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La présente invention concerne un procédé de fabrica- tion de substance d'enzyme protéolytique et plus particulièrement d'un protéinase pancréatique spécialement utile à la dispersion de cellules de tissu dans des cultures de tissu.
La préparation d'agents do culture de tissu pour assurer la croissance de micro-organismes, tels que les virus de dégénération de tissu, comprend la dispersion de cellules de tissu dans le milieu de culture pour faciliter son accessibilité
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aux micro-organismes. Jusqu'à. présent, cette dispersion de cellules de tissu dans le milieu de tise été obtenue avec des produits pancréatiques bruts. Ces pr@@@aits contiennent toute une variété d'agents du type enzyme coriprenant des protéinases, des lipases, des amylases et des nucléases. En conséquence, l'application de matières de pancréas brut aux cultures de tissu a pour effet une hydrolyse et une décomposi- tion de nombreux constituants de ces dernières en plus de la dispersion de cellules du tissu.
Ceci produit une destruction indésirable de certains élé ants ses ntiels de la culture de tissu et rend on ne,,peut difficile l'obtention de cultures uniformes de tissu d'une masse à l'autre. En conséquence, la croissance de micro-organismes dans les cultures de tissu ne peut pas être contrôlée dans la Mesure désirée.
On a maintenant trouvé un procédé de production d'une substance enzyme protéolytique capable de disperser des cellules de tissu dans des cultures de micro-organismes sans produire des dégradations et décompositions indésirab dans la culture de tissu. Cette enzyme que l'on a appelée "pancrine" peut être caractérisée analytiquement par son aptitude à faire cailler le lait dans le procédé de Kunitz (voir J. Gen. Physiol 18, 495 1935), dans lequel le caillage du lait est exprimé en unités rainette par mg. d'enzyme et par son inaptitude à coaguler du plasma citré sur toute base de comparaison avec la trypsine, c'est-à-dire le poids, la détermination protéolytique en unités ou la détermination en unités d'esterase TSAME.
De même, la pancrine peut être caractérisée par sa sensibilité aux inhibiteurs généraux de .. téase, par exemple au fluorophos- phate de diisopropyle (DF) @ sérum sanguin, puis des inhibiteurs spécifiques de trypsine dérivés de pancréas, graines de soja, etc. C'est-à-dire qu'alors que la pancrine est essentiellement inhibitée par le DFP et le sérum sanguin, elle .est incomplètement inhibitée par la graine de soja et les inhibiteurs de trypsine de pancréas. En outre, la sensibilité de la pancrine à la d-phénylalanine (inhibiteur de carboxypep-
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tidase) et au propionate do bota phényl (inhibiteur de chymotrypsine et de carboxypoptidases diffère qualitativement de celle soit de la chymotrypsine, soit de la carboxypeptidase.
Une autre caractéristique de la pancrinc est que son action protéolytique se produit sensiblement sans diminution en l'absence d'agents réducteurs, tels que cystéine et acide sulfhydrique.
Cette protéinase peut être caractérisée chimiquement du fait qu'elle est soluble dans une solution aqueuse d'alcool à 60 % (en volume), à une température de 25 C. De même, l'activité protéolytique de pancrine peut être maintenue dans une solution aqueuse pendant une période de 8 heures à une température de 25 C et avec un pH de 4,7, puis pendant deux mois à une température de 2 à 3 C et à un pII de 7,4 ou 4,7.
L'activité enzymatique de pancrine peut être caracté- risée par le fait que le rapport de son activité protéolytique sur un substrat d'hémoglobine dénaturé à l'urée à son activité d'esterase sur un substrat d'ester éthylique d'acétyl-1-tyrosine (ATEE) est d'au moins 150. Par exemple, on a trouvé qu'une préparation partiellement épurée de cette protéinase montre une activité de 38,4 unités sur un substrat d'hémoglobine dénaturé à l'urée, tandis que son activité sur le substrat ATEE est de 0,187 unité. Ainsi, le rapport d'activité d'hémoglobine à activité ATTE pour cette préparation est de 206.
D'autre part; un produit de chymotrypsine cristallisé montre une activité de 5,7 unités sur un substrat d'hémoglobine dénaturé à l'urée et de 0,396 unité sur un substrat ATEE; en conséquence, le rapport hémoglobine : ATEE pour la chymotrypsine est 14,4.
