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La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique et un procédé pour l'obtenir.
On connaît l'importance des antibiotiques qui, précédemment utili- sés pour des buts thérapeutiques, servent aujourd'hui aussi dans d'autres domaines avec des résultats satisfaisants.
La demanderesse a trouvé qu'un actinomucète, cultivé dans des milieux nutritifs liquides appropriés, est capable de donner @ @ une substance antibiotique que l'on peut extraire du bouillon ou milieu de culture grâce à des méthodes appropriées.
La nouvelle substance active, formée pendantla culture de l'aoti- nomycète, a été appelée "flavensomyoine". Les caractéristiques physiques et chimiques de la flavensomycine diffèrent de celles des antibiotiques déjà décrits. Ce nouvel antibiotique a été récupéré dans le bouillon de culture d'un Streptomyces isolé dans un sol rural de Cavour, en Piémont, et qui appartient au groupe des espèces chromogènes. Ce Streptomyces a été baptisé Streptomyces Cavourensis, souche N 829.8.52.
Le mycélium végétatif est formé d'hyphes longs et minces, rami- fiés ou en amas ; lemycélium aérien est formé d'hyphes longs, droits et ondu- leux, qui se transforment assez lentement en conidiophores portant conidies presque rondes, non groupés en buisson,
On n'a pas observé de spirales.
Dans le tableau suivant, on indique les caractéristiques culturel- les du Streptomyces 829.
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T A BLE A ¯¯¯I¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯aractéristiques¯de¯culture-(à¯27 C)¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯-¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ Î, ÎÎ 1 ' Pigment 8 Caractéristiques Mycélium végétatif 1 Mycélium aérien soluble biochimiques --------------------------- ----------------------- t--------------------------- 1------------ -------------------------- , 'Agar-agar de Czapek 'abondant, , jaunâtre 'abondant, crayeux , 'absent 'Viande et agar-agar abondant, marron orangé' blanc jaunâtre rare du marron clair' .
S"é" àabondant, marron orangé)µµ fµlyµ'µ'±Î imarrDn clair, 'blanc sale gris jaunâtre'
EMI2.2
<tb> 'Gluco.se <SEP> et <SEP> agar-agar <SEP> 'abondant, <SEP> ridé, <SEP> marron <SEP> abondant, <SEP> blanc <SEP> jaunâtre <SEP> 'marron <SEP> foncé'
<tb>
EMI2.3
'Pomme terre et agar-agar' abondant marron foncé 'abondant, gris avec taches 'brun' ,Pomme terre agar-agar ,abondant, marron foncé :
Jaunâtres , gris avec ,brun jaunâtres foncées Asparagine-glycérol-agar-agar a on an , ridé, couleur ,rare, blanc brun 'noisette
EMI2.4
<tb> 'Avoine <SEP> et <SEP> agar-agar <SEP> 'abondant, <SEP> ridé, <SEP> marron <SEP> 'abondant, <SEP> ridé, <SEP> gris <SEP> avec <SEP> 'marron <SEP> clair'
<tb> 'clair <SEP> 'taches <SEP> marron <SEP> marron <SEP> clair,
<tb>
<tb> 'Amidon <SEP> et <SEP> agar-agar <SEP> 'rare, <SEP> jaune <SEP> à <SEP> brunâtre <SEP> 'rare,crayeux,blanc <SEP> jaunâtre <SEP> 'brunâtre <SEP> . <SEP> 'amidon <SEP> fortement <SEP> hydrolysé'
<tb> @
<tb> 'Maléate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> et <SEP> 'clair, <SEP> jaune'
<tb> 'agar-agar <SEP> ,rare, <SEP> jaune <SEP> brunâtre <SEP> ;rare, <SEP> blanc <SEP> tacheté <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair'
<tb>
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,Gélatine ,rare, ridé, brun ,rare, gris "fluidifie la gélatine:
,Gelatine ,rare, ridé, bru..'l ,rare, gris ,brunâtre Il cm au bout de 10 jours 'Pomme de terre Roux: tabondant, ridé, marron abondant ur1;sâtre marron clair ,Pomme terre Roux tavec périphérie jaune ' abondant, 0 ,marron clair, blanc sale aune oran 'coagulation -du lait au
EMI2.6
<tb> ,lait <SEP> blanc <SEP> sale <SEP> absent <SEP> Jaune <SEP> orange <SEP> 'bout <SEP> de <SEP> 4 <SEP> jours
