17- dione and 7.-det:; rclx'o-11 (,, -hyd.roxyprok es terone. iiLt.PLE 1 $ - 1 A -hjruroxyproj1;
'. bterone Ln following the example, but using 11 -hydroXyproEesterone as a starting substrate, the anabolically active compounds 1-hydro-ll / -hy-droxytestosthrone, 11/3-hydroxy-l were produced. , 4-androstadim-3,17-diono and
<Desc / Clms Page number 22>
EMI22.1
of
EMI22.2
I-hydro-ll f3 -hydro: h. "Yrroi-: esterone, having: -lucocorticoidal activity. IL:. 'LL 16 - 19-norméthy} / testosterone By proceeding cc. [,,' le to 1 ', xc. pie 1, but by using 19-normethyltestosterone CO'1r1C steroid dn deport, one pro-
EMI22.3
did estrone and estradiol.
EMI22.4
1 = .. 'i. 17 - 17 OC -nidthy3.testost'.jrone was proceeding. co :: ie at 1 j ï, y7¯ :. 1, but using 17 o (-: J: 1etylt (stosterone as a starting steroid, u'j'ia 1-dc: hc.ro-l'7 (, -r. uahyitestostc: rone of ana- activity
EMI22.5
improved bolique.
EMI22.6
.? L le - Species of Septomyxa 2n following the processes ô.¯h Examples 1 to 17 ,. but using the J ± -rT .: C'PlSryFi S3 E: s CL1 1, Septomyxa corni, 3Por.:1.rX-9. salicina or '..iel1toJ. ± Qa t¯'1¯'cg ii, we obtained the, "ê': 8S results
EMI22.7
than those reached a: rcC C ..j ::;: '0. l "t1") U :: '- finite.
It must be -J, -; ',' - "1"! 1l '##: &. the invention is not read in the exact details 5 (, 1 T i? c), t.lon, "11 un: C ') el:) 0SS e ,,", cts described because f. variants and eq'.Tlval'3t! I: 'S will be obvious to specialists.
RK7: IC..Vli;:; s 1. A process C '¯tI C ^: 1 :!' ¯: E1G e- increase by a chi? spi- gnon of the genus bepto (1yxa sn1.lS under aerohic conditions in the presence of a nutrient medium and an S'1 ',. t? r'tJl: i? ot 1¯, separation of the 5'Géroiae ¯ -r!? Rity resulting.
EMI22.8
::. A procejoé which cut off. the c-oiss. '. nce of a. charmi- Sion au 'rcnr,:; Sr,; ptor'1: rxa sens ries conàitinns éhr0h. "'1l \, in or- out, of a nutrient medium containing (AU carbonaceous non-st.'ro.pj assimilable and a steroid cil 20, et. Lé, s, 'paréltion of
EMI22.9
resulting fermented steroid.
EMI22.10
3. A proco which the cisnance of a cha:. 'Pi- -.non of the genus beptomyxa under these acrohiuuoH conuitions in the presence of a nutrient medium containing m non steroldal
<Desc / Clms Page number 23>
EMI23.1
assimilable and an O-ketoniql1e steroid) and separated it ;! <, n at the resulting summer- roid ferments.
; .. A process which comprises the crci :: aucf, of a fungus between Septomyxa under aerobic conditions in the presence of a nutrient medium containing crr10n; non-s1c5Y'oid21 and a steroid .4. .,. 4- - .; O-cononic, and here separation of the resulting fermented t6rolde.
5. A process for the dehydroenation at position 1-2 of a steroid, comprising contacting a viable fungus of the genus Septomyxa under fermentation conditions.
EMI23.2
aerobic with l, r-trihydro-3-oxygenated sueroids, and the resulting 6l-steroid separation.
6. A process for the desrryÜro3énation e. position 1-2 of a steroid, comprising contacting a viable fungus of the genus beptonyxa under fermentation conditions
EMI23.3
aerobic with a 1, -tetrahydro-3-oxy; ene steroid, and separation of the resulting # -steroid.