Ce substrat ATTEE a été trouvé être spécifique pour la chymotrypsine par Kaufman, S. J. Biol. Chem. 177, 793 (1949), tandis que le substrat d'ester méthylique de p-toluènesulfonyl- 1-arginine (TSAI.:E) a été rapporté comme étant spécifique de la trypsine par Schwert, G.. W. J. Biol. Chem., 172, 221 (1948).
Une unité d'activité d'esterase pour l'un quelconque de ces substrats spécifiques peut être définie cornue la .. -' jure
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hydrolysantc de 1. . .. L':':jrt .. tco. î)1.lti jîyr .ts d erlr yi:ie* L'activité ['J ,ç-'::d1yti2.llú du c:.: préparations d'enzy..ies sur l'h0:,o,-lobine Ù'1lJvnJ'(0 à l'urne peut 0t1'c 1.=sur.5c suivant le mode opératoire ir.di;z: par ,,n<;.>n, J. Cen. l'hysiol. 22, 79 (1930), dans lequel jm>. ii;,it.J c'.'<;c.',zvitf' prJl6ol;ticne peut être définie co:,:..\O 1.1 . d'un. .¯=. tyrosine par rzài. d'enzyme en 10 minutes, 1. mie turc de 37 0. On a trouvé que la vitesse optinuu do pl'otG,)YS0 l 1# 11:1ncru).e ne..;o:.:., 00 ne dénaturée peut être oiJenue 1 un pli dens la co..-r.le de 7 à 9.
Ce mode opératoire anùlyti'-;L<o peut êt1'G appliqua aux substrats de protéine native, de même qu'à ceux qui ont été dénaturés à l'urée, etc. Ce mode opératoire peut aussi être utilisé en liaison avec d'autres substrats 'Le protéine, tels que case ne et albumine du sang.
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L'activité d'üst81'ase de trypsine cristallisée sur un substrat T5A..E a été trouvée être de 0,4/xj, tandis que celle d'une préparation de pancrine partiellement épurée est 0,138.
'On a trouvé que le rapport de l'activité de pancrine sur le substrat d'hémoglobine ou substrat ATEE restait pratiquement constant au cours d'une épuration partielle de cette enzyme.
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Par exemple, le rapport ri W.:olobire : ATl!iE pour 6 préparations de pancrine ayant des degrés différents de pureté fut 192 + 34.
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Ainsi, l'activité ixi 1± peut µtre inhérente à la molécule de pancrine. Cependant cn peut concevoir que l'activité ATEE peut' être due simplement b. une substance ChYI'1Otrypsine contami- nante étroi tellent associée 0. la pancrine. En conséquence, par . un rapport d'activité de pancrine sur substrat d'hémoglobine
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dénaturée à l'urée à substrat 1';, on entend comprendre la possibilité que le dno7einateur activité de substrat ATBE peut être 0, ce qui fait que l'activité d'hémoglobine dénaturée à l'urée de la pancrine peut encore être considérée comme étant plus de 150 unités et d'un rapport d'au noins 150.
Ce protéinasc peut être obtenu par un procédé qui comprend la mise en contact d'une matière à faible échange cationique et d'un concentré daueux brut du pancréas contenant
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ce protéinase, pour adsorber l'enzyme sur la matière d'échange cationique. Le protéinase adsorbé peut être élue ou séparé de la matière d'échange cationique avec une solution saline aqueuse.
Ce concentré aqueux brut de pancréas peut être préparé en faisant venir un tissu de pancréas subdivisé en contact avec une solution aqueusu pour obtenir un extrait aqueux contenant cette substance d'enzyme protéolytique. Les glandes pancréas peuvent être subdivisées par des opérations telles que hachage, broyage et réduction, puis elles sont dégraissées.,par extraction en utilisant des solvants, tels que l'acétone, le xylène et des fractions d'hydrocarbures du pétrole. Bien que du tissu de pancréas de mammifères, tels que pancréas de porc et de,,boeuf soit la source préférée de cette enzyme protéolytique, il est évident que l'aenzyme peut être obtenue à partir d'autres sources.