<tb> 'abondant,annulaire,inBouillon <SEP> viande <SEP> 'colore <SEP> après <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> 'rare, <SEP> blanc <SEP> à <SEP> croissance
<tb> 'Bouillon <SEP> de <SEP> viande <SEP> :Jaunâtre <SEP> après <SEP> 30 <SEP> jours <SEP> lente <SEP> le <SEP> long <SEP> des <SEP> parois <SEP> 'marron <SEP> clair'
<tb> 'bouillon <SEP> clair <SEP> avec <SEP> 'du <SEP> flacon
<tb> 'flocons <SEP> cotonneux
<tb> ;
Bouillon <SEP> au <SEP> glucose <SEP> aondant <SEP> etc. <SEP> (voir <SEP> absent <SEP> 'absent <SEP> et
<tb> bouillon <SEP> de <SEP> viande <SEP> absent <SEP> très <SEP> rare
<tb> rrare <SEP> 'absent <SEP> et <SEP> 'les <SEP> nitrates <SEP> ne <SEP> sont <SEP> pas <SEP> ' <SEP>
<tb> ,Bouillon <SEP> aux <SEP> nitrates <SEP> rare <SEP> absent <SEP> 'très <SEP> rare <SEP> 'réduits <SEP> en <SEP> nitrites
<tb>
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On peut cultiver ce Streptomyces par des méthodes usuelles, notam- ment en culture immobile et submergée, ce dernier mode de culture étant le meilleur. Les milieux de culture doivent contenir des hydrates de carbone, une source d'azote appropriée et des sels minéraux.
On peut conduire la cul- ture ou la fermentation à une température comprise entre 24 et 32 C,et elle dépend de l'aération, de l'agitation et de la composition du milieu nutritif; le rendement maximum est pratiquement obtenu du quatrième au septième jour de fermentation.
Pendant 'la fermentation, le pH s'élève jusqu'à 7,8-8, et il est a- vantageux qu'il ne dépasse pas ce niveau.
Le bouillon de culture résiduel, après la croissance du Streptomyces qui produit la flavensomyoine, contient diverses substances, par exemple des résidus d'éléments nutritifs, du mycélium lysé et la substance active qui peut atteindre une concentration de 1600 unités par cm et au-delà, en fonction du milieu de culture et des conditions de fermentation.
On peut extraire la flavensomycine du bouillon de culture au mo- yen de divers solvants non miscibles à l'eau, par exemple l'éther, le chlo- roforme, le butanol, l'acétate d'éthyle, l'essence, le benzène, etc...,à un pH de 7, 5 à 8,5.
On diminue le volume de l'extait qui contient l'antibiotique brut, par concentration sous vide, en travaillant à des températures comprises entre 20 et 30 C.
On conduit la purification de la flavensomycine brute par chroma- tographie du résidu obtenu, à travers une colonne de Al2O que l'o n charge avec l'un des solvants ci-dessus, de préférence le benzène.
Pour purifier l'antibiotique en solution concentrée dans le benzène (extrait brut), on peut adopter deux méthodes différentes :
1 ) par chromatographie de l'extrait brut sur une colonne d'alumi- ne, en chargeant avec une solution dans le benzène et en lavant soigneusement au benzène afin d'éliminer les fractions grasses de couleur rouge orangé, qui sont inactives, puis avec de l'acétate d'éthyle pour éluer une autre fraction jaune inactive, et finalement avec du méthanol absolu qui élue l'an- tibiotique.
2 ) On précipite l'extrait brut par l'étherde pétrole, on dissout le précipité dans l'àcétone, on le reprécipite par l'éther de pétrole , on dissout dans le benzène et on chromatographie sur de l'alumine.
On lave la colonne au benzène, à l'acétate d'éthyle, et on élue l'antibiotique par le méthanol absolu.
On récupère la f lavensomycine à partir de la solution alcoolique par évaporation du solvant. La flavensomycine est une poudre cristalline de couleur jaune citron.
On donne l'exemple suivant, uniquement pour mieux illustrer la pré- sente invention.
EXEMPLE.
On cultive la souche dans un milieu d'agar-agar, d'asparagine et de glycérol, à 27 C; sur ce milieu, on obtient une très bonne sporulation.