7. A process for the dehydrogenation at position 1-2 of a steroid, comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under aerobic fermentation conditions in the presence of a 1,2-tetrahydro-3-ketone steroid, and separates it.
EMI23.4
ration of the resulting steroid Li l¯j-ketone.
8. A process for the dehydrogenation at position 1-2 of a steroid, comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under agitated aerobic submerged fermentation conditions in the presence of a 1,2-tetrahydro- steroid.
EMI23.5
3-oxygenated, and separation of the resulting β-oxyene steroid.
9. A process for the dehydrogenation at position 1-2 of a steroid, comprising growing Septomyxa affinis under aerobic agitated fermentation conditions submerged in a nutrient medium containing a 1,2-tetrahydro steroid.
EMI23.6
3-oxygenated, and the separation of the resulting steroid, d, l - oLyF; ene.
<Desc / Clms Page number 24>
10. The process of claim 9 wherein the nutrient medium contains assimilable non-steroidal carbon.
11. A process for the dehydrogenation at position 1-2 of a steroid, comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under agitated aerobic fermentation conditions submerged in the presence of a 1,2-tetrahydro- steroid. 3- ketonia, and the separation of the resulting # 1-3-ketone steroid. s
12.
A process for the dehydrogenation at position 1-2 of a steroid, comprising growing a fungus of the gente Septomyxa under aerobic agitated conditions submerged in a medium containing a 1,2-tetrahydro-3-hydroxyl steroid, and separating the resulting # 1-3-oxygenated steroid. comprising growing a fungus 13. A process / of the genus Septomyxa under aerobic conditions in a medium containing progestrone, and separating the resulting fermented steroid.
14. A process comprising growing Septomyxa affinis under aerobic agitated conditions submerged in a medium containing carbohydrate and progesterone, and separating the resulting fermented steroid.
15. A method comprising growing a fungus. gnon of the genus Septomyxa under aerobic conditions in a medium containing 11 ss, 17 [alpha], 21-trihydroxy-4-pregnene-3, 20-dione, and separation of the resulting fermented steroid.
16. A method comprising growing Septomyxa affinis under aerobic agitated conditions submerged in medium containing carbohydrate and 11 ss, 17 ci. , 21-trihydroxy-4-pregnene-3,20-dione, and the separation of the resulting fermented steroid.
17. A method comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under aerobic conditions in a medium containing 11ss, 21-dihydroxy- # 4,17 (20) -pregnadiene-3-one or a 21 -acylate thereof, and the separation of the resulting fermented steroid.
<Desc / Clms Page number 25>
18, A process comprising growing Septomyxa under aerobic agitated conditions submerged in a medium containing carbohydrate and Il (3, 21-dihydroxy- # 4,17 (20) -pregnadiene-3-one, and separating the resulting fermented steroid.
19. A process comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under aerobic conditions in a medium containing 17 [alpha] -methyltestosterone, and separating the resulting fermented product.
20. A process comprising growing Septomyxa affinas under aerobic agitated conditions submerged in a medium containing carbohydrate and 17 OC-methyltestosterone, and separating the resulting fermented product.
21. A process comprising growing Septomyxa under agitated aerobic conditions, with an alloprenan, and separating the resulting # 1,4 -steroid.
22. A process comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under aerobic conditions in a medium containing an allopregnan-3-one, and separating the resulting steroid.
23. A process comprising growing a fungus of the genus Septomyxa under aerobic conditions in a medium containing 11 [alpha] -hydroxyallopregnan-3,0-dione, and separating the resulting fermented steroid.
24. A process comprising growing Septomyxa afi'inis under aerobic agitated conditions submerged in a medium containing carbohydrate and 11 [alpha] -hydroxyallopregnan-3,20-dione, and separation of the fermented steroid resulted; 5. Products obtained by the processes according to any one of the preceding claims.