Ce tissu de.pancréas peut contenir du tissu de duodénum de porc réduit, par exemple environ la µ? en poids. On n'a pas complètement caractérisé le mécanisme d'activation de la pancrine. Cependant, si ce protéinase est contenu homostatique- ment dans le¯pancréas sous la forme d'une proenzyme, c'est-à- dire du précurseur inactif, il peut être activé dans le duodénum par un procédé analogue à l'activation de trypsinogène par entérokinase ou l'activation de chyrnotrypsinogène par trypsine. En conséquence, il peut être désirable d'inclure de la matière de duodénum dans cette bouillie d'extraction de pancréas. De même, la bouillie d'extraction peut contenir un sel inorganique, tel que chlorure de sodium.
L'extraction de l'enzyme peut être effectuée complètement en 2 à 3 heures à une température de 25 C et en 10 à 16 heures à une température de 0 C. Cet extrait d'enzyme peut être séparé du résidu de tissu par des procédés, tels que centrifugeage et filtrage, puis le résidu séparé peut être mis au rebut ou utilisé pour produire d'autres facteurs pancréatiques.
Tout concentré aqueux brut de ce protéinase, tel que l'extrait pancréatique prémentionné,' peut être soumis à ce
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traite.i.mt d'adsorption-élution pour obtenir un produit de pancrine épuré. u cours de ce traite.lent d'épuration, l'adsorption du protcinase l;"ut ,31;1'0 obtenue car d..;;s :'i...tiores de faible échange catioaique, telles que des rcsimc 'j'acide carboxylique, par exemple celles connues sous lés nO.,1::; de XE-97 et IRC-50 (fabriquées par 710iim et lia,as). Dion qu'on ait trouvé que ce protéinase puisse être adsorbé sur la p'1)tire d' 6chanc;e à un p:3 rentrant dans la u.. :e de ',5 à et 1. uns force ionique de moins de 0,- environ, une adsorption particulièrement désirable de l'ensy-1e est obtenue z un pII de 4,7 et à une force ionique de 0,0.
La ter1.Q':'ratu,ce pour obtenir l'adsorption de ce protéinase peut être d'environ tac.
La natière d'ëchanje cationique peut être équilibrée à ces conditions d'adsorption, par exemple en faisant venir la résine en contact avec une solution tampon 0,05M acétate de sodium-acide acétique à pH 4,7. L'équilibrase de la résine peut être obtenu en mettant la résine et la solution tampon en suspension. .après que la résine a atteint un état d'équilibre avec le tampon, la nasse de la solution peut être séparée de la résine, par exemple par décantation. Le concentré aqueux brut contenant ce protéinase peut être réglé à l'état d'adsorption, par exemple par dilution avec de l'eau, jusqu'à une force ionique inférieure à 0,4,lorsque la force ionique du concentré d'enzyme aqueux est supérieure à 0,4.
D'autre part, le concentré aqueux de protéinase peut être élancé à la résine équilibrée et à un volume d'eau approprié à réduire la force ionique du mélange résultant à noins de 0,4 pour obtenir les conditions d'adsorption.
Cette opération d'adsorption peut être exécutée en mélangeant la matière d'échange cationique équilibrée et le concentré aqueux d'enzyme au cours d'une opération par ruasse et
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en séparant ensuite la ;,;.:::.tH.:re d 1,5chffi:e du liquide surnageant par des procédés, tels que centrifugée et filtrée. A titre de variante, la résine peut être tassée dans une colonne cylindrique et on peut faire passer le concentré aqueux
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d'enzyme à travers cette colonne à une vitesse de courant de nature à adsorber le protéinase sur la matière d'échange.
Le protéinase peut être élué de la matière d'échange cationique à un pH de 4,5 à 5 et à une force ionique de plus de 0,4 environ. Les meilleurs résultats d'élution peuvent être obtenus à un pH d'environ 4,7 et à une force ionique entré 0,8 et 1,5, des résultats d'élution particulièrement désirables étant obtenus à une force ionique d'environ 1,2. Cette élution peut être exécutée en faisant venir la matière d'échange cationique ayant le protéinase adsorbé sur elle en contact avec une solution saline aqueuse ayant une force ionique d'au moins 1,0 environ. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la force ionique de cet éluant aqueux est d'environ 2,0.