Pour inoculer le milieu de production, on peut partir directement de spores, ou d'un inoculum constitué par une culture immergée de Streptomyces de 24 heures, obtenue à 27 C sur le même milieu:
On inocule, avec d.es spores ou avec un inooulum, des flacons ou
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fermentateurs contenant : maltose 20 g peptone 5 g liqueur de macération de mais 2,5 g eau du robinet 1 litre
On règle le pH à 7 avec NaOH.
Quand la fermentation est achevée, on élève le pH à 7,5-8,5 en travaillant à une température de 27-28 C.
Quand la fermentation est ,achevée, on enlève le mycélium et on extrait l'antibiotique du bouillon, à trois reprises, au moyen de benzène en un rapport de 3:1, en veillant à ce que le pH soit compris entre 7,5 et 7,8. Dans ces conditions, la flavensomycinese dissout dans le benzène.
On réduit le volume de l'extrait par concentration sous vide, dans un intervalle de température de 20 à 40 C; même les dernières traces d'eau sont éliminées par cette opération.
EMI4.1
On conduit la purification en bhromatographiant le résidu dans une colonne de A12O3 chargée au benzène.
1) L'antibiotique s'adsorbe en même temps que des fractions rouge orangé, tandis que les fractions grasses et les pigments rouges violacés ne s'adsorbent pas. On lave la colonne à plusieurs reprises avec du benzène, puis avec de l'acétate d'éthyle qui élue une fraction jaune inactive, et finalement avec du méthanol absolu qui enlève la fraction active (flaven- somycine). Des fractions rouges inactives, éluablespar l'acétone et l'eau, restent dans la colonne.
2) On précipite par l'éther de pétrole l'extrait au benzène de l' antibiotique que l'on a concentré, le précipité représente la portion acti- ve, on le dissout dans l'acétone et on le reprécipite par l'éther de pé- trole ; les fractions grasses pigmentées en rouge orangé, qui ne s'adsorbent pas sur la colonne d'alumine et nécessitent donc un lavage très prolongé de la colonne avec du benzène, sont presque complètement éliminées par cette mé- thode.
On dissout le précipité dans le benzène et on le chromatographie sur une colonne d'alumine. Après lavage au benzène et à l'acétate d'éthyle, on élue la colonne par le méthanol absolu qui enlève la fraction active.
On récupère la flavensomycine à partir dela solution alcoolique en évaporant le solvant, etelle forme une poudre cristalline jaune citron, suffisamment hygroscopique et inodore.
Le nouvel antibiotique présente les-propriétés chimiques et phy- siques suivantes : la couleur jaune citron clair de la flavensomycine ne varie ni en milieu alcalin, ni en milieu acide. Le produit contient 2,11 % d'azote; il ne contient pas de soufre, ni d'halogènes. Son spectre d'absorp- tion d'ultra-violet ne présente qu'un maximum à 251.
Le spectre d'absorption d'infra-rouge présente les maxima princi-
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paux d'absorption d'infra-rouge à 20,-3,,63,°5-5t86-59.-6,17-6,51-6992¯ 802-905-10,04-1032-1091130213 lierons (voir le dessin ci-ajoint).
Aux six premiers maxima oprrespondent les groupes fonctionnels suivants: OH, CH, CO, CO conjugué, double liaison conjuguée,phényle; la présence de ce dernier groupe et de CO conjugué n'est pas sûre.
Sur le dessin ci-joint, on a porté le spectre d'absorption d'infra-
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rouge de la flavensomycine dans KBr à la concentration de 3% (courbe inféri- eure B), comparé à celui d'un disque de KBr (courbe supérieure A), enregis- trés avec un spectrophotomètre Beckmann 1R/2,
La solubilité de l'antibiotique de la présente invention est très bonne dans certains solvants, tels que le méthanol, l'éthanol, le pro- pylène-glycol, la pyridine ; dans certains alcools tels que le pro- panol-n, le butanol-n, l'alcool amylique ; il est aussi soluble dans l'aci- de acétique glacial et ses esters de méthyle, d'éthyle, de propyle, et de butyle,;il est aussi soluble dans l'acétone, le chloroforme, le dioxane et le benzène.
L'antibiotique est soluble dans l'eau. L'antibiotique est inso- luble dans le glycérol, le tétrachlorure de carbone, le sulfure de carbone, l'éther éthylique, l'hexane, l'essence, l'huile de vaseline.
On obtient la solution aqueuse de flavensomycine en ajoutant de l' eau à une solution de la poudre dans un solvant, à raison de 0,2 g/cm3 au maximum dans l'éthanol. La solution est mousseuse.