Le contact entre la matière d'échange et l'éluant pour obtenir l'élution de l'enzyme peut être produit par des modes opératoires, tels que celui à masses et les systèmes de colonne prémentionnés. La condition de force ionique utilisée dans cette épuration peut être obtenue avec tout sel inorganique inerte par rapport au protéinase.
Le protéinase élué peut en outre être épuré en répétant l'opération d'adsorption-élution prémentionnée. De même, ce protéinase peut être épuré en fractionnant le produit d'élution précédemment décrit à saturation sensiblement complète avec du sulfate,d'ammonium. On a trouvé que le protéinase élué est sensiblement soluble à une saturation de sulfate d'ammonium inférieure à 0,8, mais qu'il est insolubilisé à une saturation de sulfate d'ammonium de plus de 0,8 environ. Dans l'aternative, l'enzyme éluée peut être fractionnée à une concentration d'alcool d'au moins 65 % environ, à une température de -5 C.
Bien qu'on ait trouvé que cette enzyme de protéinase soit sensiblement insoluble à une concentration d'alcool d'environ 65 %, on obtient une précipitation plus complète de cette enzyme à une concentration d'alcool d'environ 80 % et à une température de -5 C. Comme alcools appropriés pour fractionner ce protéinase, on peut citer par exemple l'éthanol et le
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méthanol. La substance d'enzyme précipitée peut être séparée du
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liquide surnageant par des procédés tels que centrifusease et fil, puis, après dialyse pour éliminer le sel ou solvant résiduel de ce liquide, la substance d'enzyme peut être déshydratée si on le désire. De préférence, cette déshydratation
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de la substance d' eny::o est obtenue par lyophilisation.
La dispersion de cellules de tissu dans une culture de tissu peut être obtenue en faisant venir une suspension de tissu animal subdivisé en contact avec une préparation de cette substance de protéinase. Par exemple, du tissu de rein de singe subdivisé, mis en suspension dans un milieu de croissance de
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icro-orGanis2es convenable, peut être mêlant à une solution à 1 le de cette subs'nce d'enzyme pour produire la désintégration des fra7lments de tissu en les cellules individuelles. La culture de croissance dispersée de cellules de tissu ainsi obtenue peut être utilisée pour la culture de micro-organismes, tels que des virus de dégénération de tissu.
Les éléments nutritifs compris dans la culture de croissance varient avec les nécessités des organisnes particuliers et un milieu convenable pour cultiver des virus de dégénération de tissu,
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tels de poliomyelite, est décrit par J.S. Youngner ùans Proc.
Exp. Biol. ... ed. , 85, 202 (1954).
L'invention peut en outre être illustrée par les exemples suivants :
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.8x..;r1]Jle 1
Du tissu de pancréas de porc, ayant été subdivisé par hachage, dégraissée ou extraction au solvant et déshydraté en
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une quantité de 400 c:ra:,,::,es, fut n.2ln::;é avec 2000 cm3 d'eau. Le tissu de pancréas sec contenait environ 8 µ.' en poids de
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chlorure de sodiun et 10 "' en poids de tissu de duodénum de porc. Ce mélange fut soumis à l'extraction par agitation à une température de 25 C pendant une période de 5 heures.
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L'extrait formé fut séparé du résidu du tissu par centrifugeage
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et le volume de l'exteait otenu étaitde 1800 cm).
Une résine de type acide carboxylique (XE-97), en une quantité de 180 g. fat équilibréc avec un tampon à l'acétate 0,05M, contenant de l'acétate de sodium et de l'acide acétique à un pH de il-,7. La résine équilibrée fut mélangéc avec 720 cm3 d'extrait pancréatique et 4950 cm3 d'cau. Le mélange résultant fut agité à une température do 25 C pendant une période de 90 minutes et ensuite la r6sine fut séparée du liquide surnageant par centrifugeage. La résine séparée fut lavée à l'eau deux fois, chaque lavage étant effectué avec 1800 cm3 d'eau. Les eaux de lavage furent séparées de la résine par centrifugeage et mises au rebut.
La résine lavée fut' mélangée avec 760 cm3 de solution tampon acétate de sodium-2-.! - acide acétique de pH 4,7 et 'le mélange résultant fut agité pendant une période de 90 minutes à une température de 25 C. Le produit 'd'élution fut séparé de la résine par centrifugeage et ensuite 690 cm3 de produit d'élution furent récupérés, ce produit ayant une concentration de protéine de 2,4 mg. par cm3 déterminée par le procédé à la micro protéine de Folin. Ce produit d'élution, en une quantité de 675 cm3, fut mélangé avec 393 grammes de sulfate d'ammonium solide et agité à une température de 25 C pendant une période d'une heure pour obtenir la dissolution du sulfate d'ammonium.
Le précipité formé après cela fut séparé du liquide surnageant par filtrage et le précipité séparé fut séché par lyophilisation. Le produit lyophilisé pesait Il,3 grammes et contenait environ 5% de protéine. L'activité de protéinase de ce produit séché fut déterminée en utilisant de l'hémoglobine comme substrat et le résultat peut être exprimé soit comme 0,11 mg. de tyrosine libéré par mg. de poids, soit 2,2 mg. de tyrosine libérés par mg. de protéine.
Exemple 2
Un produit de pancréas de porc séché, dégraissé et réduit, contenant environ 8% en poids de chlorure do sodium et 10 % en poids.de tissu de duodénum de porc en une quantité de
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800 grades fut :..' 4; avec 4000 CH3 d' eau. Ce :,iàla=1je fut a-it3 pendant une période de 3 heures à une température de 2500. L'extrait for,.!é ensuite fut sépare du résidu de tis par centrifuc;ea,ú et le velu!.;'-' d'extrait ainsi obtenu était
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3700 cm3.
Une résine de type acide carboxylique (XE-97) en une
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quantité de 26J t;ral.E!l3 fut équilibrée avec une solution tu.-.zpon acétate de sodiwi-<i,<5-11 - acide acétique au pH -,7. La résine équilibrée fut :.:é 6ar¯.ve avec 8C0 cin3 do l'extrait pancréatique et 5450 cm3 d'eau. Ce ..;5itI1j;e fut a01 té pendant une période de
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135 minutes à une température de 25 C. La résine fut séparée du
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liquide surnageant par centri .caGe et le liquide surnageant fut nis au rebut. La r0sine fut ensuite lavée deux fois, chaque lavage ét. 1w lit avec 20CO c:3 d'eau. Les eaux de lavage furent sé# ¯ ..., de 1 résine par centrifugeage et l1ises au
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rebut.
La résine lavée fut éluée avec 800 cm3 de solution
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tampon acétate de sodiu:"-2.: - acide acétique au pi 4,7 par
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agitation à une température de 25 C, pendant une période de 135 minutes. Le produit dilution résultant fut séparé de la ré-
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sine par centrifu3eac, et la résine fut mise au rebut. Le produit d'élution fut obtenu en un volume de 750 csi3 contenant 3 1 mg. de nrotéine par cr3.
Dne partie de ce produit d' élution, en une quantité de 720 cr.3, fut -."L e avec 341 gra-mes de sulfate d'a';:''''1oniu::n solide et le ,']"1&?1'::::; T-'sû¯it;zat fut agité à une température de 25 C pendant uno :¯e..zr . 1. F;.5c; ;t< forné fut laissé déposer à une tenpérature de COC et 5ÉParà du liquide surnaGeant par centrifuC8ae. Le précipité fut séché par lyophilisation et le produit séché fut obtenu An un rendement de 10,98 gramnes.
Ce produit sèche avait W18 activité de protéinase éGale à 0,4 mz. de tyrosine par tii'. de proJui ou 3,0 r. de tyrosine par m.:::;. de protéine (le r0ju1t séché contenait environ 5 ; de protéine).
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Une seconde partie du produit d'élution, en une
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quantité de 700 c,,,3, fil j,; lan ,to avec 332 C. de sulfate
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d'ammonium solide et le mélange fut agite à une température de 25 C pendant une heure. Ensuite, le précipité formé fut laissé déposer à une température de 0 C et séparé du liquide surnageant par centrifugage. Ce précipité fut déshydraté par lyophilisation et le produit séché fut obtenu en un rendement de 14,35 g. contenant environ 5 % en poids de protéine.