La flavensomycine donne des réactions colorées avec les réactifs de Milisch, de Fehling et d'Ehrlicyh; il ne se produit pas de réactions co- lorées avec les réactifs de Selivanoff, de Tollens, de Millon, de Liebermann, de Sakaguchi, ni avec le biuret ; avecFeCl3 il se forme un précipité sans réaction colorée.
La flavensomycine est:assez stable quand on la conserve sous vide sous forme de poudre sèche, ou sous forme de solutions dans des solvants or- ganiques.
En solution aqueuse, particulièrement à faible concentration, elle tend à perdre partiellement son activité et on a noté que 1'.antibiotique de- vient plus rapidement inactif au pH 8-10 qu'au pH 6-4.
Une solution aqueuse de 100 ug/cm3 au pH neutre et à 18 C perd envison 40 % de son activité au bout de3 jours. Une solution aqueuse de 1mg cm au pH neutre, conservée à 4 C. est inaltérés au bout de 7 jours, l'acti- vité de la même solution est réduite au centième au bout de 6 heures à 70 C et au bout de 30 minutes à 100 C.
La lumière semble avoir peu d'influence sur le processus d'inacti- vation. La meilleure stabilité en solution aqueuse est obtenue au pH 6,3-70
La flavensomycine a une action essentiellement anticryptogamique et elle est partiellement active sur les levures du type Saccharomyces et sur les champignons filamenteux du genre Penicillium. Elle n'est pas active sur les Schizomycètes à des concentrations inférieures à 100 /ug/cm .
Dans le tableau suivant, on indique le spectre d'activité antibio- tique de la flavensomycine, déterminé comme suit dilution dans l'agar-agar; solutions aqueuses de l'antibiotique préparées à partir de solutions à 10 % dans l'éthanol:
TABLEAU II.
Spectre d'activité antibiotique de la flavensomycine. Milieu de cul- ture : agar-agar et malt. Température de croissance: 27 C. Résultats enregis- trés au bout de 48 heures.
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<tb>
Microorganismes <SEP> Concentrations <SEP> Microorganismes <SEP> Concentrations <SEP> don-
<tb>
<tb>
<tb> essayés <SEP> donnant <SEP> l'inhi- <SEP> essayés <SEP> nant <SEP> l'inhibition
<tb>
<tb>
<tb> bition <SEP> complète <SEP> complète
<tb>
<tb>
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<tb> ( <SEP> ug/cm3) <SEP> (ug/cm3)
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<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Sacchromyces <SEP> 0,5 <SEP> Pénicillium <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> oerevisiae <SEP> Crysogenum <SEP> Q <SEP> 176
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> 0,5 <SEP> Penicellium <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb> ellipsoideus <SEP> 350 <SEP> Signa
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> 0,1 <SEP> Pénicillium <SEP> sp.
<tb>
<tb>
<tb> carlsbergensis <SEP> (isolé <SEP> à <SEP> partir <SEP> du <SEP> cuir)
<SEP> 1
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candi&a <SEP> albicans <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb> @
<tb>
<tb>
<tb> Candidla <SEP> pelliculosa <SEP> > <SEP> 20 <SEP> Penicillium <SEP> sp.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
(isolé <SEP> à <SEP> partir <SEP> du <SEP> bois) <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Monilia <SEP> cand, <SEP> > <SEP> 20 <SEP> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Kloeckera <SEP> brevis <SEP> 20 <SEP> Aspergillus <SEP> glaucus <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> W <SEP> 203
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Criptococcus <SEP> neo- <SEP> 20 <SEP> Alternaria <SEP> tenuis <SEP> 5
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<tb>
<tb> f <SEP> ormans <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torula <SEP> utilis <SEP> > <SEP> 20 <SEP> Fusarium <SEP> licoperisici <SEP> > <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torula <SEP> neoformans <SEP> 20 <SEP> Rhizophus <SEP> triticini <SEP> > <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> glabrata <SEP> 7,
5 <SEP> Cercosphora <SEP> > <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acetosella
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> histolyti- <SEP> 20 <SEP> Trisophyton <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ca <SEP> mentagrophytes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Oidium <SEP> ludwigi <SEP> 20 <SEP> Endothia <SEP> parasitica <SEP> 5
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporotrichium <SEP> > <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bourmanii
<tb>
Outre sa forte action anticryptogamique, l'antibiotique de la pré- sente invention présente aussi une activité insecticide remarquable.Le tableau suivant illustre cette activité insecticide, expérimentée par appli- cation topique sur la mouche domestique.