L'activité de protéinase de ce produit était équivalente à 0,37 mg. de tyrosine par mg. de produit ou 7,4mg. de tyrosine par mg. de .protéine. Exemple 3
Du tissu de pancréas de porc réduit, dégraissé et séché, contenant environ 8 % en poids de chlorure de sodium et
10 % en poids de tissu de duodénum de porc, en une quantité de
400 g.,' fut mélangé avec 2000 cm3 d'eau. Ce mélange fut agité pendant 4 heures à une température de 25 C. L'extrait formé fut séparé du résidu de,tissu par centrifugeage. Cet extrait pancréatique fut obtenu en un volume de 1530 cm3.
La résine de type acide carboxylique (XE-97), en une quantité de 300 g., fut équilibrée avec une solution tampon acétate de sodium-0,05M - acide acétique au pH 4,7. La résine équilibrée fut mélangée avec 1200 cm3 de l'extrait paneront ue et 8174 cm3 d'eau, puis le mélange résultant fut agité à @@@ température de 25 C. Ensuite, la résine fut séparée du lique surnageant et ce liquide fut mis au rebut. La résine fut laves deux fois, chaque lavage étant fait avec 3000 cm3 d'eau. Les eaux de lavage furent séparées de la résine par centrifugeage et mises au rebut. La résine fut mélangée avec 1200 cm3 de solution tampon acétate de sodium-2M - acide acétique au pH 4,7 et le,mélange résultant fut agité à une température de 25 C.
Le produit d'élution formé fut séparé de'la résine par centrifugeage. Ce produit d'élution fut mélangé avec 498 g. de sulfate d'ammonium solide et le mélange résultant fut agité pendant une heure à une température de 25 C. Ensuite, le
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mélange fut laissé déposer à une tc:np,5r[turc de OOG et le précipité forme fut séparé par contrifu,ca-0. Ce précipité fut séché par lyophilisation et le produit séché résultant pesait 23,0 g. contenant environ 5 % do protéine. L'activité de protéinase de ce produit fut déterminée comme 0,25 -au. de
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tyrosine par m. de produit ou 5, 0 ln;. de tyrosine par ru,. de protéine.
La résine éluée prénentionnée fut ;ù41anyse avec 500. cl) de solution tampon acétate de soâiu:r-2:.: - acide acétique de pH 4,7. Le 1.iôianse résultant fut agité à une température de 0 C et ensuite le produit d'élution fut séparé de la résine par centrifujeage. Ce produit d'élution, qui fut obtenu en un volune de 450 cm3, était avec 214 C. de sulfate
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dlarinonium solide. Le mélange résultant fut aité à une température de 250C pendant une heure et le précipité for.-.i6 fut laissé déposer à une température de 0 C. Ce précipité fut
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séparé du liquide surnageant par centrifugeage et ce précipité fut déshydraté par lyophilisation. Le rendement de produit séché était de 6,6 g. contenant environ 5 % en poids de
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protéine.
L'activité de protéinase de ce produit fut déterminée co-rte 0,36 mb. de tyrosine par n. ioduit ou 7 , 2 ^.. .., de tyrosine par mg. de protéine.
Exemple 4
Du tissu de pancréas de porc séché, décaissé et réduit, contenant environ 8 % en poids de chlorure de sodium et
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10 . en poids de tissu de duod'nurl de porc, fut avec 3.600 en-3 d'eau. Ce ?n2lane rut aité à une t rature de 25'C pendant 5 heures. Ltr'xtrait rsultant fut séparé du résidu de tissu par centrifugage et le voulse d'extrait ainsi obtenu fut de 3050 cm3.
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Une raine de type acide c,rboY.:ylir.!.ue (X2:-97) en une quantit0 de 70'J r. fut 'nuilibr6e avec une solution tampon acétate de ::oriurn-c3,t,î,1 - acide ac..Lique de pII -1,7. La résine équilibrée [',It u'Jlanr,;t':;c av'..c 2000 c/:(;; cytrait PIncr,5atique et
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19090 cm3 d'eau. Ce mélange fut ajité pendant 60 minutes il une température de 25 C, nsuite, la r6sîno fut du liquide surnageant par contrifugcace. Cette rusine fut lavée deux fois, ce lavage étant obtenu avec 7000 cm3 d'eau. Les eaux de lavage
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furent séparées de la résine par conbrifucasc et Mises au rebut. La résine lavée fut ',1 ;lauÔe avec J0'>0 cn3 de solution tampon acétate d'ammonium-2M - acide acétique de pI3 4,7 et le mélan,e résultant fut aGité pondant 60 minutes à une température de 25 C.
Le produit d'élution formé fut séparé de la résine par centrifugeage..Ce produit d'élution fut obtenu en un volume de 2800 cm3 contenant 3,0 mg. de protéine par cm3, tel que déterminé par le procédé micro protéine de Folin.
Une partie de ce produit d'élution, en une quantité
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de 380 cm3, fut mélangée avec 2045 cmj d'alcool 3.A à 95 ;.
L'alcool fut additionné au produit d'élution d'une manière capillaire à une température de -5 C sous une agitation vigoureuse. Le précipité formé fut laissé déposer à une température de -5 C et ce précipité fut séparé du liquide surnageant par centrifugeage. Le précipité séparé fut séché par lyophilisation et obtenu en un rendement de 0,49 g. Ce produit, qui était sensiblement tout protéine, fut désigné par A.
Une seconde partie de ce produit d'élution, en une quantité de 1600 cm3, fut mélangée avec 8600 cm3 d'alcool 3A à 95 L'alcool fut additionné au produit d'élution .d'une manière capillaire à une température de -5 C sous agitation vigoureuse. Le précipité formé fut laissé déposer à une température de -5 C et il fut ensuite séparé du liquide surna- geant par centrifugeage. Ce précipité fut déshydraté par lyophilisation et obtenu en un rendement de 2,6 g. Ce produit séché, qui était sensiblement tout protéine, fut désigné par B.
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Une troisième partie du produit d'élution, en une quantité de 595 cnâ, fut raclansoe avec '3200 cmj d'alcool 3 à 95 #. L'alcool fut additionné au produit d'olution d'une manière capillaire à une température de -5oC, sous agitation vigoureuse. Le précipité ainsi for 10 fut laisse déposer à une
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température de -5 C et séparé du liquide surnageant par centri- fugeage.. Ce précipité séparé fut déshydraté par lyophilistion et le produit séché pesait 0,70 g.. Ce produit sec fut désigné par C et était sensiblement tout protéine..
Les produits sèches prémentionnés A. B et. C furen' rassemblés et mélangés pour former une masse uniforme., Cette masse fut analysée quant à son activité de protéinase et les résultats indiquèrent une activité de 6,5 mg. de tyrosine:par mg. de produit.
Exemple 5
Un produit d'élution de protéinase, obtenu suivant l'exemple 4, fut soumis à une opération d'adsorption analogue comme suit :
Ce produit d'élution, en un volume de 140 cm'3, fut mélangé avec 965 cm3 d'eau et 96,5 cm3 de résine XE-97 tassée contenant 35 g. de résine sèche préalablement équilibrée, suivant le procédé de l'exemple 4.
Le mélange résultant fut agité à la température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite le liquide surnageant fut séparé de la résine par centrifugeage et mis au rebut. La résine séparée fut soumise à l'élution avec 168 cm3 de solutioi. tampon acétate d'ammonium-2N- acide acétique de pH 4,7.
Ce produit d'élution fut analysé et les résultats furent les suivants :
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> protéine <SEP> (procédé
<tb> micro <SEP> Folin <SEP> mg/cm3) <SEP> 0,246
<tb> activité <SEP> protêt-tique <SEP> (substrat
<tb> d'hémoglobine <SEP> dénaturée <SEP> - <SEP> unités/cm3) <SEP> 9,44
<tb>
Ainsi, la pureté de ce produit de pancrine peut être calculée comme 38,4 unités protéolytiques par mg. de protéine.
Exemple
L'activité protéolytique du produit de pancrine obtenu à l'exemple 5 fut comparée avec celle de trypsine et de chymotrypsine sur différents substrats de protéine, dans
<Desc/Clms Page number 15>
lesquels D désigne la forme dénaturée à l'urée du substrat et N désigne les substrats naturels.