TABLEAU III.
Activité insecticide de la flavensomycine.
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<tb>
Doses <SEP> de <SEP> produit <SEP> % <SEP> de <SEP> mortalité <SEP> % <SEP> de <SEP> mortalité <SEP> DM
<tb>
<tb>
<tb> ug <SEP> par <SEP> mouche <SEP> après <SEP> 20 <SEP> heures <SEP> après <SEP> 48 <SEP> heures <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,4 <SEP> 98 <SEP> 99
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,2 <SEP> 83 <SEP> 89 <SEP> en <SEP> 20h <SEP> = <SEP> 0,128
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,15 <SEP> 62 <SEP> 80 <SEP> en <SEP> 40h <SEP> = <SEP> 0,094 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> 29 <SEP> 55
<tb>
La toxicité de la flavensomycine a été déterminée sur la souris blanche : par injection intrapéritonéale: la DM50 est de 1 mg/kg; la DMO
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est de 350 /ug/kg.
Par injection sous-cutanée : laDM est de 2 mg/kg; la DM est de 250 ug/kg. chaque jour pendant 10 jours. Tonicité buccale: la DM50 est de 25 mg/kg, aiguë (dans le méthanol aqueux); dans le propylène - glycol aqueux, la DM50 est de 19 mg/kg.
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The present invention relates to a novel antibiotic and a method for obtaining it.
We know the importance of antibiotics which, previously used for therapeutic purposes, are now also used in other fields with satisfactory results.
We have found that an actinomucete, grown in suitable liquid nutrient media, is capable of yielding an antibiotic substance which can be extracted from the broth or culture medium by appropriate methods.
The new active substance, formed during the cultivation of the Aotinomycete, has been called "flavensomyoine". The physical and chemical characteristics of flavensomycin differ from those of the antibiotics already described. This new antibiotic was recovered in the culture broth of a Streptomyces isolated in a rural soil of Cavour, in Piedmont, and which belongs to the group of chromogenic species. This Streptomyces was named Streptomyces Cavourensis, strain N 829.8.52.
The vegetative mycelium is formed of long, slender hyphae, branched or in clusters; the aerial mycelium is formed of long, straight and wavy hyphae, which transform rather slowly into conidiophores bearing almost round conidia, not grouped in a bush,
Spirals were not observed.
The following table shows the cultural characteristics of Streptomyces 829.
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TA BLE A ¯¯¯I¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯culture characteristics- (to¯ 27 C) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯-¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ Î, ÎÎ 1 'Pigment 8 Characteristics Vegetative mycelium 1 Soluble aerial mycelium biochemicals --------------------------- ---------------------- - t --------------------------- 1 ------------ -------- ------------------, 'Czapek's agar' abundant,, yellowish 'abundant, chalky,' absent 'Meat and agar-agar abundant, orange-brown' yellowish white rare light brown '.
S "é" abundant, orange brown) µµ fµlyµ'µ '± Î imarrDn clear,' dirty white yellowish gray '
EMI2.2
<tb> 'Gluco.se <SEP> and <SEP> agar-agar <SEP>' abundant, <SEP> wrinkled, <SEP> brown <SEP> abundant, <SEP> white <SEP> yellowish <SEP> 'brown <SEP> dark '
<tb>
EMI2.3
'Potato and agar-agar' abundant dark brown 'abundant, gray with' brown 'spots, Potato agar-agar, abundant, dark brown:
Yellowish, gray with, dark yellowish brown Asparagine-glycerol-agar-agar a on year, wrinkled, color, rare, white hazelnut brown
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<tb> 'Oats <SEP> and <SEP> agar-agar <SEP>' abundant, <SEP> wrinkled, <SEP> brown <SEP> 'abundant, <SEP> wrinkled, <SEP> gray <SEP> with < SEP> 'brown <SEP> light'
<tb> 'light <SEP>' stains <SEP> brown <SEP> brown <SEP> light,
<tb>
<tb> 'Starch <SEP> and <SEP> agar-agar <SEP>' rare, <SEP> yellow <SEP> to <SEP> brownish <SEP> 'rare, chalky, white <SEP> yellowish <SEP>' brownish <SEP>. <SEP> 'highly hydrolyzed <SEP> starch <SEP>
<tb> @
<tb> 'Maleate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> and <SEP>' clear, <SEP> yellow '