Les résultatsfurent comme suit :
EMI15.1
<tb>
<tb> Substrats <SEP> tryp- <SEP> chyme- <SEP> pancrine <SEP> ancrine: <SEP> pancrine:
<tb> sine <SEP> tryp- <SEP> trypsine <SEP> chymo-
<tb> ¯¯¯¯ <SEP> sine¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> trypsine
<tb> hémoglobine <SEP> D <SEP> 11,94 <SEP> 5,70 <SEP> 38,40 <SEP> 3,2 <SEP> 6,7
<tb> hémoglobine <SEP> N <SEP> 1,79 <SEP> 1,10 <SEP> 5,36 <SEP> 3,0 <SEP> 4,9
<tb> albumine <SEP> de
<tb> sérum <SEP> D <SEP> 4,77 <SEP> 2,45 <SEP> 6,17 <SEP> 1,3 <SEP> 2,5
<tb> albumine <SEP> de
<tb> sérum <SEP> N <SEP> 0,44 <SEP> 0,38 <SEP> 1,90 <SEP> 4,3 <SEP> 5,0
<tb> caséine <SEP> D <SEP> 11,52 <SEP> 18,40 <SEP> 31,55 <SEP> 2,7 <SEP> 1,7
<tb> caséine <SEP> N <SEP> 6,16 <SEP> 9,49 <SEP> 9,54 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0
<tb>
* Rapport d'activité de pancrine à trypsine.
** Rapport d'activité de pancrine à chymotrypsine.
Exemple 7
L'influence d'inhibiteurs de trypsine particuliers sur l'activité protéolytique de pancrine par rapport au substrat d'hémoglobine dénaturée à l'urée fut démontrée comme suit :
EMI15.2
<tb>
<tb> Inhibiteur <SEP> trypsine <SEP> chymotryp- <SEP> pancrine
<tb> acti- <SEP> inhi- <SEP> sine <SEP> acti- <SEP> inhivite <SEP> bition <SEP> acti- <SEP> inhi- <SEP> vité <SEP> bition <SEP> %
<tb> vité <SEP> bition
<tb> néant <SEP> 11,94 <SEP> 5,70 <SEP> 35,80
<tb> inhibiteur
<tb> graine <SEP> de <SEP> soja
<tb> trypsine <SEP> .1,58 <SEP> 87 <SEP> 3,67 <SEP> 36 <SEP> 28,20 <SEP> 21
<tb> inhibiteur
<tb> trypsine
<tb> pancréatique <SEP> 2,41 <SEP> 80 <SEP> . <SEP> 4,63 <SEP> 19 <SEP> 24,50 <SEP> 32
<tb>
La concentration d'inhibiteur dans ces compositions était de 100 grammes par unité d'activité protéolytique.
Ceci s'élève à un rapport de poids d'inhibiteur à enzyme de 4 (pancrine) 1,2 (trypsine) et 0,6 (chymotrypsine).
Exemple 8
L'influence de propionate de bêta phényl sur l'activi-
<Desc/Clms Page number 16>
té protéolytique et esterolytique de chymotrypsine et de pancrine peut être démontée comme suit
EMI16.1
<tb>
<tb> Substrat <SEP> propionate <SEP> chymotrypsine <SEP> pancrine
<tb> betaphényle <SEP> activité <SEP> (unités) <SEP> activité <SEP> (unités)
<tb> concentré <SEP> M <SEP> init. <SEP> final <SEP> inhib. <SEP> init. <SEP> final <SEP> inhib.
<tb>
@
<tb> hémoglobine
<tb> dénaturée
<tb> par <SEP> urée <SEP> 0,09 <SEP> 5,70 <SEP> 1, <SEP> 60 <SEP> 72 <SEP> 35,80 <SEP> 16,49 <SEP> 54
<tb> ATEE <SEP> 0,06 <SEP> 0,396 <SEP> 0,190 <SEP> 52 <SEP> 0,187 <SEP> 0,161 <SEP> 14
<tb> ATEE <SEP> 0,006 <SEP> 0,396 <SEP> 0,356 <SEP> 10 <SEP> 0,187 <SEP> 0,187 <SEP> 0
<tb>
Les différences de sensibilité de pancrine et de chymotrypsine à l'inhibition par le propionate de betaph6nyle dépassent les limites d'erreur pour le procède d'essai. En conséquence, ces résultats indiquent que l'inhibition de chymotrypsine par le propionate de bétaphényle est qualitativement différente de celle de pancrine.
Bien que dans la description qui précède divers modes de réalisation de l'invention aient été décrits en détail pour l'illustrer, il est évident que diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadr le l'invention.