<tb> 'agar-agar <SEP>, rare, <SEP> yellow <SEP> brownish <SEP>; rare, <SEP> white <SEP> spotted <SEP> to <SEP> brown <SEP> light'
<tb>
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, Gelatin, rare, wrinkled, brown, rare, gray "thins the gelatin:
, Gelatine, rare, wrinkled, bru .. 'l, rare, gray, brownish It cm after 10 days' Potato Roux: tabundant, wrinkled, abundant brown ur1; saccharine light brown, Roux potato with yellow periphery' abundant, 0, light brown, dirty white oran alder coagulation -from milk to
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<tb>, milk <SEP> white <SEP> dirty <SEP> absent <SEP> Yellow <SEP> orange <SEP> 'end <SEP> of <SEP> 4 <SEP> days
<tb> 'abundant, ring finger, inBouillon <SEP> meat <SEP>' color <SEP> after <SEP> 10 <SEP> days <SEP> 'rare, <SEP> white <SEP> to <SEP> growth
<tb> 'Broth <SEP> of <SEP> meat <SEP>: Yellowish <SEP> after <SEP> 30 <SEP> days <SEP> slow <SEP> the <SEP> long <SEP> of the <SEP> walls <SEP> 'brown <SEP> light'
<tb> 'clear <SEP> broth <SEP> with <SEP>' from <SEP> flask
<tb> 'fluffy <SEP> flakes
<tb>;
Broth <SEP> with <SEP> glucose <SEP> abundant <SEP> etc. <SEP> (see <SEP> absent <SEP> 'absent <SEP> and
<tb> broth <SEP> from <SEP> meat <SEP> absent <SEP> very <SEP> rare
<tb> rrare <SEP> 'absent <SEP> and <SEP>' the <SEP> nitrates <SEP> not <SEP> are <SEP> not <SEP> '<SEP>
<tb>, Broth <SEP> with <SEP> nitrates <SEP> rare <SEP> absent <SEP> 'very <SEP> rare <SEP>' reduced <SEP> in <SEP> nitrites
<tb>
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This Streptomyces can be cultivated by the usual methods, in particular in immobile and submerged culture, the latter mode of culture being the best. Culture media should contain carbohydrates, a suitable nitrogen source and mineral salts.
Cultivation or fermentation can be carried out at a temperature between 24 and 32 C, and it depends on aeration, agitation and the composition of the nutrient medium; the maximum yield is practically obtained from the fourth to the seventh day of fermentation.
During fermentation the pH rises to 7.8-8, and it is advantageous that it does not exceed this level.
The residual culture broth, after the growth of Streptomyces which produces flavensomyoine, contains various substances, for example residues of nutrients, lysed mycelium and the active substance which can reach a concentration of 1600 units per cm and above , depending on the culture medium and the fermentation conditions.
Flavensomycin can be extracted from the culture broth using various water-immiscible solvents, eg, ether, chloroform, butanol, ethyl acetate, gasoline, benzene. , etc ..., at a pH of 7.5 to 8.5.
The volume of the extract that contains the crude antibiotic is reduced by concentration in vacuo, working at temperatures between 20 and 30 C.
The purification of the crude flavensomycin is carried out by chromatography of the residue obtained, through an Al2O column which is charged with one of the above solvents, preferably benzene.
To purify the antibiotic in concentrated solution in benzene (crude extract), two different methods can be adopted:
1) by chromatography of the crude extract on an aluminum column, loading with a solution in benzene and washing thoroughly with benzene in order to remove the orange-red fatty fractions, which are inactive, then with ethyl acetate to elute another inactive yellow fraction, and finally with absolute methanol which elutes the antibiotic.
2) The crude extract is precipitated with petroleum ether, the precipitate is dissolved in acetone, it is reprecipitated with petroleum ether, dissolved in benzene and chromatographed on alumina.
The column is washed with benzene, with ethyl acetate, and the antibiotic is eluted with absolute methanol.
The f lavensomycin is recovered from the alcoholic solution by evaporation of the solvent. Flavensomycin is a crystalline powder with a lemon yellow color.
The following example is given only to better illustrate the present invention.
EXAMPLE.
The strain is cultured in a medium of agar-agar, asparagine and glycerol, at 27 ° C .; on this medium, very good sporulation is obtained.
To inoculate the production medium, it is possible to start directly from spores, or from an inoculum consisting of an immersed culture of Streptomyces for 24 hours, obtained at 27 C on the same medium:
Inoculate, with spores or with an inooulum, vials or
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fermenters containing: maltose 20 g peptone 5 g corn maceration liquor 2.5 g tap water 1 liter
The pH is adjusted to 7 with NaOH.
When fermentation is complete, the pH is raised to 7.5-8.5 by working at a temperature of 27-28 C.
When the fermentation is complete, the mycelium is removed and the antibiotic is extracted from the broth three times with benzene in a ratio of 3: 1, ensuring that the pH is between 7.5 and 7.8. Under these conditions, the flavensomycinesis dissolves in benzene.
The volume of the extract is reduced by concentration in vacuo, over a temperature range of 20 to 40 C; even the last traces of water are removed by this operation.
EMI4.1
The purification is carried out by bhromatographing the residue in a column of A1203 loaded with benzene.
1) Antibiotic adsorbs together with orange-red fractions, while fatty fractions and purplish red pigments do not adsorb. The column is washed several times with benzene, then with ethyl acetate which elutes an inactive yellow fraction, and finally with absolute methanol which removes the active fraction (flavenomycin). Inactive red fractions, elutable by acetone and water, remain in the column.
2) The benzene extract of the concentrated antibiotic is precipitated with petroleum ether, the precipitate represents the active portion, is dissolved in acetone and reprecipitated with ether. oil; the fatty fractions pigmented in orange red, which do not adsorb on the alumina column and therefore require a very prolonged washing of the column with benzene, are almost completely eliminated by this method.
The precipitate is dissolved in benzene and chromatographed on an alumina column. After washing with benzene and with ethyl acetate, the column is eluted with absolute methanol which removes the active fraction.
The flavensomycin is recovered from the alcoholic solution by evaporating the solvent, and it forms a lemon yellow crystalline powder, sufficiently hygroscopic and odorless.
The new antibiotic has the following chemical and physical properties: the light lemon yellow color of flavensomycin does not vary in alkaline or acidic environments. The product contains 2.11% nitrogen; it does not contain sulfur or halogens. Its ultraviolet absorption spectrum shows only a maximum at 251.
The infrared absorption spectrum shows the main maxima
EMI4.2
infrared absorption pales at 20, -3,, 63, ° 5-5t86-59.-6,17-6,51-6992¯ 802-905-10,04-1032-1091130213 lierons (see the attached drawing).
The first six maxima have the following functional groups: OH, CH, CO, conjugated CO, conjugated double bond, phenyl; the presence of the latter group and conjugated CO is not certain.
In the attached drawing, we have plotted the infra-
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red flavensomycin in KBr at a concentration of 3% (lower curve B), compared to that of a KBr disc (upper curve A), recorded with a Beckmann 1R / 2 spectrophotometer,
The solubility of the antibiotic of the present invention is very good in certain solvents, such as methanol, ethanol, propylene glycol, pyridine; in certain alcohols such as propanol-n, butanol-n, amyl alcohol; it is also soluble in glacial acetic acid and its esters of methyl, ethyl, propyl, and butyl, and it is also soluble in acetone, chloroform, dioxane and benzene.
The antibiotic is soluble in water. The antibiotic is insoluble in glycerol, carbon tetrachloride, carbon disulphide, ethyl ether, hexane, gasoline, petrolatum oil.
The aqueous solution of flavensomycin is obtained by adding water to a solution of the powder in a solvent, at a rate of 0.2 g / cm3 at most in ethanol. The solution is frothy.
Flavensomycin gives color reactions with Milisch, Fehling and Ehrlicyh reagents; no color reactions occur with the reagents of Selivanoff, Tollens, Millon, Liebermann, Sakaguchi, or with biuret; with FeCl3 a precipitate forms without color reaction.
Flavensomycin is: fairly stable when stored under vacuum as a dry powder, or as solutions in organic solvents.
In aqueous solution, particularly at low concentration, it tends to partially lose its activity and it has been noted that the antibiotic becomes inactive more quickly at pH 8-10 than at pH 6-4.
An aqueous solution of 100 µg / cm3 at neutral pH and at 18 ° C. loses about 40% of its activity after 3 days. An aqueous solution of 1 mg cm 3 at neutral pH, stored at 4 C. is unaltered after 7 days, the activity of the same solution is reduced to one hundredth after 6 hours at 70 C and after 30 minutes. at 100 C.
Light seems to have little influence on the inactivation process. The best stability in aqueous solution is obtained at pH 6.3-70
Flavensomycin has an essentially anticryptogamic action and is partially active on yeasts of the Saccharomyces type and on filamentous fungi of the genus Penicillium. It is not active on Schizomycetes at concentrations below 100 µg / cm.
The following table shows the spectrum of antibiotic activity of flavensomycin, determined as follows dilution in agar-agar; aqueous solutions of the antibiotic prepared from 10% solutions in ethanol:
TABLE II.
Spectrum of antibiotic activity of flavensomycin. Culture medium: agar-agar and malt. Growth temperature: 27 C. Results recorded after 48 hours.
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EMI6.1
<tb>
Microorganisms <SEP> Concentrations <SEP> Microorganisms <SEP> Concentrations <SEP> don-
<tb>
<tb>
<tb> tried <SEP> giving <SEP> the inhibition <SEP> tried <SEP> without <SEP> the inhibition
<tb>
<tb>
<tb> bition <SEP> complete <SEP> complete
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> (<SEP> ug / cm3) <SEP> (ug / cm3)
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Sacchromyces <SEP> 0.5 <SEP> Penicillium <SEP> 0.05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> oerevisiae <SEP> Crysogenum <SEP> Q <SEP> 176
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> 0.5 <SEP> Penicellium <SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb> ellipsoideus <SEP> 350 <SEP> Signa
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> 0.1 <SEP> Penicillium <SEP> sp.
<tb>
<tb>
<tb> carlsbergensis <SEP> (isolated <SEP> to <SEP> from <SEP> of <SEP> leather)
<SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candi & a <SEP> albicans <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb> @
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<tb>
<tb> Candidla <SEP> pelliculosa <SEP>> <SEP> 20 <SEP> Penicillium <SEP> sp.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
(isolated <SEP> to <SEP> from <SEP> of <SEP> wood) <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Monilia <SEP> cand, <SEP>> <SEP> 20 <SEP> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Kloeckera <SEP> brevis <SEP> 20 <SEP> Aspergillus <SEP> glaucus <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> W <SEP> 203
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Criptococcus <SEP> neo- <SEP> 20 <SEP> Alternaria <SEP> tenuis <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb> f <SEP> ormans <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torula <SEP> utilis <SEP>> <SEP> 20 <SEP> Fusarium <SEP> licoperisici <SEP>> <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torula <SEP> neoformans <SEP> 20 <SEP> Rhizophus <SEP> triticini <SEP>> <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> glabrata <SEP> 7,
5 <SEP> Cercosphora <SEP>> <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acetosella
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> histolyti- <SEP> 20 <SEP> Trisophyton <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ca <SEP> mentagrophytes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Oidium <SEP> ludwigi <SEP> 20 <SEP> Endothia <SEP> parasitica <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporotrichium <SEP>> <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bourmanii
<tb>
In addition to its strong anti-cryptogamic action, the antibiotic of the present invention also exhibits remarkable insecticidal activity. The following table illustrates this insecticidal activity, experienced by topical application on the house fly.
TABLE III.
Insecticidal activity of flavensomycin.
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<tb>
Doses <SEP> of <SEP> produces <SEP>% <SEP> of <SEP> mortality <SEP>% <SEP> of <SEP> mortality <SEP> DM
<tb>
<tb>
<tb> ug <SEP> by <SEP> fly <SEP> after <SEP> 20 <SEP> hours <SEP> after <SEP> 48 <SEP> hours <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.4 <SEP> 98 <SEP> 99
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.2 <SEP> 83 <SEP> 89 <SEP> in <SEP> 20h <SEP> = <SEP> 0.128
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.15 <SEP> 62 <SEP> 80 <SEP> in <SEP> 40h <SEP> = <SEP> 0.094 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.1 <SEP> 29 <SEP> 55
<tb>
The toxicity of flavensomycin was determined in white mice: by intraperitoneal injection: the MD50 is 1 mg / kg; BMD
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is 350 / ug / kg.
By subcutaneous injection: the MD is 2 mg / kg; the MD is 250 µg / kg. every day for 10 days. Oral tone: the MD50 is 25 mg / kg, acute (in aqueous methanol); in aqueous propylene glycol, the MD50 is 19 mg / kg.